Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

4. EL SISTEMA LANGENDORFF.

4.1. INTRODUCCIN.
La construccin de un sistema Langendorff (figura 4.1) es la base para llevar a
cabo la parte experimental del proyecto global. Consta de dos partes: un sistema de
perfusin con control integral y un sistema de instrumentacin y monitorizacin de
parmetros. Ambas han de ser utilizadas segn el protocolo de criopreservacin
diseado.
Una mesa lo suficientemente robusta constituye el soporte fsico de todo el
sistema. Est compartimentada, permitiendo as la ubicacin de los distintos
componentes.

Figura 4.1. Sistema Langendorff. Integra el sistema de perfusin

y del equipo de instrumentacin y monitorizacin.

ESI. Universidad de Sevilla.

24

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

4.2. SISTEMA DE PERFUSIN CON CONTROL INTEGRADO.

Este sistema forma parte de varios proyectos paralelos al que se presenta,
complementndose mutuamente en la construccin final del Langendorff. En particular,
permite al experimentador llevar a cabo la realizacin de un perfil diseado con
anterioridad para el protocolo de criopreservacin. De esta forma, se puede imponer en
cada instante la temperatura del fluido que se le inyecta al rgano adems de la
concentracin de crioprotector. Un esquema grfico se muestra en la figura 4.2 y consta,
principalmente de:
PC, encargado de controlar todo el proceso..
Software de programacin HP VEE versin 5.0.
Una tarjeta de adquisicin de datos de la casa Data Translation, junto con los
drivers que adjunta. Las caractersticas tcnicas se detallan en el captulo 5.
Circuitos electrnicos diseados para adaptacin de seal.
Cables de conexin.
Fuentes de alimentacin.
4 bombas peristlticas modelo Infusomat de Braun. Para el sistema de
inyeccin de flujo.
Congelador Zanussi C-20.
Sensores de temperatura. Para el sistema de control.
Sensores de flujo o caudalmetros. Para el sistema de control.
Eliminador de burbujas del interior del sistema de perfusin. Mediante
atrapador de burbujas.
4 baos de temperatura. Para el almacenamiento de los Krebs y
crioprotectores.
4 termostatos-calefactores. Para el control de los baos de temperatura.
Agitadores. Para acelerar los procesos de mezcla y disolucin.
Sistema de tuberas. Para la conduccin de los fluidos. Tubos Intrafix Air.

ESI. Universidad de Sevilla.

25

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

Cnula artica construida con acero inoxidable y extremo distal de tefln que
permite la conexin del corazn a travs de la aorta ascendente al sistema.
Carbgeno. Se usan bombonas de 13 litros de carbgeno (95% de 02 y 5%
de CO2) de Carburos Metlicos.
Oxigenador de fibra hueca marca TERUMO modelo CAPIOX 300.
Bolsas de PVC con capacidad volumtrica de 2 litros que se utilizan para la
administracin de lquidos de perfusin y posterior lavado del sistema con
agua bidestilada.
Recipientes. Para recogida de lquidos de perfusin.
Llaves de 3 pasos.

Figura 4.2. Esquema grfico del Sistema de Perfusin.

El funcionamiento del sistema es el siguiente:

1.- El experimentador disea el perfil deseado en Matlab y ,posteriormente, se
importa desde en un programa elaborado con HP VEE 5.0 (Hewlett Packard

ESI. Universidad de Sevilla.

26

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

Visual Engineering Enviroment). Dicho programa lee los datos y , en funcin de

stos, genera para cada instante una tensin de entre 0 V y 10 V (y 10 mA) en
cada una de las salidas analgicas de la tarjeta que controlan las 4 bombas.
2.- Estas seales, antes de actuar sobre las bombas, se manipulan para llevarlas a
los rangos de tensin (24 V) y potencia (30 W) necesarios para su correcto
funcionamiento.
3.- Cada bomba peristltica extrae el fluido contenido en cada uno de los 4
baos trmicos cuyo contenido es el siguiente:
Bao 1: Crioprotector (Polietilenglicol al 50%) a 10C.
Bao 2: Solucin de Krebs-Henseleit a 1C.
Bao 3: Crioprotector (Polietilenglicol al 50%) a 37C.
Bao 4: Solucin de Krebs-Henseleit a 37C.
Los baos a 37C estn formados por un nico depsito aislante de 55
litros de capacidad, cerrado y lleno de agua. En dicho depsito se encuentra
instalado un termostato calefactor, dos recipientes de vidrio (uno con
crioprotector y otro con la solucin de Krebs-Henseleit) y tres sondas trmicas
(una en el bao y las otras dos dentro de los contenedores de vidrio). Los baos a
10C y 1C son similares al anterior. La diferencia fundamental es que, ahora
hemos de usar dos depsitos aislantes (de 16 litros de capacidad cada uno), dos
termostatos calefactores (uno en cada recipiente), y sendos recipientes de vidrio.
Los dos depsitos-termo se ubican dentro de un congelador , separados por un
grueso tabique aislante. En lugar de agua, el bao se llena con una disolucin de
anticongelante para evitar su congelacin. Los termostatos son necesarios por un
doble motivo: en primer lugar, porque el tipo de termostato que tienen
incorporado los congeladores comerciales posee oscilaciones de temperatura por
encima de los 3C, que no est dentro de los objetivos de precisin. Con la
inclusin de los termostatos-calefactores se puede garantizar (ya se ha
comprobado experimentalmente en laboratorio) oscilaciones por debajo de
0.1C. Los termostatos-calefactores (marca Phyme) funcionan en el rango 20C
a 200C.
ESI. Universidad de Sevilla.

27

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

4.- Las cuatro salidas de las bombas se conectan a un nico inyector, por el que
sale el crioprotector a la temperatura y concentracin deseada en cada instante.
5.- Para corregir las eventuales prdidas trmicas y controlar la presin, antes del
punto de confluencia en el inyector, cada una de las salidas de las bombas lleva
el sensor correspondiente. La seal de estos sensores es convertida digitalmente
e introducida a la tarjeta de adquisicin de datos a travs de sus canales digitales
de entrada/salida.
6.- El programa de ordenador realiza las correcciones oportunas en funcin de la
lectura recibida, enviando de nuevo la seal renormalizada a las bombas y
cerrando el bucle.
7.- Este mismo sistema de perfusin es utilizado en la fase de recalentamiento en
fro hasta los 37C y limpieza de crioprotector, condiciones necesarias para su
funcionamiento.

4.3. SISTEMA DE INTRUMENTACIN Y MONITORIZACIN.

Este equipo permite monitorizar diversos parmetros durante el protocolo de
criopreservacin con el fin de comprobar el grado de recuperacin del rgano tras el
almacenamiento en fro y el posterior recalentamiento, as como almacenar todo el
proceso en soporte informtico para un posterior anlisis ms detallado. Est formado
por dos sistemas diferentes:

Registrador isovolumtrico de presin.

Recoge las medidas de presin en el interior del ventrculo izquierdo y, a
partir de ellas, calcula parmetros adicionales como el dP/dt. Los resultados se

ESI. Universidad de Sevilla.

28

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

muestran en tiempo real mediante el programa informtico CRYOCA

desarrollado para el proyecto y que adems permite su almacenamiento en
archivos para anlisis posteriores.

Registrador de electrocardiografa (ECG).

Muestra y almacena el funcionamiento elctrico del corazn utilizando el
mismo programa.

Este sistema se utiliza junto con el de perfusin, slo que ahora nicamente se
reperfunde con krebs a 37C para reanimar el corazn (figura 4.3).

Control flujo de gas

Control presin
de perfusin

Oxigenador

dP/dt max
Presin
media

Flujo
coronario

dP/dt min

Presin
de perfusin

Presin
ECG

Estimulador
270/min

Figura 4.3. Diagrama de bloques del sistema de recuperacin y monitorizacin.

Al ser parte fundamental y extensa del proyecto, se dedica todo el captulo 5

para el explicar el desarrollo completo de ambos sistemas.

ESI. Universidad de Sevilla.

29

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

4.4. PROTOCOLO DE CRIOPRESERVACIN.

Se sabe que los agentes crioprotectores son tanto menos txicos cuanto ms fro
est el rgano. Por ello se realiza una perfusin controlando la temperatura y las
concentraciones.
El montaje consiste en lo siguiente. En un ordenador se establece la temperatura
a la que queremos que est el rgano en cada instante y la concentracin de
crioprotector que debe contener en ese momento. El ordenador se encarga de dar las
debidas instrucciones al sistema de perfusin para que se inyecte en el rgano la
solucin con las caractersticas de temperatura y concentracin definidas en el paso
anterior. Un sistema de sensores monitoriza continuamente los parmetros que definen
estas propiedades sobre el rgano y la informacin se remite al ordenador que, tras
compararla con los objetivos tericos, realiza las modificaciones necesarias sobre el
sistema para ajustarse a lo deseado.
Despus de bajar la temperatura del rgano, se almacena durante 20 horas y,
posteriormente, se aplica un proceso inverso al anterior (lavado de crioprotector y
recalentamiento hasta 37C) para llevarlo a condiciones de funcionamiento cardaco. Se
utiliza el Sistema de Instrumentacin y Monitorizacin para llevar a cabo medidas de
esfuerzos y electrocardiografas que permiten observar el grado de funcionalidad del
rgano.
Por ltimo, se realiza un estudio histolgico para analizar la situacin final del
tejido cardaco.
Los sistemas basados en la adicin de crioprotectores (anticongelantes) estn
muy experimentados en diversas aplicaciones (esperma, piel, huesos, etc.) y cumplen
dos funciones: la primera, al aadirse a la clula, se aumenta la concentracin
intracelular provocando un descenso en el punto de congelacin; la segunda, las sales
intracelulares no estarn tan concentradas al aparecer tambin el anticongelante
disuelto, evitando que las concentraciones salinas lleguen a niveles demasiado txicos.

ESI. Universidad de Sevilla.

30

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

El xito del proceso de preservacin en fro depende de la capacidad para

optimizar todos los parmetros puestos anteriormente de relieve: la velocidad de
enfriamiento, la concentracin de crioprotectores, el tipo de crioprotector a utilizar, el
tiempo de almacenamiento, la temperatura ltima de almacenamiento, la forma de
recuperacin, etc. En la relativo a clulas en suspensin la situacin actual es bastante
buena, y se puede conservar con xito un conjunto importante de tipos de clulas. En lo
que se refiere a la conservacin de tejidos y rganos, los principios de conservacin en
fro son los mismos que los aplicables al caso de clulas aisladas. Sin embargo, desde el
punto de vista tcnico aparece una dificultad aadida que hace que esta empresa sea an
ms complicada: el hielo extracelular en experimentos con tejidos es un problema, ya
que a diferencia que para clulas aisladas, al crecer los cristales de hielo extracelular,
stos no pueden desplazar a las clulas hacia otros lugares libres, por lo que las acaban
destruyendo.
Por lo tanto, para la conservacin de tejidos y rganos, la formacin de hielo
extracelular se convierte en un problema que no se resuelve nicamente con la adicin
de crioprotector debido a la conductividad trmica finita del rgano. Cuando se calcula
la concentracin de crioprotector necesaria para evitar la formacin de hielo, se
comprueba que est entono a 8 molar si el rgano es enfriado desde su periferia
(prctica habitual), cantidad que resulta demasiado txica para el caso de los
crioprotectores convencionales. Por otra parte, con esta prctica aparecen fuertes
gradientes de temperatura que hemos de evitar. Todo ello conlleva casi necesariamente
hacer una perfusin a travs del sistema vascular; sera conveniente introducir el
crioprotector de forma controlada, debido a que ste es tanto menos txico cuanto ms
fro est el rgano. Para hacer un diseo del protocolo de conservacin en fro resulta
fundamental conocer de antemano el campo de temperaturas que presentar el rgano,
pues de otra forma, la gran cantidad de parmetros experimentales hara imposible
optimizar el proceso. Adems, parece lgico pensar que el diseo de crioprotectores de
baja toxicidad, gran penetracin

elevada temperatura de vitrificacin ayudara

enormemente.
Los experimentos de instrumentacin y monitorizacin expuestos en el captulo
6 se han realizado tras la aplicacin del siguiente protocolo diseado para corazones de
ESI. Universidad de Sevilla.

31

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

conejo blanco de Nueva Zelanda, segn la normativa internacional vigente en materia

referente a animales de laboratorio, en particular, segn el texto Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals elaborado por el Insitute of Laboratory Animal
Resources y publicado por el National Institute of Health (NIH publicacin n. 8623, revisado en 1.985):
1.-El animal es anestesiado con 100 mg/kg de pentobarbital sdico.
2.- Se anticoagula inyectando en la femoral heparina sdica al 5% [Rovi, 5.000
U.I.].
3.- Mediante una esternotoma media se extrae el corazn rpidamente,
sumergindolo en una solucin de Krebs-Henseleit (composicin de la solucin
en milimoles por litro: NaCl 118.3, KCl 4.8, MgSO4 1.2,KH2PO4 1.2,CaCl2 2.5,
NaHCO3 25.0, glucosa 11.0, 316 mOsm, pH 7.4 (Sigma)) a 4C.
4.- El corazn es conectado al sistema de perfusin canulado por la aorta,
contenido en una bolsa de PVC (Stemflex, modelo MSE 2204 DU) que permite
tanto la entrada por la aorta como la circulacin exterior de la solucin (dentro
de la bolsa) gaseando con carbgeno (95% O2, 5% CO2) inicialmente a 37C,
con un flujo de 25ml/min. Esta fase se mantiene durante 15 minutos (periodo de
estabilizacin).
5.- Se inicia el proceso de criopreservacin. De forma controlada y mediante la
ejecucin del perfil de conservacin diseado se aumenta la concentracin de
crioprotector al mismo tiempo que se hace descender la temperatura. Esta fase
dura 20 minutos, aunque este tiempo es uno de los parmetros experimentales.
Cuando se alcanza la temperatura y concentracin deseadas, el corazn se
introduce en el bao trmico, que se encuentra a la misma temperatura que la
mnima alcanzada en el proceso de perfusin.
6.- Se procede a un tiempo de almacenamiento de 20 horas en estas condiciones.

ESI. Universidad de Sevilla.

32

Captulo 4.

El Sistema Langendorff.

7.- Se reperfunde el rgano, disminuyendo la concentracin existente de

crioprotector hasta su eliminacin y aumentando la temperatura hasta los 37C,
en la cual el corazn ha de volver a funcionar. Esta fase dura tambin 20
minutos, aunque tambin es uno de los parmetros a estudiar.
8.- El corazn se estabilizado a un ritmo cardaco alrededor de 130 pulsaciones
por minuto.
9.- Se introduce el baln en el ventrculo izquierdo del miocardio a travs de la
aurcula izquierda y la vlvula mitral y se conectan los tres electrodos del
electrocardigrafo digital. Se miden estos parmetros basales.
10.- Se desconecta el corazn del sistema de perfusin, se extrae tejido del
miocardio y se realiza un anlisis mediante microscopa electrnica.
11.- Se comparan estadsticamente los resultados entre el grupo experimental de
control mediante una t de Student de dos extremos.
La eleccin de este protocolo inicial se basa en la experiencia de otros
investigadores. Sin embargo, dada la gran cantidad de variables y parmetros a
controlar, puede ser revisado a medida que se obtengan los resultados de las distintas
pruebas.

ESI. Universidad de Sevilla.

33