La aplicacin de la Inmunihistoqumica (IHQ) como

herramienta en el diagnstico y pronstico del cncer.

Vernica Mara Grupe

Lic. en Bioquimica
Magister en Ciencias Qumicas
Fundacin para el Progreso de la Medicina

ANATOMA PATOLGICA

Tcnica centenaria

IHQ: tcnica esencial en el

diagnstico anatomopatolgico de las
enfermedades (neoplsicas fundamentalmente)

Toma de la muestra

Fijacin en Formol

Corte con micrtomo

Inclusin en Parafina

Colocacin en cassettes

Inmunohistoqumica

DIAGNOSTICO
TRATAMIENTO
ADECUADO

Hematoxilina/
Eosina

INMUNOHISTOQUMICA

Es un mtodo para localizar antgenos en
clulas o tejidos, basado en el
reconocimiento antgeno-anticuerpo,
hacindolos visible a la microscopia
ptica.

INMUNOHISTOQUMICA
Surge de una idea muy simple
antgeno+anticuerpo+componente fluorescente

Limitaciones de la IHQ:
 El personal tcnico y mdico debe estar
especficamente entrenado.
 Los resultados deben analizarse en un contexto
clnico-patolgico.
 No ayuda en el 100% de los casos, por el contrario,
puede llevar a errores en la interpretacin.
 La IHQ es una herramienta ms para el diagnstico
del paciente y no una tcnica diagnstica en s
misma.

Mala interpretacin de la reaccin

Diagnstico errneo

Tratamiento inadecuado

IHQ: tcnica esencial en el

diagnstico anatomopatolgico de las
enfermedades (neoplsicas fundamentalmente)

Toma de la muestra

Fijacin en Formol

Inclusin en Parafina

Corte con micrtomo

Colocacin en cassettes

Fijacin del tejido: paso esencial y crtico

Una fijacin inadecuada impide cualquier
resultado fiable.
FORMOL al 10% tamponado a pH 7,4
(formalina). Perodo no menor de 24 horas ni
mayor de 48 horas.

Reaccin Qumica

La fijacin en formol buffer preserva la

morfologa del tejido
No
afectado

Ag
Enmascarado

Completamente
afectado

Ag Completamente
afectado
Sobre fijacin: por perodos muy largos,
produce deterioros en el tejido y prdida de la
reactividad del antgeno: falsos negativos.
Fijacin hbrida: perifricamente se fijan
con formol mientras las partes profundas
centrales lo hacen gracias a los alcoholes que
se emplean durante el procesamiento.

La fijacin en formol buffer preserva la

morfologa del tejido
No
afectado

Ag
Enmascarado

Completamente
afectado

Recuperacin antignica
Huang y col. (1976) introduce la utilizacin de
enzimas.
Pepsina
Proteasa
Ampliamente utilizadas
Tripsina
Fascina
Proteinasa K

Mejora la tincin de ALGUNOS marcadores

Gran desventaja: condiciones ptimas para la
digestin difciles de lograr.

Recuperacin antignica
En 1991 Shi y col. introduce el trmino Antigen Retrieval (AR) :
recuperacin de la inmunoreactividad a travs de la exposicin
del tejido en una solucin cerca de su punto de ebullicin.
Bao
de
Agua

Autoclave

AR
Microondas
Microondas

Vaporera
(Steamer)

Recuperacin antignica en
microondas

Posibles mecanismos de AR
Ruptura de uniones cruzadas inducidas por
formol.
Extraccin de protenas bloqueadoras.
Precipitacin de protenas.
Rehidratacin de las secciones de tejido:
-mejor penetracin del anticuerpo
-aumento de la accesibilidad de los epitopes
Appl Immunohistochem Mol Morphol. Volume 16, Number 4, July 2008

AR: influencia del ph de la solucin

Dabbs. Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic

Applications. 3rd Edition.

Pasos de la Tcnica de IHQ

Estufa a 60C y desparafinizacin en xileno
Rehidratacin del tejido en alcoholes con
graduaciones decrecientes.
Bloqueo de la peroxidasa endgena.
Desenmascaramiento del Ag-recuperacin
antignica:
-microondas (citrato- EDTA)
-enzimas
Tincin inmunohistoqumica en autostainer.
Contra tincin con hematoxilina.

Sistemas de deteccin
LSAB+

Immunohistochemical Staining Methods Education Guide Chapters. www.dako.com

Sistemas de deteccin
Polymer Method (Envision)

Immunohistochemical Staining Methods Education Guide Chapters. www.dako.com

Optimizacin de la
inmunorreactividad
Los factores ms importantes son:
Dilucin del anticuerpo primario.
Duracin de la incubacin del primario.
Tcnica de recuperacin antignica empleada.
Sistema de deteccin y amplificacin.

Manual de calidad de IHQ en anatoma patolgica. Hospital Donostia.

Espaa-2007

Inmunohistoqumica
 Valor Diagnstico
 Valor Pronstico
 Valor Teraputico

Aplicaciones de la IHQ
 Correcta tipificacin de tumores
 Tumores de origen desconocido
 Para definir tratamiento (ER, PR, CerbB2, CD117,
EGFR)
 Factor pronstico (ki67, p53)

CD3: molcula asociada al TCR que

identifica clulas T y neoplasias asociadas

CD30
Receptor de transmenbrana que juega un rol en la funcion y
diferenciacin de las clulas linfoides normales.
Clulas de Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin

Calretinina
Protena ligante de calcio.
Presente en tejido nervioso central y perifrico y en la retina.
Ampliamente expresada en clulas mesoteliales.

TTF1
Thyroid trascription factor.
Regulador trascripcional de genes especficos de Tiroides y
de Pulmn.
Positivo en carcinoma de Tiroides y carcinoma pulmonar

Aplicaciones de la IHQ
 Correcta tipificacin de tumores
 Tumores de origen desconocido
 Para definir tratamiento (ER, PR, CerbB2, CD117,
EGFR)
 Factor pronstico (ki67, p53)

Her 2Neu o cerbB2

Protoncogen
Oncoprotena
Tirosinquinasa
Pertenece a la familia de los
receptores de factores de
crecimiento epidermal (EGFR)

Amplificacin gentica y/o la

sobreexpresin de la protena:







crecimiento
duplicacin
sntesis de ADN
invasividad
potencial
metasttico

Sistema de graduacin del Her2/neu

FOTOS
40X

Score
Score1+
0, Negativo
2+
3+
Negativo
Dudoso
Positivo

Confirmar con FISH o CISH

H
E
R
C
E
P
T
I
N
A

Hibridizacion in situ
Tcnica que permite marcar especficamente cidos
nucleicos (ADN o RNA) en secciones tisulares

Marcada

Aplicaciones de la IHQ
 Correcta tipificacin de tumores
 Tumores de origen desconocido
 Para definir tratamiento (ER, PR, CerbB2, CD117,
EGFR)
 Factor pronstico (ki67, p53)

Ki67
Protena no histnica presente en todas las fases del ciclo
celular, EXCEPTO en G0
Buen marcador de clulas proliferantes

P53
Protena producto del gen supresor de tumores
En tejidos normales no es detectable por IHQ
P53 mutada es detectada en una amplia variedad de tumores y
est asociada a mal pronstico.

IHQ-XITO
TCNICA

Tipo y tiempo de fijacin

Buen procesamiento del tejido
Buena morfologa
Tcnica estandarizada
Control de calidad

IHQ : Cuidados de Tcnica y de

Interpretacin
 Deben realizarse controles internos
y externos
Control externo del lab: NordiQC (Dinamarca)

Trompa de Falopio
CKAE1/AE3
ASMA

Placenta
CD34
PLAP

Tissue Microarray (TMA): qu son?

La tecnologa de las micromatrices de tejido, o
tissuemicro arrays (TMA) consiste en obtener un
nico bloque de parafina en el cual se ha
ensamblado, siguiendo un patrn predeterminado,
mltiples ncleos de distintos tejidos, permitiendo
el anlisis histolgico simultneo de los mismos.

Introduccin

Sausage method

Battifora H.The multitumor (sausage) tissue block: Novel Method for

Immunohistochemical Antibody Testing. Lab Inves 1986; 55: 244-248

1986

1987

1990

1998

Control y estandarizacin de los

anticuerpos

TMA

Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A. Tissue Microarrays for Highthroughput Molecular profiling of Tumor Specimens. Nature Med 1998; 4: 844-7.
(extrado de la pgina web: www.microarraystation.com).

Introduccin

VENTAJAS DEL USO DE

TISSUE MICROARRAYS

Permite el estudio de grandes series de pacientes

simultneamente en un tiempo escaso.

Ejemplo de la diagramacin de un TMA

(coordenadas): TMA de tejidos normales

RESULTADOS PARTE I

Vista Microscpica de un TMA.

FOTOS
2,5X

FOTO
20X

FOTOS
10X

Utilidades y ventajas de los TMAs

LAB
1

LAB 4

LAB 2

LAB 3

Nueva era de la IHQ

El Rango de diagnstico de la IHQ se est
expandiendo a la identificacin de cambios
de niveles de protenas que se correlacionan
con una alteracin molecular

LLEGAMOS AL FINAL

POR SU ATENCIN