Informe de TP 7.

IBCM
Grupo N 1

Informe de Trabajo Prctico N 7:

Extraccin y anlisis de lpidos por cromatografa
en capa fina de una muestra biolgica.

Asignatura: IBCM, Comisin B.

Profesor a cargo: Dr. Mariano R. Gabri.
Profesores instructores: Dra. Fernanda Rubio y Dr. Andrs Romanowski.
Alumnos: Vera, Mara.
Grupo N1

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Resumen:
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El objetivo del presente trabajo fue obtener distintos extractos de lpidos a partir de tejidos
biolgicos, para esto se realiz una extraccin de Bligh and Dyer. Luego se determin el peso total
de lpidos obtenidos de cada muestra, en una muestra de hgado de 0,2 grs se encontr un peso
total de lpidos de 0,03 grs. Posteriormente se realiz el sembrado de las muestras lpidos en una
placa cromatogrfica para separar e identificar los componentes de las mezclas lipdicas, en las
muestras se observ la presencia de triglicridos, cidos grasos, diglicridos y esteres de
colesterol. Finalmente se compar los perfiles lipdicos de los tejidos y se llego a la conclusin de
que los tejidos con mayor concentracin de lpidos eran los de hgado, pulmn y corazn, a
diferencia del tejido de cerebelo que contena menor concentracin de lpidos.

Introduccin:
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Los lpidos constituyen el segundo grupo fundamental de compuestos orgnicos encontrados en la

materia viva. Como los hidratos de carbono, son compuestos de tomos de carbono, hidrgeno y
oxgeno. Son un grupo muy diverso pero que comparten una caracterstica comn: son solubles en
disolventes orgnicos y no en agua, en este principio se basa la extraccin de lpidos en tejidos
biolgicos. Dentro de este grupo existe un gran nmero de sustancias qumicas distintas: cidos
grasos, triacilgliceroles, fosfolpidos, esteroides, prostaglandinas y vitaminas liposolubles entre
otros.
Al igual que en el resto de biomolculas estudiadas, los mtodos de determinacin y cuantificacin
de los lpidos se fundamenta en sus propiedades diferenciales respecto al resto de biocompuestos.
En el caso de los lpidos su propia definicin indica cmo pueden determinarse los lpidos totales,
ya que engloba a todos los compuestos solubles en disolventes orgnicos.
El estudio de una clase concreta de lpidos requiere su fraccionamiento por tcnicas de separacin
fundamentadas en mtodos que permiten discriminar entre los distintos tipos de lpidos,
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normalmente por diferencia en el grado de polaridad. As, tcnicas separativas tales como la
cromatografa, en sus diferentes vertientes, son de gran utilidad para estudiar y fragmentar las
distintas clases de lpidos.
Extraccin de lpidos de una muestra biolgica:
Los lpidos de una muestra biolgica se pueden extraer tratndola con mezclas de disolventes
orgnicos en proporciones variables. El mtodo de Bligh & Dyer utiliza una mezcla de cloroformometanol, en proporcin 2:1 (v/v). Los lpidos extrados se encontrarn mayoritariamente en la fase
clorofrmica y las sustancias hidrosolubles en la fase acuosa, separndose con facilidad ambas
fases por centrifugacin. Si tomamos la fase clorofrmica y eliminamos el cloroformo por
evaporacin, quedar en el tubo el extracto de la mezcla de lpidos que contiene la muestra
biolgica de partida.
Separacin de las distintas especies lipdicas mediante cromatografa en capa fina (TLC):
La cromatografa es una tcnica que se utiliza para separar e identificar los componentes de una
mezcla. Se basa en el reparto de cada compuesto entre una fase mvil y una fase estacionaria. El
reparto se produce sobre la fase estacionaria, que tiende a retener el compuesto por adsorcin. La
fase mvil discurre a travs de la fase estacionaria y tiende a arrastrarlo (desorcin). Los
componentes de la mezcla se separan porque responden de forma distinta a las fuerzas de
adsorcin/desorcin. En la TLC la fase estacionaria es silicagel y la fase mvil una mezcla de
disolventes (eluyente). El eluyente se selecciona de acuerdo con los lpidos que se desean separar:
los lpidos neutros se separan con eluyentes apolares y los lpidos cargados con eluyentes polares.
Cada lpido migra a una distancia caracterstica en funcin de su polaridad que le hace identificable
al compararlo con patrones.

Metodologa Experimental:
Extraccin de Lpidos:
Para la extraccin de los lpidos se tom una muestra de tejido de hgado de 0,2 grs y se la coloc
en un eppendorf pesado previamente, se agreg 600 l de metanol y se homogeneiz, luego se
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agreg 300 l de cloroformo (relacin cloroformo Cl3CH:H2O = 2:1:0.8). Posteriormente se agit la
muestra durante 30 min (4C). Se agreg 300 l cloroformo, se agit y centrifug a 10000 rpm 5
min; se pas el sobrenadante a un nuevo eppendorf ya pesado. Despus se agreg 300 l de agua
(relacin cloroformo:Cl3CH:H2O = 2:2:1.8). Se centrifug a 5000 rpm, 10 min. Se separ la fase
acuosa de la orgnica que contena los lpidos.
Cuantificacin de lpidos totales:
A partir de la fase clorofrmica se realiz el pesaje de lpidos luego de dejar evaporar el solvente.
Cromatografa en capa fina (TLC) para evaluar las distintas fracciones lipdicas presentes:
Se realiz el sembrado de las muestras lpidos (fase clorofrmica) en una placa para cromatografa
en capa fina con silicagel 60 G previamente activada y se dej secar la placa. Luego se coloc la
placa en una cuba saturada con solvente y se dej correr hasta que el frente avance una distancia
fijada.
Luego se retir la placa y se la dej secar. Se revel la placa con yodo slido en una cuba
saturada. Se sac la placa y se marc con lpiz los contornos de las manchas obtenidas.

Resultados:
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Cuantificacin de lpidos totales:

Se obtuvo una masa de 0,03 grs de lpidos totales a partir de una muestra de hgado de 0,2 grs.
Cromatografa en capa fina (TLC) de muestras de lipdicas:

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Triglicridos

Ac. Grasos libres

Diglicridos
Esteres de colesterol

Punto de siembra
1

Fosfolpidos

Se sembr una gota de muestras en el siguiente orden: 1. hgado; 2. Corazn; 3. hgado; 4. pulmn; 5. Cerebelo.

Discusin y conclusin:
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En funcin de los datos obtenidos, se realiz la siguiente discusin sobre los mtodos utilizados:
Se decidi que el mejor mtodo para extraer lpidos de tejidos musculares era el de Bligh & Dyer ya
que es una tcnica sencilla y rpida, que se basa en las propiedades de todos los lpidos
(solubilidad en solventes orgnicos pero no en agua). Los lpidos extrados se encontraron
mayoritariamente en la fase clorofrmica y las sustancias hidrosolubles en la fase acuosa.
Para la separacin de la mezcla lipdica se realiz una cromatografa en capa fina (TLC) que es un
mtodo simple y rpido ya que logra una buena separacin en poco tiempo, adems los resultados
son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos.
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Cuando se realizaron las extracciones de lpidos es posible que se haya hecho una mala
homogenizacin de las muestras produciendo un aumento de la desviacin de los resultados y
restando confiabilidad a los datos obtenidos, haciendo que las muestras puedan aparentar una
mayor o menor concentracin de la deseada.
Para una muestra de lpidos (la N1 correspondiente a un extracto de tejido de hgado de ratn) se
obtuv un peso seco de la muestra de 0,03 grs partiendo de un tejido de 0,2 grs, comparando con
el resto de muestras los valores obtenidos fueron muy similares, teniendo en cuenta que todas las
muestras provenan de una masa de 0,2/0,3 grs.
Al observar la distribucin de cada una de las bandas de las muestras se determin que haba
muestras que tenan una mayor cantidad de lpidos ya que se pudo detectar bandas ms intensa a
pesar que se haban sembrado los mismos volmenes para cada muestra. Por ejemplo se observ
mayor concentracin de triglicridos en hgado y pulmn; una concentracin de cidos grasos muy
similar en todas las muestras; una concentracin de diglicridos mayor en hgado y corazn; por
otra parte los esteres de colesterol estuvieron ms presentes en las muestras de hgado y
cerebelo.
Adems en la cromatografa se observ que hubo dos bandas correspondientes a los triglicridos
para las muestras de hgado, corazn y pulmn, esto puede deberse a que hay diferentes
triglicridos con mayor o menor polaridad.
Se concluye que es posible realizar una extraccin de lpidos basndose en sus propiedades
qumicas. Adems de una efectiva separacin de los lpidos por una TLC con una mezcla de
solventes, se observ que los lpidos migraron a una distancia caracterstica en funcin de su
polaridad. Verificndose que los lpidos ms polares quedaron ms retenidos puesto que se
adsorbieron ms firmemente a la fase estacionaria, mientras que los no polares se eluyeron con
mayor facilidad. En la TCL no se utiliz un patrn por lo cual no pudimos realizar un anlisis ms
exhaustivo de los resultados de la separacin, pero a partir de las predicciones tericas pudimos
detectar las bandas de lpidos esperadas.
Adems se pudo determinar los perfiles lipdicos de las muestras analizadas, por ejemplo se pudo
ver que las clulas cerebrales contienen menor concentracin de lpidos a diferencia de las de
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corazn, hgado o pulmn ya que en estas ltimas tienen ms concertacin de lpidos como por
ejemplo los triglicridos y diglicridos.

Bibliografa:
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- Alberts, Bruce, Molecular Biology of the Cell.5th ed. Garland Publishing, New York (2010).
- Apuntes de la materia.
- Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Damell J. Molecular Cell Biology,
1995, Scientific American Books.
- Jos Flix Patio Restrepo, Metabolismo, Nutricin y Shock, 4ta ed. Ed. Mdica
Panamericana, Colombia (2006).