La ausencia de sealizacin de la insulina en el corazn induce cambios en

potasio
canal de expresin y la repolarizacin ventricular
Anglica Lpez-Izquierdo, 1 Renata O. Pereira, 2,3 Adam R. Wende, 2,4 Bonnie
B. Punske, 1 E. Dale Abel, 2,3
y Martin Tristani-Firouzi1
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Instituto de Investigacin y Formacin de
la Universidad de Utah, Salt Lake City, Utah; 2Program
en Medicina Molecular y de la Divisin de Endocrinologa, Metabolismo y
Diabetes de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Utah;
3Fraternal Order of Eagles Diabetes Centro de Investigacin y de la Divisin de
Endocrinologa y Metabolismo, Roy J. y Lucille A.
CarverCollege of Medicine, Universidad de Iowa, Iowa City, Iowa; y 4Molecular y
Patologa Celular del Departamento de
Patologa de la Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, Alabama
Enviado 28 de octubre 2013; aceptados en forma definitiva 24 de diciembre
2013
Lpez-Izquierdo A, Pereira RO, Wende AR, Punske BB, Abel ED,
Tristani-Firouzi M. La ausencia de sealizacin de la insulina en los induce al
corazn
cambios en la expresin del canal de potasio y la repolarizacin ventricular. am
J Physiol Corazn CircPhysiol 306:. H747-H754, 2014 Publicado por primera vez
27 de diciembre 2013; doi: 10.1152/ajpheart.00849.2013.-Diabetes mellitus
aumenta el riesgo de disfuncin cardaca, insuficiencia cardaca, y repentina
la muerte. La amplia gama de cambios neurohormonales asociadas con
diabetes plantean un desafo a la comprensin de los roles de concreto
vas que alteran la funcin cardaca. Aqu, nosotros usamos un modelo de ratn
con
eliminacin de cardiomiocitos con restriccin de receptores de insulina (CIRKO,
cardacasknockout especfico del receptor de insulina) para estudiar los efectos
especficos de
deterioro de la sealizacin de la insulina en la repolarizacin ventricular
cardiaca, independiente
de los trastornos metablicos asociados con generalizadas
la diabetes. Deterioro de la accin de la insulina caus una reduccin en el
ARNm y
la expresin de protenas de varios K clave? canales que dominan ventricular
repolarizacin. Especficamente, los componentes de transitoria hacia afuera
K?
actual componente rpido (Ito, rpido; Kv4.2 y KChiP2) se redujeron,
coherente con una reduccin en la amplitud de Ito, rpido en aislados izquierda
miocitos ventriculares CIRKO, en comparacin con los controles de la misma
camada. la
reduccin en Ito, dio como resultado rpido en accin ventricular prolongacin
del potencial
y la prolongacin del intervalo QT en el ECG de superficie. Estos resultados
apoyar la idea de que la falta de sealizacin de la insulina en el corazn es
suficiente para causar las alteraciones de la repolarizacin descritos en otra

modelos animales de diabetes.

receptor de la insulina cardiaca; los canales de potasio; la repolarizacin
ventricular
Miocardiopata diabtica se asocia a disfuncin cardiaca,
tales como diastlico alterado y la funcin sistlica, adems
a los cambios estructurales y metablicos en el miocardio.
Disfuncin cardiovascular asociados a la diabetes puede conducir a
insuficiencia cardiaca, independientemente de la enfermedad de la arteria
coronaria y
hipertensin (3). La diabetes est asociada con un electrocardiograma
(ECG) alteraciones que pueden aumentar el riesgo de arritmias.
En concreto, la prolongacin del intervalo QT ha sido
reportado como consecuencia de un aumento de la accin ventricular
potencial (AP) duracin (APD) (6, 7). electrofisiolgico
los estudios han demostrado que una reduccin en K? repolarizacin corrientes
es responsable de la prolongacin de APD en los cardiomiocitos
aislado de animales diabticos (8, 15, 30). Especficamente, la atenuacin
del transitorio cardiaca activar rpidamente e inactivar
hacia el exterior de K? actual (Ito) subyace prolongacin APD en
tipo I y II modelos diabticos de una variedad de especies,
incluyendo perro, conejo, rata y ratn (15, 33, 34). En concordancia
con estos hallazgos, los genes y los niveles de protena de la
subunidades que forman poros de canal se redujo en los pacientes diabticos
corazones (20, 25).
Dos componentes Ito con la cintica de recuperacin distintos, denominados
a los componentes como rpidos y lentos de Ito (Ito, rpido e Ito, lento,
, respectivamente), se han distinguido en la mayora de las clulas cardacas
tipos (35). Ambos componentes de Ito se expresan diferencialmente
y contribuir a la heterogeneidad regional en las formas de onda de AP (5).
En miocitos de ratones, de Ito es altamente expresado y domina el
fase de repolarizacin, causando un AP abreviada, un tpico
funcin de estas clulas cardiacas (19, 21). Por lo tanto, de Ito tiene un
papel destacado en la repolarizacin ventricular cardiaca y
cambios en esta corriente pueden afectar significativamente la APD en murino
corazones (13, 21). Ito, canales rpidos son heteromultmeros, compuesto
de Kv4.2 y Kv4.3? subunidades. En contraste, Ito, canales lentos
estn codificadas por la?-subunidad Kv1.4 (5, 14). El citoplsmica
Protena KChIP2 es un componente esencial de Ito cardaca, rpido en la
que co-expresin con subunidades KCHIP modula la biofsica
propiedades y aumenta la expresin en la superficie celular de Kv4
canales (26, 37). Otros estudios sugieren que la expresin de Kv4
y protenas KChIP2 estn regulados recprocamente (9, 10).
Mientras que diversos modelos animales se han utilizado para caracterizar
las consecuencias funcionales de la diabetes en el corazn (3, 28, 36),
analizar los efectos especficos de sealizacin de la insulina en el corazn
de los efectos sistmicos de confusin de metabolismo alterado
(tales como la hiperglucemia y la hiperlipidemia) sigue siendo un desafo.
En este trabajo, se utiliz un receptor especfico del corazn de la insulina
knockout (CIRKO) modelo de ratn que nos permiti examinar

las consecuencias elctricos de sealizacin de la insulina ausente en el

corazn en los niveles de los animales moleculares, celulares y enteros. la
fenotipo cardaco de los ratones CIRKO se ha descrito previamente
e incluye una reduccin en el tamao del corazn y los cambios en
la utilizacin de sustratos cardiaca (2, 4, 27). Hay una modesta
reduccin de los ndices ecocardiogrficos de la funcin ventricular
(2, 4), aunque el gasto cardaco permanece normal (4). La modesta
reducciones en la contractilidad cardaca no conducen a la insuficiencia
cardaca.
MTODOS
Generacin Mouse. CIRKO ratones fueron generados por el cruce de ratones
que eran homocigotos para un alelo del receptor de insulina en el que floxed
sitios loxP flanquean el exn 4 del gen del receptor de la insulina (IRlox / LOX)
con
IRlox / lox ratones transgnicos con expresin especfica del corazn de la
recombinasacre
(dirigido por el promotor de la cadena pesada?-miosina). CIRKO
ratones tienen la Cre-IRlox/lox genotipo, y sus controles de camada
tienenel genotipoIRlox/lox[en lo sucesivo denominados de tipo salvaje (WT)
compaeros de camada], como en los estudiosdeAbel ycolegas(1, 2).
Anteriormente,
No se demostrarondiferencias en latolerancia a la glucosa, la captacin de
glucosa,
concentracin deinsulina ometablicassustratos,peso corporal/corazn, o
rendimiento contrctilentre los ratoneslox/lox(homocigotos loxP
ratones sinexpresincre)y los ratonesWT (1).
Clula de aislamiento. Ventricular izquierda(LV) miocitosse aislaron a partir
CIRKO(genotipo Cre-IRlox/lox) los ratones, ysus compaeros de camadaWTde
control
(genotipoIRlox/lox) (22-25 semanas de edad) por digestinenzimtica
se handescritoanteriormente en detalle(2, 28). En pocas palabras,despus dela
heparina
la inyeccin, los ratones se anestesiaroncon hidrato de cloral(1 mg / g
decuerpo
en peso) por inyeccin intraperitoneal. Se retir elcorazn, rpidamente
canulado, y luegoperfundidosretrgradamenteen unade Langendorffmodificada
aparato a travs dela aortacon la siguiente solucin: (en mM) 126
de NaCl; 4,4de KCl; 1MgCl2; 4NaHCO3; 10de HEPES; 302,3-butanodiona
monoxima; 5,5glucosa;1.8piruvato; 0.025de CaCl2(pH 7,3); y0,3
tipomg/ml de colagenasaIV(WorthingtonBiochemical). siguiente
colagenasa tipoIV-solucin que contiene, la pared libredel VI fue
disecadosy se tritursuavementeen la solucinKraftbruhehastacelular
disociacin. Miocitosaisladosse almacenaronen solucinKraftbruhe
a 4 C hasta su uso. Durantetodo elprotocolo de perfusin, lassoluciones
se mantuvieron a37C.Todos los animales procedimientosfueron aprobados por
laComisin de la UniversidadInstitucional Cuidado de Animalesy Uso

deUtah.
Grabacinde patch-clamp. Voltage-gated K?Se registraroncorrientes
entoda laconfiguracin de la celdadela tcnicade patch-clamp
usandoun amplificadorAxopatch200B(Molecular Devices,
Sunnyvale, CA). Todos los experimentos serealizaron a temperatura ambiente
(21-23 C). Potencialesde adquisicin de datosy de mandoeran
controladopor el softwarede ordenador pClamp8.0(Molecular Devices). parche
pipetasfueron hechas devidriode borosilicatocapilares(WorldPrecision
Instruments,Sarasota, FL), con una resistencia de2-3M?
cuando se llena conla siguiente solucininterna: (en mM) 135KCl,
1MgCl2, 10EGTA, 10HEPES; y5glucosa (pH 7,2). El bao
solucincontena (enmM) 136NaCl; 4de KCl; 1de CaCl2, 2MgCl2,
5CoCl2, 10HEPES, y10de glucosa(pH 7,4). Ito, rpido se registr
en presenciadetetraetilamonio(TEA; 25mM). Para la corrienteexperimentosde fijacin, CoCl2seomiten desolucin del bao.
Capacitanciacelular se midimediante la integracin delasuperficie de
el transitoriocapacitivaevocadosdurante?Pasos de voltajede 10mV.
La compensacin porla resistencia en serie(80%) y la capacitanciaeran
realizadopor va electrnica.Para cadapulso de prueba, la amplitud deIto
se midicomo la diferenciaentre elmximohacia afuera
actual y el nivelde corrienteal finaldel pulsodespolarizante.
Enlas grabaciones decorriente-clamp, APsmiocitosfueron grabados conel
Sistema de amplificacinAxoclamp-2A (AxonInstruments)en modopuente.
APsfueron desencadenados por2msde pulsocuadrado
dedespolarizacinintracelular
actuala 1 Hzy se registrandespus de alcanzar elestado estacionario.
Datos dePatch-clampse procesaron utilizandoClampfit10.2(Molecular
Dispositivos)y analizada enOrigen7.5(OriginLab, Northampton, MA).
Corrientesamplitudesfueron normalizadospara la capacitanciacelular (en
PapF? 1). Las fasesde desintegracin dela idaK?Se midieron lascorrientes
mediante el ajuste dela suma dedosfunciones exponencialesusando el
siguiente ecuacin:
y?t? ?ExpA1?? T /?1? ?ExpA2?? T /?2? ?B
dnde?es el tiempo,?1y?2 son lasconstantes de tiempo dedecaimiento de la
la inactivacin deK?corrientes, A1 y A2sonlas amplitudes delainactivacin
componentes de la corriente, y B esla amplitud de lade estado estacionario,
noninactivatingcomponentedel totalhacia el exteriorK?corrientes. la
Se determin ladependencia del voltajedela inactivacinen estado estacionario
deIto
por la normalizacin depicos de corrienteprovocados porlosimpulsos de
pruebacomoIto/Ito, mx
y se representacomo una funcindeacondicionadoVm. Lasrelaciones eran
montado enuna ecuacin deBoltzmannde la forma:
Ito/Itomax? 1/?1? exp? Vm? V1/2? /K?

dondeVmes el voltajeacondicionadoy V1/2yk sonlahalfmaximal

potencial deinactivaciny la pendiente dela curva, respectivamente.
Western blot yanlisis de PCRcuantitativaen tiempo real. la superficiede la
clula
preparaciones de membranase extrajerona partir de tejidoLVdeWT y
CorazonesCIRKO. Las muestras de tejidosutilizados enlaspreparaciones de
membrana
se congelaronrpidamenteen nitrgeno lquidodespus de la cosechade
rganos.Lostejidos
a continuacin,se homogeneizaronutilizando untampn de
homogeneizacinque contienesacarosa
un cctelinhibidor de la proteasaDetener yfosfatasa(Pierce,
Rockford, IL) y se centrifugaron durante20min a4000rpm. Elsobrenadante
fue transferido altubo deultracentrfugay se centrifug durante50
min a90.000rpm. La fraccin de membranasedimento resultante se
seresuspendieronen el ensayo deradioinmunoprecipitacinque contiene unHalt
proteasayfosfatasacctel inhibidory se almacen a?80C hasta que se
utilizar. El anlisis de transferenciaWestern se realizcomo se describi
previamente
(31). La concentracin de protenadecada una de lasmuestrassolubilizadasera
determinada usando el kitde ensayo de protenasMicroBCA (Pierce) con
albmina de suero bovinocomo el estndar. Para el anlisisde transferencia de
Western, las clulas
protena de membranaenriquecidase cargy se fraccionen un10%
Gel de SDS-poliacrilamida yse electrotransfirieronadifluoruro depolivinilideno
membranas, comandos, yseguido de incubacindurante la noche a
4C conuno de lossiguientesanticuerpos primariosmonoclonales. la
Los anticuerposutilizados fueron anti-Kv4.2, Kv4.3anti-, anti-Kv1.5, anti-KChIP2
[Universidad de California (UC), Institutos Davis/Nacionales de laSalud
(NIH) instalacinNeuroMab], en diluciones de1:200. azul de Coomassie
(Bio-Rad, Hercules, CA) se utilizcomo control de carga. Encuadernacin
primaria
anticuerpo se detectcon una dilucin1:10.000deanticuerpo de cabra antiratn
Alexa Fluor 680(Invitrogen) y de cabra anti-conejo 800(LI-COR
Biosciences,Lincoln, NE). La deteccin se realizmediante la medicin de
intensidad defluorescencia deanticuerpos secundariosutilizando elOdyssey
Sistema de imgenesde infrarrojos, y la cuantificacinse hizo consu
software que lo acompaa(versin3.0,LI-COR Biosciences).estbamos
incapaz de detectarcualquier sealen WTLVutilizando dosmonoclonalseparada
anticuerpos contraKv2.1(COOH-terminal y extracelularS1-S2
eptoposde bucle, respectivamente; UCDavis/ NIHinstalacinNeuroMab), a
pesar de
detectar una sealfuerteen cerebro de ratn(datos no mostrados). as

No hay msexperimentos se realizaronpara medirla protenaKv2.1.

Se consiguiel anlisis de PCRcuantitativa en tiemporealpara determinarla
niveles de mRNA expresinrelativade los genesque codificanKv4.2, Kv4.3,
KChIP2, Kv1.5, Kv2.1, y el ratnter-a-go-goenLVdeWT y
Corazones del ratnCIRKO. ARN fueextrado por medio dereactivoTRIzol
(Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificaron usandoelARN totalRNAeasy
Kit de aislamiento(Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el fabricantede
instrucciones. ARN(3
g) se sintetiza cDNA utilizandoSuperndice
IIItranscriptasa inversa(Invitrogen). Cuantitativo en tiemporeal PCR
se realiz conABIPrism7900HTReal-TimePCR System
(AppliedBiosystems, Foster City, CA) usando placas de384pocillos. SYBR
Mecolorante fluorescenteverde(Molecular Sondas-Invitrogen) se utiliz para
cuantificar losniveles de ARNmrelativos.Todas las reaccionesse realizaron en
por triplicado.Los niveles de transcripcinpara elgen de
mantenimientoconstitutiva
ciclofilinaproducto, tambinse midieroncuantitativamenteen cada muestra.
PCR datosse calcularoninicialmente comoel nmero de transcripcionespor
nmero demolculasde ciclofilina, ylosdatos se normalizarona la
valor medioPESO.
Registro de ECGde superficie. Registros de ECGde superficieestndarfueron
obtenido a partir de(22 a 25 semanas de edad) los ratones anestesiadosWT
yCIRKO.
ECGde superficiefueron registradasconelectrodos de platacolocados en el
piel enposicionesoptimizadaspara obtenergrabacionesde amplitudmxima.
Los datos fueron registradosy analizados medianteLabChart7Pro
software(ADInstruments, Colorado Springs,CO) yQT, QTc,
QRS, relaciones pblicas, ylos intervalos RRfueron determinados; valores
medios de
se reportanlos animalesindividuales.
El anlisis estadstico. Los resultados sepresentan como medias?SE.en total
experimentos, n representael nmero declulas. Prueba tde Student o
ANOVAse aplic para compararconjuntos de datosindividuales.Adosde cola
valor de probabilidadde 0,05(P0,05) se consider estadsticamente
significativo.
RESULTADOS
Ventricularprotenacanales Kvy los nivelesde mRNA fueron
disminuidaen los ratonesCIRKO. Hallazgos previosinformaron que
hacia el exteriorde K?corrientesse redujeronsignificativamente enCIRKO
los ratones(28). As,nos hemos centradonuestro anlisis enla expresin
los nivelesdelos genes que codificanelventrculomurinodirector
Canales Kv(Kv4.2, Kv4.3, KChIP2, Kv1.5, Kv2.1) enLV
tejido deCIRKOysucamadade controlcorazones(WT)
(22-25semanas de edad). Como se muestraen la figura. 1, la expresin de

mRNA
Kv4.2, uno de los componentesdeIto, rpido, se redujo en un? 80%
en ratonesCIRKO. Encontraste, el otro componentedeIto, rpido,
Kv4.3, se mantuvo sin cambiosen ratonesCIRKO. KChIP2, la
subunidadaccesoriodeIto, rpido, se redujo en un?50%. gene
expresin delassubunidades? formadores de porosdelainactivarlentamente
K? actual (IK, lento),Kv1.5yKv2.1, eran ambos
disminuidopor? 70%.
A continuacin se investigel efecto de laespecficacardiacaausente
sealizacin de la insulinaenlos niveles de protenasde los canales inicos. Se
realiz
Western blot deprotena de membranaenriquecidade clulasen
LVdeWT yCIRKOcorazones (Fig. 2). canalKv4.2
protenase redujo en? 50% en ratonesCIRKO(fig. 2). no
se encontrdiferencia enlos nivelesde membranaKv4.3entrePESO
y corazonesCIRKO. Los niveles de protenadeKChIP2disminuyeron
por?40% en los corazonesCIRKOcomparacincon el WT. Adems,
Kv1.5banda densidadesde membranase redujo en?50% en
CorazonesCIRKO. Estos resultadosparalelasla disminucinen el ARNm
expresin.
Reducidohacia afueraK?corrientesen ratonesCIRKO. En el ratn
miocitosventriculares, diverso voltaje-gated K? corrientestienen
sido identificados, que son cinticamentey farmacolgicamente
distinta(35): Ito, rpido, Ito,,IK, de estado estacionariolento ylentohacia el
exterior
actual (ISS). Ito, rpido e Ito, lento sonresistentes a la exposicinTEA
(25 mM), mientras que tanto IK, lento yIssse reducenpor?60%.
As,se analiz laactualqueda despus de25mMde TEA
(Fig.3). Hacia el exteriorde K?corrientesfueron
provocadospordespolarizaciones4-s de paso
entre? 40 y?60mV, desde un?70mV
potencial de mantenimiento. Tantoel picode salida de K?densidades de
corriente
(Fig.3B) yla corrienteal finaldel pulso(fig. 3C) eran
disminuidoen ratonesCIRKO. La densidad de corrientepico a?40
mVse redujo significativamente enCIRKO(52? 2), en comparacin
conmiocitosWT (16? 3, n?5, *P0,05). Como se inform
previamente(35), lasfasesde desintegracin dela idaK?corrientes
evocadodurantepulsosde despolarizacinlargosestn bien descritospor
la suma dedos exponenciales. Nuestros datosfueron descritos porel
suma dedos exponencialesen presencia de25mMdeTEA
(significa?SE).constantes de tiempode inactivacin(? decaimiento) en PESO
miocitosfueron395? 14 y36? 1ms. Estos valoresde decaimiento?
nofueron significativamente diferentes delos miocitosCIRKO: 349?

11y37? 1ms, respectivamente. Anlisisde las fasesde desintegracin

estn representadosen la figura. 3D.
Enlos prximosexperimentos, se determin si la ausencia
de la sealizacin dela insulinacardiacoalterado laspropiedades biofsicas
deIto, rpido. La Figura4compara ladependencia de voltajedeestado
estacionario
la inactivacindeIto, rpido en miocitosLVaisladode WT
y los ratonesCIRKO. Las corrientes seexaminaron usandoun voltaje
pasosprotocolo?50mVdespus de5sprepulsosacondicionadopara
potencialesentre?100 y?10mV. Las amplitudes de
Ito, rpido en WTyCIRKOse determinarona partir deun nico
ajuste exponenciala las fasesde desintegracin delascorrientes evocadasen
?50mV delpotencial decadaprepulsoy luegonormalizada a
su respectivaamplitud de la corrientemximaevocadaa partir de?100
mV(en la misma celda). NormalizadoIto, amplitudesrpidoseran
trazadacomo una funcindepotencialacondicionadocomo se ilustra en
Higo. 4B yequipadaconuna nica funcinde Boltzmann. NiV1/2
nikse altersignificativamenteen los miocitosCIRKO(V1/2?
?31? 1mV, yK? 3.7? 1mVpara WT; y V1/2?
?34? 2mV, yK? 4.3? 2mV paraCIRKO; n? 8). la
anlisis dela recuperacin deIto, rpido de la inactivacinen estado
estacionario
se muestraen la figura. 5. Las clulas sedespolarizanprimeroa?50mV para
5spara inactivarIto,rpido, entonceshiperpolarizadosa?70mV para
tiempos que vande 0 a1.300msvariable, y finalmenteescalonada
a?50mV.La amplitud deIto,evocrpidamentea?50mVdespus
el perodo de recuperacinsedetermina a partir deun soloexponencial
adaptarsea las fasesde desintegracindeltotal dela corriente externay
normalizadaa la amplitud decorriente provocadadespus de la recuperacin
tiempo(en la misma celda). ElnormalizadoIto, amplitudes rpidas
trazadacomo una funcin deltiempo de recuperacinse presentanen la figura.
5B.
Los datosde recuperacin deIto, rpido fueronbien descritaspor un solo
exponencial conconstantes de tiempo de19? 2ms paraWT y
16? 1ms paramiocitosCIRKO(n?5). Nuestros datos muestran que
Ito,densidad de corrienterpidase redujosignificativamente; Sin embargo,
ni el tiempo nilas propiedadesdependientes de voltajedeIto, rpido
se vieron afectadosen los miocitosCIRKO.
Los estudios previos delos animales diabticoshan demostrado queel
interiormenterectificadorK?actual(IK1) no se ve afectadopor la diabetes
(8, 33). Aqu, hemos explorado si la ausencia dela insulina
receptoren el coraznpodra afectarIK1. La Figura6ilustra que
IK1densidad de corrienteno se ha modificadosignificativamenteen los miocitos
aisladode ratonesCIRKOmice.CIRKOmostrarAPDyprolongacin del intervalo QT.

Para determinar
losefectos de los receptoresde insulinaausentescardiacaen el
nivel celular, registramos AP enmiocitosaislados debaja tensin
WT yCIRKOratones.Como se muestraen la figura. 7A, APS formas de onda
se prolongaronen miocitosCIRKO. El anlisis cuantitativo
deAPDen50y90% derepolarizacinrevelsignificativa
prolongacinenCIRKO(7,3? 0,9y78,3? 7ms, n?10)
en comparacinconmiocitosWT (3? 0,2y25,8? 2,2ms,
n? 7). Por el contrario,los potenciales de membranaen reposo, APDen
10%, de APDa 25%, y APamplitudesse mantuvieron sin cambios
(los datos seresumen en la Tabla1). Adems,la carrera ascendentemxima
la velocidadno fue diferente entreel WTy
APsratonesCIRKO. Por ltimo, se analiz el efecto de laausencia
receptores de insulinacardiacasa nivelde todo el organismo
mediante la medicin dela actividadde ECGen ratonesanestesiados. Figura8
ilustra la comparacinde las grabacionesde ECGde WTy
RatonesCIRKO. Los anlisis delosparmetros del ECGconfirmaronun
prolongacin significativaenQRS, QT yQTcen
RatonesCIRKOrelacin con el controlde camada(n 6;?P
0,05). Corregidode tasaTantoysin corregirlos intervalos QT
fueron significativamentems largoen los animalesCIRKO.
DISCUSIN
La diabetes mellitusafecta a ms de8% delacorriente de los Estados
Los Estadosde la poblacin,y la epidemiamundial de obesidady
estilo de vida sedentariose prev queresultar enms de 300 millones
las personas con diabetesen 2025. Los pacientes condiabetes tienenun
riesgo significativo dedesarrollo decardiomiopata, que se caracteriza
porhipertrofia cardiaca, disfuncin ventricular, y
un aumento del riesgode arritmiasletales. Resistencia a la insulinacardiaca
esun factor quecontribuye ala miocardiopata diabtica
(17, 18). La amplia gama decambiosneurohormonalesasociadas
con diabetespresentan un desafoa la comprensin delas funciones de los
caminos especficosque estn alteradosen esta enfermedadcompleja.
Aqu, tomamos ventaja delos ratonesCIRKOestudiar laespecfica
efectos de laalteracin dela sealizacin de insulinacardiacoventricularen
repolarizacin, independiente delasalteraciones metablicasgeneralizadas
asociada con la diabetes.
Reduccin deK?gen del canaly laexpresin de protenas enCIRKO
corazones.Encontramosque la accinde la insulinadeterioradacaus una
reduccin
en el mensajeyla expresin de protenasdevariosKclave?
canalesque dominanla repolarizacinventricular; especficamente,
componentesdeIto, rpido (Kv4.2 yKChiP2) yKv1.5fueron
downregulateden los corazonesCIRKO. Al igual que ennuestro estudio

deausentes
sealizacin de la insulinaen el corazn, algunos estudiosenmodelos animales
de
diabetes tambinrevelauna reduccinen el mensajey protenas
los nivelesdeloscomponentesdeIto, rpido (25). Por el contrario, otro
estudios que utilizanun modelo de ratadediabetes de tipo Iinformaron
queKv4.2,
pero noKv4.3, la expresin de ARNmse downregulated(20). en
niveles denuestrotrabajo, ni mensajesKv4.3ode expresin de protenas
fueron alteradosen ratonesCIRKO; ms bien,una reduccin deKv4.2y
MensajeKChiP2y protenasproporcionan labase molecular de la
Itoreducida. Un aspecto especfico dela insulinaen la modulacin deK?
la expresin del gendel canales apoyado porla observacin de que
incubacinde los miocitosaislados decorazonesdiabticoscon
insulinarestauradoactualIto(16, 29, 33). Estos hallazgos demuestran
elefecto moduladorde la insulina sobreK?gen del canal
yexpresin de la protena. Adems, unarelacin mecanicistaentre
sealizacin de la insulinay K?la expresin del gendel canalviene de
la observacin de quela activacindelos receptores de insulinaen un
factorneurotrficoinducemRNA yexpresin de la protenade
Kv4.2y aumentael transitoriohacia afueraK? actual (IA)
densidades enratasneuronas granulares de cerebelo. Por otra parte, la insulina
bloqueodel receptor vareducidaneurotrficomediada por el factor
induccin de laIAdensidades de corrienteylos niveles de protenaKv4.2.
En este contexto, se especula que la supresindelos cardiomiocitos
receptores de insulinaafectageny de la protenamediada por la insulina
regulacin de laespecficaK?canales.
Estudioscoexpressionheterlogosdemostraron queIto, rpido
canalesse generanpor la asamblea deKv4.2/Kv4.3y
KChIP2subunidades (12). En este trabajo, demostramos que Kv4.2y
GenKChIP2y expresin de protenasson downregulateden
CorazonesCIRKO, yestosresultados son consistentes conla reduccin
deIto, densidades de corrienterpida. Sin embargo, la alternativa?Subunidad
componentedeIto, rpido Kv4.3no se ve afectada. Hay una fuerte
evidencia de quelos canalesKv4.3no son necesarios parala generacin
deItofuncional, canales rpidosenratones (21). Orientados supresin
deKv4.2elimina completamenteIto, rpido en el ratnadulto
ventrculos, mientras que enratones que carecen deKv4.3, lasdensidades de
corriente
y el tiempoy las propiedadesdependientes de voltajedeIto,fueron rpidos
similar alos ratones WT. Estos resultados indicaban quelas subunidades
deKv4.2
son fundamentalespara la generacin deventricularIto,canales rpidos
en los ventrculosde ratn adulto(11, 21). As, loscambios en

Kv4.2yKChIP2gen del canaly lasuperficie de la protenade membrana

expresin observadaen nuestro estudioaltersignificativamente
Ito,densidad de corrienterpidaen los corazonesCIRKO. Del mismo modo,
Kv1.5y
Mensajesde mRNAKv2.1se ven disminuidos, lo que sugiere IK, lento
reduccin de ladensidad de corrienteen ratones con-cardiomiocitosselectiva
supresindel receptor de insulina.
Hacia el exteriorde K?las corrientesse reducenenCIRKOventrculo.
En consonancia conla observacin de ladisminucin de la expresinde la
superficie celular
deprotenaKv4.2yKChiP2, se observ una reduccin
en Itodensidad de corriente enCIRKOventrculo.El voltaje
la dependenciay la cinticadeIto, rpido no se vieron afectadospor el
ausencia desealizacin de la insulinacardaco.La ausencia detensin
cambiosdependientes/cinticoses consistente conel hallazgo de que
disminuyeronlas protenastantoKv4.2yKChIP2. KChIP2es
conocidopara aumentarla densidad de corrienteymodificar elbiofsico
propiedades decanalesKv4, alterando el tiempo-y voltagedependent
propiedades delas corrientes(9). Una reduccinenKChIP2
expresin por s sola, suprimeIto, rpido y ralentizala cintica de
elcomponente rpidodela inactivacin(23). Sin embargo, se especula
que lareduccin combinadaKChIP2yKv4.2preservala
propiedadesdependientes de voltajedeIto, rpido. Nose encontr ninguna
las diferencias enladependencia de voltajedela inactivacino la recuperacin
de la inactivacindeIto, rpido en ratonesCIRKOen comparacincon
Canales deWT.
APDsignificativosyprolongacin del intervalo QTen ratonesCIRKO. la
reduccin enlas densidades de lascorrientes derepolarizacinenKV4
ventrculosratn adultomodificalas formas de onday contribuyeAP
a la dispersinanormal derepolarizacin(13, 24). nuestro
hallazgos sugierenque, como consecuenciadela reduccin de expresinde
Ito,componentes rpido, ventricularAPDse prolong enCIRKO
MiocitosLV,que a su vez, producenuna prolongacin delintervalo QT
intervaloen el ECG desuperficie.Del mismo modo, la prolongacinde
APDventricular
se inform enotros estudiosde la diabetes (8, 33). QT
prolongacines unconocido factor de riesgode muerte cardiaca sbita
yprolongacin del intervalo QTcconstituye unpredictor independiente
factor defuturosaccidentes cerebrovasculares enpacientescon diabetes tipo2
(6). Nuestroestudio pone de relievela contribucin especfica dedeterioro
insulinacardiomiocitossealizacina K?la expresin del gende canal
que conduce a laprolongacin del intervalo QT, independiente de lasistmica
trastornos metablicosque acompaan ala diabetes. adems
estudios paradelinear losmecanismos moleculares

mediante el cuallos controlesde insulinadel ion dela expresin del gendel canal
en la
corazn.
Limitaciones.Sealizacin de la insulinajuegaun papel importante en
regulandoel tamaocardacopostnatal, la expresin gnica isoformade miosina,
yla utilizacin de sustratosen el corazn. Las alteraciones enresultado
probableencambios secundariosen la expresindeuna variedad de
genes, algunos de los cualespuedeninfluir en la expresino funcin
de los canales inicoscardacosparadar lugar alos cambios observados en
repolarizacin. A medida que nuestraatencin selimita acardiacaespecfica
canales inicos, no podemos excluir la posibilidadde que las alteraciones
en otros genestambin influyen enla repolarizacinen ratonesCIRKO.
Por otra parte, se conocela insuficiencia cardacapara inducir cambios eniones
la expresin del gendel canalque puede causarla prolongacin delQT
intervalo.Mientras que los ratonesCIRKOexhibencambios modestos encardiaco
la contractilidad(2, 4, 27), queno desarrollaninsuficiencia cardacay
Por lo tanto,los cambios observadosen la expresinde canales de ionesen
este estudio nosonprobablemente una consecuenciade la insuficiencia
cardiacaen s.
Haydiferencias significativas enel repertorio deiones
genes de los canalesque modulanla repolarizacinenel roedory
ventrculohumano.Considerando queItodominala repolarizacin ventricular
en roedores, el rectificadorretardadoK?corrientesI Kryconocimientos
indgenasson
las principales corrientesrepolarizarenel ventrculohumano(19, 22,
23). Mientras que nuestrosresultados indicanque la ausencia dela insulina
sealizacinen el coraznmurinoaltera la expresinderepolarizacin
protenas de los canales, no queda claro si los cambiossimilares
que podra ocurrir enlos seres humanos.
Varios estudios indicanla importancia delatransmural
gradientedeIto ylas diferencias regionales enla DPAcomoconsecuencia
de lascorrientes inicasexistentesen todo elLVlibre
pared (25, 32). Centramosnuestra investigacinenlos miocitos
aislado deLVcomo la masadel VIcontrola principalmentela
Intervalo QT enel ECG de superficie. Sin embargo, transmuraly
las diferencias regionalesen la expresindel canal inicotal
vezseandiferencialmente
reguladapor la insulinaola falta desealizacin de la insulina.
Adems, no tenemospruebas de que laprolongacin del intervalo QT
observadaen ratonesCIRKOtraduce enarritmiasventriculares,
ya queno se realizla telemetracontinua.
Mientras que nuestroproyecto secentra principalmente enlos efectos de la
deficiencia de insulinacardiacaenla repolarizacin ventricular, tambin

observadoprolongacin del QRSen ratonesCIRKO. No hubo

diferencia enla velocidad decarrera ascendentemximaentre el control
yratones transgnicos, lo que sugiere queNa? la funcin del canalera
Nosensiblemente diferentes. Es posibleque la ausencia de
deficiencia de insulinacardiaca oconsecuencias secundariasde los mismos
puedeinfluir en la expresinde los genesconexinapara prolongar la
ComplejoQRS.
Conclusiones. En resumen, laaccin de la insulinacon problemasen el
corazncaus una reduccinen el mensajeyla expresin de protenasde
variosKclave?canalesque dominanla repolarizacinventricular.
Kv4.2y el mensajeKChiP2y protenasse redujeron,
que conduce auna reduccinenla amplitud deIto, rpido enaisladoLV
MiocitosCIRKO. Comoconsecuencia de la reduccinde Ito, rpido, ventricular
Intervalosde APDy QTfueron prolongadas. Estos resultados
apoyarel concepto de quela falta desealizacin de la insulinaen el
coraznessuficiente para hacer quelasalteraciones de la repolarizacin
descritoen otros modelosanimales de diabetes.
SUBVENCIONES
Este trabajo fue apoyadopor la FundacinNoraEcclesTreadwell
yporla American HeartAssociation (AHA) SubvencionesRO1DK092065y
UO1HL087947(a EDAbel,un investigadorestablecidoAHA). A.R.
Wendefue apoyadopor la Fundacin deInvestigacin de Diabetes
JuvenilAvanzada
PostdoctoralFellowship10-2009-672yNacional del Corazn, los Pulmones y la
Sangre
Institute (NHLBI) de subvencinK99-HL-111322. R.O.Pereirafue apoyado por
AHA(Afiliados occidental)beca postdoctoral delaypor el NHLBI
concederT32-HL-007576.
REVELACIONES
No hay conflictos deintersfinanciero o de otra, se declaranpor el autor(s).

Hipertensin posmenopusica: papel del sistema nervioso simptico en un

modelo animal
Rodrigo O. Maran, 1,2 Roberta Lima, 1,2 Mohammed Mathbout, 4 Jussara M. do
Carmo, 2 John E. Hall, 2
Richard J. Romano, 1,3 y Jane F. Reckelhoff1, 2
Centro de Investigacin en Salud de 1Women, 2 Departamento de Fisiologa y
Biofsica, 3 Departamento de Farmacologa y
Toxicologa de la Universidad de Mississippi Medical Center, Jackson, Mississippi; y
4Alfaissal UniversityCollege of Medicine,
Riad, Reino de Arabia Saudita
Enviado 31 de octubre 2013; aceptados en forma definitiva 18 de diciembre 2013
Maran RO, Lima R, Mathbout M, do Carmo JM, Hall JE,
Romano RJ, Reckelhoff JF. Hipertensin posmenopusica: papel de la
sistema nervioso simptico en un modelo animal. Am J PhysiolRegul

IntegrCompPhysiol 306:. R248-R256, 2014 Publicado por primera vez diciembre

31, 2013; doi: 10.1152/ajpregu.00490.2013.-In posmenopusica
las mujeres los mecanismos responsables de la hipertensin no han sido
completamente dilucidado, y no existen directrices especficas de gnero para
las mujeres a pesar de los estudios que muestran que la presin arterial no es as
controlado a la meta en las mujeres como en los hombres. En el presente estudio se evalu
la hiptesis de que el sistema nervioso simptico y el renal
nervios simpticos contribuyen a la hipertensin en el envejecimiento de las ratas hembras,
que la activacin simptica puede ser mediada por la melanocortina 3/4
receptor (MC3/4R), y que la activacin MC3/4R pueden deberse a
aumenta en la leptina. ? 1,? -1,2-Adrenrgico bloqueo reducido de sangre
presin en tanto jvenes (3-4 meses) y mayores (18-19 meses) hembra espontneamente
ratas hipertensas (SHR). Denervacin renal atenu la
la hipertensin en las mujeres ms viejas que en las mujeres jvenes. MC3/4R
antagonismo con SHU-9119 dado tena intracerebroventricularmente no
efecto sobre la presin arterial, ya sea en las mujeres jvenes o viejos, pero
significativamente
presin sangunea reducida en los hombres de edad. Niveles de leptina en plasma fueron
similar en edad, macho y hembra SHR y en viejos contra los jvenes hembras.
Estos datos sugieren que la hipertensin en edad femenina SHR es, en parte,
debido a la activacin del sistema nervioso simptico, que el renal
nervios contribuyen a la hipertensin, y que el mecanismo responsable
para la activacin simptica en viejas hembras es independiente de la
MC3/4R.
envejecimiento; denervacin renal; leptina; melanocortina 3/4 del receptor; las diferencias
de sexo
ENVEJECIMIENTO EN LOS DOS MUJERES Y HOMBRES se asocia con aumentos en
la presin arterial. Sin embargo, el Sistema Nacional de Salud y Nutricin
(NHANES 1999-2004) mostr que despus de
50 aos de edad, la prevalencia de la hipertensin es mayor en
las mujeres que en los hombres, independientemente de su origen tnico (6). De hecho,
cardiovasculares
enfermedad es uno de los factores causales ms importantes
en un aumento de la mortalidad y la morbilidad en las mujeres, y la hipertensin
es un principal factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular (20, 23,
27, 41). Los mecanismos responsables para el aumento en la sangre
la presin en las mujeres posmenopusicas que no han sido completamente
determinado.
Al igual que en muchas mujeres, a medida que envejecen, las mujeres de manera
espontnea
ratas hipertensas (SHR) muestran aumentos en la presin arterial
de tal manera que para el momento en que lleguen a 16-18 meses de edad, su sangre
la presin es similar o mayor que en los varones de la misma edad (20,
41). Hemos evaluado varios sistemas que se sabe que
contribuir al control de la presin arterial en estas viejas hembras, tales
como el sistema renina-angiotensina, el sistema de la endotelina, y
eicosanoides tales como vas de 20-HETE (21, 38-40). nosotros

encontrado que el bloqueo de estas vas por separado y / o en

combinacin reduce la presin arterial en la edad femenina SHR, pero
no normalizar la presin arterial (21, 38-40), por lo tanto
lo que sugiere sistemas adicionales puede contribuir a la hipertensin.
Si bien las causas de la hipertensin en los seres humanos envejecen, no tienen
sido completamente dilucidado, la activacin de la nervioso simptico
sistema (SNS) ha sido implicado (1, 16). creciente
la evidencia sugiere que el SNS acta a travs de la simptica renal
nervios, el aumento de la liberacin de renina, la alteracin de la glomerular
la tasa de filtracin, y el aumento de la reabsorcin tubular de sodio,
y puede haber diferencias de gnero en estos efectos (1, 9, 15,
25). Hemos demostrado anteriormente que la denervacin simptica renal
reduce la presin arterial en jvenes de sexo masculino y femenino
SHR en el mismo porcentaje (17). As, mientras renal simptico
actividad nerviosa contribuye a la hipertensin en hombres y
hembra SHR mientras son jvenes, no explica el sexo
diferencia en la presin de la sangre que se encuentra en estas ratas. El papel
que el sistema nervioso simptico desempea y, en particular,
el papel que los nervios simpticos renales pueden desempear en la mediacin
la hipertensin en edad femenina SHR no se ha determinado
a nuestro conocimiento.
Una de las maneras en la que el sistema nervioso simptico
puede ser estimulado es a travs de la activacin de pro-opiomelanocortina
(POMC), las neuronas y de melanocortina 3/4 receptores (MC3/4R).
Esta va se cree que desempean un papel en la mediacin de la obesidad
hipertensin con uno de los factores activadores siendo la leptina (10,
12, 14). da Silva y sus colegas (8) mostraron previamente que
a pesar de no ser obeso, el bloqueo de la MC3/4R con SHU9119 en varn joven SHR reduce la presin arterial, lo que sugiere
la va MC3/4R es un mecanismo responsable de
La activacin del SNS en los hombres jvenes. Ya sea MC3/4Rs juegan un papel
en la mediacin de la hipertensin en el envejecimiento femenino SHR no est claro.
Los estudios han demostrado que los niveles de leptina aumentan con el envejecimiento en
mujeres (7) y son tpicamente ms altos en las mujeres que los hombres (22),
ya que la leptina es liberada por el tejido adiposo y las mujeres tienen
tejido adiposo ms especialmente con el envejecimiento, incluso cuando no estn
sobrepeso. Adems, se encontr que los niveles de leptina a ser asociado
con hipertensin en mujeres postmenopusicas en la
Estudio del Corazn de la Familia (22). Una vez ms, si los niveles de leptina son
mayor en edad, sexo femenino SHR que en los hombres, y si esto podra
contribuir a su hipertensin es desconocida.
Sobre la base de estos datos y los datos que muestran que simptico
activacin desempea un papel en muchas formas de hipertensin esencial primaria
en los seres humanos, hemos probado la hiptesis de que 1) la regulacin positiva del SNS
de hecho contribuye a la hipertensin en el envejecimiento
hembra SHR; 2) los nervios simpticos renales contribuyen a la
hipertensin en edad femenina SHR ms que en las mujeres jvenes;

y 3) que el mecanismo responsable de la activacin de la

SNS en edad, las mujeres est mediada, en parte, a travs de MC3/4R y
tal vez se debe a los niveles ms altos de leptina que activan MC3/4R.
Materiales y mtodos
ratas
Hembras reproductoras jubilados se obtuvieron del vendedor (Taconic
Farms, Germantown, PA) a 4-9 meses de edad, con edades en el Laboratorio
Instalaciones Animal (LAF) en la Universidad de Mississippi Medical
Center (UMMC), y se utiliza a 18-20 meses de edad. Masculino SHR eran
obtenido del proveedor a 10-12 semanas de edad y se dej envejecer a
18-20 mo en el UMMC LAF. Se obtuvieron femenina joven SHR
desde el proveedor a las 10 semanas de edad y se utiliza a 12-16 semanas de edad. Las ratas
se mantuvieron con pienso estndar para ratas (Teklad, Harlan SD, Indianapolis,
IN) y el agua del grifo en un ambiente con 12 horas de 12-h de luz-oscuridad
ciclo mientras que el envejecimiento y a travs de los protocolos. Los protocolos cumplido
con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
por los Institutos Nacionales de Salud y se han revisado y aprobado
por el Comit de Cuidado de Animales institucional y el uso al UMMC.
Diseo experimental
Protocolo 1. Bloqueo adrenrgico. SHR ratas hembra, 12 aos
sem y 18 meses, se dividieron en dos grupos (n 5? por grupo).
Transmisores de radiotelemetra (TA11PA-C40; Data Sciences International,
St. Paul, MN) se implantaron en la aorta abdominal utilizando
anestesia con isoflurano, como hemos descrito previamente (17, 21, 39).
Despus de 2 semanas de la recuperacin de la ciruga, la presin arterial media (MAP) fue
medido durante 5 das como perodo de lnea de base. Despus de eso, ambos grupos
fueron
tratados con terazosina (10 mg kg 1 da 1 pb;?? un 1-selectivo del receptor?
antagonista) y propranolol (10 mg kg 1 da 1 pb;?? un selectivo
Antagonista de? 1,2-receptor) a travs de minibombas osmticas (Alzet) durante 7 das
con la medicin MAPA continua. Durante el perodo de tratamiento, todos los
ratas bebieron cantidades similares de agua (30-35 ml / da) y se excretan
cantidades similares de orina (29,6 -33,5 ml / da), y los pesos corporales eran
similar en todo el estudio.
? - Y?-Bloqueo adecuacin se puso a prueba en el da 5 del bloqueo a travs de
catteres venosos femorales utilizando fenilefrina (4? g/200? l iv) siguieron
5 minutos ms tarde con isoproterenol (0,7? G/200? L iv). La infusin agonista
se program exactamente, y sus efectos tanto en el MAP y la frecuencia cardaca (FC)
se registraron 1 min despus de cada bolo y se compara con el MAP y
HR inmediatamente antes de la infusin (2, 3, 5, 24, 28). adrenrgico
bloqueo tambin fue probado en mujeres jvenes sin tratar como SHR
los controles (n? 3).
Protocolo 2. Denervacin renal. Macho y hembra SHR, 3 aos de edad
o 16 a 18 meses (n? 6/grupo), fueron sometidos a uninefrectoma derecho
(UNX) a travs de la incisin dorsal durante la anestesia con isoflurano. Despus de 2
semanas

la recuperacin, las ratas se sometieron a la lnea media incisin abdominal bajo

anestesia con isoflurano, y denervacin renal izquierda se realiz por
pintando los nervios renales izquierda y la arteria renal izquierda con 10% de fenol
en solucin de etanol y luego cortar todos los nervios renales visibles, como lo
se ha descrito previamente (17). Todos los animales de simulacin tambin recibi dejaron
UNX 2
sem antes de, y en el da de la ciruga, se identificaron los nervios renales pero
deja en paz. Inmediatamente despus de la denervacin renal, radiotelemetra
transmisores (TA11PA-C40, Data Sciences Internacional Transoma)
se implantaron en la aorta abdominal por debajo de las arterias renales, como
previamente descrito (21, 39).
Dos semanas despus de la denervacin renal y la implantacin de telemetra,
PAM y FC se medirn de forma continua en todos los animales durante 5 das como
previamente descrito (21, 39). Al final del experimento, la
los animales fueron anestesiados con isoflurano, y se retiraron los riones
y broche de congelados en nitrgeno lquido para la medicin de la noradrenalina
contenido por espectroscopa cromatografa / masa de lquido (17, 42), en el
Colegio Mdico de Wisconsin, bajo la direccin del Dr. David
Mattson.
Protocolo 3. Inhibicin de MC3/4R CON SHU-9119. Joven (N? 16)
y viejos mujeres (n? 12) SHR, con edades de 12 semanas o 18-20 meses, respectivamente,
y los machos viejos, de edad 18 a 20 meses (n 6? por grupo), se implantaron
con transmisores de radiotelemetra utilizando anestesia con isoflurano. despus
implantacin del transmisor, una cnula de acero inoxidable (calibre 26, 10 mm
de longitud) se implant en el ventrculo cerebral lateral derecho, como
se ha descrito previamente (8). La cnula gua estaba anclado en su lugar
con dos tornillos de acero inoxidable de la mquina, una tapa de metal y dental
acrlico, y un estilete se insert para sellar la cnula para evitar que se
se obstruya. Varios das despus de que las ratas se recuperaron de la ciruga,
la precisin de la colocacin de la cnula se ensay mediante la medicin de la
respuesta dipsogenic (beber inmediata de al menos 5 ml de agua en
10 min) a un intracerebroventricular (icv) de inyeccin de 100 ng de
angiotensina II. Despus se midieron 2 semanas de recuperacin, PAM y FC
durante un perodo de lnea de base 5-das, y luego una minibomba osmtica (Alzet)
se implant por va subcutnea en la regin escapular y conectado a
la cnula intracerebroventricular se utilice tubera de polietileno para
infusin del antagonista SHU-9119 MC3/4R (1 nmol / h, 0,5? l / h icv)
durante 10 das. La dosis de infusin SHU-9119 se basa en nuestra
estudios previos que muestran que esta dosis bloquea eficazmente MC3/4R
y aumenta la ingesta de alimentos (8). Desde SHU-9119 causa un aumento en
la ingesta de alimentos, se midi el peso corporal antes intracerebroventricular
la implantacin de la cnula y de nuevo al final del estudio, y la ingesta de alimentos
se registr diariamente. Despus del experimento, los animales fueron sacrificados,
y los cerebros se extrajeron, se seccionaron, y se tieron con cresil
violeta para confirmar la colocacin de la cnula en el lateral derecha
ventrculo.
Los niveles de leptina en plasma. Leptina en plasma se midi usando un enzymelinked

(ELISA; CrystalChem, Downers Grove,

IL) segn las instrucciones del fabricante. Para las mediciones de leptina que comparan
hombres y mujeres de edad, se extrajo sangre a la eutanasia en
controlar y despus del tratamiento SHU. SHU no tuvo ningn efecto sobre la leptina
plasmtica
niveles, por lo que los datos se combinaron para el control y ratas tratadas con SHU
(N? 12/grupo). Para la comparacin entre las mujeres jvenes y mayores,
leptina se midi en sangre tomada de diferentes ratas no tratadas que
descrito anteriormente para el estudio SHU (N? 8/grupo).
estadstica
Los datos se presentan como medios? SE. La significacin de la diferencia
en los valores medios entre y dentro de los grupos se determin usando un
ANOVA de dos vas para medidas repetidas y test de Dunn para
comparaciones planeadas de antemano utilizando software SigmaPlot. La importancia
cambio de absoluta y / o el porcentaje de la presin arterial despus adrenrgicos
bloqueo y la denervacin renal en varios valorada entre los grupos fue
realizado utilizando una prueba t no pareada utilizando GraphPadPrism. La importancia
de diferencias en los niveles de leptina entre los grupos fueron tambin
analizados mediante una prueba t no pareada. P? 0,05 fue considerado para ser
estadsticamente significativa.
RESULTADOS
Protocolo 1
Bloqueo adrenrgico. MAP fue significativamente mayor en edad
las hembras que en las mujeres jvenes durante el perodo de referencia (Fig. 1A).
El bloqueo de?1,? Receptores 1/2-adrenergic redujeron significativamente
MAP en las mujeres jvenes y mayores. En hembras de mayor edad
MAPA se redujo de 182? 4 a 104? 4 mmHg durante la
primera 24 h, pero aument gradualmente a 141? 7 mmHg durante el da 7
de la infusin. En las mujeres jvenes, el MAP tambin disminuy significativamente
desde 126? 2-91? 2 mmHg durante las primeras 24 h y
aumentado gradualmente de nuevo a 108? 2 mmHg por da 7 de
infusin. Ambos grupos incrementaron MAPA volver a los niveles de control por el da 4-5
de la recuperacin. Como se muestra en la figura. 1B, el porcentaje
caer en la PAM en el da 8 (tratamiento), en comparacin con el da 4
(lnea de base) fue significativamente mayor en las hembras de edad (? 27? 3%)
que las mujeres jvenes (18? 2%, p? 0.04).
Adecuacin de bloqueo. Como se muestra en la Tabla 1, el bloqueo era
probado como se describe en Materiales y mtodos. Despus de?-Adrenrgicos
bloqueo, ni la fenilefrina ni isoproterenol tenan un
efecto significativo en el MAP o de recursos humanos en las mujeres mayores y jvenes.
Estos datos sugieren bloqueo adecuada con?1,? 1,2-adrenrgico
bloqueantes en jvenes y adultos hembra SHR.
Protocolo 2
Denervacin renal. Como se muestra en la figura. 2A, MAP fue ms alta en
Hembra uninefrectomizadas (UNX) sham SHR que en
jvenes fundas UNX femenino. Denervacin renal en las mujeres UNX
reducida MAP en ambos grupos, pero tuvo un efecto mayor sobre la edad

las hembras que en las mujeres jvenes tanto numricamente (viejas mujeres:
? 30? 1; las mujeres jvenes:? 17? 1 mm de Hg; P? 0,01) y por
porcentuales (viejas mujeres: 17,6 0,4%; hembras jvenes??:
? 12.2? 0,4%, P? 0,05). Niveles de norepinefrina renales fueron
similar en jvenes y ancianos fundas UNX mujeres y la disminucin de
niveles similares con denervacin renal en ambos grupos (Fig. 2B).
HR fue similar en jvenes y adultos hembras farsa UNX y fue
no afectada por la denervacin renal en ninguno de los grupos (edad femenina
UNX farsa: 330? 11 vs viejo UNX renal denervada: 336? 3
latidos / min; y la hembra joven UNX farsa: 343? 7 vs joven
UNX denervado: 344? 5 latidos / min; P? NS).
Protocolo 3
Melanocortina 3/4 antagonismo del receptor. Como se muestra en la Tabla 2
y. Fig. 3A, el tratamiento-SHU 9119 aument la ingesta de alimentos por
69? 8% de las mujeres jvenes SHR y el peso corporal en un 29? 4%.
Jvenes hembras tratados con vehculo tambin mostraron un aumento en
peso corporal durante el periodo experimental de 17? 6%
(aumento de la ingesta de alimentos de 18? 0,7%). A pesar del efecto en
la ingesta de alimentos, un sello distintivo de bloqueo, MC3/4R antagonismo tuvo
ningn efecto sobre MAP (Fig. 3B), pero redujo significativamente los recursos humanos
en
hembra joven SHR en comparacin con los controles del vehculo no tratados
(Fig. 3C).
En la vieja hembra SHR, el antagonismo MC3/4R crnica con SHU9119 aument la ingesta de alimentos en un 65? 6% (Fig. 4A) y
aumento del peso corporal en un 18? 2% (Fig. 4A, Cuadro 2). desemejante
en las mujeres jvenes, sin embargo, las mujeres de edad tratados con vehculo no lo
hicieron
tener un aumento en el peso corporal durante el periodo experimental
(Tabla 2). Como se ha indicado en la figura. 4A, mapas eran diferentes en algunos
da de medicin de lnea de base entre ratas destinadas a obtener SHU9119 tratamiento y controles destinados a ser tratada, ya que
aleatorizado a las ratas a los grupos sin mirar el mapa en
la lnea de base. Sin embargo, al igual que en las mujeres jvenes SHR, el tratamiento-SHU
9119
no tuvo efecto sobre MAP en la vieja hembra SHR en comparacin con
controles de vehculo (Fig. 4B). HR tampoco se vio afectada por SHU9119 (Fig. 4C).
En el viejo macho SHR, crnica MC3 / 4 antagonismo aument alimentos
ingesta en un 58? 9% y el peso corporal en un 23? 3% (Fig. 5A y
Tabla 2). Sin embargo, a diferencia de los jvenes y viejos femenino SHR,
MC3/4R antagonismo redujo la PAM y la FC en los viejos machos SHR niveles de leptina
Comparacin de los niveles de leptina en plasma en hombres y mujeres de edad
no mostr diferencias entre los dos grupos [varones (n 12?):
4.18? 1,12; las hembras (n 10?): 3,87? 0,88 ng / ml, P? NS].
Los niveles de leptina en otros grupos de la misma edad joven (n? 7)
y las hembras de edad (n? 9) (no incluido en el estudio SHU) fueron

Tampoco diferente (joven: 2,21 0,42; edad:?? 2,55 0,42 ng / ml,

p
NS).
DISCUSIN
Las principales conclusiones de estos estudios son los siguientes. En primer lugar,
el sistema nervioso simptico contribuye a la hipertensin en
jvenes y viejos femenino SHR; Sin embargo, la disminucin en la sangre
presin con bloqueo adrenrgico es mayor en edad, las mujeres
en comparacin con las mujeres jvenes, lo que sugiere una mayor contribucin
del sistema nervioso simptico a la hipertensin en la edad
las hembras. En segundo lugar, la denervacin renal tambin se reduce la sangre
presin en las mujeres jvenes y mayores, y mientras que el depresor
respuesta fue ligeramente mayor en las mujeres de edad, lo ms importante,
MAPA despus de la denervacin renal se mantuvo por encima de 140
mmHg en la edad, las mujeres, el apoyo a nuestros estudios anteriores que muestran
que los mecanismos distintos de los nervios renales tambin contribuyen a
la hipertensin en edad femenina SHR. En tercer lugar, el antagonismo MC3/4R
presin sangunea reducida en los hombres de edad [como se muestra anteriormente
en varones jvenes (5)], pero no tuvo efecto en las mujeres jvenes o viejos,
lo que sugiere que, mientras que la activacin simptica juega un importante
papel en la mediacin de la hipertensin en las mujeres, los mecanismos
responsable de la activacin del SNS es probable independiente
de la activacin MC3/4R. Por ltimo, los niveles de leptina no son
diferentes en edad SHR macho y hembra, dejando el papel de la leptina
en la mediacin de la activacin de MC3/4R en los hombres de edad en cuestin.
El envejecimiento en los seres humanos se asocia con un aumento significativo en
la actividad nerviosa simptica muscular (ANSM), con las mujeres que presentan
ANSM mayor que los hombres despus de la edad de 60 aos (25, 26,
30). Adems, hay evidencia en mujeres premenopusicas
que la actividad del nervio simptico se puede reducir por el estradiol
(35, 36). En apoyo de esta hiptesis, Narkiewicz y colegas
(25) reportaron que ANSM aument ms con la edad en
las mujeres que en los hombres. Tank y sus colegas (33) reportaron que
ANSM correlaciona bien con el envejecimiento en los hombres y las mujeres, y
pero esa relacin cada vez mayor entre cintura y cadera, la masa corporal y cintura
circunferencia correlacionado con el aumento de ANSM en los hombres, pero
no en las mujeres. Vianna y colaboradores (34) tambin informaron que
el aumento de la PAM despus de ANSM explosin fue atenuada con
envejecimiento, pero fue atenuada ms en las mujeres que los hombres.
Nuestros estudios actuales apoyan la idea de que el SNS tiene un
papel esencial en la mediacin de la hipertensin en el envejecimiento femenino SHR.
Hemos demostrado previamente que el sistema renina-angiotensina
(39), el sistema de la endotelina (38), y la sntesis de eicosanoides,
particularmente 20-HETE (40), tambin contribuyen a la hipertensin
en el envejecimiento femenino SHR. De hecho, recientemente hemos demostrado que el
bloqueo
de todos los tres de estos sistemas todava no permite normalizar la

MAPA a 100 mmHg (21). Los resultados del presente estudio

sugieren que la activacin del SNS puede explicar fcilmente la
elevacin restante de la presin arterial.
Anteriormente puso de manifiesto que el SNS renal desempea un papel en
la mediacin de la hipertensin en los jvenes de sexo masculino y femenino SHR
(17). Adems, puso de manifiesto que la diferencia de sexo en la sangre
presin en estas ratas jvenes no podra explicarse sobre la base
de la activacin del nervio renal solos ya que la reduccin porcentual
de la PAM con denervacin renal fue similar en varones jvenes y
hembras (17). En nuestro estudio, la denervacin renal en edad
hembra SHR caus una reduccin en la presin arterial que fue mayor (numricamente y
por porcentaje) que en joven
las hembras. Es importante destacar que, el MAP se mantuvo en 139? 4 mmHg en
las viejas mujeres, apoyando a nuestros estudios previos de otros
mecanismos no renales SNS contribuyen a su hipertensin.
La actividad nerviosa simptica renal disminuye con la edad en los seres humanos,
como se muestra por Esler y sus colegas (49), pero se incrementa
en presencia de aumento de peso y el sndrome metablico (12,
31), los incidentes ms comunes en las mujeres posmenopusicas. desemejante
las mujeres posmenopusicas, la vieja mujer SHR no ganar
peso con el envejecimiento hacindolos atpico en comparacin con la mayora
las mujeres posmenopusicas. En los seres humanos, el uso de radiofrecuencia
la ablacin del nervio renal ha tenido bastante xito en el tratamiento
de la hipertensin resistentes (29, 30). Sin embargo, para nuestro conocimiento,
no se han realizado estudios en los que las diferencias de gnero en la
eficacia de la ablacin del nervio renal para reducir la presin arterial tiene
sido evaluado. En base a los estudios actuales, es posible que
la ablacin del nervio renal puede ser ms eficaz en mujeres mayores
que en las mujeres ms jvenes. Dicho esto, los estudios preliminares en
dos mujeres jvenes con sndrome de ovario poliqustico (SOP)
mostr que la ablacin del nervio renal radiofrecuencia atenuada
su presin arterial sistlica? 8 mmHg en una y 27
mmHg en la otra mujer (19, 32), pero las mujeres se mantuvieron
hipertensiva.
Diversos estudios han demostrado que la hipertensin en las mujeres,
en particular las mujeres de edad, no est tan bien controlados para teraputica
objetivo que en los hombres (11, 18, 27). directrices Farmacoterapia
para el tratamiento de la hipertensin es similar en hombres y mujeres
ya que no hay evidencia de que ambos sexos responden con similares
eficacia (11, 27). El uso de?-Bloqueantes como tratamiento de primera lnea en
hipertensin no complicada se ha debatido y ya no se recomienda en personas con riesgo
promedio (27). Sin embargo,
?-bloqueantes son considerados como terapia de primera lnea en mujeres con
aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular, tal como en mujeres
con la enfermedad cardaca coronaria conocida, enfermedad vascular perifrica,
o un riesgo de Framingham 10-ao puntuacin superior a 20%
(27). Nuestros datos en la vieja hembra SHR apoyaran el concepto

que el uso del bloqueo adrenrgico en forma crnica hipertensiva

las mujeres posmenopusicas pueden ser tiles en el control de su
la presin arterial.
En el presente estudio tambin se evalu el papel de la
MC3/4R en la mediacin de la hipertensin en mujeres SHR. da
Silva y colegas (8) informaron de que el bloqueo de la MC3/4R
en varn joven SHR redujeron su presin arterial por? 25
mmHg. Basndose en estos datos, nos sorprendi cuando nos enteramos
ninguna respuesta depresor de SHU-9119 en cualquier viejo o joven
SHR hembra. Por lo tanto, se determin si la hipertensin
en el viejo macho SHR respondera a MC3/4R antagonismo y
encontr que SHU-9119 caus? 15 mmHg disminucin de su
la presin arterial, similar a los varones jvenes (8). As, el hecho de que
el antagonismo MC3/4R no redujo significativamente la sangre
presin en hembra SHR sugiere que diferentes mecanismos
puede ser responsable de la activacin del SNS en hombres y
SHR hembra. Estos mecanismos no son probable que sea debido a
leptina, leptina aunque se cree que desempean un papel importante en
activacin de proopiomelanocortina (POMC), las neuronas que liberan
hormona?-estimulante de los melanocitos (?-MSH), la primaria
agonista para el MC3/4R. En nuestro estudio, encontramos que
niveles de leptina en plasma no son diferentes en edad, macho y hembra
SHR. Sin embargo, es posible que los niveles de leptina en el cerebro puede
ser diferente entre hombres y mujeres de edad y por lo tanto todava contribuir a la
activacin de la MC3/4R en los hombres y la activacin de
SNS. Alternativamente, las diferencias en los esteroides sexuales pueden ser importantes
en la regulacin de la expresin de POMC y por lo tanto-? MSH liberacin
y la activacin MC3/4R. Por ejemplo, las ratas tratadas con testosterona
tener niveles ms altos de expresin de POMC en el ncleo arqueado de
el hipotlamo (4), y hay una disminucin relacionada con la edad en
Expresin de POMC en ratas macho (13). Ya sea mayor testosterona
niveles en SHR macho, machos, especialmente los jvenes, podran explicar la
mayor efecto de MC3 / 4 bloqueo a disminuir la presin arterial en comparacin
con la hembra SHR est claro.
Otro hallazgo interesante de nuestros estudios es que el efecto de
Inhibicin MC3/4R en la ingesta de alimentos se disocia de la sangre
presin en las mujeres, pero no en los hombres. Estos datos sugieren que
quizs en femenino SHR, las reas del cerebro que controlan los alimentos
ingesta son diferentes de los que controlan la presin arterial, pero que
estas reas pueden solaparse en los hombres. Este hallazgo puede ser una cepa
la diferencia ms que una diferencia de sexo, ya que tenemos preliminar
datos en nuestro modelo de sndrome de ovario poliqustico en ratas Sprague-Dawley que
MC3/4R
antagonismo atena el aumento de la presin arterial, pero aumenta
la ingesta de alimentos (datos no mostrados). Alternativamente, como se mencion
anteriormente,
andrgenos pueden upregulate la MC3/4R, y el modelo SOP es

hecha dando a los andrgenos ratas (4, 13). Para evaluar el papel de los
MC3/4R, vamos a tener que realizar estudios en otro hipertensiva
modelos, como Dahl sensibles a la sal ratas o modelos no genticos a
evaluar ms a fondo las posibles diferencias de sexo.
Con respecto a otros mecanismos potenciales que podran afectar
la actividad nerviosa simptica en las mujeres, Xue y colaboradores (37)
inform de que la activacin de los receptores de estrgenos (ER)? en el
ncleo paraventricular y atena mdula rostroventrolateral
la actividad nerviosa simptica y reduce la presin arterial en
hipertensin aldosterona en ratas hembras. Por lo tanto, es posible que
una reduccin de los estrgenos con el envejecimiento podra contribuir a SNSmediated
hipertensin en las mujeres. Esto no es probable que sea el
mecanismo de activacin simptica en nuestras viejas hembras, ya que
ovariectoma tiene poco efecto sobre la presin arterial en mujeres SHR,
independientemente de si son jvenes o mayores (39).
Limitaciones de los Estudios
Una limitacin de nuestro estudio es que no hemos medido
la expresin o la unin de ligando de los receptores adrenrgicos
en nuestra hembra jvenes y ancianos SHR. Por lo tanto, es posible que el
la expresin del receptor adrenrgico o disminuye la afinidad de unin
con la edad, de tal manera que las viejas hembras no responden tan bien como
mujeres jvenes hacen para adrenrgico bloqueo. Adems, se utiliz
bloqueo adrenrgico como un indicador de que el Sistema Nacional de Salud, en general,
es...