Freitas FAD, Siqueira HR, Albano RM .

Mtodos moleculares na tuberculose e resistncia do Mycobacterium tuberculosis

Curso de temas avanados de tuberculose - aula 12

Mtodos moleculares no diagnstico da tuberculose e na

resistncia do Mycobacterium tuberculosis s drogas.
Molecular methods in diagnosis of tuberculosis and resistance
of Mycobacterium tuberculosis to drugs.
Flvia A. D. de Freitas1, Helio R. de Siqueira2, Rodolpho M. Albano1.

Resumo

A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, a doena infecto-contagiosa, produzida por um nico microorganismo, que mais causa bitos de indivduos adultos no mundo. O objetivo deste artigo revisar a metodologia para a
identificao do Mycobacterium tuberculosis e analisar a resistncia aos medicamentos isoniazida e rifampicina, no tratamento desta doena, por mtodos de biologia molecular que so cada vez mais utilizados, por sua grande sensibilidade e
especificidade, apesar do custo ser ainda elevado.
Descritores: tuberculose, diagnstico, biologia molecular.

Abstract

Tuberculosis is an infection contagious disease caused by Mycobacterium tuberculosis and has been described as the main
responsible by adult death, by the only one microorganism, in the World. The aim of this article is a review of methodology to
identify the Mycobacterium tuberculosis and to analyze the resistance for isoniazid and rifampicin by biological and molecular
methods, which have been used more frequently due to high sensibility and specificity, in spite of their high price.
Keywords: tuberculosis, diagnosis, molecular biology.

Introduo
Atualmente a tuberculose (TB) a doena infecto-contagiosa, causada por um nico microorganismo, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que mais causa bitos de indivduos adultos no mundo. Estima-se
que, nesta dcada, ocorrero mais de 80 milhes de
novos casos e 20 milhes de bitos. A maioria destes
pacientes encontra-se em pases do terceiro mundo,
onde a associao de polticas inadequadas de sade
pblica e uma situao socioeconmica desfavorvel
contribui para a manuteno deste flagelo. Com a
pandemia do HIV/AIDS, os pases do primeiro mundo

tambm tiveram um aumento no nmero de casos da

doena, com a transmisso ocorrendo, principalmente, em hospitais e prises.1
Com exceo das quinolonas, antibitico inicialmente desenvolvido para combater infeces
por germes comuns, mas que tem poder bactericida
sobre o Mtb, h mais de 40 anos no surge um novo
medicamento para o tratamento da TB, enquanto
a resistncia primria vem aumentando gradativamente no mundo, com o surgimento de multirresistncia (MR) resistncia, pelo menos, isoniazida
(INH) e rifampicina (RMP) - e de TB-XDR - TB MR

1. Laboratrio de Genoma. Departamento de Bioqumica, Instituto de Biologia Roberto Alcntara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
2. Disciplina de Pneumologia e Tisiologia, Faculdade de Cincias Mdicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
Trabalho realizado no Laboratrio de Genoma. Departamento de Bioqumica, Instituto de Biologia Roberto Alcntara Gomes, Universidade do Estado do Rio
de Janeiro (UERJ). No h conflito de interesses.
Endereo para correspondncia: Helio Ribeiro de Siqueira. Rua Pontes Correa, 38, apto. 501, Tijuca, CEP 20510-050, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Tel: 55 21 2208-0015.
E-mail: drhelio@infolink.com.br.
Recebido em 22/05/2009 e aceito em 30/06/2009, aps reviso.

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com resistncia associada a uma quinolona e a um

medicamento injetvel (amicacina, canamicina ou
capreomicina). Estes fatos trazem a necessidade de
se diagnosticar rapidamente os casos MR para uma
terapia eficaz.
MTODOS CONVENCIONAIS DE DIAGNSTICO DA
TUBERCULOSE E DE RESISTNCIA
Com o aumento progressivo da resistncia primria no mundo, a cultura para micobactrias e o
teste de sensibilidade aos medicamentos deveriam
ser realizados j no incio do tratamento. Mas estes
exames se tornam muito importantes, diramos obrigatrios, nos casos em que a baciloscopia do escarro
permanece positiva aps o segundo ms de tratamento, ou negativa inicialmente e positiva, a seguir,
durante o tratamento. A mesma necessidade de cultura e teste de sensibilidade tem que ser considerada
nos casos de recidiva, de contato com pessoas com
suspeita de terem TB resistentes, de pacientes HIV
que adquirem TB em ambiente hospitalar, de presos
ou de pessoas em abrigos e de profissionais de sade
que adoecem.
Os testes de sensibilidade aos frmacos utilizados no tratamento requerem o isolamento do M. tuberculosis do espcime clnico em um meio de cultura adequado, como o de Lwenstein-Jensen e Ogawa. Essa etapa de isolamento do bacilo bastante
lenta (trs a seis semanas). Vrios mtodos podem
ser utilizados para testar a sensibilidade do M. tuberculosis, sendo o das propores o mais empregado.2
Os resultados desse mtodo so reportados como a
percentagem do total da populao bacteriana resistente a um determinado frmaco. Isto definido
pela quantidade do crescimento no meio de cultura
contendo o frmaco, quando comparado ao crescimento em meio sem o frmaco. Este mtodo necessita de 28 dias para ser concludo (aps a cultura inicial), tempo por demais dilatado para uma deciso
clnica. Mtodos alternativos e mais rpidos tambm
podem ser utilizados como MODS - observao microscpica da sensibilidade s drogas - que detecta
precocemente o crescimento do M. tuberculosis em
meio lquido e determina o teste de sensibilidade
(mas com risco de contaminao do profissional
durante o procedimento) e o mtodo Alamar Blue,
que um corante indicador que mede a proliferao
da micobactria, quantitativamente, atravs da oxidao-reduo (REDOX), produzindo uma mudana
colorimtrica.
O teste de sensibilidade para isolados de M. tuberculosis tambm pode ser realizado por tcnicas
automatizadas, como o sistema BACTEC MGIT 960
(Mycobacteria Growth Indicator Tube). Esse mtodo
pode reduzir o tempo de identificao dos microorganismos resistentes aos frmacos para trs semanas,
mas dispendioso para uso hospitalar de rotina.3

MTODOS MOLECULARES NO DIAGNSTICO DA

TUBERCULOSE
Os mecanismos genmicos associados multirresistncia do M. tuberculosis geralmente envolvem
mutaes nos genes que codificam determinadas protenas, que so inibidas pelas drogas ou que as metabolizam. As mutaes podem produzir trocas de aminocidos, que geram uma protena com menos atividade ou afinidade pela droga, ou modificar a ao dos
promotores dos genes, alterando a expresso gnica.
Cada droga apresenta, pelo menos, uma protena envolvida em seu metabolismo, que pode ser modificada
por mutaes genticas. Atravs de mtodos moleculares, estas mutaes podem ser detectadas com rapidez, alta sensibilidade e especificidade.
PCR Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
A PCR a tcnica onde uma curta regio de um
gene, de um determinado DNA, copiada muitas vezes por uma enzima DNA polimerase. As seqncias de
nucleotdeos das extremidades da regio a ser amplificada devem ser conhecidas para que dois pequenos
oligonucleotdeos (iniciadores) possam hibridizar (se
ligar) com a molcula de DNA, cada um com uma das
fitas da dupla hlice (Figura 1).
Para iniciar uma amplificao por PCR, prepara-se uma mistura (mix) com os quatro tipos de
nucleotdeos (dNTPs), magnsio, enzima DNA polimerase, tampo da enzima e os oligonucleotdeos.
Em seguida, essa mistura aquecida a 95C para a
desnaturao (separao) da dupla fita do DNA. Assim, cada fita de DNA-molde fica livre para, em uma
temperatura mais baixa, os iniciadores se hibridizarem, permitindo que a DNA polimerase sintetize
as novas fitas complementares. Em um novo ciclo,
a mistura ento reaquecida a 95C, para que as
fitas recm-sintetizadas se separem (desnaturao)
e resfriadas, permitam que mais iniciadores se hibridizem com estas fitas, repetindo-se os ciclos com
a formao de outras fitas complementares. As reaes de PCR se fazem de maneira exponencial e,
em uma reao de 35 ciclos, por exemplo, ocorrem
2 (35+1) = 236 = 68 bilhes de cpias (amplicons) da
regio desejada do gene. O resultado da reao
lido por eletroforese em gel de agarose. Atualmente
a tcnica de PCR em tempo real (RT PCR) executa as
reaes e reproduz o resultado automaticamente.
Esta sigla muitas vezes confundida com a tcnica
de transcriptase reversa PCR usada para amplificar
fitas de RNA.
A PCR tem sido amplamente utilizada em biologia
molecular, devido a sua rapidez e eficcia. Para o diagnstico de TB em material de escarro, esta tcnica possui mdia sensibilidade (65%) e grande especificidade (acima
de 90%), e pode ser realizada em algumas horas. Algumas limitaes so a possibilidade de contaminao da
amostra (o que pode gerar um resultado falso positivo), a
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presena de protenas inibidoras da reao (o que geraria

um resultado falso negativo) e o custo desta metodologia, que ainda elevado. A sensibilidade do mtodo se
prende, ainda, ao nmero de bacilos presentes no es-

carro. Quando o escarro positivo na pesquisa de BAAR

(presena de 5 mil a dez mil bacilos por mililitro), a reao
de PCR positiva e sua sensibilidade cai com o menor nmero de bacilos existentes no material analisado.

A. cadeia de aminocidos codificada. Cada trs nucleotdeos condifica um aminocido.

B. PCR - exemplo de escolha dos oligonucleotdeos. Tendo-se apenas a fita superior, o oligonucleotdeo anti-senso vai ser o inverso do seu complemento. A seguir
mostra-se a amplificao por PCR de um segmento do gene.

Figura 1 Cpias do fragmento de DNA desejado (amplicons).

Para otimizao do diagnstico de tuberculose pela

PCR, e para que sejam minimizadas as possibilidades de
resultados falso negativos ou positivos, o CDC (Centers
for Disease Control and Prevention) padronizou e publicou
um quadro de regras a serem seguidas (Figura 2). Como
pode ser observado, se a pesquisa BAAR de um paciente
apresentar resultado negativo, devem ser realizadas duas
PCRs. Sendo os dois resultados positivos, o diagnstico de
tuberculose determinado; sendo um positivo e outro ne98

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gativo, necessrio que se repita o procedimento e sendo

os dois negativos, o diagnstico de TB descartado. Entretanto, se a pesquisa de BAAR apresentar resultado positivo, e a reao de PCR for positiva, confirma-se o diagnstico especfico de Mycobacterium tuberculosis e sendo negativa, a PCR repetida. Esta segunda PCR, ao apresentar
novamente resultado negativo, aponta para duas possibilidades: a presena de inibidores na reao ou a presena
de Mycobacterium no tuberculosis no paciente.

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TB diagnstico de tuberculose (Mycobacterium tuberculosis).

MNTB Mycobacterium no tuberculosis.

Figura 2 Quadro de regras do CDC para diagnstico da tuberculose

por PCR.

Alm da reao em cadeia da polimerase in house, existem kits comerciais para o

diagnstico da tuberculose. Dentre os kits
existentes, apenas o AMTD, o Amplicor e
o EMTD foram aprovados pela FDA (Food
and Drug Administration), para amostras
respiratrias com baciloscopia positiva, e
apenas o EMTD foi aprovado para amostras
com baciloscopia negativa.

A RMP inibe a transcrio gnica da micobactria

por bloqueio da RNA-polimerase DNA dependente, o
que impede a sntese de RNA mensageiro (mRNA), produzindo morte celular.6 Cerca de 95% das cepas resistentes rifampicina apresentam mutaes na regio
central do gene rpoB que codifica a subunidade beta
da RNA polimerase. As mutaes modificam a estrutura desta enzima, fazendo com que a RMP perca a capacidade de bloque-la, liberando a sntese de mRNA.
A regio que codifica a subunidade beta da RNA polimerase, denominada rifampicin resistance determining
region (RRDR) ou hot spot, possui 81 pares de base (27
cdons) e delimitada pelos cdons 507 a 533 (Figura
4), o que facilita o diagnstico molecular de resistncia.11,12 As mutaes mais freqentes nesta rea ocorrem nos cdons 526 e 531.13,14

A marcao em negrito indica o cdon 315 onde ocorre o maior nmero de mutaes que produzem mudana do aminocido agc serina por acc treonina e resistncia INH.. Aminocidos: Lys
lisina; Ser serina; Gly glicina; Thr treonina; Asp cido asprtico, Ala alanina; Ile isoleucina;
Glu cido glutmico; Val valina. O gene katG tem 2224 nucleotdeos. E 741 cdons.

Figura 3 Gene katG: cdons de 301 a 320.

DIAGNSTICO DE MULTIRRESISTNCIA
POR BIOLOGIA MOLECULAR
Ao contrrio da resistncia RMP,
em que a maioria das mutaes se concentra em uma pequena faixa de um s
gene, a resistncia INH mais comple- Os cdons 507 e 533 (setas) delimitam a regio hot-spot. O cdon 531 (serina) o que sofre maior
xa, pois pode ocorrer por mutaes em nmero de mutaes, que se traduzem em resistncia RMP.
vrios genes, sendo os mais importantes Figura 4 Pequena parte do gene rpoB.
o katG (32 a 93% dos casos) e o inhA (de
15 a 25%).4
Sequenciamento de genes
O gene katG codifica a enzima catalase-peroO seqenciamento do gene, para o diagnstico
xidase, importante no metabolismo do bacilo.5 Esta
de mutaes, realiza-se com a reao de PCR, numa
enzima ativa a INH, que uma pr-droga, produzinfase anterior, que delimita a regio a ser analisada. A redo radicais reativos de oxignio (superxido, pergio delimitada produz uma seqncia de nucleotdexido de hidrognio, peroxinitrato) e radicais orgnios, que alinhada com a seqncia de referncia para
cos que inibem a formao de cidos miclicos da
o M. tuberculosis, para a determinao das mutaes e,
parede bacilar e produzem dano no DNA.6,7 A mutaconseqentemente, da resistncia especfica a um fro mais comum no gene katG surge no cdon 315
maco. O seqenciamento depende de aparelhos caros
(Figura 3) pela substituio do aminocido serina
e a tcnica trabalhosa, embora os resultados sejam
(AGC) por treonina (ACC), com diminuio da ao
altamente confiveis e possam ser utilizados como
catalase, o que resulta em resistncia INH.8 O gene
padro ouro para o desenvolvimento de mtodos de
inhA codifica a enzima carreadora de enoil acil
biologia molecular, para o diagnstico de mutaes de
(ACP) redutase - NADH dependente, importante na
forma mais rpida e simples.
sntese de cidos miclicos. Um dos produtos da INH
ativada o radical acil isonicotnico liga-se NADH
Testes rpidos em biologia molecular para o diag(nicotinamida adenina dinucleotdeo) e impede a
nstico de mutaes
atividade da enzima, resultando na morte da bactO mtodo INNO-LiPA Rif. TB especfico para a
ria, por interferncia na sntese do cidos miclicos.9
RMP e identifica as mutaes mais comuns na RRDR.15,16
A mutao estrutural do gene inhA faz com que a
Os mtodos Genotype MTBDR Assay e Real-Time PCR
enzima modificada perca afinidade pela NADH e a
diagnosticam mutaes tanto na RRDR quanto no cbactria se torna resistente INH.10
don 315 do gene katG.17,18,19 Estes mtodos dependem
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de kits, que tambm so de alto custo para uso em instituies pblicas. O mtodo MTBDR-plus capaz de
diagnosticar as mutaes mais freqentes nos genes
rpoB e katG, e vem sendo recomendado pela Organizao Mundial de Sade por ser menos dispendioso e
analisar 40 amostras simultaneamente. Mokrousov e
colaboradores20 utilizaram, em seu trabalho, a tcnica
de PCR-RFLP (PCR-restriction fragment lenght polymorphism), que usa a enzima de restrio HAPII para diagnosticar a mutao no cdon 315 (Serina AGC para Treonina ACC). Este mtodo tem sido importante como
um marcador de resistncia para a INH, no noroeste
da Rssia, por ser rpido, ter baixo custo, apresentar
manipulao simples e ser fcil de interpretar. O mtodo requer, apenas, aparelhagem padro de PCR e de
eletroforese. Novas pesquisas precisam ser realizadas
para avaliar melhor esta tcnica.
IS6110-RFLP
O IS6110-RFLP (restriction fragment length polymorphism) possibilita uma anlise genotpica e, conseqentemente, o entendimento da epidemiologia
da tuberculose. A seqncia de insero IS6110 est
presente no genoma de muitas cepas do complexo
M.tuberculosis, em um nmero varivel de cpias. A
anlise por RFLP com o IS6110 provou ser um conveniente e confivel mtodo para diferenciao de cepas
de M. tuberculosis, sendo considerado o mtodo de
padro-ouro na genotipagem molecular do M. tuberculosis, com um alto poder discriminatrio.21
Resumidamente, esta tcnica consiste na digesto das amostras isoladas de DNA, atravs de uma endonuclease de restrio. Esta enzima cliva o DNA em
um stio especfico, e cada seqncia IS6110 apresenta
apenas um stio de restrio para esta enzima. Como
esta seqncia apresenta-se em nmero varivel e em
mltiplas cpias no genoma do M. tuberculosis, o paReferncias

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dro de bandas gerado pela digesto permitir a diviso das amostras analisadas em clusters.
Mtodo de Spoligotyping
A tcnica de tipagem molecular pelo Spoligotyping uma tcnica baseada em PCR, com a possibilidade de utilizao de menor quantidade de DNA. Este
procedimento, alm de ser mais rpido, facilita a investigao epidemiolgica em tempo real, tornando mais
rpida a tipagem molecular. O Spoligotyping, no qual
avalia-se o polimorfismo presente no locus DR (Direct
Repeat) encontrado exclusivamente no genoma das
micobactrias do complexo M. Tuberculosis, tem sido
utilizado em diversos estudos filogenticos.22
Uma particularidade do Spoligotyping classificar
as cepas de M. tuberculosis em determinadas famlias,
de acordo com o padro encontrado.23 Atravs desta
tcnica, foram determinadas as famlias predominantes em nvel mundial - Beijing, LAM (Latin-American
and Mediterranean), Haarlem e T - sendo mais encontradas, na sia, as cepas Beijing e, na Europa e Amricas, as cepas LAM.24
PRA PCR para identificao de espcies e subespcies de micobactrias
O PRA PCR consiste na anlise do padro de
restrio (PRA - Restriction Enzyme Pattern Analysis) de
produtos da amplificao de um fragmento de 439
pares de bases do gene hsp65. Aps a amplificao
deste gene, realizada a restrio dos fragmentos amplificados, atravs da digesto com as enzimas BstII e
HaeIII. A interpretao do padro de bandas gerado
por esta digesto permite a identificao de espcies
e subespcies de micobactria. Esta tcnica possui alta
acurcia, sendo mais rpida e menos dispendiosa que
a identificao fenotpica convencional, realizada por
meio de reaes qumicas.
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