1 Fotométria

UNIVERSIDAD DE HUANUCO.
MECANICA DE SUELOS II.

DOCENTE: VELA ESPIRITU, TOMAS.
Fotmetro
En un amplio sentido, un fotmetro es cualquier instrumento usado para medir la

intensidad de la luz. Los que se utilizan para la fotometra, son instrumentos para detectar
Intensidad de luz dispersa.
Absorbancia.
Fluorescencia.
Los dos ms importantes en la astronoma son el fotmetro fotoelctrico y el fotmetro
CCD: el primero de ellos, aunque se utiliza todava, est en desuso ya que el chip CCD
presenta numerosas ventajas frente al anterior (linealidad, precios ms reducidos, mayor
fiabilidad, amplia respuesta al espectro electromagntico, mayor precisin, etc.).
El fotmetro fotoelctrico naci a finales del siglo XIX en Inglaterra, mejor en los
Estados Unidos a inicios del siglo XX y alcanz su madurez en los aos 50 del pasado siglo,
cayendo en desuso a medida que la tecnologa digital primero, y CCD despus, fue
aumentando la precisin y reduciendo su precio.
En los artculos astronmicos ms recientes (ao 2005) se ha presentado la magnitud
de las estrellas del cmulo abierto M67 con una precisin de 0,0001 magnitudes o ms, algo
impensable hace slo unos pocos aos cuando la mxima precisin era de 0,001
magnitudes (puede compararse con las 0,01 magnitudes que puede extraerse de la
fotometra fotogrfica, empleando para ello microdensitmetros de alta calidad).
Absorbancia
En espectrofotometra, la absorbancia1 (a veces, absorbencia) ( ) es definida como:
, donde:
es la intensidad de la luz con una longitud de onda especfica
y que es pasada por una
muestra (intensidad de la luz transmitida)

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es la intensidad de la luz antes de que entre a la muestra (intensidad de la luz incidente)

El trmino es frecuentemente intercambiable con densidad ptica, si bien este ltimo
se refiere a la absorbancia por unidad de longitud.
Las medidas de absorbancia son frecuentemente usadas en qumica analtica, ya que
la absorbancia es proporcional al grosor de una muestra y la concentracin de la sustancia
en sta, en contraste a la transmitancia (I / I0 ), la cual vara exponencialmente con el grosor
y la concentracin.
Fluorescencia
Coleccin de 47 minerales iluminados con luz ultravioleta, emitiendo luz

visible de diversos colores mediante el proceso de fluorescencia.
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia,

que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energa en forma de
radiaciones electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin
electromagntica de longitud de onda diferente.
La energa total emitida en forma de luz es siempre menor a la energa total absorbida
y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayora de los casos la
longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energa- que la absorbida, sin
embargo, si la radiacin de excitacin es intensa, es posible para un electrn absorber dos
fotones; en esta absorcin bifotnica, la longitud de onda emitida es ms corta que la
absorbida, sin embargo en ambos casos la energa total emitida es menor que la energa
total absorbida.
En general las sustancias fluorescentes absorben energa en forma de radiacin
electromagntica de onda corta (p ej radiacin gamma, rayos x, UV, luz azul, etc), y luego la
emiten nuevamente a una longitud de onda ms larga, por ejemplo dentro del espectro
visible; los ejemplos ms notables de fluorescencia ocurren cuando la luz absorbida se
encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro -invisible al ojo humano- y la luz emitida
se encuentra en la regin visible.
Pag: 2
El mecanismo de fluorescencia tpico implica tres pasos secuenciales, llamados

respectivamente absorcin (1), disipacin no radiativa (2) y emisin (3).
El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del orden de los nanosegundos, por lo
que puede considerarse prcticamente instantneo. Es este tiempo tan corto lo que
diferencia a la fluorescencia de otro conocido fenmeno luminoso, la fosforescencia. El
mecanismo de fluorescencia tambin se encuentra muy relacionado con el proceso de
quimioluminiscencia.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de
radiacin se denominan fluorforos. Es posible obtener una una amplia variedad de colores
por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto fluorescente.
El fenmeno de fluorescencia posee numerosas aplicaciones prcticas, entre las que se
encuentran
por
ejemplo
anlisis
en
mineraloga,
gemologa,
sensores
qumicos
(espectroscopia fluorescente), pigmentos y tintas, detectores biolgicos y lmparas

fluorescentes.
ndice
1 Historia
2 Mecanismo
o 2.1 Consideraciones previas
o 2.2 Transiciones electrnicas
o 2.3 Espectros moleculares
o 2.4 Mecanismo bsico y diagrama de Jablonski
3 Ecuaciones
o 3.1 Fotoqumica
o 3.2 Rendimiento cuntico
Pag: 3
o 3.3 Tiempo de vida
4 Reglas
5 Aplicaciones
o 5.1 Iluminacin
o 5.2 Qumica analtica
o 5.3 Bioqumica y medicina
o 5.4 Gemologa, mineraloga, geologa y ciencias forenses
o 5.5 Lquidos orgnicos
6 Vase tambin
7 Enlaces externos
8 Referencias
Historia
Matlalina, la sustancia fluorescente en la madera del rbol Eysenhardtia

polystachya
Copa de Lignum nephriticum hecha de la madera del rbol de narra (Pterocarpus

indicus), y un frasco que contiene sus soluciones fluorescentes
Una temprana observacin de la fluorescencia fue descrita en 1560 por Bernardino de
Sahagn y en 1565 por Nicols Monardes en la infusin conocida como lignum nephriticum
(del latn, "madera renal"). Fue derivado de la madera de dos especies de rboles,
Pterocarpus indicus y Eysenhardtia polystachya. El compuesto qumico responsable de esta
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fluorescencia es la matlalina, que es el producto de oxidacin de uno de los flavonoides que

se encuentran en esa madera.
En 1819, Edward D. Clarke y en 1822 Ren Just Hay describieron fluorescencia en
las fluoritas, en 1833 sir David Brewster describi el fenmeno en la clorofila y en 1845 sir
John Herschel hizo lo mismo con la quinina.
En un artculo de 1852 sobre la "refrangibilidad " (cambio de longitud de onda) de la
luz, George Gabriel Stokes describi la facultad del fluorspar y del cristal de uranio para
cambiar la luz invisible ms all del extremo violeta del espectro visible en luz azul. Llam a
este fenmeno fluorescencia (fluorescence): Casi me inclino a acuar una palabra, y llamo
la apariencia fluorescencia, de fluor-spar [es decir, la fluorita], como el trmino anlogo
opalescencia se deriva del nombre de un mineral. El nombre fue derivado del mineral
fluorita (difluoruro de calcio), que en algunas muestras tiene rastros de europio bivalente,
que sirve como activador fluorescente emitiendo luz azul. En un experimento clave utiliz un
prisma para aislar la radiacin ultravioleta de la luz solar y observ la luz azul emitida por
una solucin de etanol de quinina expuesto por ella.
Mecanismo
Consideraciones previas
Para entender el mecanismo subyacente al proceso de fluorescencia es necesario
primero repasar el concepto de orbital atmico y de orbital molecular.
Los electrones en un tomo se organizan ocupando diferentes orbitales, esto es,
regiones en el espacio en torno al ncleo donde existe una cierta probabilidad de
encontrarlos. Existen orbitales de baja energa y orbitales de alta energa. Los electrones
prefieren ocupar primero, y siempre que sea posible, los orbitales de menor energa que se
encuentren desocupados. Sin embargo esto no significa que no puedan ocupar
transitoriamente orbitales de mayor energa.
Transiciones electrnicas
Para mover un electrn de un orbital de baja energa a un orbital de mayor energa es
necesario cubrir esa diferencia de energa con un aporte externo (es casi como llevar un
cuerpo de un lugar bajo a un lugar con cierta altura, con la diferencia de que a escala
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atmica la diferencia de energa entre orbitales se encuentra cuantizada). Para cada tipo de
tomo la diferencia de energa entre dos orbitales dados es constante y los electrones se
pueden mover entre esos orbitales nicamente ganando o perdiendo esa cantidad fija de
energa. Este proceso se conoce como transicin electrnica. En el caso de tratarse de
tomos nicos esto provoca que cada tipo de tomo posea lneas de absorcin y lneas de
emisin muy caractersticas, es decir que sea capaz de absorber o emitir energa en forma
de cuantos de luz a determinadas longitudes de onda correspondientes a cada uno de los
procesos de salto de los electrones entre orbitales de diferente energa. En el caso de
tomos nicos las lneas espectrales son muy precisas y definidas porque las transiciones
entre diferentes orbitales poseen diferencias de energa muy marcadas y precisas.
Espectros moleculares
Cuando los tomos se combinan para formar molculas, sus orbitales atmicos
desaparecen, combinndose para formar orbitales moleculares. Los electrones ahora
pueden ocupar regiones de probabilidad en torno a varios ncleos. La combinacin de
orbitales atmicos se produce en forma lineal, esto significa por ejemplo que si se combinan
dos tomos, cada uno de los cuales posee cuatro orbitales atmicos, la molcula poseer
como resultado ocho orbitales moleculares. Estos orbitales moleculares poseern energas
intermedias a las de los orbitales atmicos que se combinaron para formarlos. La situacin
se va tornando ms compleja cuantos ms tomos posea una molcula. Como
consecuencia molculas relativamente simples poseen un nmero muy elevado de orbitales
moleculares entre los cuales se pueden producir transiciones electrnicas. Es por eso que
las molculas poseen bandas de emisin y absorcin y no lneas. Estas bandas se
encuentran formadas por la superposicin de una gran cantidad de lneas correspondientes
a cada una de las transiciones posibles entre diferentes orbitales dentro de la molcula. Y
para complicar an ms la situacin, hay que considerar que las molculas no son rgidas,
sino que se trata de estructuras dinmicas que estn sometidas a deformaciones
estructurales, debidas por ejemplo a vibraciones trmicas o a rotaciones de determinadas
partes de la molcula. Cuando se altera la forma de una molcula, tambin se altera la forma
de los orbitales moleculares que la forman y como consecuencia se altera la energa de los
mismos. Las deformaciones estructurales provocan ligeras diferencias entre las energas de
diferentes orbitales que hacen que se modifiquen las energas de transicin electrnica entre
ellas. Finalmente cabe considerar que en una molcula en estado basal, muchos de los
electrones se encuentran en estado singlete, es decir, se encuentran complementados por
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otro electrn dentro del mismo orbital con un espn antiparalelo. Una transicin electrnica
tpica, implica que un electrn en estado singlete, salta a un orbital de mayor energa
adquiriendo un estado doblete donde su espn no se encuentra complementado por otro
antiparalelo. Pero pueden ocurrir otro tipo de transiciones, en la cual dos electrones en
estado doblete, pueden ser promovidos a dos orbitales degenerados (de igual energa)
adquiriendo un estado triplete en el cual sus espines son paralelos. Las transiciones de
espn, tambin pueden absorber y emitir energa en forma de luz.
Mecanismo bsico y diagrama de Jablonski
Un diagrama de Jablonski es bsicamente una representacin simplificada de los
niveles electrnicos (orbitales) de una molcula y de las posibles transiciones electrnicas
que se pueden dar entre estos niveles. En un diagrama de Jablonski se agrupan
verticalmente los estados electrnicos de acuerdo a su energa y horizontalmente de
acuerdo a su multiplicidad de espn. Las transiciones radiativas se representan con lneas
rectas y las no radiativas con lneas onduladas. A continuacin se presenta un diagrama de
Jablonski modificado para representar una molcula hipottica que posee un nivel
electrnico basal (S0) dos niveles electrnicos de alta energa (S 1 y S2) y un nivel de dos
orbitales degenerados con espines paralelos (triplete T 1) cada uno de estos niveles con
varios subniveles vibracionales debidos a las deformaciones trmicas de la molcula (Vb).
En el eje vertical se ubica la energa relativa de cada nivel electrnico, y en el eje horizontal
hemos considerado al tiempo y no a la multiplicidad de espn. Las flechas verticales
representan absorciones y emisiones de energa en forma de fotones y las flechas
diagonales implican disipacin de energa por medios no radiativos (en forma de calor).
Pag: 7
La situacin aqu representada comienza por la promocin de un electrn que se

encontraba en estado basal S0 a un nivel electrnico de alta energa S 2 en un estado
vibracional alto (la lnea Vb ms alta de todas). Esta
promocin se produce cuando la molcula absorbe
energa, en general en forma de un cuanto de luz
(fotn). Este electrn en un estado electrnico
excitado vibracionalmente alto puede ceder parte de
su energa en forma de vibraciones que se
transmiten al resto de la molcula (flecha amarilla
diagonal rotulada como NR). Esta energa aumenta la amplitud de las vibraciones de la
molcula, energa que es finalmente disipada cuando la molcula choca con otras molculas
cedindola en forma de calor.
El electrn puede ir cayendo como en una escalera entre diferentes estados
vibracionales cediendo en cada escaln parte de su energa en forma de calor, que aumenta
las vibraciones de la molcula. Tambin puede hacerlo cediendo toda su energa de golpe,
cayendo a un nivel inferior y emitiendo gran parte de la energa en forma de un nico cuanto
de luz (situacin representada por la primera flecha verde vertical).
Aunque en teora sera posible que el electrn cayera desde el estado vibracional alto
al estado basal S0, en la prctica esto no ocurre, pues la molcula rpidamente transfiere
parte de la energa absorbida a otros orbitales por medio de un mecanismo de reconversin
energtica interna, un proceso que ocurre usualmente en tiempos muy cortos del orden de
10-15 segundos, por lo que resulta virtualmente imposible para el electrn ceder nuevamente
el total de la energa que recibi y como consecuencia la luz emitida es siempre de menor
energa y mayor longitud de onda que la recibida. A medida que el tiempo se prolonga,
mayor es la cantidad de energa que se pierde por procesos no radiativos y mayor es la
longitud de onda de la luz emitida. Eventualmente todos los electrones en estados excitados
caen hasta el estado basal ya sea emitiendo luz (FE) o perdiendo energa por procesos no
radiativos (NR) estos procesos se producen en la fluorescencia en tiempos de hasta 10 -9
segundos.
En algunas molculas sin embargo, existen orbitales degenerados con energas muy
similares a las de los niveles excitados. En estas molculas puede ocurrir que un electrn
con alta energa ceda parte de su energa a un electrn en estado basal para formar dos
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electrones desapareados en dos orbitales degenerados (estado triplete) de energa

intermedia. El estado triplete es metaestable y puede existir por tiempos enormemente
largos si se lo compara con las transiciones entre estados dobletes; en el primer caso los
tiempos de decaimiento usualmente van desde las centsimas de segundo hasta las horas.
Cuando los electrones en estado triplete aparean sus espines ceden esa energa de
apareamiento en forma de luz, produciendo el fenmeno de fosforescencia.
La relajacin de un estado S 1 tambin puede ocurrir a travs de una interaccin con
una segunda molcula mediante lo que se conoce como desactivacin (quenching
fluorescente) de la fluorescencia, en este caso la molcula excitada cede su energa a otra y
esta ltima la disipa en forma de calor. El oxgeno molecular (O2), por ejemplo, es muy
eficiente desactivando la fluorescencia de otras molculas debido a su inusual estado triplete
fundamental.
Finalmente algunas molculas que se excitan a travs de la absorcin de luz o por
medio de un proceso diferente (P. ej. a causa de una reaccin qumica) pueden transferir
esta energa a una segunda molcula sensibilizada por un mecanismo de paso intersistema
entre molculas. A travs de este mecanismo la segunda molcula es conducida a un estado
de excitacin electrnica y es finalmente esta ltima la que va a emitir fluorescencia. En
estos casos las diferencias de energa entre la radiacin excitadora y la emitida son
excepcionalmente grandes. Este mecanismo se utiliza por ejemplo en los contadores de
centelleo lquidos para producir luz visible a partir de radiaciones nucleares de alta energa.
Ecuaciones
Fotoqumica
En resumen la fluorescencia ocurre cuando una molcula, tomo o nanoestructura vuelve a
su estado fundamental despus de haber sido excitada electrnicamente.
Excitacin:
Fluorescencia (emisin):
Pag: 9
Aqu,
es un trmino genrico para la energa del fotn con h = constante de Planck y
donde
= frecuencia de la luz. (Las frecuencias especficas de la luz excitadora y emitida
son dependientes en cada sistema en particular.)

El estado S0 se llama estado fundamental de la molcula fluorescente y S 1 es su primer
estado electrnico excitado.
Adems de estos estados electrnicos, que corresponden a la ubicacin de los electrones
de enlace de la molcula en diferentes orbitales moleculares, existen diferentes estados
vibracionales para estos orbitales moleculares, estos estados vibracionales corresponden a
las oscilaciones que experimentan los tomos que forman la molcula en torno a los
enlaces.
Los estados vibracionales altos pueden disipar energa en forma de calor, aumentando las
vibraciones de las molculas vecinas.
Una molcula en estado de excitacin electrnica, S 1, puede adquirir un estado de menor
energa por diferentes mecanismos. Puede por ejemplo sufrir un 'decaimiento no radiativo'
en el cual la mayor parte de la energa de excitacin es disipada como calor (vibraciones)
hacia el disolvente. Las molculas orgnicas excitadas tambin pueden relajarse mediante
conversin a un estado triplete entregando energa a otro orbital molecular para obtener al
final dos orbitales con energas intermedias, finalmente alguno de estos orbitales se relaja
emitiendo un cuanto de luz, por fosforescencia o mediante un segundo paso no radiativo de
decaimiento.
Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico de un proceso de fluorescencia es una manera de interpretar la
eficacia del mecanismo.
Se define como la proporcin entre el nmero de fotones emitidos y el de fotones
absorbidos.
Pag: 10
El mximo rendimiento cuntico de fluorescencia es por lo tanto 1 (100%); esto significa que
cada fotn absorbido resulta en un fotn emitido. Sin embargo compuestos con rendimientos
cunticos de 0,10 se consideran an bastante fluorescentes.
Otra forma de definir el rendimiento cuntico de un mecanismo de fluorescencia es mediante
las tasas a las cuales decae el estado de excitacin:
donde
es la tasa de emisin espontnea de radiacin y
es la suma de todas las
tasas de decaimiento.
Otras tasas de decaimiento del estado de excitacin se deben a mecanismos diferentes a la
emisin de fotones y con frecuencia se llaman, por lo tanto, tasas no-radiativas.
Entre estas ltimas podemos incluir: desactivacin por colisin dinmica, interaccin de
campo cercano dipolo-dipolo (o transferencia de energa de resonancia), conversin interna
y paso de intersistema. Por lo tanto, si la tasa de decaimiento de cualquier va cambia, esto
afecta tanto al tiempo de vida del estado excitado, como al rendimiento cuntico de la
fluorescencia.
El rendimiento cuntico de fluorescencia se mide comparndolo con un patrn; la sal sulfato
de quinina disuelta en cido sulfrico es un patrn comn para la medicin de fluorescencia.
Tiempo de vida
El tiempo de vida de la fluorescencia depende bsicamente del tiempo promedio que
permanece la molcula en su estado de excitacin antes de emitir un fotn.
La fluorescencia tpicamente sigue una cintica de primer orden:
donde
es la concentracin de molculas en estado de excitacin en el tiempo ,
la concentracin inicial y
es
es la tasa de decaimiento o el inverso del tiempo de vida de la
fluorescencia.
Pag: 11
Este es un ejemplo de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no radiativos

pueden despoblar el estado excitado. En ese caso, la tasa de decaimiento total es la suma
de todas las tasas:
donde
es la tasa de decaimiento global,
es la tasa de decaimiento radiativo y
la tasa de decaimiento no radiativo.

La ecuacin es muy similar a una reaccin qumica de primer orden en la cual la tasa
constante de primer orden es la suma de todas las tasas (un modelo cintico paralelo). Si la
tasa de emisin espontnea, o cualquiera de las otras tasas, son rpidas el tiempo de vida
es corto.
Para compuestos fluorescentes que emitan fotones con energas desde el UV hasta el
infrarrojo cercano, los tiempos tpicos de decaimiento del estado excitado se encuentran
entre 0.5 a 20 nanosegundos. El tiempo de vida de un fluorforo es un parmetro importante
para las aplicaciones prcticas de la fluorescencia tales como la transferencia de energa de
resonancia.
Reglas
Existen algunas reglas para predecir los comportamientos de la fluorescencia. La Regla de
Kasha, por ejemplo, dicta que el rendimiento cuntico de luminiscencia es independiente de
la longitud de onda de la radiacin.
Esto no es siempre cierto y se contradice a menudo en muchas molculas simples. Una
declaracin un tanto ms confiable, aunque an con excepciones, podra ser que el espectro
de fluorescencia muestra muy poca dependencia con la longitud de onda de la radiacin.
El diagrama de Jablonski describe la mayor parte del mecanismo de relajacin para las
molculas en estado excitado.
Aplicaciones
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Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y tienen un

sinnmero de aplicaciones prcticas, desde la simple decoracin fluorescente hasta
aplicaciones en qumica analtica tales como FPIA. En la naturaleza hay mltiples ejemplos
de organismos que utilizan la fluorescencia y en especial la quimioluminiscencia para atraer
alimento o pareja, o bien para espantar a los depredadores.
Iluminacin
El comn tubo fluorescente depende de la fluorescencia. Dentro del tubo de vidrio hay
un vaco parcial y una pequea cantidad de mercurio. Una descarga elctrica en el tubo
causa que los tomos de mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el rango
ultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el tubo se encuentra
revestido con una capa de un material fluorescente llamado fsforo, el cual absorbe la luz
ultravioleta y la reemite en el espectro visible. La iluminacin fluorescente es
energticamente mucho ms eficiente que la tecnologa incandescente, pero el espectro
producido puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es as porque el
espectro de emisin no es continuo, sino que se encuentra formado por un limitado nmero
de longitudes de onda (lneas de emisin).
A mediados de los aos 1990, ya era tecnologa comn el LED de luz blanca, este tipo de
LED funciona a travs de un proceso similar. Tpicamente, en estos dispositivos el
semiconductor emisor produce luz en la parte azul del espectro, la cual choca con un
compuesto fluorescente depositado en el chip; y este fluorescente emite en la regin verde y
roja del espectro. La combinacin de la luz azul que pasa a travs del fluorescente y la luz
emitida por el mismo produce una luz casi blanca.
La Lmpara fluorescente compacta (CFL) funciona de la misma forma que cualquier tubo
fluorescente tpica y con ventajas. Es utilizada para reemplazar lmparas incandescentes en
muchas aplicaciones. Producen un cuarto del calor por lumen emitido que los bombillos
incandescentes y duran hasta cinco veces ms. Estas lmparas contienen mercurio y deben
ser manejadas y dispuestas con cuidado. Las desventajas de que estas lmparas tengan un
balastro es que no encajan adecuadamente en todos los aparatos de luz. Todas las
lmparas fluorescentes tienen un retraso significativo al momento de ser encendidas
comparadas con las lmparas incandescentes, una desventaja en algunas aplicaciones.
Adicionalmente, la tecnologa que les permite ser usadas tambin reduce significativamente
Pag: 13
su vida til y su fiabilidad en aplicaciones de luz crepuscular, por ejemplo al utilizarlas con los
famosos atenuadores o dimmers.
Qumica analtica
La fluorescencia puede ser detectada con un monocromador para encontrar emisiones
tpicas de compuestos presentes en una cromatografa lquida de alta eficacia. Adems,
permite visualizar las manchas producidas por una TLC si los compuestos o los reactivos de
reveladores son fluorescentes.
La fluorescencia es ms efectiva cuando hay una gran proporcin de tomos en los niveles
bajos de energa en una distribucin de Boltzmann. Existe entonces una mayor probabilidad
que los tomos con energa baja sean excitados y liberen a su vez fotones, permitiendo as
un anlisis ms eficiente.
Las huellas dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como la ninhidrina.
Vanse tambin: Fluormetro y Espectrofluorimetra.
Bioqumica y medicina
Las biomolculas pueden marcarse con un grupo qumico fluorescente (fluorocromo)
mediante una reaccin qumica simple, lo cual permite una deteccin sensible y cuantitativa
de la molcula. Algunos ejemplos:
La microscopa de fluorescencia de tejidos, clulas o estructuras subcelulares se

consigue marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que aqul
encuentre su antgeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios
anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualizacin de mltiples
objetivos dentro de una misma imagen.
Secuenciacin automtica de ADN por el mtodo de terminacin de la cadena: cada

uno de los cuatro ddNTP se encuentra marcado con un fluorocromo especfico, de tal
forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una
Pag: 14
fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena

debido a la longitud de onda emitida caracterstica de cada fluorocromo.
Electroforesis en gel de agarosa teido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala en el ADN y
fluoresce naranja cuando se expone a luz UV.
Deteccin de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre

de cambiar su conformacin en disolucin, tiene poca
fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente
cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy til para visualizar la
localizacin de fragmentos de ADN en el mtodo de electroforesis en geles de
agarosa. El bromuro de etidio puede ser txico, por tanto una alternativa ms segura
es teir con SYBR Green.
Microarreglos
Inmunologa: los sitios de unin de un anticuerpo a un espcimen microscpico por

ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se
le ha unido previamente un grupo qumico fluorescente al anticuerpo especfico (IFI).
La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformacin del

ADN, as mismo como de protenas, con tcnicas como la transferencia de energa de
resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es
especialmente importante en complejos de biomolculas mltiples.
Es utilizada en (Citometra) de flujo para identificar diferentes receptores en las

clulas estudiadas, marcando estas clulas con anticuerpos especficos conjugados a
un fluorescente.
La Protena Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha

convertido en una herramienta de investigacin muy importante. GFP y otras
Pag: 15
protenas relacionadas son usadas como reporteros de un sin nmero de eventos

biolgicos incluyendo aquellos de localizacin subcelular. Los niveles de expresin
gnica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de produccin de GFP con
el gen de inters.
Tambin, diversas molculas biolgicas tienen fluorescencia intrnseca y por tanto, pueden
ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta qumica. Algunas veces, esta
fluorescencia intrnseca cambia cuando la molcula se encuentra en un ambiente especfico,
de tal forma que la distribucin o el ligamiento de la molcula pueden ser medidos. La
bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albmina srica en un
sitio especfico. La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las clulas sanguneas cuando
la produccin del grupo hemo es inhibido por la existencia de plomo o la ausencia de hierro
en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, empleada para detectar
estos problemas.
El nmero de aplicaciones de la fluorescencia ha ido creciendo en el campo de la
biomedicina, la biologa y en otras ciencias relacionadas. Los mtodos de anlisis en estos
campos tambin han ido aumentando: FPIA, FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP,
FCS, PFRAP, smFRET, FRIPS, SHRIMP o TIRF. Muchas de estas tcnicas se basan en los
microscopios de fluorescencia. Los microscopios utilizan fuentes de luz de alta intensidad,
usualmente lmparas de mercurio o xenn, LEDs, o lseres, para generar fluorescencia en
las muestras bajo observacin. Posteriormente, los filtros pticos separan la luz excitada de
la fluorescencia emitida, para permitir que sea detectada a simple vista, empleando una
cmara o utilizando algn otro detector de luz como espectrgrafos, etc. Muchas
investigaciones se estn llevando a cabo para mejorar ya sea el desempeo de estos
microscopios, las sondas fluorescentes usadas, y las aplicaciones de las mismas. De inters
particular son los microscopios confocales, los cuales utilizan un poro para lograr secciones
pticas, proporcionando una vista cuantitativa y en 3D de la muestra.
Gemologa, mineraloga, geologa y ciencias forenses
Las gemas, los minerales, las fibras y muchos otros materiales que pueden ser encontrados
en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva o pueden fluorecer diferente
bajo luz ultravioleta de onda corta, de onda larga, o rayos X: Muchos tipos de calcita y mbar
presentarn fluorescencia bajo luz ultravioleta de onda corta. Los rubes, las esmeraldas y el
Pag: 16
diamante Hope exhiben fluorescencia roja bajo luz UV de onda corta; los diamantes tambin
emiten luz bajo rayos X.
El petrleo emite fluorescencia en un rango de colores, desde el marrn mate para aceites
pesados y alquitrn hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy livianos y
condensados. Este fenmeno es usado en perforaciones hechas para la exploracin de
petrleo permitiendo identificar pequeas cantidades de crudo en las perforaciones y en los
poros de las muestras.
Lquidos orgnicos
Los lquidos orgnicos, como las mezclas de antraceno en benceno o tolueno, emiten
fluorescencia bajo la accin de radiacin UV o rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de
esta fluorescencia se encuentran en el orden de los nanosegundos ya que la duracin de la
luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del material fluorescente, en este
caso antraceno.
Pag: 17

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En un amplio sentido, un fotmetro es cualquier instrumento usado para medir la

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y que es pasada por una

muestra (intensidad de la luz transmitida)

es la intensidad de la luz antes de que entre a la muestra (intensidad de la luz incidente)

Coleccin de 47 minerales iluminados con luz ultravioleta, emitiendo luz

La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia,

El mecanismo de fluorescencia tpico implica tres pasos secuenciales, llamados

(espectroscopia fluorescente), pigmentos y tintas, detectores biolgicos y lmparas

o 3.3 Tiempo de vida

Matlalina, la sustancia fluorescente en la madera del rbol Eysenhardtia

Copa de Lignum nephriticum hecha de la madera del rbol de narra (Pterocarpus

fluorescencia es la matlalina, que es el producto de oxidacin de uno de los flavonoides que

La situacin aqu representada comienza por la promocin de un electrn que se

electrones desapareados en dos orbitales degenerados (estado triplete) de energa

es un trmino genrico para la energa del fotn con h = constante de Planck y

= frecuencia de la luz. (Las frecuencias especficas de la luz excitadora y emitida

son dependientes en cada sistema en particular.)

es la tasa de emisin espontnea de radiacin y

es la suma de todas las

es la concentracin de molculas en estado de excitacin en el tiempo ,

es la tasa de decaimiento o el inverso del tiempo de vida de la

Este es un ejemplo de decaimiento exponencial. Varios procesos radiativos y no radiativos

es la tasa de decaimiento global,

es la tasa de decaimiento radiativo y

la tasa de decaimiento no radiativo.

Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y tienen un

La microscopa de fluorescencia de tejidos, clulas o estructuras subcelulares se

Secuenciacin automtica de ADN por el mtodo de terminacin de la cadena: cada

fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena

Deteccin de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre

Inmunologa: los sitios de unin de un anticuerpo a un espcimen microscpico por

La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformacin del

Es utilizada en (Citometra) de flujo para identificar diferentes receptores en las

La Protena Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria, se ha

protenas relacionadas son usadas como reporteros de un sin nmero de eventos

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