11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

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11. ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

11.1. Introduccin
El agua es esencial en nuestra vida. Puede ser vector de grmenes peligrosos, por lo cual es
necesario determinar su potabilidad. Para ello deben realizarse una serie de anlisis fisicoqumicos y bacteriolgicos. Las pruebas bacteriolgicas tienen como objetivo determinar si
el agua contiene microorganismos fecales (no necesariamente patgenos), cuya presencia es
indicativa de contaminacin de origen animal o humano.
La presencia de un nico microorganismo patgeno es suficiente para provocar una
enfermedad a una persona. Ya que es imposible analizar el total de agua de consumo, se
controla la presencia de organismos indicadores que nos indicarn si una muestra de agua ha
estado en contacto con aguas residuales.
Los microorganismos ms abundantes en los intestinos humanos y por tanto en los
excrementos, son los coliformes y el estreptococcus. La presencia de estos microorganismos
(aunque no sean patgenos) indica contaminacin fecal y descartar dicha agua para el
consumo humano.
La aguas subterrneas profundas, que no tienen contacto con aguas residuales, a temperaturas
fras, carentes de materia orgnica, presentan condiciones poco idneas para el desarrollo de
microorganismos, por lo que difcilmente tendrn microorganismos patgenos.
11.2

POTABILIDAD DE UNA MUESTRA DE AGUA

Para considerar si un suministro de agua es o no apta para su consumo sta ha de someterse a

cuatro tipos de anlisis:

Anlisis qumico, donde se determinar su dureza, residuo seco, oxgeno disuelto,

pH, cloruros, sulfatos, as como otros productos qumicos nocivos; por ejemplo,
cobre, plomo, zinc, etc.

Examen fsico, que determinar la posible turbidez o no, el color, el sabor y olores
inadecuados, es decir, las propiedades organolpticos de las aguas.

Anlisis biolgico, que permite determinar la presencia de algas, protozoos, grupos

de nemtodos, larvas de insectos acuticos, etc.

Anlisis microbiolgico, que establece un examen y estudio de gran valor y vital

importancia en la prevencin de epidemias resultantes de la contaminacin de aguas.
Con este tipo de anlisis se determinar el nmero de bacterias presentes en el agua
as como la presencia o ausencia de bacterias del grupo coliforme y Streptococus
faecalis, cuya presencia es indicativo de contaminacin fecal y, por tanto, de la
posible presencia de cepas microbianas patgenas responsables de enfermedades,
tales como las fiebres tifoideas, fiebres paratifoideas, disentera, clera, etc.

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11.3. CARACTERES Y CLASIFICACIN SANITARIA DE LAS AGUAS

En general, todas las aguas van a poder ser clasificadas desde un punto de vista sanitario en
funcin de una serie de caracteres orientadores de la calidad de sta, de acuerdo con el
reglamento tcnico-sanitario para el abastecimiento y control de la calidad de las aguas
potables de consumo pblico.
AGUAS POTABLES
Reglamentacin tcnico-sanitaria para el abastecimiento y control de calidad de las aguas
potables de consumo pblico. Real Decreto el 18-junio-1982. (BOE del 29-6-1982).
Aguas potables son aqullas cuyos caracteres organolpticos, fsico-qumicos y
microbiolgicos corresponden a los aceptados por la reglamentacin tcnico-sanitaria para el
abastecimiento y control de calidad de las aguas potables.
Carcteres microbiolgicos:
Caracteres orientadores de calidad:

Hasta 100 bacterias aerobias por ml de agua a 22 C.

Hasta 10 bacterias aerobias por ml de agua a 37 C.
Ausencia total de bacterias coliformes, Streptococcus faecalis en 100 ml de agua.
Ausencia de esporos de clostridios sulfitos reductores en 20 ml de agua.
Ausencia de microorganismos parsitos y/o patgenos.
Ausencia total de elementos formes que pudieran ser apreciados a simple vista.
Como lmite mximo se permite un contenido total de 200 bacterias aerobias por ml
de agua a 37 C.

Aguas santariamente permsibles: son aqullas en las que algunos de sus caracteres fsicoqumicos sobrepasan los lmites tolerables, sin presentar productos txicos, ni elementos
radiactivos, ni contaminacin fecal. Su consumo ser excepcional y con carcter temporal.
Carcteres microbiolgicos:

Bacterias aerobias (lo que salga)

Coliformes totales 10 / 100 ml.de agua
Coliformes fecales ausencia / 100 ml de agua
Streptococcus 10 / 100 ml de agua
Clostridios sulfitos reductores 2 / 20 ml de agua.

Aguas no potables: son aqullas cuyos caracteres fsico-qumicos y/o caracteres

microbiolgicos o de radiactividad hacen imposible su distribucin y consumo, quedando
prohibido su uso.

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

135

11.4. TOMA DE MUESTRA DE AGUAS PARA ANLISIS MICROBIOLGICO

11.4.1 Objetivo: Obtener del agua a analizar una cantidad de muestra suficiente para poder
determinar a partir de ella su calidad microbiolgica de inters sanitario.
Tomas de muestra. Tipos:

Muestras simples. Se toman en un lugar determinado para anlisis individual. En el
caso de anlisis microbiolgico de aguas, las muestras a analizar son siempre simples,
es decir, se toman en un punto de la zona de muestreo.

Muestras compuestas. Se toman muestras simples en el mismo punto pero en
diferentes tiempos y se homogenezan.

Muestras integradas. Consiste en la homogeneizacin de muestras simples en
distintos puntos y recogidas al mismo tiempo.
11.4.2 Material utilizado: Las muestras debern ser recogidas en recipientes de vidrio
neutro e incoloro de boca ancha y con tapn a ser posible de vidrio esmerilado. Tal recipiente
no deber desprender nunca materia orgnica ni elementos alcalinos que pudieran contaminar
la muestra, por ejemplo, el slice. No reaccionar con ningn componente de la muestra y
podr ser cerrado y sellado hermticamente. En algunas ocasiones, se podrn utilizar envases
de plstico.
11.4.3 Volumen de la muestra: El volumen considerado adecuado para el anlisis
bacteriolgico se tomar en una sola muestra cuyo recipiente deber presentar una capacidad
mnima de
250 ml, siendo conveniente utilizar otros de mayor capacidad.
11.4.4 Precintado y rotulacin: El frasco de la toma de muestra ser rotulado antes de la
toma de sta. Con un rotulador resistente al agua y con una referencia que permita
identificarla correcta mente. La rotulacin deber indicar:

Datos de quin solicita el anlisis con la direccin completa incluyendo la entidad a
que pertenece.

Datos del origen del agua, como por ejemplo, lugar, trmino municipal, provincia,
fecha y hora de la captacin, etc.

Indicar si el agua es natural o tratada, o si sufre algn tipo de depuracin, etc.
11.4.5 Conservacin: El material para anlisis microbiolgico deber estar esterilizado
previamente en autoclave (120 C, 30') o en el horno Pasteur a 180 C durante 2 horas. Una
vez recogida la muestra, sta deber ser examinada en el menor tiempo posible.
Para aguas impuras el tiempo mximo a transcurrir ser de 6 horas. Para aguas relativamente
puras, 12 horas, Las muestras se mantendrn durante este tiempo a temperaturas
comprendidas entre 6 y 10 C
Si el anlisis se realizase sobre aguas de piscinas, se podr aadir tiosulfato sdico de 20 a
50 mg o 0,2 ml cuando dicho tiosulfato presente una riqueza del 3% en un volumen total de
250 ml de muestra, con el fin de neutralizar el cloro residual y evitar la destruccin de las
bacterias en el tiempo que transcurre desde la toma de la muestra a su posterior anlisis.
Las muestras debern mantenerse en oscuridad y se conservarn un mximo de 24 horas
siempre y cuando su temperatura haya sido 6 C ( ! 2 C).

136

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

11.4.6 Toma de la muestra: Si como muestra problema se emplea agua de origen natural,
un aspecto importante es el mtodo de toma de la muestra. sta debe ser:

Recogida en condiciones de esterilidad para asegurar que los microorganismos

encontrados en el anlisis provienen exclusivamente del agua que hay que analizar.
Representativa de la procedencia. Por ello los mtodos de toma de muestra variarn
en funcin del origen de las aguas (fuentes, ros, grifos, pozos, etc.)
Recogida en cantidad suficiente: el volumen variar segn el tipo de anlisis.
Etiquetada en el momento de su recogida indicando los datos que puedan resultar ms
interesantes: lugar exacto de la toma, presencia cercana de letrinas o basureros,
temperatura, fecha, nombre de la persona que la recogi, etc.
Analizada lo antes posible. Si no es posible, se conservar en refrigeracin hasta su
anlisis.

11.5. DETERMINACIONES MICROBIOLGICAS EN AGUAS

Agua de consumo poco contaminada
Agua de consumo muy contaminada
Agua contaminada (segn tipos)

Aerobios
1 ... -1
1 ... -3
-1 ... -5

Coliformes
10 1 -1
10 ... -3
-1 ... -6

11.5.1. Recuento de bacterias aerobias a 37 C y 22 C

Son todas aquellas bacterias hetertrofas aerobias y anaerobias facultativas mesfilas y
psicotrficas capaces de crecer en agar nutritivo. En este grupo se incluyen bacterias
patgenas y no patgenas. Nos permite conocer la calidad microbiolgica del agua. Unas
tasas altas indican que el agua no es apropiada para el consumo humano.
Mtodo de las diluciones decimales
1. A partir de 100 ml de muestra problema de agua realizar las diluciones decimales
seriadas que se consideren convenientes .
2. Aadir 1 ml de cada dilucin a las respectivas placas de Petri vacas para la siembra
de los microorganismos en profundidad.
3. Verter unos 20 ml por placa de PCA fundido y atemperado a 45-50 C.
4. Homogeneizar la muestra deslizando la placa sobre la mesa con cuidado.
5. Una vez que haya solidificado el agar, incubar las placas:
a. 48 h. a 37 C.
b. 72 h. a 22 C.
1. Realizar el recuento de colonias y expresarlo en ufc/ml.
2. Observar y describir las diversas morfologas coloniales desarrolladas.
11.5.2. Recuento de coliformes totales (prueba presuntiva).
Las Enterobacteriaceae lactosa-positivas o grupo col-aerogenes constituyen un grupo de
bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios
taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad
para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un
periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37 C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, oxidasa negativas, no
esporulados.

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

137

El grupo coliforme pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios gneros:

Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Se encuentra en el intestino del hombre y
de los animales, pero tambin en otros ambientes como suelo, plantas, etc., por lo que como
indicadores de contaminacin fecal no son totalmente confirmativos. Sin embargo, su
frecuencia en las heces, su fcil deteccin y la posibilidad de que junto a ellos existan
microorganismos patgenos hacen que se empleen como principales indicadores de
contaminacin fecal. La determinacin se realiza por la tcnica del nmero ms probable
(NMP).
Determinacin de coliformes totales por el mtodo del NMP
1. Disponer 6 series de 3 tubos con 10 ml. de caldo lactosado (Lauril Triptosa, Prpura
de bromocresol, Mc.Conkey), 5 series a concentracin normal (% 1), 1 serie a
concentracin doble (% 2) en tubos grandes.
2. Colocar una campana de Drham en posicin invertida en cada tubo.
3. Esterilizar en autoclave.
4. Aadir con pipetas estriles:

10 ml de la muestra inicial a 3 tubos (% 2)

1 ml de cada una de las diluciones a 3 tubos (% 1)
5. Incubar los tubos a 37 C durante 24-48 h.
6. Se consideran positivos los tubos que tras la incubacin producen gas (al menos un
10 % del volumen de la campana Drham), y el viraje del indicador, por la
fermentacin cida de la lactosa.
7. Determinar el NMP de coliformes totales/100 ml de agua a partir de los tubos
positivos (tabla 11.1).
11.5.3.

Recuento de coliformes fecales (Prueba confirmativa)

Dentro del grupo de coliformes, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario
y, por consiguiente, los que ms interesan en el anlisis microbiolgico de alimentos.
Se considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. Sus principales
caractersticas son ademas de las sealadas para la familia Enterobacteriaceae y para el grupo
coliformes:

Capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44,5 C en 24 h.

Capacidad para crecer en presencia de sales biliares.
Facultad para producir indol en agua de peptona.

El grupo de los coliformes fecales incluyen nicamente 9 especies pertenecientes a los 4

gneros (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter) citados en el apartado
coliformes totales. Su presencia en un alimento est todava ms estrechamente ligada con
una contaminacin de origen fecal del mismo (prueba confirmativa). Deben someterse a esta
prueba todos los tubos que hayan dado positivo (tambin los casos dudosos) en la prueba
presuntiva de coliformes totales.

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

138

Mtodo de las diluciones decimales

1. Resembrar con 2 asas de kolle de cada tubo positivo, en un medio confirmativo de
coliformes fecales (EC, prpura de bromocresol, agar Levine) .
2. Despus de 30 min., incubar durante 24 h. a 44 C.
Lectura de los tubos. Un crecimiento bacteriano con produccin de gas confirma la presencia
de coliformes fecales. La prueba complementaria de produccin de Indol son confirmativas
de E. coli. Contabilizar los tubos que hayan dado positivo y hacer el clculo del NMP

Fig. 11.1 Coliformes totales y coliformes fecales

11.5.4.

Recuento de estreptococos fecales

139

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

Son cocos Gram positivos, anaerobios facultativos, catalasa negativa que fermenta en la
glucosa con produccin de cido y gas a 37 C. Son grmenes cuyo hbitat normal es el tubo
digestivo del hombre y los animales de sangre caliente, por lo que se utilizan como
indicadores de contaminacin fecal.
El grupo comprende las siguientes especies de Streptococcus: faecalis, durans, bovis y
equinus. Todas ellas estn comprendidas en el grupo serolgico D de Lancefield. Al contrario
que el resto de Estreptococos, el grupo fecal es resistente a la azida (germicida).

Fig. 11.2

140

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

Mtodo de las diluciones decimales. La determinacin se efecta por el mtodo del NMP,
prueba presuntiva y confirmativa.
a. Prueba presuntiva
1. Disponer 6 series de 3 tubos con 10 ml. de caldo azida de Rothe, 5 series a
concentracin normal (% 1), 1 serie a concentracin doble (% 2) en tubos
grandes.
2. Esterilizar en autoclave.
3. Aadir con pipetas estriles:

10 ml de la muestra inicial a 3 tubos (% 2)

1 ml de cada una de las diluciones a 3 tubos (% 1)
4. Incubar los tubos a 37 C durante 24-48 h.
5. Se consideran positivos los tubos que tras la incubacin presenten
enturbiamiento o sedimento.
a. Prueba confirmativa
1. A partir de cada tubo de caldo Rothe positivo homogeneizar el medio y
sembrar 2 asas de Kolle en tubos de caldo de Litsky (EVA).
2. Incubar a 37 C durante 24-48 h.
3. Hacer recuento de tubos positivos. Se consideran positivos los tubos que
presenten enturbiamiento y/o sedimento de color violeta.
4. Determinar el NMP de estreptococos fecales/100 ml de agua a partir de los
tubos positivos.
Tabla n 11.1. Tabla para la obtencin del nmero ms probable (NMP)
Nmero de tubos que dan reaccin
Lmite de confianza
positiva
del 95 %
NMP
3 tubos de
3 tubos de
3 tubos de
Lmite
Lmite
10 ml
1 ml
0,1 ml
inferior
superior
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

0
1
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3

1
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2

3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1.100

< 0,5
< 0,5
< 0,5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150

9
13
20
21
23
36
36
36
36
37
44
89
47
149
120
130
379
210
230
380
440
470
1.300
2.400
4.800

141

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

Clculo del nmero ms probable (NMP)

1.
2.
3.
4.
5.

Anotar, para cada serie de tres tubos, el nmero de los considerados positivos.
Determinar la secuencia de valores segn concentraciones en orden descendente.
Tomar un terno de cifras de manera que la ltima sea 0.
Obtener de la tabla del NMP, el valor correspondiente al terno seleccionado.
Multiplicar este valor por el inverso del valor de la dilucin que corresponda a la
inoculacin central del terno considerado.
Este resultado ser la concentracin de microorganismos en 100 ml de agua obtenida por el
mtodo de valoracin del NMP.
MTODO DE LAS MEMBRANAS FILTRANTES.
Determinacin de aerobios totales, coliformes, estreptococos.
1. Preparar el equipo de filtracin.
2. Filtrar 100 ml de la muestra de agua problema mediante vaco, de manera que los
microorganismos presentes queden retenidos en el filtro de membrana.
3. Filtrar 10 ml. de agua de peptona
4. Retirar el filtro de membrana con ayuda de unas pinzas estriles y colocarlo en la
superficie de una placa del medio correspondiente (PCA, VRBG,...).
5. Incubar 24-48 h a 37 C.
6. Efectuar el recuento de colonias. El resultado se expresa en UFC/100 ml.

Fig. 11.3

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

11.5.5.

142

Recuento de esporas de clostridios.

El grupo bacteriano de los sulfito-reductores est integrado por grmenes pertenecientes al

gnero Clostridium, que tienen en comn reducir el sulfito a sulfuro. El sulfuro con el hierro
forma el sulfuro de hierro que produce un halo de color negro.
Se utilizan como indicadores de la calidad higinica del agua. Si bien, en ocasiones, son de
origen telrico, su presencia, acompaada de coliformes y/o estreptococos, viene a confirmar
la contaminacin fecal..
Son bacterias de morfologa bacilar, Gram positivos, anaerobios estrictos. La capacidad de
esporular de este grupo de microorganismos, les confiere una gran resistencia
A. Determinacin de formas vegetativas y esporuladas de Clostridium sulfitoreductores
1. Preparar el medio de cultivo agar-sulfito-polimixina-sulfadiazina (SPS). .
2. Aadir 15 ml de SPS a 2 tubos estriles de 16 x 160 mm. Esterilizar y enfriar
rapidamente al sacar del autoclave, mantener atemperado a 45-50 C.
3. Preparar diluciones decimales 1, -1, -2, -3 de la muestra de agua.
4. Sembrar 1 ml. de cada dilucin, en los tubos con el medio atemperado. La
siembra se hace introduciendo la pipeta con el inculo hasta el fondo del tubo
y depositndolo lentamente de abajo arriba.
5. Obturar los tubos aadiendo una capa de 1 cm de parafina estril.
6. En posicin vertical, colocar los tubos en una jarra para anaerobios. Eliminar
el oxgeno de la jarra mediante el "mtodo de la vela".
7. Incubar a 37 /46 C durante 24-48 h.
8. Recuento de puntos negros en el medio y calculo de n de ufc/ 20 ml agua.
B. Determinacin de formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores
Para obtener nicamente las formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores, se
aprovecha su termorresistencia calentando a 80 C el agua problema o las diluciones.
De esta manera se destruyen las formas vegetativas.
1. Se someten las diluciones decimales a una bao Mara de 80 C durante 5 min
2. Sembrar 1 ml de cada dilucin en tubos con agar SPS atemperado a 50 C. La
siembra se hace introduciendo la pipeta con el inculo hasta el fondo del tubo
y depositndolo lentamente de abajo arriba.
3. Obturar los tubos aadiendo una capa de 1/2 cm de parafina estril.
4. En posicin vertical, colocar los tubos en una jarra para anaerobios. Eliminar
el oxgeno de la jarra mediante el "mtodo de la vela".
5. Incubar a 37 C durante 24-48 h.
6. Recuento de puntos negros en el medio y calculo de n de ufc/ 20 ml agua.

Cuestionario aguas
1. Describe brevemente a que nos referimos cuando hablamos de los siguientes grupos de
bacterias. qu caractersticas fundamentales definen cada grupo?

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11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

a. Enterobacterias

b. Coliformesc. Coliformes fecales

2. Cuales son las principales causas de patogenidad en las enterobacterias.

3. Qu tipos de antgenos presentan las enterobacterias?
4. Explica porqu es de vital importancia, analizar el agua suministrada a comunidades?
5. Qu normas es preciso tener en cuenta en la toma y utilizacin de muestras de aguas para
realizar un anlisis microbiolgico, en cuanto a:

Recipiente utilizado

Volumen de la muestra

Precintado y rotulacin

Conservacin
6. Qu es un organismo indicador. Cita ejemplos.
7. Qu razones justifican la eleccin de la bacteria Escherichia coli como un indicador de
potabilidad en aguas de consumo? Ventajas e inconvenientes que presenta.
8. Elabora un resumen de los medios habituales en determinacin de aguas. Indica su
composicin, caractersticas y modo de empleo.
9. Podemos beber agua "sanitariamente permisible". En que se diferencia del agua potable.
10. Qu caractersticas debe cumplir el agua potable segn la normativa legal?
11. Porqu en la prueba del NMP se preparan 3 tubos de caldo a concentracin doble?
12. A partir de una muestra de 100 ml de agua se realizaron cinco diluciones decimales
sucesivas -1, -2, -3, -4, -5, -6. Se sembr 0,1 ml de cada dilucin en una placa de Agar
nutritivo y tras la incubacin el recuento fue de:
-1: (sin determinar); -2: (> 1500);

-3: (380) ; -4: (54); -5: (3);

-6: (0)

Cul es el nmero de aerobios mesfilos totales en la muestra inicical?

13. Con las mismas diluciones del problema anterior se realiz la siembra para determinacin
de coliformes totales por el mtodo del NMP, obtenindose despus de las lecturas de
tubos la secuencia numrica: 332100. Qu resultado da el anlisis?
14. Calcular el NMP de coliformes totales, coliformes fecales y estreptococos fecales en 100
ml de muestra, con los datos de las figuras 11-1, 11-2.
15. Razona porqu no es recomendable determinar directamente los coliformes fecales.

11 - ANLISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

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