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ANALTICOS EN LECHE
Final Qumica Analtica
Julio de 2014
POTENCIOMETRA
Los mtodos potenciomtricos de anlisis se basan en la medida del potencial de celdas
electroqumicas sin paso de corriente apreciable.
En base a ello, se puede utilizar la potenciometra para determinar puntos finales de
valoraciones. Ms recientemente, las concentraciones inicas selectivas se miden a travs
del uso de electrodos de membrana diseados especficamente.
La potenciometra es una tcnica electroanaltica con la que se puede determinar la
concentracin de una especie electroactiva en una disolucin empleando un electrodo de
referencia (un electrodo con un potencial constante con el tiempo y conocido) y un
electrodo de trabajo (un electrodo sensible a la especie electroactiva).
Mediante el siguiente diagrama que describe una celda tpica para estudios
potenciomtricos, se detallarn cada una de las partes en un equipo de potenciometra y
sus funciones.
Todas las pilas tienen lugar a una transferencia de energa. Este movimiento conduce a la
produccin de una corriente elctrica a travs del circuito conectado a la batera.
Los dos vasos y sus contenidos son semipilas. El circuito que conecta los 2 electrodos
est formado por un cable, un interruptor (para cerrar y abrir el circuito) y un aparato de
medida (que seala el paso de la corriente elctrica a travs del circuito). Las dos
disoluciones se conectan mediante un puente salino. Este puente est formado por un
tubo de vidrio cerrado parcialmente en sus dos extremos con un material poroso, tal
como lana de vidrio, rellena de una disolucin salina.
Cuando se abre el interruptor no se producen reacciones en ninguna de las semipilas.
Cuando se cierra, se producen reacciones en las superficies de ambos electrodos, los
electrones fluyen a travs del cable y el aparato de medida registra un voltaje. Las
reacciones que tienen lugar en los electrodos son:
Oxidacin: Zn Zn2+ + 2eReduccin: Ag+ + e- Ag
El puente salino mantiene la electroneutralidad de las dos disoluciones.
Para equilibrar la acumulacin de cargas en los vasos, los iones del puente salino se
desplazan de un vaso al otro, movindose los iones positivos de izquierda a derecha y los
negativos de derecha a izquierda.
La reaccin total de la pila se describe:
Zn + 2 Ag+ Zn2+ + 2Ag
Electrodo de Hidrgeno
Pt|H2(g)(1atm)|H+ (1M)
E= 0.00
Electrodos de calomelanos
Hg|Hg2Cl2(s)|KCl (concentrac. Conocida)
Hg2Cl2(s) + 2e- 2Hg(l) + 2Cl
Est formado por un electrodo de saturado con ClAg y sumergido en KCl. Alambre de
plata recubierto parcialmente por una pelcula de cloruro de plata. La concentracin de
cloruros est fijada por la solubilidad del cloruro de plata
Pueden utilizarse a temperaturas superiores a 60 C.
E = E -
0.059
[Ag][Cl- ]2
log(
)
2
[AgCl]
E = E - 0.059 log([Cl- ])
E = 0.222 - 0.059 log([Cl- ])
La fem de cualquier semireaccion puede expresarse como tal cuando tiene lugar como
semiraccin de la reduccin o bien como la fem de la semireaccin considerada como una
oxidacin.
La ecuacin de Nernts
La ecuacin de Nernst se utiliza para calcular el potencial de reduccin de
un electrodo fuera de las condiciones estndar (concentracin 1 M, presin de 1 atm,
temperatura de 298 K 25 C).
La siguiente reaccin es una ecuacin general para una reaccin de oxido-reduccin.
aA + bB cC + dD
El efecto de las concentraciones de los productos y de los reactivos viene dado por la
ecuacin de Nernst:
E=E0 0,059 * log [C]c * [D]d
n
[A]a * [B]b
0,059: valor numrico de una combinacin de factores, uno de los cuales es la
temperatura.
n: numero de electrones tranferidos en la reaccin general de redox.
E0: reaccin o semireaccin en sentido en que aparezca escrita.
pH-metro
Es un aparato de medida formado por una pila voltaica y un dispositivo para medir la
fem producida por la pila. Nos permite medir la concentracin de iones H midiendo la fem
producida por la pila.
Para medidas de pH se usa el electrodo de vidrio en conjunto con un electrodo de
referencia, generalmente calomelanos o cloruro de plata, sumergidos en la disolucin de
la que queremos medir el pH. El bulbo sensible, que es el extremo sensible del electrodo,
est formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de
pH). Este electrodo desarrolla un potencial en caso que la
concentracin protones de H sea diferente de las
disoluciones que estn en contacto con las paredes del
vidrio.
El contacto elctrico entre dos pilas se consigue
mediante un tapn poroso situado en el electrodo de
referencia.
Se llena el bulbo con la solucin de cido
clorhdrico 0.1M saturado con cloruro
de
plata.
El voltaje en el interior del bulbo es constante, porque se
mantiene su pH constante (pH 7) de manera que
la diferencia de potencial solo depende del pH del medio
externo.
El
alambre
que
se
sumerge
al
interior
(normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial
hasta un amplificador.
DETERMINACIN DEL pH
La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una
fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con diferente concentracin
de protones.
Mtodo
1. Objeto.
Esta tcnica describe la medida potenciomtrica del pH (acidez inica).
Determina concentracin de protones en el medio. pH=-log [H]
2. Material y aparatos
pH-metro con electrodo de vidrio. Sensibilidad 0,05 unidades de pH.
3. Reactivos.
Solucin tampn de referencia a pH=7.
Solucin tampn de referencia a pH=4.
Solucin de limpieza: agua destilada
4. Procedimiento.
PREPARACIN DE SOLUCIONES BUFFER.
Buffer pH 4 (Solucin buffer de CH3COOH/CH3COONa)
Se coloca en vaso de precipitado acetato de sodio (2,05gr) y cido actico, adicionar
el 80% de agua destilada del volumen de solucin a preparar. Llevar al agitador
magntico para agitar la solucin hasta que se vea homognea. Esperar unos
minutos. Medir el pH con pH-metro. Si no corresponde exactamente al
requerido, sin dejar de agitar y medir el pH, agregue el acido o base de ajuste
de pH, para obtener lo ptimo.
PREPARACIN DE LA MUESTRA.
Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se
obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la
muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C.
DETERMINACIN.
Calibrar el pH-metro con la ayuda de las dos soluciones tampn de
referencia.
o Colocar en el buffer 7 y calibrar display 7.
o Lavar con agua destilada.
o Colocar en el buffer 4 y calibrar display 4.
Medir el pH.
5. Expresin de los resultados.
Leer directamente el valor del pH sobre la escala graduada del potencimetro.
Los resultados se expresan en unidades de pH, a 20C, segn la forma:
pH a 20C=x,xx (la segunda cifra decimal es 0 5).
6. Precisin.
La diferencia mxima entre dos determinaciones sucesivas debe ser de 0,1 unidades
de pH.
7. Parmetros
6,6 6,8
Aplicacin.
Se determina por medida directa con pH-metro el valor de pH de la muestra de leche.
Resultados: pH = 6,71
ACIDEZ
La leche fresca contiene muy poco cido lctico. Bajo la influencia de algunos
microorganismos, la lactosa presente en la leche se convierte en cido lctico, y por lo
tanto se acidifica. (La leche, adems del cido lctico contiene cantidades pequeas de
otros cidos, stos tambin quedan neutralizados en el proceso del mtodo, pero
calcularemos los resultados como si nicamente estuviera presente el cido lctico).
El grado de acidez de la leche determina su comportamiento y las propiedades de sus
derivados.
DETERMINACIN DE ACIDEZ
Para esta determinacin podemos aplicar dos mtodos:
Titulacin cido-Base.
Mtodo
1. Principio
Se entiende por acidez en las leches natural, certificada, higienizada y esterilizada,
el contenido aparente de cido, determinado por el procedimiento expuesto a
continuacin.
Un determinado volumen de leche se valora con solucin de sosa, empleando
solucin de fenolftalena y luego se expresa el resultado en grados Dornic (D)
2. Material y aparatos
Bureta graduada cada 0,05 mililitros o cada 0,1 mililitros que permita apreciar la
semidivisin.
Portabureta.
Vaso de precipitado o erlenmeyer.
3. Reactivos
Solucin 0,11M de hidrxido sdico (NaOH).
Indicador: 0,5 mililitros de una solucin de fenolftalena al 1 %.
4. Procedimiento
PREPARACIN DE LA MUESTRA.
Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se
obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la
muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C.
DETERMINACIN.
Se determina volumtricamente operando sobre 10 mililitros de leche con solucin
0,11M de NaOH. Como indicador se emplean 0,5 mililitros de solucin alcohlica de
fenolftalena al 1 por 100. Dar por terminada la valoracin cuando aparece una
coloracin rosa fcilmente perceptible por comparacin con un testigo tomado de la
misma leche. Dicha coloracin desaparece progresivamente, pero se considera
obtenido el viraje cuando el tinte rosa persiste durante unos 10 segundos.
Aplicacin. Valoracin de cido dbil (cido lctico) con base fuerte (hidrxido de sodio)
Valoramos una muestra de 10 ml de leche que contiene cido lctico con NaOH 0,11M.
Para alcanzar el punto final determinado por indicador se gastaron 1,6 ml de titulante,
con este valor calculamos la concentracin de cido lctico.
mmoles de base = mmoles de cido
1,6ml*0,11M = 10ml*Ccido Ccido = 0,0176M
La reaccin de valoracin es
NaOH + C3H6O3(ac) C3H5O3Na + H2O
Equilibrios involucrados
H2O --------> H+ + OHHL <------> H+ + LNaOH -----> OH- + Na+
Clculos
Los clculos de valoracin para este ejemplo se hacen de cuatro formas distintas segn
la regin de la curva de valoracin:
1. Antes de que se aada base, la disolucin contiene nicamente HL en leche. ste
es un cido dbil, cuyo pH queda determinado por el equilibrio
Ka
HL <------> H+ + L2. A partir de la primera adicin de NaOH hasta inmediatamente antes del punto de
equivalencia, hay una mezcla de HL sin reaccionar y L- producido por la reaccin
de valoracin.
3. En el punto de equivalencia, todo el HL se ha convertido en L-.
4. Despus del punto de equivalencia, se aade un exceso de NaOH a una disolucin
de A-. como buena aproximacin, el pH est determinado por la base fuerte.
Resultados
1,6 ml NaOH = 16D
Valoracin Potenciomtrica.
Mtodo
1. Principio
Este mtodo sigue el transcurso de una valoracin cido-base con un pH-metro. El
aparato elimina la necesidad de un indicador visual, puesto que el punto de
equivalencia de la reaccin se determina construyendo una grfica del pH (medido
con el pH-metro) en funcin de los ml de disolucin valorada aadidos (medidos con
la bureta).
Cuando la curva alcanza el punto de mxima pendiente, se ha alcanzado el punto
final de la valoracin.
Se realiza la titulacin potenciometrica para encontrar el valor exacto en el cual se
produce el punto de equivalencia de la titulacin y por ende la acidez verdadera.
2. Material y aparatos
Bureta graduada cada 0,05 mililitros o cada 0,1 mililitros que permita apreciar la
semidivisin.
Portabureta.
Vaso de precipitado o erlenmeyer.
pH-metro
3. Reactivos
Solucin 0,11M de hidrxido sdico (NaOH).
4. Procedimiento
PREPARACIN DE LA MUESTRA.
Antes del anlisis poner la muestra a 202 C y mezclarla cuidadosamente. Si no se
obtiene una dispersin homognea de la materia grasa, calentar nuevamente la
muestra a 40C mezclar nuevamente y enfriarla de nuevo a 202C.
DETERMINACIN.
Calibrar el pH-metro con la ayuda de las dos soluciones tampn de
referencia.
o Colocar en el buffer 7 y calibrar display 7.
o Lavar con agua destilada.
o Colocar en el buffer 4 y calibrar display 4.
Colocar 5 ml de una alcuota de la muestra en un vaso de precipitado. Aadir
100 ml de agua.
Introducir un par de electrodos vidrio-calomenanos (o combinado) en la
disolucin.
Introducir un agitador magntico en el vaso y ajustar la altura de los
electrodos de modo que la barra del agitador no pueda tocar a los
electrodos.
Poner en marcha el agitador y el pH-metro.
Valorar la disolucin con la solucin de NaOH. Tomar una lectura por cada
ml o cada vez que el aparato seale una variacin de 0,2 unidades, segn lo
que suceda antes.
Construir una grfica del pH (eje vertical) frente a ml de base aadida (eje
horizontal).
Determinar los ml de NaOH necesarios para alcanzar el punto final.
1 derivada 2 derivada
pH/
(pH/)/
2,81
3,1
3,39
3,63
3,86
4,03
4,33
4,45
4,67
5,01
7,98
10,95
11,24
11,41
11,55
11,73
11,84
11,92
12,1
12,05
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
1,25
1,35
1,45
1,55
1,65
1,75
1,85
1,95
2,1
2,3
2,5
2,7
2,9
2,9
1,45
1,2
1,15
0,85
1,5
1,2
2,2
3,4
29,7
29,7
2,9
1,7
1,4
0,9
0,55
0,4
0,9
-0,25
-7,25
-1,25
-0,25
-1,5
3,25
-2
10
12
263
4,61853E-13
-268
-12
-3
-3,333333333
-1,75
-0,75
2,5
-5,75
pH
14
12
pH
10
8
6
4
2
0
0
0,4
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2,4
2,8
V (ml NaOH)
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,1
1,25
1,35
1,45
1,55
1,65
1,75
1,85
1,95
2,1
2,3
2,5
2,7
2,9
pH/
1 Derivada
V (ml NaOH)
2 Derivada
300
(pH/)/
200
100
0
-100
0,3
0,7
-200
-300
V (ml NaOH)
2,7
Resultados
1,6 ml NaOH = 16D
Conclusin
El mtodo ms exacto para la determinacin del punto final de una valoracin cidobase es el poteciomtrico. El uso de indicadores visuales trae aparejado un pequeo
error.
Un indicador cido-base, es un cido orgnico o una base orgnica dbil, cuya forma
disociada tiene un color distinto que su base o cido conjugado. Estas molculas se
pueden utilizar para determinar cundo se ha adicionado la cantidad suficiente de
titulante y se les denomina indicadores visuales.
Como regla general, se debe seleccionar el indicador que cambia de color en un pH
aproximado al punto de equivalencia de la titulacin.
ESPECTROFOTOMETRA
MTODOS ESPECTROSCPICOS DE ANLISIS
Los mtodos espectroscpicos de anlisis se basan en la medicin de la radiacin
electromagntica emitida o absorbida por los analitos.
Los mtodos de emisin utilizan radiacin emitida cuando un analito es excitado por
energa trmica, elctrica o radiante.
A diferencia de los anteriores, los mtodos de absorcin se basan en la disminucin de
la potencia de un haz de radiacin electromagntica como consecuencia de su interaccin
con el analito.
Los mtodos espectroscpicos se clasifican segn la regin del espectro
electromagntico que se utiliza. stas regiones incluyen rayos X, ultravioleta, visible,
infrarrojo, microondas y radiofrecuencias.
La radiacin electromagntica es una forma de energa que se transmite por el espacio a
velocidades muy altas. Se debe considerar como un flujo de partculas discretas o
paquetes ondulatorios de energa (fotones o cuantos).
Espectro Electromagntico
Se denomina espectro electromagntico o espectro a la radiacin electromagntica que
emite o absorbe una sustancia.
El espectro electromagntico se extiende desde la radiacin de menor longitud de onda,
como los rayos gamma y los rayos X, pasando por la luz ultravioleta, la luz visible y los
rayos infrarrojos, hasta las ondas electromagnticas de mayor longitud de onda, como
son las ondas de radio.
Abarca un intervalo muy amplio de longitudes de onda.
Espectro de absorcin
El espectro de absorcin de un material muestra la fraccin de la radiacin
electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias.
Cada elemento qumico posee lneas de absorcin en algunas longitudes de onda; hecho
que est asociado a las diferencias de energa de sus distintos orbitales atmicos.
Se emplea el espectro de absorcin para identificar los elementos componentes de
algunas muestras.
Fuentes de radiacin
Existen fuentes de radiacin continuas y de lnea.
Las primeras emiten una radiacin cuya intensidad vara slo de manera gradual con la
longitud de onda.
Las fuentes de lnea emiten un nmero restringido de bandas de radiacin, cada una de
las cuales abarca un margen muy reducido de longitud de onda.
Espectroscopa infrarroja (IR)
Es la rama de la espectroscopa que trata con la parte infrarroja del espectro
electromagntico. sta cubre un conjunto de tcnicas, siendo la ms comn una forma de
especttroscopa de absorcin.
2. Campo de aplicacin
El mtodo descripto se aplica a la determinacin de grasa, protenas y, como apropiado,
lactosa en leche entera.
3. Definicin
Aparatos de infrarrojos: instrumentos de fbrica utilizados bajo condiciones definidas los
cuales dan sucesivamente la concentracin de grasa, protenas y lactosa en leche,
expresada en gramos del componente por cada 100 gramos de leche.
4. Caractersticas principales de los aparatos IR
Los instrumentos comerciales disponibles pueden tener una o dos celdas; con dos o una
banda de ondas por canal (componente).
Pueden utilizar un sistema ptico de haz de luz simple o doble, usar un sistema
electrnico o un servo sistema para estimar la transmisin de luz. La longitud de onda
seleccionada puede ser producida por red de difraccin o por un filtro ptico de
referencia.
Los instrumentos pueden diferir entre s con respecto al nmero especfico de longitudes
de onda disponibles.
5. Calibracin del aparato
Ajuste a cada longitud de onda de la seal del aparato, de forma que, a cada nivel de
concentracin del componente que se est midiendo la lectura del aparato se acerque lo
ms posible al valor dado por el mtodo de referencia.
Puesto que los aparatos de anlisis por IR tienen diferentes sistemas de calibracin, no se
puede dar un procedimiento especfico.
El fabricante debe suministrar al laboratorio los medios para ajustar el instrumento con el
fin de cumplir con los requisitos.
6. Procedimiento
ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR:
Las muestras se almacenan en recipientes de forma y capacidad adecuada y de un
material que las proteja adecuadamente. Los materiales convenientes incluyen al vidrio,
el acero inoxidable y algunos plsticos (como el polipropileno). Los recipientes y sus
cierres estn secos y limpios en el momento de la toma de muestra, el cierre es seguro,
no absorbente, resistente a la grasa, previene la entrada de olores, no influye en las
propiedades, la composicin, el olor o el sabor de la muestra.
Las muestras sin conservantes debern almacenarse en heladera a temperatura entre 0
y 7C durante 2 das como mximo.
MTODO DE ENSAYO
Este Plan de la Calidad rene la informacin necesaria para realizar el anlisis de
determinacin materia grasa, protenas y slidos totales basado en la Norma FIL 141C:
vigente.
LECHE DE VACA
(NORMA FIL 141C: vigente)
Esta tcnica describe un mtodo para la determinacin de materia grasa, protenas y
slidos totales en leche cruda de vaca y leche cruda de vaca preservada qumicamente.
Equipo infrarrojo.
Bao con agua de circulacin capaz de mantener 40C +/- 1C.
REACTIVOS:
Se utilizan concentrados y polvos provistos por el fabricante o representante del equipo, y
se preparan siguiendo sus instructivos.
El resultado obtenido por el pasaje de una muestra por el milkoscan se establece a travs
de una combinacin entre una calibracin bsica provista de fbrica y de un ajuste de
slope/intercept. El ajuste slope / intercept se aplica a cada uno de los componentes y se
describe por medio de la siguiente ecuacin:
Resultado final de la medicin = S*(resultado de la calibracin bsica)+Y
Donde:
S: es el slope
Y: es el intercept.
La calibracin est validada si se verifica que el valor absoluto de las diferencias
algebraicas entre los resultados instrumentales y los resultados de referencia obtenidas
del anlisis de n nmero de muestras es menor o igual a 0.14 /n y el desvo estndar de
las diferencias numricas es menor o igual a 0.07% para muestras de leche de pool.
Ajuste de calibracin:
El equipo ejecuta cinco mediciones con el lquido de cero y toma el promedio. Si est
dentro de las especificaciones del cero de fbrica (<0.02 para MG, ST, PT) no se ajusta, el
instrumento lo acepta automticamente.
Si no entra en especificacin realizar tres purgas con la solucin de limpieza o cleaning
reagent a 40C.
Se vuelve a pedir el cero. Si entra en especificaciones el instrumento lo acepta
automticamente; si no, vuelve a preguntar si se acepta o rechaza. Rechazar.
Correr el material de referencia interno. Si el corrimiento del cero se traslada a la material
de referencia interno (se hace el clculo) se vuelve a correr el cero y se acepta. Volver a
correr el material de referencia interno y continuar la sesin.
Si el corrimiento del cero trasladado al material de referencia interno, superase los lmites
establecidos para la misma, se recomienda verificar dentro de la opcin service del
equipo: temperatura de cubeta, lquido cero y homogeneizador.
c) Control de la estabilidad del equipo.
El material de referencia interno tiene el propsito de verificar corrimientos en la
calibracin.
Preparacin del material de referencia interno:
Se fraccionan, en condiciones estriles, 2 litros de leche esterilizada U.H.T.
(aproximadamente 44 frascos de 50 ml de capacidad). Se toman al azar 10 frascos y se
procesan como muestras individuales en el IR. Se toma como aceptable para el chequeo
de la homogeneidad un desvo estndar menor de 0,02 % en materia grasa.
El material de referencia interno se rotula y se almacena en la heladera.
El valor del material de referencia interno se obtiene del promedio de 10 muestras
medidas en el tiempo para cada parmetro. El vencimiento de la misma es de 4 meses.
Pasaje del material de referencia interno:
Se procede a pasar el material de referencia interno por lo menos dos veces al comienzo
de la jornada de trabajo, la primera medicin se descarta. La frecuencia del pasaje del
material de referencia interno es cada 20 muestras individuales o duplicadas. Al final de la
jornada de trabajo se pasa el material de referencia interno, por lo menos una vez.
Medicin de muestras:
Se calientan las muestras en bao a 40C +/- 1C. Agitar suavemente por inversin 3 o 4
veces. Las mismas se analizan por duplicado.
Cierre:
Purgar el equipo 3 veces. Proceder a pasar un cero y realizar un normal stop.
Si las muestras procesadas son muchas, dejar el equipo en solucin de limpieza fuerte
(enzimtica) por un lapso no mayor a 1 o 2 das.
Para planes de pago de leche por calidad, se realiza una determinacin por muestra,
previo acuerdo con el cliente.
EXPRESIN DE LOS RESULTADOS:
Los resultados se expresan con dos cifras decimales y en las unidades en las que ha sido
calibrado el equipo.
QU PUEDE DETERMINARSE?
PARMETRO
Grasa
Protena
Lactosa
Slidos totales
Slidos no grasos
Descenso crioscpico
LECHE
SI
SI
SI
SI
SI
SI
NATA
SI
SI
SI
SI
SI
-
1) Carga de la muestra:
3) Esperar el resultado:
CROMATOGRAFA
Es un mtodo analtico empleado ampliamente en la separacin, identificacin y
determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas.
Es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una
mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil.
La muestra se disuelve en una fase mvil, que puede ser un gas, un lquido o un fluido
supercrtico. sta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible, la
cual se mantienen fija en una columna o sobre una superficie slida. Las fases se eligen de
tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la
fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con ms fuerza
por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los
componentes que unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en
bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Los mtodos cromatogrficos son de dos tipos:
Mtodo especfico
Lquido-Lquido o
particin
Fase estacionaria
Lquido adsorbido
sobre un slido
Tipo de equilibrio
Particin entre
lquidos inmiscibles
Lquido-Fase unida
Especies orgnicas
unidas a una sup.
Slida
Slido
Particin entre
lquidos y sup.
Unida.
Adsorcin
Resina de
intercambio inico
Intercambio inico
Lquido-Slido o
adsorcin
Intercambio de
iones
Cromatografa lquida
(CL)
(fase mvil:lquida)
Cromatografa
gaseosa (CG) (fase
mvil:gas)
Cromatografa
gaseosa (CG) (fase
mvil:gas)
Cromatografa
gaseosa (CG) (fase
mvil:gas)
Cromatografa fluida
(CFS)
(fase mvil:fluido
supercrtico)
Exclusin por
tamao
Gas-Lquido
Gas-Fase unida
Gas-Slido
Gas-Slido
Lquido en
intersticios de un
slido polimrico
Lquido adsorbido
sobre un slido
Particin/tamizado
Especies orgnicas
unidas a una sup.
Slida
Slido
Particin entre
lquido y sup. Unida
Especies orgnicas
unidas a una sup.
slida
Particin entre
fluido supercrtico y
superficie unida
Adsorcin
LA COLUMNA:
La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto que es
en ella donde tiene lugar a separacin.
As, resulta fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada
separacin.
Las columnas ms utilizadas en ste tipo de cromatografas son las de relleno. stas
consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase estacionaria adecuada
al tipo de separacin que desee llevarse a cabo.
El dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin y su longitud vara
entre 5 y 30 cm.
Todas las separaciones cromatogrficas tienen lugar sobre la fase estacionaria. sta se
encuentra constituida generalmente por partculas de materiales rgidos o semirgidos, y
en la mayora de los rellenos suele utilizarse slice.
La slice utilizada realiza una de las tres funciones que se indican:
Superficie adsorbente: en este caso, los propios grupos activos de la superficie de
la slice (grupos silanol) son los responsables de la separacin.
Soporte de la fase estacionaria: sta, o bien impregna la superficie de la slice, o
bien se encuentra ligada qumicamente a ella (slice modificada qumicamente).
Actuacin como sustrato microporoso: aqu la slice permite la seleccin de
molculas en funcin de su tamao.
Preparacin de soluciones:
5- MUESTRAS PATRN
Para leche en polvo:
Previo al anlisis homogenizar bien la leche. Trasvasar la leche a un recipiente
aproximadamente el doble del volumen de sta, provisto de un cierre hermtico. Cerrar
el recipiente inmediatamente y mezclar bien.
Pesar 2,000 g 0,001 g y aadir 20,0 g de agua a 50 C. Disolver agitando durante 5
minutos con la ayuda de un agitador.
Llevar a 25 C. Aadir en 2 minutos 10,0 ml de la solucin de cido tricloroactico
agitando constantemente con la ayuda de un agitador.
Mantener a 25C durante 60 minutos.
Centrifugar por 10 min a 2500 rpm o filtrar sobre papel desechando los primeros 5 ml de
filtrado. Pasar filtrado por un filtro de membrana de poro 0,45 m o menor.
II.
En cada interrupcin lavar las columnas con agua y en toda interrupcin superior a
veinticuatro horas, despus del lavado con agua, se les debe pasar solucin de
lavado; por lo menos tres horas a un flujo de 0,2 ml por minuto.
7- CLCULOS:
Con el fin de detectar cualquier anomala, ya sea debida al mal funcionamiento del
cromatgrafo o de las columnas, debido a la muestra a analizar, es necesario observar el
aspecto de cada cromatograma antes de efectuar cualquier interpretacin cuantitativa.
Procedimiento de clculo cuando se utilizan las reas de los picos para la determinacin
del porcentaje de suero de quesera aadido.
Clculo del coeficiente de respuesta:
R=
P
A(5) A(0)
En donde:
R = es el coeficiente de respuesta
A(5) = es el rea del pico III obtenido del anlisis cromatogrfico del patrn de leche en
polvo adicionada el 5% (m/m) de suero de quesera.
A(0) = es el rea del pico III, obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de leche en
polvo exenta de suero de quesera.
P = es el porcentaje de suero de quesera presente en el patrn (en este caso 5%).
Clculo del rea relativa del pico III obtenido del anlisis cromatogrfico de la muestra:
S (E) = R x A (E)
En donde:
S(E) = rea relativa del pico III en la muestra
A(E) = rea correspondiente al pico III obtenida en el anlisis cromatogrfico de la
muestra
R = Coeficiente de respuesta (calculado en el paso anterior).
Clculo del rea relativa del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn de
leche en polvo exento de suero de quesera:
S (0) = R x A (0)
En donde:
S(0) = rea relativa del pico III en el patrn de leche en polvo exenta de suero de quesera.
A(0) = rea correspondiente al pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn
de leche exenta de suero de quesera.
R = coeficiente de respuesta.
Clculo del tiempo de retencin relativo del pico III en la muestra:
TRR (E) = TR (E)
TR (5)
En donde:
TRR(E) = tiempo de retencin relativo del pico III de la muestra.
TR(E) = tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico de la
muestra.
TR(5) = tiempo de retencin del pico III obtenido en el anlisis cromatogrfico del patrn
de leche en polvo adicionada del 5 % (m/m) de suero de quesera.
Por la experimentacin est demostrado que existe relacin lineal entre el tiempo
relativo del pico III en la muestra y el porcentaje de suero de quesera aadido hasta el 10
%.
Con un contenido < 5 %, el TRR(E) es > 1,000.
Con un contenido " 5 %, el TRR(E) es = 1,000.
Clculo del porcentaje de suero de quesera presente en la muestra:
W = S (E) (1,3 + (S(0) 0,9))
En donde:
W = porcentaje m/m de suero de quesera presente en la muestra.
S(E) = rea relativa del pico III para la muestra.
1,3 + = media experimental del rea relativa del pico III expresada en gramos de suero de
quesera en 100 g de leche no adulterada.
S(0) = rea relativa del pico III para el patrn de leche exenta de suero de quesera.
S(0)-0,9 = correccin que hay que efectuar en el rea relativa media 1,3 cuando el valor
S(0) no es igual a 0,9.
Lmite de deteccin:
Se considerar que una muestra contiene suero de quesera aadido cuando el
porcentaje cuantificado sea superior al 5 % para las leches UHT y superior a 3% en leches
pasteurizadas, esterilizadas y en polvo.