UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

IV PRCTICA

CURVA DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS (LCTICAS)

CURVA DE SNTESIS DEL PRODUCTO (CIDO LCTICO)

I.

OBJETIVO
Estudiar la curva de crecimiento de bacterias lcticas y al mismo
tiempo construir la curva de sntesis de acido lctico.
Comparar los resultados de una cepa con fecha de vencimiento
vencida con una de fecha no vencida.

II.

FUNDAMENTO TERICO

LACTOBACILLUS BULGARICUS:
A diferencia de otras bacterias de aplicacin industrial, los lactobacilos son
exigentes en cuanto a los nutrientes que necesitan para multiplicarse, pues
adems de azcares (fuente de energa) y sales minerales, que aportan
elementos como nitrgeno, fsforo y potasio, deben proporcionarse protenas,
aminocidos y vitaminas.
Es importante mencionar que la seleccin del medio en el que se cultiven, debe
basarse en los requerimientos de cada especie, en su capacidad para
mantener el crecimiento microbiano y alcanzar conteos finales de clulas
adecuados al proceso de que se trate, por ejemplo obtencin de probiticos,
as como del costo pues esto repercutir en el del producto. Un medio que se
usa frecuentemente es la leche descremada, la que provee de varios nutrientes
a las bacterias lcticas. Sin embargo no resulta del todo adecuada para escalas
industriales pues debe pasteurizarse, puede generar slidos que dificulten la
recuperacin de las clulas microbianas y en general no se alcanzan conteos
mayores a 1 x 107 clulas/mL, que son valores bajos si se pretende tener
concentrados celulares ms altos puesto que deber trabajarse entonces con
fermentadores de ms volumen.

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Otro medio de cultivo adecuado para las bacterias lcticas es un preparado
comercial, conocido como MRS, que

contiene

protenas hidrolizadas

provenientes de diferentes fuentes, glucosa y sales (figura 2). En ste se

alcanzan cuentas microbianas de hasta 1 x 1012 clulas/mL, dependiendo de
la especie, pero su elevado costo lo hace poco apto para volmenes
industriales.

Figura 2. Siembra en nivel de laboratorio en agar MRS y micrografa de

bacterias cido lcticas

El medio de cultivo puede disearse de acuerdo al objetivo del proceso, es

decir, si se desea obtener biomasa microbiana o algn producto como cido
lctico o bacteriocinas. En general los nutrientes que debe incluir un medio
para bacterias lcticas se dividen en cuatro grupos:
1. Nutrientes complejos como extracto de levadura, licor de maz,
hidrolizados de protenas de soya, casena o suero de leche. Tambin se
incluyen aqu la leche descremada y los concentrados de suero de
leche.
2. Nutrientes simples que se subdividen en orgnicos como los azcares
(glucosa, lactosa, sacarosa) y vitaminas. Los inorgnicos incluyen las
sales que aportan elementos como fsforo, potasio, nitrgeno, azufre,
etc.
3. Amortiguadores o buffers.

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4. Antiespumantes para reducir la espuma formada como resultado de la
agitacin y de las protenas presentes, usualmente se utiliza silicn.
Como se mencion anteriormente los componentes del medio se eligen no
solamente por el aporte de nutrientes al microorganismo sino tambin por su
estado fsico (slidos en suspensin, concentracin, etc.), la disponibilidad
durante el ao y el precio.
Adems del medio de cultivo hay otros aspectos que influyen en el crecimiento
de los lactobacilos, como son la temperatura, el pH, el oxgeno presente en el
medio y la sal que se utilice para neutralizar el cido formado al crecer las
bacterias. La temperatura a la que se efecte el cultivo est relacionada con el
valor ptimo para el crecimiento, si son mesfilas o termfilas, por ello puede
variar desde 26 a 42C aproximadamente, para las cepas mas importantes en
la industria.
La aeracin no es un factor limitante en el cultivo de bacterias lcticas en
fermentadores, puesto que stas se consideran microaeroflicas y no toleran
altas concentraciones de oxgeno. Nuevamente esto es variable para cada
especie pues en algunos casos el oxgeno promueve el crecimiento
microbiano,

como

sucede

con

Lactobacillus

plantarum,

Leuconostoc

mesenteroides y Lactobacillus delbrueckii. Tambin la produccin de cido

lctico puede estimularse en Lactobacillus helveticus por medio de la
alimentacin de aire.
El pH inicial del medio de cultivo puede ajustarse sin mayor problema pero
conforme transcurre la fermentacin la produccin de cido lctico provoca que
descienda. Hay un efecto inhibitorio en el crecimiento de los microorganismos
por lo que el pH se controla mediante la adicin de neutralizantes, que
usualmente son bases como el hidrxido de sodio o de amonio. Existen
diversos reportes en la literatura sobre el efecto de las diferentes bases en el
desarrollo de las bacterias, en general se considera que el hidrxido de amonio
es mejor como agente neutralizante.

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Finalmente el equipo en el que se llevan a cabo estos procesos son
fermentadores convencionales, con agitacin mecnica y sistema de control de
temperatura. Deben contar con chaqueta o serpentn para poder esterilizarlos
dado que los medios de cultivo son ricos en nutrientes y por consiguiente se
contaminan fcilmente. Si se alimenta aire tambin este se esteriliza por medio
de filtros. El volumen de los fermentadores depende el propsito del cultivo de
las bacterias lcticas, si el objetivo es producir clulas o cido lctico, por
ejemplo, de la cantidad deseada y de los rendimientos.
Un proceso tpico parte del cultivo conservado ya sea en caja Petri o en tubo de
ensaye con un medio slido (v.g. agar MRS), una etapa de propagacin en
tubo o matraz y etapas de pre inculo e inculo para el fermentador de
produccin. El nmero de pasos lo determinan el volumen de ste as como el
porcentaje o la concentracin inicial de clulas que constituyen el inculo. En la
siguiente figura se ejemplifica lo anterior, en la produccin de cido lctico.

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Se sabe que las bacterias se dividen por fision binaria, la celula madre al
alcanzar un determinado volumen

RELACIONES ENTRE VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TAMAO

CELULAR
Es fcil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto ms rico es un
medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao
medio de las clulas.
1.

bacterias creciendo en un medio relativamente pobre

(supongamos que en este medio g=60 min, C+D=g);

2.

si transplantamos una clula recin dividida procedente del

cultivo anterior a un medio ms rico (por ejemplo, que permite un tiempo de
generacin g=35 min) podemos observar que:
a. la primera divisin ocurre C+D (60 minutos) despus; es decir, con un
tiempo idntico al que tena en el medio anterior;
b.

pero como en este medio g=35 min, la iniciacin de

una nueva ronda de replicacin ocurre antes de dicha replicacin
celular (es decir, C y D se superponen);

c.

se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con

un tamao celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio
(tras la divisin celular) mayor, alterndose igualmente el tiempo de
inicio.

III.
-

MATERIALES
Un vaso de precipitado de 1 lt. Estril

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-

Pipetas de 10, 5,5,1 ml.

Placas Petri

Tubos de ensayo.

Cepas de Lactobacillus.

Agar Rogosa

Equipo de incubacin anaerbica

Equipo para determinacin de acidez titulable.

IV.

PROCEDIMIENTO

Sembrar la leche con Lactobacillus. Incubar a 43C. Controlar el proceso de

fermentacin. Realizar las siembras y titulaciones necesarias.
Utilizar una cepa con fecha de vencimiento recientemente vencida. Comparar
con los resultados anteriores. Graficar los resultados vs. Tiempo.

TABLKA N1: Resultados de cepas con fecha de vencimiento no vencida

N
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Hora de anlisis
10:25
11:05
11:30
12:03
12:36
13:08
13:40
14:20
15:00

D (acidez)
18
20
21
30
43
50
55
60
60

Recuento

de

Ufc/ml
16*105
42*105
70*105
75*105
85*105
110*105
220*105
530*105

TABLA N 2: Curva de crecimiento de bacterias lcticas. (bioflora ,cepa

comprada en Tienda Bocchio donde estuvo congelada). Con fecha de
vencimiento 2014

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Hora

D Produccin de cido Recuento

lctico

bacterias

lcticas ufc/ml de leche

(X).------x106

9:05
9:40
10:20
11:00
11:40
12:20
13:00
13:50
14:20

18
18,5
20
32
50
64
72
78
80

1000000
0
1000000
4000000
6000000
17000000
34000000
68000000
75000000

Nota: La leche se tuvo que recalentar a las 11 :00 a 43 C . La temperatura

ambiente = 15-17 C, obteniendo buen resultado. En un inicio la temperatura
de incubacin era de 37-39 C, lo cual impidi el buen desarrollo.
CLCULOS:
Para la tabla n 1 tenemos:
X
10:25

Y
18

Ln de Y
2,8903717

11:05

20

6
2,9957322

11:30

21

7
3,0445224

12:03

30

4
3,4011973

12:36

43

8
3,7612001

13:08

50

2
3,9120230

13:40

55

1
4,0073331

60

9
4,0943445

14:20

6
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15:00

60

4,0943445
6

Grfico n 1:

Ln X
tiempo vs. Ln D

TIEMPO

De este primer grafico podemos decir que la cepa produjo su mxima cantidad
de acido lctico rpidamente hasta las 12:36 y se fue equilibrando en el punto
(Y 55) y a partir del penltimo tiempo medio hasta el ltimo este se mantuvo
constante.
-

Para hacer la comparacin tambin obtuvimos un grfico para lo que es

la segunda tabla:
X
10:25
11:05
11:30
12:03

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Y
1600000
4200000
7000000
7500000

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12:36
13:08
13:40

8500000
11000000
2200000

14:20

0
5300000

15:00

0
0

Obtenindose en Excel el grafico n 2: Tiempo vs. Cant. De producto.

Tiempo vs. producto

Tiempo vs. producto

Linear (Tiempo vs.
producto)

Producto

f(x) = 121115808.67x - 51045187.18

R = 0.22

Tiempo

Del grfico se puede deducir que de acuerdo al lineamiento que tiene la curva
se puede decir que a horas 13:40 hasta la 14:20 se dio la mayor produccin de
ufc/ml de parte de la cepa. En tal caso a este periodo se le denominara el
periodo de crecimiento exponencial.
K=

(PinicialPfinal )
( Tiempo finalTiempoinicial ) (Xm )

Xm=

Xm=

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Xf Xi
2

5300000+ 1600000
2
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Xm=3450000

K=

(1865)
( 3 :0010 :25 ) (3450000)

K=1.879 106

Para la segunda muestra con fecha de vencimiento 2014 se tiene que,

de la primara tabla para esta muestra es:
X

9:05

18

9:40

18,5

10:20

20

11:00

32

11:40

50

12:20

64

13:00

72

13:50

78

14:20

80

ln
2,890371
76
2,917770
73
2,995732
27
3,465735
9
3,912023
01
4,158883
08
4,276666
12
4,356708
83
4,382026
63

Y el grafico correspondiente a este es:

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ln del producto

Tiempo vs. Ln
producto

Tiempo

Para hacer lectura de la cantidad de bacterias desarrolladas en cada tiempo

tomado tambin se hizo:
X

9:05
9:40
10:20
11:00
11:40
12:20
13:00
13:50
14:20

1000000
0
1000000
4000000
6000000
17000000
34000000
68000000
75000000

Cuyo grafico en Excel nos arrojo: Tiempo vs. Ufc/ml

De lo que se desprende que la mayor produccin denominada logartmica est

entre el antepenltimo y penltimo punto; despus de este como que cesa un
poco el crecimiento.
K=

(PinicialPfinal )
( Tiempo finalTiempoinicial ) (Xm )

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Xm=
Xm=

Xf Xi
2

75000000+1000000
2
Xm=38000000

K=

(1880)
( 2 :209 :05 ) (38000000)

K=2.38187 10

V.
-

CONCLUSIONES
Se desarrollaron las curvas de desarrollo de cepa as como tambin la
produccin de acido lctico a partir de dos cepas del mismo gnero sino
que

de

diferentes

fechas

de

vencimiento;

siendo

su

nombre

Lactobacillus.
-

Al comparar las graficas de produccin de acido lctico nos podremos

dar cuenta que la relacin que guardan son muy similares por lo que no
se encuentra diferencias en ello entre la cepa de fecha de vencimiento
no vencida con la cepa que vence el 2014.

Para el caso desde crecimiento o desarrollo exponencial manifestado en

ufc/ml se traduce de comparar ambos ltimos grficos de cada tabla: En
la cepa de fecha de vencimiento no vencida este desarrollo ptimamente
hasta un penltimo punto y luego descendi bruscamente quizs porque
se dio la muerte progresiva de la cepa. Para el segundo caso, el
desarrollo de la cepa tambin fue bueno e incluso al tomar el ltimo
tiempo se mostraba crecimiento aunque en el inicio se retraso un poco

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debido a que se dieron con la sorpresa que al traerla de la estufa al
laboratorio para sembrarla esta haba sufrido un enfriamiento y se debi
de nuevo calentar la leche. La actividad especfica de las cepas (K)
resulta para cada uno de la siguiente manera:

Cepa1: 1,879*10-6

Cepa 2: 2,38*10-7

Lo que nos dice que la segunda cepa tuvo menor actividad especfica.

VI.
-

BIBLIOGRAFA
http://www.hablemosclaro.org/Temas/5/40/Producci
%C3%B3n_de_Bacterias_%C3%81cido_L

%C3%A1cticas#.VGYnxsV5OE4
fuente.uan.edu.mx/publicaciones/03-07/1.pdf
https://micro.cornell.edu/.../fisin-binaria-e-otras-formas-de-reproducco...

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