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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos


Departamento de Cincias Bsicas

BIOQUMICA FUNDAMENTAL
PROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESAR
ENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO

DETERMINAO DE PESOS MOLECULARES DAS


PROTENAS DOS PESCADOS SARDINHA E ARUAN
POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913

Pirassununga
2015

SUMRIO

RESUMO......................................................................................................... 3
1.

INTRODUO........................................................................................... 4

2.

OBJETIVO................................................................................................. 9

3.

MTODO................................................................................................. 10

4.

RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................12

5.

CONCLUSO.......................................................................................... 15

6.

BIBLIOGRAFIA........................................................................................ 16

RESUMO
Para analisar propriedades de protenas necessrio purifica-las
primeiro. Existem diversos mtodos descritos na literatura para se fazer a
purificao. Um deles chamado de eletroforese, mtodo pelo qual as
protenas de uma determinada amostra a ser analisada so separadas, no
experimento desse relatrio elas sero separadas de acordo com o seu peso
molecular.
Para a realizao da corrida eletrofortica h a preparao de dois gis,
o gel de separao e o gel de empilhamento, no gel de empilhamento sero
colocadas as amostras e no gel de separao, como o prprio nome diz,
onde as protenas sero separadas. A separao s possvel pois o gel de
separao poroso, fazendo com que protenas mais leves caminhem por ele
mais rapidamente e portanto, a uma distncia maior. necessrio tambm
uma fonte de tenso para que as protenas caminhem.
Ao final da corrida, o gel corado e pode-se verificar os pesos
moleculares das protenas contidas nas amostras. essencial que junto com
as amostras tenha uma amostra padro de pesos moleculares conhecida, para
que, assim, a partir de uma curva padro, calcule-se os pesos moleculares das
outras amostras.
No experimento desse relatrio, verificou-se os pesos moleculares das
protenas dos pescados Sardinha e Aruan e pode-se identificar, alm de
outras, as protenas actina e miosina.
Palavras chave: protena, purificao, eletroforese, gel de poliacrilamida, SDSPAGE, peso molecular, sardinha, Aruan, actina, miosina

1. INTRODUO
Protenas esto presentes em praticamente toda nutrio humana e
animal e tambm nas clulas que os compe, torna-se interessante ento
analisar as propriedades e atividades das mesmas. Para determinao dessas
caractersticas necessria a purificao das protenas. Sendo assim vrios
mtodos para separao de protenas esto descritos na literatura, podendo
classificar a separao em tamanho, carga, propriedades de ligao, entre
outros (LEHNINGER, 2006).
Um dos mtodos de separao de protenas e outras macromolculas
a eletroforese, fenmeno no qual uma molcula com carga eltrica move-se em
um campo eltrico (BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2008). Apesar de possuir
uma grande vantagem, ao possibilitar uma boa visualizao das protenas
separadas e permitir ao pesquisador estimar rapidamente os diferentes tipos de
protenas presentes na mistura bem como seu peso molecular aproximado, a
eletroforese no utilizada, geralmente, para purificar grandes quantidades de
protena, j que existem mtodos mais simples e que no afetam a estrutura e
funo das protenas (LEHNINGER, 2006).
Para

realizao

da

eletroforese

necessrio

um

aparelho

eletrofortico (Figura 1) constitudo de uma fonte de tenso e uma unidade de


eletroforese, nesse aparelho so colocadas duas placas de corrida contendo,
cada uma, um gel de separao e um gel de empilhamento, ou gis de
poliacrilamida, que so formados pela copolimerizao de acrilamida e
bisacrilamida, constituindo uma rede porosa, cujo dimetro dos poros
inversamente proporcional a concentrao de acrilamida.

Figura 1 Aparelho eletrofortico


Fonte: http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/cubas-de-eletroforese

O gel formado entre duas placas de vidro que so mantidas juntas por
uma pina, porm separadas por um espaador (WILSON; WALKER, 2005),
como mostra a Figura 2. Primeiramente colocado o gel de separao (gel de
corrida) e aps sua solidificao colocado o gel de empilhamento (gel de
concentrao) junto a um pente, para formar cavidades onde sero colocadas
as amostras.

Figura 2 Montagem dos gis de poliacrilamida


Fonte: http://e-escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp?id=246&ordem=2

SDS-PAGE

(Sodium

Dodecyl

Sulphate-Polyacrylamide

Gel

Electrophoresis) o mtodo mais utilizado para anlises qualitativas de


protenas. Sendo um mtodo em que protenas so separadas segundo o
tamanho, a anlise de protenas por SDS-PAGE tambm til para a
determinao da massa molecular relativa da protena (WILSON; WALKER,
2005).
O SDS um detergente aninico forte, que se liga aos resduos
positivamente carregados das protenas, conferindo s mesmas uma carga
final negativa e ocasionando a desnaturao. Desta forma, todas as protenas
da amostra possuiro carga negativa, estaro linearizadas, e migraro em
direo ao eletrodo positivamente carregado.
A velocidade de migrao depender somente da massa molecular,
sendo que protenas com menor tamanho passaro mais facilmente atravs da
malha do gel e, portanto, migraro a uma distncia maior, molculas muito
maiores que os poros so quase imveis e molculas de tamanho intermedirio
movem-se atravs do gel com graus variveis de facilidade (BERG;
TYMOCZO; STRYER, 2008). A ao do SDS pode ser vista na Figura 3 e uma
amostra de como ocorre a eletroforese pode ser visualizada na Figura 4.

Figura 3 Ao do detergente aninico SDS


Fonte: http://biologia.ifsc.usp.br/biomolcel1/roteiros/roteiro08.pdf

Figura 4 (A) Aparelho de eletroforese em gel; (B) A ao de peneiramento de um gel poroso


de poliacrilamida separa protenas de acordo com o tamanho.
Fonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

Sendo assim, para realizar uma corrida eletrofortica as placas contendo


os gis so colocadas no aparelho eletrofortico, as amostras so pipetadas,
com uma pipeta de vidro, nas cavidades, o aparelho tampado e ligado. Aps
a corrida, os gis so retirados da placa e transferidos para um corante
(Coomassie Blue) que se liga s protenas mas no ao gel.
Junto com as amostras colocadas no gel, colocada uma amostra
padro onde so conhecidas as protenas contidas e seus respectivos pesos
moleculares, para que, aps a corrida eletrofortica seja possvel comparar as
protenas das amostras com o padro e saber, aproximadamente, seu peso
molecular, medido em kiloDalton (kD).

A figura abaixo mostra um gel aps a colorao:

Figura 5 Gel aps ser tratado com corante


Fonte: http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810

2. OBJETIVO
Esse experimento teve como objetivo identificar os pesos moleculares
das protenas presentes nos pescados Sardinha e Aruan.

3. MTODO
Primeiramente, adicionou-se 250

L de tampo de amostra Laemmli

para um microtubo sem rosca rotulado com o nome do pescado (sardinha). Um


pedao de cerca de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm 3 do msculo do pescado foi cortado
com uma tesoura e colocado junto ao tampo no micro tubo. Agitou-se o
microtubo intensamente por mais ou menos 15 vezes e aps, ele foi incubado
por 5 minutos a temperatura ambiente.
Feito isso, apenas o tampo homogeneizado do msculo foi transferido
para outro microtubo com tampa e rotulado, ento o microtubo foi incubado
durante 5 minutos a 95C.
A seguir, utilizando luvas, foi preparado o gel de separao (2 mini gis)
0,375M Tris, pH 8,8 de acordo com as medidas (receita) indicadas na tabela a
seguir:

gua deionizada
1,5M Tris-HCl, pH 8,8
SDS 10% - estoque

12%*
3,35 mL
2,5 mL
100 L

Acrilamida/Bis (estoque 30%)


Persulfato de amnio 10%

4,0 mL
50 L

TEMED

* Para protenas tratadas com SDS de peso molecular de aproximadamente


10-100Kd
Aps preparar o gel, ele foi transferido rapidamente para a placa de
corrida com o auxlio de uma pipeta, aguardou-se alguns instantes e vedou-o
com lcool Butanol 80%, aguardou-se a solidificao e retirou-se a gua com
papel filtro.

10

Enquanto o gel de separao era solidificado, foi tambm preparado o


gel de empilhamento (2 mini gis) 0,125M Tris, pH 6,8 de acordo com as
medidas indicadas na tabela abaixo:

gua deionizada
0,5M Tris-HCl, pH 6,8
SDS 10% - estoque

4%
3,04 mL
1,25 mL
50 L

Acrilamida/Bis (estoque 30%)

664

Persulfato de amnio 10%

25

L
L

TEMED

Aps a solidificao do gel de separao, adicionou-se, com uma pipeta,


o gel de empilhamento at o final da placa e introduziu-se o pente, aguardou-se
45 minutos at sua solidificao e retirou-se o pente para aplicar as amostras.
Em cada cavidade formada pelo pente no gel foram aplicada as
amostras de protenas musculares dos pescados, reservando duas cavidades
para os padres de peso molecular:

L Padro de Peso Molecular Kaleidoscope 250 KD a 10 KD


10 L Amostra muscular de peixe Aruan
10 L Amostra muscular de peixe Sardinha

10

L Tampo padro de Actina e Miosina

Imediatamente aps a adio das amostras realizada a corrida no


aparelho eletrofortico com a voltagem constante (200 V) por 45 minutos
temperatura ambiente. Em seguida, transferiu-se o gel para 25 mL do corante
Coomassie Blue por 15 minutos, aps a colorao descartou-se o corante e
colocou-se o gel em tampo descorante por mais 30 minutos.

11

4. RESULTADOS E DISCUSSO
Realizada a eletroforese, foi obtido o gel da Figura 6, na quarta coluna
est o padro que foi adicionado, nas outras cavidades esto amostras dos
pescados Aruan e Sardinha intercalados, comeando (esquerda) por Aruan.

Figura 6 Gel aps a corrida eletrofortica

Ao analisar a coluna do padro, que contm pesos moleculares


conhecidos, foi medida a distncia do topo at a protena, verificando a
mobilidade da protena, esse valores esto mostrados na tabela 1.

Tabela 1 Mobilidade e peso molecular das protenas na amostra padro

Mobilidade (mm)
6
10
15
18
27
35
41
47
52

Peso Molecular (KD)


250
160
100
75
50
37
25
20
15

12

Sabendo que a mobilidade proporcional ao log do peso molecular, foi


construdo um grfico padro, que se encontra anexado ao final do relatrio.
Para determinar o peso molecular das protenas dos pescados foi
medida a sua mobilidade e, a partir do grfico padro, encontrou-se o peso
molecular. As tabelas 2 e 3 mostram esses dados, alguns pesos no puderam
ser medidos pois a escala do grfico no permitia.

Tabela 2 Mobilidade e peso molecular das protenas do pescado Sardinha

Mobilidade (mm)
9
12
18
19
21
23
27
31
33
34
36
39
41
45
48
50
54

Peso Molecular (KD)


75
70
64
58
50
42
39
38
35
28,5
25
21
19
16,5
-

Tabela 3 Mobilidade e peso molecular das protenas do pescado Aruan

Mobilidade (mm)
5
7
11
14
18
21

Peso Molecular (KD)


75
64
13

23
25
30
32
33
36
37
38
49
52

58
53
44
41
42
35
32
31,5
18
15

Pode-se identificar nos pescados miosina de cadeia leve (21kD, 19kD e


16kD) e actina (42kD).

14

5. CONCLUSO
Pode-se concluir que a eletroforese um mtodo bastante eficiente de
separao proteica, conseguindo identificar protenas que se diferenciam por
apenas 1kD.
As protenas miosina e actina puderam ser identificadas em ambos
pescados, apesar de eles possurem constituies proteicas diferentes.

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6. BIBLIOGRAFIA

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2008). Bioqumica (6 ed.). Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan.
(2014). ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS (SDS-PAGE).
Universidade de So Paulo, Instituto de Fsica de So Carlos, So
Carlos.
Lehninger, D., & Cox, M. (2006). Princpios de Bioqumica (4 ed.). So Paulo:
Sarvier.
Wilson, K., & Walker, J. (2010). Principles and Techniques of Biochemistry
and Molecular Biology (7 ed.). New York: Cambridge University Press.

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