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INTRODUO

A tcnica de diluio do nmero mais provvel (NMP) empregada para


estimar o nmero de microrganismos de uma amostra a partir de respostas
onde os resultados so reportados como positivos ou negativos em nica
diluio ou para diluies mltiplas em tabela que foram previamente
calculadas estatisticamente.
Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes
fecais e E.Coli em gua e alimentos (SILVA et al, 2007).
A tcnica NMP como qualquer outra tcnica, est sujeita a varias fontes de
erros.
OBJETIVO
O objetivo do presente trabalho aplicar a tcnica do nmero mais provvel
(NMP) na deteco de coliformes totais e fecais (E.Coli) em uma amostra de
gua coletada no bebedouro da granja do IFRS - Campus Bento Gonalves.
REVISO BIBLIOGRAFICA
Tcnica de diluio idealizada por McCrady (1915), onde se faz uma
estimativa da densidade mdia dos microrganismos na amostra.
Segundo a Instruo Normativa N 62, DE 26 de agosto de 2003, define a
tcnica do nmero mais provveis como um mtodo que permite estimar a
densidade de microrganismos viveis presentes em uma amostra sob
anlise.
A tcnica do nmero mais provvel um mtodo de anlise quantitativo
que permite determinar o nmero mais provvel (NMP) do (s)
microrganismo(s) alvo na amostra, atravs da inoculao de alquotas dessa
amostra em uma sria de tubos, contendo um meio de cultura lquido
adequado ao seu crescimento (SILVA et al, 2007).
A determinao do nmero de microrganismos baseada no princpio de
que, subdividindo a amostra em alquotas, algumas alquotas vo conter
microrganismos e outras no, dependendo da quantidade dos
microrganismos na amostra. O nmero de alquotas com microrganismos
(tubo com crescimento positivo aps a incubao) e alquotas sem
microrganismos (tubos com crescimento negativo aps a incubao)
permite estimar, por clculo de probabilidade, a densidade original dos
microrganismos na amostra. Essa aplicao da teoria da probabilidade
depende de que os microrganismos estejam distribudos ao acaso e
homogeneamente por toda a amostra. No caso de amostras lquidas, essa
condio pode ser atingida sem dificuldade, atravs da cuidadosa agitao
do material. No caso de amostras slidas pode ser atingida no preparo e
homogeneizao da primeira diluio, tomando-se as alquotas a partir
dessa diluio. HHHH situaes em que as alquotas da amostra slida so
inoculadas diretamente no caldo de cultura. A inoculao direta das
amostras slidas, entretanto, menos comum e depende do tipo de

amostra (SILVA et al, 2007).


Como a inoculao feita em meios lquidos, a tcnica do NMP apresenta
algumas vantagens em relao contagem padro em placas. Uma delas
a possibilidade de inocular quantidades maiores da amostra, aumentandose proporcionalmente o volume de meio de cultura. Isso confere a tcnica
umasensibilidade maior do que a da contagem em placas e em grande
flexibilidade no estabelecimento do limite de deteco. Outra vantagem
que permite a introduo de etapas de recuperao de injurias, utilizando
um meio no seletivo para a inoculao inicial, mais favorvel aos
microrganismos injuriados, e depois transferindo a cultura para meios
seletivos (SILVA et al, 2007).
A tcnica do NMP bastante verstil, permitindo a enumerao de
diferentes grupos ou espcies de microrganismos, variando-se o meio de
cultura e as condies de incubao(SILVA et al, 2007). Ela pode detectar
microrganismos que turvam o meio, que produzem gs, cido ou base, etc.
Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes
fecais e E. coli em gua e alimentos. Pode tambm ser utilizada em outros
ensaios quantitativos, quando a contaminao esperada na amostra est
abaixo do limite de deteco do plaqueamento ou quando partculas do
alimento interferem na contagem em placas. Outra aplicao a adaptao
de mtodos qualitativos para quantitativos, como a contagem de
Salmonella, Listeria Monocytogenes e outros microrganismos
tradicionalmente analisados por mtodos de presena/ ausncia (SILVA et al,
2007).
Para a inoculao, a tcnica do NMP apresenta dois formatos dependendo
de como as alquotas so distribudas. Um o formato do teste de diluio
mltipla, no qual trs cinco ou dez alquotas de uma diluio so inoculadas
numa srie de trs, cinco ou dez tubos e, depois, uma nova sria de trs,
cinco ou dez alquotas, da diluio subseqente, so inoculadas em outra
sria detubos e assim por diante. Quanto maior o nmero de diluies e de
tubos por diluio, maior a preciso da contagem. Para a maioria das
situaes encontradas nas anlises de alimentos trs diluies so
suficientes para uma boa estimativa do NMP. O outro formato o teste de
diluio nica que mais utilizado para amostras com baixo nvel de
contaminao, para as quais no h necessidade nem se justifica a
preparao de diluies. Uma de suas principais aplicaes so a contagem
de coliformes em gua tratada e em sucos e refrigerantes (SILVA et al,
2007).
O grupo dos coliformes totais inclui as bactrias na forma de bastonetes
Gram negativos, no esporognicos anaerbios facultativos, capazes de
fermentar a lactose com produo de gs, em 24 a 48 horas a 35C. O
grupo inclui cerca de 20 espcies, dentre as quais encontram-se tanto
bactrias originarias do trato gastrintestinal de humanos e outro animais de
sangue quente, como tambm diversos gneros e espcies de bactrias no
entricas, como Serratia e Aeromona , por exemplo. Por essa razo, sua
enumerao em gua e alimentos menos representativa, como indicao
de contaminao fecal, do que a enumerao de coliformes fecais ou E.Coli

(SILVA et al, 2005).


O grupo de coliformes fecais ou coliformes termotolerantes tem a mesma
definio de coliformes totais, porem, restringindo-se aos membros capazes
de fermentar a lactose com produo de gs, em 24 horas a 44,5- 45,5C.
Essa definio objetivou, em principio, selecionar apenas os coliformes
originrios do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que o
grupo doscoliformes fecais inclui pelo menos trs gnero, e Escherichia,
Enterobacter e Klebsiella , dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem
cepas de origem no fecal. Por esse motivo, a presena de coliformes fecais
em gua e alimentos menos representativa, como indicao de
contaminao fecal, do que a enumerao direta de E.Coli, porm, muito
mais significativa do que a presena de coliformes totais, dada a alta
incidncia de E.Coli dentro do grupo fecal. Cerca de 95% dos coliformes
existentes nas fezes humanas e de outros animais so E.coli ( SILVA et al,
2005).
A portaria N 518 de 25 de maro de 2004 estabelece os procedimentos e
responsabilidade relativo ao controle e vigilncia da qualidade da gua para
consumo humano e seu padro de potabilidade, onde deve apresentar
ausncia de coliformes fecais (termotolerantes) e totais em 100 ml de gua.
A tcnica de enumerao de microrganismos por NMP inclui as seguintes
etapas analticas:
a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na srie de tubos
mltiplos). Recupera clulas injuriadas.
b) Teste confirmatrio (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo
em caldo de maior impedincia ou em gar seletivo diferencial para o
microrganismo pesquisado).
c) Teste completo identificao bioqumica da (s) espcie (s) microbiana (s)
presente(s).
Para aplicar a tcnica NMP e determinar fecais (E.Coli) no teste presuntivo
utiliza-se o caldo lauril triptose (caldo LST) que possibilita a recuperao de
clulas injuriadas e permite uma adaptao inicial as condies restritas que
selecionam os coliformestotais, capazes de fermentar a lactose com
produo de gs (capturado nos tubos de Duran), quando incubadas 3537C, por 48 horas. No teste confirmativo, se tem a confirmao de
coliformes fecais, utiliza-se o caldo lactosado bile verde brilhante (caldo
VBBL) com crescimento de gs (capturado nos tubos de Duran) quando
incubados 35C, por 24 48 horas. E por fim, o teste completo utiliza-se o
caldo EC, onde os microrganismos continuam fermentando a lactose com
produo de gs (capturado nos tubos de Duran), quando incubados a
temperatura de 44,5-45,5C por 24 horas tendo como objetivo a E.Coli.
Para determinar os microrganismos produtores de gs atravs da tcnica
NMP os tubos positivos so aqueles que formam uma bolha de gs no tubo
de Duran que este, est invertido dentro do tubo de ensaio como mostra na
figura 1. Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas
somente as 3 diluies mais significativas.
Figura 1: tubo positivo

[pic]
A concentrao de coliformes totais relacionada com a qualidade higinica
dos alimentos, sendo altas concentraes indicativas de limpeza e
higienizao deficientes, tratamento trmico ineficiente. J uma alta
concentrao de coliformes fecais indica contaminao de um alimento com
matria de origem fecal, j que assuma-se que haja um alto percentual de
E.Coli dentre os coliformes fecais.
A combinao de tubos negativos e positivos na tcnica do NMP permite
estimar, por clculo de probabilidade, a densidade do (s) microrganismo (s)
alvo naamostra. Os clculos podem ser feitos usando vrias frmulas, mas,
para as combinaes de tubos positivo e negativos que ocorrem com mais
freqncia, os valores j foram calculados e tabulados em tabelas de NMP,
no sendo necessrio o uso de frmulas (SILVA et al, 2007).
MATERIAIS E MTODO
MATERIAIS
Estufa a 35C
Bico de Bunsen
Pissetas com lcool 70% iodado
Algodo
Tubos de Duran (um para cada tubo de ensaio)
9 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo LST
Pipetas de 10 ml
MEIOS DE CULTURA
Caldo Lauril Sulfato Triptose (caldo LST)
DESCRIO DA AMOSTRA
gua coletada por alunos e funcionrios no bebedouro da granja do Instituto
Federal do Rio Grande do Sul Campus Bento Gonalves.
METODOLOGIA
Teste presuntivo
Homogeneizou-se a amostra
Colocou-se 10 ml da amostra nos 9 tubos que contm o caldo LST
Incubou-se a 35C durante 48 horas
Decorrido o tempo de incubao separar os tubos positivos, ou seja, que
apresentarem gs no interior do tubo de Duran.
RESULTADOS E DISCUSSO
A anlise de contagem de microrganismos pelo nmero mais provvel teve
de amostra a gua do bebedouro da granja. Em que foi feito por diluio
nica, pipetando-se 10 ml da amostra para cada tubo (9 tubos) com caldo
LST e posterior incubao a 35C, onde depois de 24 horas tivemos a
primeira leitura, onde no apresentou formao de gs e turvamento em

nenhum dos tubos. Depois de 48 horas fizemos a segunda leitura tendo


como resultado negativo (sem formao de gs eturvamento nos tubos).
Sendo assim, no prosseguindo com o teste confirmativo e o completo.
Portanto, podemos afirmar que segundo a tcnica de NMP a gua do
bebedouro da granja no possui coliformes totais, tendo como resultado
negativo, sem formao de gs, ou seja, nos tubos de Duran no houve
formao de bolhas de ar.
O resultado encontrado foi o esperado, pois sabemos que na granja no tem
ou no teve surtos de infeco, intoxicao ou toxinfeco por coliformes.
CONCLUSO
A determinao do nmero de microrganismos presentes em um alimento
pode ser feito pela tcnica do nmero mais provvel (NMP) que se pode
obter informaes sobre a populao presuntiva (teste presuntivo), real
(teste confirmativo) e a verdadeira espcie (teste completo) de
microrganismos.
A tcnica NMP para determinar coliformes (formadores de gs), foi
considerada eficiente na anlise da gua, onde no foi detectado coliformes
totais, sendo assim passando apenas pelo teste presuntivo.