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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos


Departamento de Cincias Bsicas

BIOQUMICA FUNDAMENTAL
PROF. DR. MARCELO DE CERQUEIRA CESAR
ENGENHARIA DE ALIMENTOS XIV - DIURNO

MTODO DE LOWRY: DETERMINAO DE PROTENA


EM AMOSTRA DE LEITE

CAROLINE OLIVEIRA AGOSTINI 9006913

Pirassununga
2015

SUMRIO

RESUMO......................................................................................................... 3
1.

INTRODUO........................................................................................... 4

2.

OBJETIVO................................................................................................. 7

3.

MTODO................................................................................................... 8

4.

RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................10

5.

CONCLUSO.......................................................................................... 13

6.

BIBLIOGRAFIA........................................................................................ 14

RESUMO
Devido a diversidade de funes realizadas pelas protenas torna-se
interessante utilizar mtodos para quantifica-las, o mtodo de Lowry
vantajoso, pois apresenta uma alta sensibilidade. No experimento, foram feitas
amostras padro, para posterior clculo de uma curva padro, e amostras de
leite integral e desnatado diludos na proporo de 1:200. A partir da curva
padro foi ajustada uma reta onde y representa as absorbncias obtidas por
um espectrofotmetro e x a concentrao de protenas em mg/mL. Pela
equao da reta ajustada foi possvel calcular as concentraes das amostras
de leite depois de medir suas absorbncias e substitu-las na equao
calculada. Foi feita uma mdia das concentraes e concluiu-se que a mdia
do leite desnatado foi superior a mdia do leite integral, porm a diferena foi
mnima, sendo justificada por erros experimentais que esto envolvidos em
qualquer experimento e confirmando a informao dos rtulos de leite integral e
desnatado que dizem que as concentraes de protenas so iguais.
Palavras chave: protenas, mtodo de Lowry, leite, reativo de Folin,
absorbncia, espectrofotmetro

1. INTRODUO
Protenas so as macromolculas biolgicas mais abundantes que
ocorrem em todas as clulas e em todas as partes das clulas (LEHNINGER,
2006). Sua unidade estrutural bsica so os aminocidos, que existem em
grandes quantidades, porm apenas 22 so considerados proteinognicos, ou
seja, podem ser encontrados como constituintes de protenas (MORAES et al.,
2013).
Com exceo da glicina, todas as molculas de aminocidos so
assimtricas, o carbono central ligado a um grupo amina (-NH2), a um grupo
cido carboxlico (-COOH), a um hidrognio e a uma cadeia lateral variada.
Sendo assim, as protenas possuem uma grande variedade estrutural devido
ao grande nmero de possibilidades de sequncias de aminocidos. Para
formar protenas necessrio que se formem ligaes peptdicas (Figura 1)
entre os aminocidos, essas ligaes ocorrem quando o grupamento amina de
um aminocido se liga ao grupamento cido carboxlico de outro aminocido
(MORAES et al., 2013).

Figura 1 Ligao peptdica


Fonte: http://www.simbiotica.org/composicaoquimicacelula.htm

Em virtude da alta variabilidade estrutural das protenas elas possuem


diversas funes como, por exemplo, fornecer proteo e resistncia a
estruturas biolgicas, catalisar reaes (enzimas), transportar molculas e
regular a atividade celular. Por esse motivo torna-se interessante estudar
metodologias para determinao de protenas em vrias reas como tecnologia
e cincias de alimentos, laboratrios de anlises clnicas, nutrio animal,
nutrio humana, entre outros.
Na literatura esto descritos vrios mtodos de determinao de
protenas baseados em espectrofotometria, nefelometria e medies HPLC
(SANTOS, 2012). Os mtodos vias espectrofotometria mais utilizados so:
mtodo de Biureto, mtodo de Bradford, mtodo de Smith ou BCA, mtodo de
absoro ultravioleta e mtodo de Lowry, esse ser utilizado no experimento
desse relatrio. importante acrescentar que no existe um mtodo universal,
a escolha deste vai depender do tipo de anlise e da substncia a ser
analisada.
O mtodo de Lowry para determinao de protenas consiste,
basicamente, em duas reaes, a primeira delas a de reduo do on cobre,
em condies alcalinas, formando um complexo com as ligaes peptdicas, o
on de cobre monovalente conjuntamente s cadeias laterais de alguns
aminocidos da protena (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina)
levam reduo dos componentes cidos presentes no reagente de Folin
amplificando a colorao primeiramente obtida (MORAES et al. , 2013), sendo
assim, as amostras com tons de azul mais fortes devem conter maior
concentrao de protenas.
As principais vantagens do mtodo de Lowry so: a sua alta
sensibilidade, melhor exatido e menor consumo de amostra e, por isto, tem
sido utilizado para a determinao da concentrao de protenas totais em
diversos meios, sendo eles: lquor, plasma sanguneo, saliva humana, tecido
animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos alimentcios
(ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998).

A concentrao de protena, nesse mtodo, calculada a partir da leitura


da absorbncia ou quantidade de luz absorvida, que medida por um
espectrofotmetro. Este constitudo por uma fonte de luz, um colimador, um
prisma, uma fenda seletora, um compartimento de amostras, uma clula
foteltrica e um amplificador (Figura 2). A luz fornecida fracionada pelo prisma
em luzes monocromticas, o comprimento de onda dirigido at a amostra
onde parte da luz absorvida e outra parte transmitida, a reduo de
intensidade luminosa medida pela clula foteltrica, o sinal eltrico
amplificado e visualizado no galvanmetro em nmeros, lido como uma
absorbncia e proporcional concentrao da substncia existente no
compartimento.

Figura 2 Componentes de um espectrofotmetro: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma,
(d) fenda seletora, (e) compartimento de amostras, (f) clula foteltrica e (g) amplificador.
Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/componentes.html

Sendo assim, neste relatrio o mtodo de Lowry ser utilizado para


quantificar as protenas do leite desnatado e integral, que, no rtulo, so iguais.

2. OBJETIVO
Esse relatrio tem por objetivo determinar a quantidade de protena do
leite pelo mtodo de Lowry.

3. MTODO
Primeiramente foram identificados 2 micro tubos com leite integral e leite
desnatado. As amostras de leite foram diludas com gua destilada na
proporo 1:20 em outros dois micro tubos identificados como leite integral
diludo e leite desnatado diludo. Sendo assim, os micro tubos diludos
continham 50 L de leite integral ou desnatado e 950 L de gua
destilada. Aps a diluio os micro tubos foram homogeneizados.
Cinco tubos de ensaio foram enumerados de 1 a 5, em outro tubo
escreveu-se BRANCO, em outros 3 tubos escreveu-se LID (Leite Integral
Diludo) e em outros 3 LDD (Leite Desnatado Diludo).
Foi ento colocada nos tubos BRANCO e os enumerados de 1 a 5 uma
soluo padro de albumina e gua destilada nas medidas indicadas na tabela
1 para a curva padro e depois fez-se a leitura de absorbncia dos tubos.

Tabela 1 Quantidade de soluo padro de albumina e gua destilada nos respectivos tubos

Tubos

Soluo Padro

gua Destilada

de Albumina
BRANCO
1
2

(0,4mg/mL)
100 L
200 L

300 L
400 L

500 L

500 L
400 L
300 L
200 L
100 L
-

Nos tubos das triplicatas de Leite Integral Diludo e Leite Desnatado


Diludo foram colocadas as amostras inicialmente diludas e gua destilada, as
quantidades esto na tabela abaixo:

Tabela 2 Quantidade das amostras diludas e de gua destilada nos respectivos tubos

Tubos

Leite Integral

gua Destilada

Triplicata

Diludo 20x
50 L

450 L

Tubos

Leite Desnatado

gua Destilada

Triplicata

Diludo 20x
50 L

450 L

Em seguida, foi colocado 5mL de mistura reativa em todos os tubos,


agitou-se todos eles no agitador para tubos e incubou-se por 10 minutos a
temperatura ambiente. Aps os 10 minutos, adicionou-se 500 L do reativo
de Folin e cobriu-se com papel parafilme todos os tubos para que fosse levado
ao agitador novamente. Os tubos foram incubados a temperatura ambiente por
mais 30 minutos. Fez-se ento a leitura das absorbncias de cada tubo em
espectrofotmetro a 660nm, sendo que o tubo BRANCO foi utilizado como
padro.

4. RESULTADOS E DISCUSSO
Ao fazer a leitura dos tubos de 1 a 5 (Figura 3) e do tubo BRANCO
foram obtidas as seguintes absorbncias:
Tabela 3 Absorbncias dos tubos 1 a 5 e BRANCO

Tubos

Leitura

BRANCO

0,234

0,121

0,239

0,280

0,316

Figura 3 Tubos 1 a 5 da direita para esquerda aps adio do reativo Folin

Era esperado que fosse obtida uma absorbncia crescente ao longo dos
tubos, porm, por algum erro de pipetagem, o tubo 2 apresentou uma
absorbncia menor do que a esperada. Com esses valores montou-se uma
curva padro e ajustou-se uma reta como pode ser visto na Figura 4.

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Figura 4 Curva padro das amostras padres e reta ajustada com equao
y=0,6557x + 0,0672

A partir da equao da reta ajustada foi possvel calcular a concentrao


de protena nas amostras de leite integral (Tabela 4) e desnatado (Tabela 5) a
partir da leitura dos tubos (Figura 5) LID e LDD em triplicata pelo
espectrofotmetro.

Figura 5 Tubos LID e LDD aps adio do reativo de Folin


Tabela 4 Concentrao de protenas no leite integral

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Tubos - LID
1
2
3

Leitura

Concentrao de

Mdia

0,139
0,168
0,157

protena (mg/mL)
21,9002
30,7458
27,3906

26,6789
mg/mL

Tabela 5 Concentrao de protenas no leite desnatado

Tubos LDD
1
2
3

Leitura

Concentrao de

Mdia

0,189
0,155
0,131

protena (mg/mL)
37,1511
26,7805
19,4601

27,7972
mg/mL

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5. CONCLUSO
Aps realizar o experimento concluiu-se que feitas as mdias pode-se
notar que a concentrao de protenas no leite desnatado foi maior que no leite
integral. E importante ressaltar que, por ter mais gordura que o leite
desnatado, o leite integral pode sofrer alteraes nas medidas de absorbncia,
pois a gordura um fator interferente na espectrofotometria.
Apesar de as mdias diferirem, a diferena pouca e justificada por
erros inatos ao experimento, podendo concluir que no existe diferena
significativa entre as concentraes de protenas do leite desnatado e integral,
como est nos rtulos.

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6. BIBLIOGRAFIA

Lehninger, D., & Cox, M. (2006). Princpios de Bioqumica (4 ed.). So Paulo:


Sarvier.
Moraes, C. d., Junior, F. O., Masson, G., Rebello, K. M., Santos, L. d., Bastos,
N. F., & Faria, R. C.-R. (2013). Srie em biologia celular e molecular Mtodos experimentais no estudo de protenas (1 ed.). Rio de
Janeiro.
Santos, F. R. (2012). MTODO DE LOWRY: VALIDAO E ESTIMATIVA DO
CLCULO DA INCERTEZA. Araraquara.
Zaia, D. A., Zaia, C. T., & Lichtig, J. (1998). DETERMINAO DE PROTENAS
TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS
MTODOS EXISTENTES. Qumica Nova, 787-793.

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