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Oviedo, 2005
Al Dr. Baltasar Mayo Prez, bajo cuya direccin y supervisin he realizado este
trabajo, por su labor en mi formacin cientfica.
Al Dr Juan Carlos Bada, director del Instituto de Productos Lcteos de Asturias
(IPLA), por darme la oportunidad de hacer este trabajo en el centro.
A la Dra. Covadonga Barbs Miguel, mi tutora en la Universidad, por su ayuda en
la revisin de la memoria.
Al Dr. Adolfo Surez del Servicio de Digestivo del Hospital de Cabuees (Gijn),
por la seleccin de los individuos y proporcionarnos las muestras de estudio.
Al Ministerio de Educacin y Ciencia, por la concesin de una beca de Formacin
de Personal Investigador (FPI).
A los Drs. Gerald Fitzgerald de la University College Cork (Irlanda) e Ingolf F.
Ness de la Agricultural University of Norway (Noruega), por permitirme realizar
estancias de investigacin en sus laboratorios.
A todos los que de un modo u otro han participado en este trabajo y
especialmente a los compaeros del IPLA con los que he compartido tanto tiempo, a
los presentes y a los que ya no estn en el centro.
Por ltimo quiero dar las gracias a mi familia, sobre todo a mis padres por sus
constantes nimos y motivacin, y de forma muy especial a lvaro por su apoyo
incondicional.
NDICE
Introduccin.
5
6
8
10
10
11
13
14
14
14
15
1.2.5.D. Gnotobitica.
17
2. PROBITICOS.
18
18
19
20
22
24
25
2.3.2. Inmunomodulacin.
25
26
27
28
29
29
29
30
32
Material y Mtodos.
34
34
2. Anlisis microbiolgicos.
35
35
35
37
37
37
37
4. Anlisis estadstico.
38
5. Aislamiento de microorganismos.
38
38
6. Identificacin de microorganismos.
39
39
39
41
41
7.2. RAPD-PCR.
42
8. Anlisis molecular.
43
43
44
45
47
47
47
47
48
48
49
50
50
50
51
51
51
52
Resultados y discusin.
53
53
53
53
56
58
59
63
63
65
67
69
69
72
72
73
74
76
77
81
84
84
89
90
91
92
93
94
II.5.2. RAPD-PCR.
97
101
104
106
108
111
113
115
116
Discusin general.
119
Conclusiones.
130
Bibliografa.
132
Anexos.
153
ABREVIATURAS
p/v: Peso/volumen.
DNA.
Tool.
pH 8.
Tris:
propanodiol.
IPTG: isopropil--D-tiogalactopiransido.
Laboratory Standards.
NCDO:
National
Collection
of
Dairy
Tris
2-amino-2
(hidroximetil)-1,3-
Organisms (UK).
X-gal:
galactopiransido.
YGCA:
Chloramphenicol Agar.
5-bromo-4-cloro-3-indolil--DYeast
extract
Glucose
Introduccin
Introduccin
Duodeno
Colon transverso
Yeyuno
Colon descendente
Colon ascendente
Vellosidades intestinales
Ciego
Apndice
Colon sigmoideo
Recto
leon
Introduccin
Introduccin
abundantes (Tannock, 1995). Tambin son dominantes otros microorganismos Grampositivos no esporulados pertenecientes a los gneros Eubacterium, Bifidobacterium,
aparecen
poblaciones
de
bacterias
anaerobias
facultativas
como
Grupo microbiano
Nmero (ufc/g)
Bacteroides
109-1012
Bifidobacterias
109-1011
Eubacterias
109-1011
Peptoestreptococos
109-1011
Peptococos
109-1011
Ruminococos
105-1011
Fusobacterias
106-1010
Clostridios
106-109
Lactobacilos
105-108
Enterobacterias
105-108
Enterococos
105-107
Estreptococos
103-105
Levaduras
102-105
Estafilococos
0-104
Compilado de Hagiage (1994), Cummings (1997), Holzapfel y cols. (1998) y Salminen y cols.
(1998c).
Introduccin
Introduccin
Introduccin
10
Bifidobacterium
8
Lactobacillus
Clostridium prefringes
2
nacimiento
destete
madurez
vejez
Introduccin
Introduccin
Introduccin
perjudiciales
podemos
incluir
infecciones
intestinales,
infecciones
extraintestinales y carcinognesis.
En condiciones normales el ecosistema intestinal est en equilibrio y los
microorganismos perjudiciales no ejercen su poder patgeno; sin embargo, en
determinadas situaciones, stos pueden dar lugar a infecciones y enfermedades
nocosomiales si se establecen en regiones del cuerpo en las que no son residentes
habituales o cuando su nmero se incrementa de forma excesiva debido a
perturbaciones del ecosistema intestinal. Entre los miembros de la microbiota
anaerobia estricta, Bacteroides fragilis es el que con ms frecuencia causa infecciones
y sepsis a partir de contaminacin fecal (Patrick, 1993); mientras que Escherichia coli,
la bacteria anaerobia facultativa cultivable ms frecuente en heces, es la causa ms
habitual de infecciones del tracto urinario (Sobel y Kaye, 1995).
10
Introduccin
Infecciones por rotavirus. Las infecciones por rotavirus son la mayor causa de las
diarreas graves durante la infancia y la adolescencia. Desde el punto de vista clnico, la
mucosa intestinal se ve afectada y se modifica la composicin de la microbiota
intestinal, lo que da lugar a un episodio de diarrea osmtica seguida de un crecimiento
excesivo de alguna de las poblaciones bacterianas no dominantes (Ciarlet y Estes,
2001).
Diarrea por Clostridium difficile asociada al tratamiento con antibiticos. Uno de los
desrdenes intestinales ms importantes y mejor documentados es la diarrea asociada
al tratamiento con antibiticos. La incidencia de esta diarrea se sita entre un 5 y un
25% de los casos de la terapia antibitica, siendo mucho ms frecuente cuando se
utilizan antimicrobianos de amplio espectro. El tratamiento con antibiticos perturba el
balance de la microbiota intestinal normal permitiendo la proliferacin de patgenos
emergentes como Cl. difficile, causante de la colitis pseudomembranosa que se
produce entre el 10 y el 20% de estas diarreas (Bergogne-Brzin, 2000).
Infecciones por Helicobacter pylori. H. pylori es una bacteria espiral Gram-negativa
que coloniza la mucosa gstrica humana. Este microorganismo se ha asociado con el
desarrollo de gastritis crnicas, lceras ppticas y cncer gstrico. Uno de sus
principales factores de patogenicidad es la presencia de la enzima ureasa que hidroliza
la urea generando amonio, de forma que el pH local aumenta y se favorece la
colonizacin y la proliferacin del microorganismo (Malfertheiner y cols., 2002).
11
Introduccin
12
Introduccin
13
Introduccin
en el colon (Gibson y cols., 1992; Scheppach y cols., 1995). De esta forma el efecto
protector de la fibra dietaria en el cncer de colon se asocia con una mayor produccin
de butirato (Mortesen y Clausen, 1996).
14
Introduccin
15
Introduccin
Figura 3. Estructura del ARNr 16S en la que se sealan las regiones variables ms
importantes (V1 a V9).
16
Introduccin
1.2.5.D. Gnotobitica.
La Gnotobitica es un mtodo de estudio in vivo de la microbiota intestinal que
utiliza animales de experimentacin libres de microorganismos (Falk y cols., 1998).
Tras el parto, realizado generalmente por cesrea, los animales se disponen
directamente en cabinas estriles, donde adems de la atmsfera, todos los materiales
y nutrientes que se les proporciona son estriles. En otros casos, el estado de
esterilidad se consigue con un primer bibern de antibiticos que imposibilita la
implantacin de bacterias en el TGI. En estos animales se pueden introducir con
posterioridad microorganismos de forma controlada para su estudio.
Gran parte de las funciones que se le atribuyen a la microbiota intestinal se han
determinado mediante la comparacin de animales axnicos (estriles) y animales
holoxnicos (animal convencional con microbiota normal). As se ha visto que en los
animales axnicos los glcidos son degradados a hexosas y pentosas, pero esta
degradacin no va acompaada de la produccin de cido lctico y de cidos grasos
voltiles provenientes del metabolismo bacteriano, tal y como sucede en los animales
convencionales (Midtvedt, 1997). En los animales axnicos se ha observado tambin
una menor tasa de reemplazamiento celular en la mucosa del intestino delgado y un
menor desarrollo del sistema inmune (Falk y cols., 1998).
17
Introduccin
2. PROBITICOS.
2.1. PROBITICOS Y ALIMENTACIN FUNCIONAL.
Hasta finales del siglo XX, la meta en la alimentacin humana era asegurar un
aporte adecuado de energa y de macro y micronutrientes en la dieta. Hoy en da est
naciendo un nuevo concepto de nutricin, que procura, adems de los objetivos
tradicionales, la promocin de la salud y el bienestar y la prevencin de las
enfermedades. En este contexto, aparecen los alimentos funcionales, una de cuyas
definiciones ms aceptadas es la de aquel alimento modificado o ingrediente
alimentario que provee un beneficio para la salud adems de satisfacer los
requerimientos nutritivos tradicionales (Sanders, 1998). El concepto de alimento
funcional incluye que su ingesta se efecte como componente habitual de la dieta y
que ste ejerza sus efectos en las cantidades ingeridas normalmente en una dieta
equilibrada. Dentro de los alimentos funcionales tienen un papel destacado, y en
general bien reconocido, los probiticos y los prebiticos.
Los prebiticos son ingredientes alimenticios no asimilables por nuestro
organismo que promueven la proliferacin selectiva de bacterias intestinales
beneficiosas (Gibson y Roberfroid, 1995). Fructooligosacridos, inulina, lactulosa y
galactooligosacridos son algunas de estas sustancias.
Los probiticos son alimentos o suplementos alimenticios con bacterias vivas que
contribuyen a mantener el equilibrio microbiano del TGI (Fuller, 1989). Una definicin
ms precisa dice que stos son microorganismos vivos que, tras su ingestin en cierto
nmero, ejercen efectos beneficiosos en el hospedador ms all de los inherentes a la
nutricin bsica (Guarner y Schaafsma, 1998). Recientemente Schrezenmeir y de
Vrese (2001) han redefinido el concepto, puntualizando que un probitico es un
18
Introduccin
19
Introduccin
Bifidobacterias
Otras BAL
No BAL
Lactobacillus
johnsonii (NCC 533)
Bifidobacterium
bifidum
Enterococcus faecium
Propionibacterium
freudenreichii
Lactobacillus casei
Bifidobacterium breve
Streptococcus
thermophilus
Escherichia coli
Lactobacillus
delbrueckii
Bifidobacterium
longum
Lactobacillus
rhamnosus (GG)
Bifidobacterium lactis
Saccharomyces
cerevisiae (Boulardii)
Lactobacillus reuteri
Bifidobacterium
adolescentis
(Shirota)
(Bb 12)
(Nissle)
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus
plantarum (299v)
Compilado de Collins y cols. (1998), Fooks y cols. (1999) y Salminen (2001).
20
Introduccin
21
Introduccin
22
Introduccin
Las bifidobacterias fueron descritas por vez primera por Tissier a comienzos del
siglo pasado, quien las denomin Bacillus bifidus. A partir de los aos 50 pasaron a
denominarse Lactobacillus bifidus, para constituir ms tarde el gnero Bifidobacterium.
Aunque poseen algunas caractersticas comunes con las BAL, y en muchas ocasiones
se incluyen dentro de stas por razones prcticas, el gnero Bifidobacterium pertenece
en realidad a la subdivisin Actinomycetes con un alto contenido cromosmico en G+C
(>50%) (Axelsson, 1998).
El metabolismo de los azcares difiere tambin del de las verdaderas bacterias
lcticas
ya
que
las
bifidobacterias
carecen
de
aldolasa y glucosa-6-fosfato
23
Introduccin
0.01
24
Introduccin
2.3.2. INMUNOMODULACIN.
La microbiota intestinal normal a travs del contacto y la interaccin con el tejido
linfoide de la mucosa intestinal desempea un papel fundamental en el desarrollo y
maduracin del sistema inmune competente (Gordon y cols., 1997; Cebra y cols.,
1998; Noverr y Huffnagle, 2004). El carcter inmunomodulador de los probiticos hace
referencia a un amplio espectro de efectos sobre la inmunidad celular y humoral
25
Introduccin
(Borruel, 2003). Ciertos probiticos son capaces de aumentar la inmunidad innata, por
ejemplo mediante un incremento de la capacidad fagoctica (Donnet-Hughes y cols.,
1999; Gill y cols., 2001). Adicionalmente, se ha descrito que los probiticos pueden
producir una estimulacin de la inmunidad adquirida o especfica induciendo la
produccin de inmunoglobulinas especficas del tipo A, que son las que defienden las
mucosas (Link-Amster y cols., 1994; Tejada-Simon y cols., 1999). En otras situaciones
patolgicas hay evidencias de que los probiticos pueden inducir efectos opuestos,
como la inhibicin de reacciones de hipersensibilidad o reduccin de alergias (Majamaa
e Isolauri, 1997; Isolauri y cols., 2001; Kalliomki y cols., 2001).
26
Introduccin
diarrea del viajero o la diarrea asociada al tratamiento con antibiticos (Hilton y cols.,
1997; Vanderhoof y cols., 1999).
Recientemente se han comenzado a realizar estudios sobre el tratamiento con
probiticos de otras alteraciones intestinales como las enfermedades inflamatorias
(enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) (Gupta y cols., 2000; Guslandi y cols., 2000;
Hamilton-Miller, 2001), el cncer colorrectal (Hirayama y Rafter, 2000; Wollowski y
cols., 2001) o las gastritis crnicas y las lceras gstricas causadas por H. pylori (Sheu
y cols., 2002); aunque no en todos los casos se ha podido demostrar de forma clara su
papel bioteraputico.
27
Introduccin
28
Introduccin
29
Introduccin
30
Introduccin
ser
tambin
factores
importantes.
Adems,
es
deseable
que
los
31
En este contexto, los objetivos que se plantearon en este trabajo fueron los
siguientes:
32
de
identificacin
tipificacin
para
el
estudio
de
los
33
Material y mtodos
34
Material y mtodos
2. ANLISIS MICROBIOLGICOS.
Las muestras se homogenizaron en una solucin reductora compuesta por: Brain
Heart Infusin (BHI) (Merck) con 0,5% de extracto de levadura (Biokar), 0,5% de
glucosa (Merck), 0,25% de L-cistena, 10 g/l de vitamina K1 (Merck) y 0,02 g/l de
hemina (Sigma). Las muestras de mucosa intestinal debido a su naturaleza mucosa se
disgregaron en la solucin reductora con la ayuda de una pipeta Pasteur aplanada y
con agitacin vigorosa en un vortex.
A partir de los homogenizados se realizaron diluciones decimales sucesivas que se
sembraron en superficie y por duplicado en placas Petri agarizadas con la ayuda de un
asa Digralsky. Los recuentos se expresaron como unidades formadoras de colonias
(ufc) por gramo de muestra. Los medios de cultivo utilizados para los recuentos de los
distintos grupos microbianos y las condiciones de incubacin se relacionan a
continuacin en la Tabla 3.
35
Medio de cultivo
Suplementacin
Condiciones de incubacin
Microorganismos anaerobios
totales
Clostridios
Bifidobacterias y lactobacilos
0,25% L-cistena
Bacteroides
Enterobacterias
Aerobiosis, 37C,
24-48 h
Coliformes
Aerobiosis, 37C,
24-48 h
Enterococos
Aerobiosis, 44C,
24-48 h
Estafilococos
Agar de Baird-Parker
Mohos y levaduras
Aerobiosis, 37C,
24-48 h
Material y mtodos
descrito
por
Tangerman
Nagengast
(1996)
con
algunas
modificaciones.
37
Material y mtodos
4. ANLISIS ESTADSTICO.
Los recuentos microbianos, as como los resultados de SCFAs del seguimiento
mensual de 8 sujetos se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA) de una va
utilizando individuo como factor con 8 categoras. Otos parmetros estadsticos
utilizados fueron: el coeficiente de variacin, la moda, la media y la desviacin
estndar. El anlisis se llev a cabo usando la hoja de clculo Microsoft Excel 2002 y el
programa estadstico SPSS 11.0 para Windows.
5. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
5.1. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO.
Se aislaron un total de 265 cepas de placas de MRSC (MRS con un 0,25% de
cistena) y 57 cepas de placas de BHI, a partir de distintas muestras de heces y
mucosa intestinal de los 10 individuos. Las cepas se crecieron en cabina de
38
Material y mtodos
anaerobiosis durante 24-48 h en caldo MRSC y BHI respectivamente. Todas las cepas
se mantuvieron y conservaron a -80C en el medio de cultivo fresco correspondiente
con un 40% de glicerol (Merck).
6. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS.
6.1. OBTENCIN DE EXTRACTOS CELULARES.
Para la obtencin de extractos bacterianos se utiliz bsicamente el protocolo
descrito por Song y cols. (2000). Las cepas se crecieron en cabina de anaerobiosis
durante 72 h en placas de MRSC o BHI y a partir de colonias aisladas se obtuvo
biomasa que se lav y resuspendi en 0,1 ml de Tampn TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA pH 8) con 0,9% de NaCl. La suspensin celular se calent a 98C durante 10 min
en un termociclador Dualcycler LINUX (Cultek) y posteriormente se centrifug 10 min
a 14.000 rpm para eliminar los restos de material celular. Los extractos se conservaron
congelados a -20C hasta su utilizacin.
39
Material y mtodos
unidades (U) de ADN polimerasa Taq (Amersham) y 5 l de los extractos celulares. Las
condiciones de la PCR fueron las siguientes:
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
Desnaturalizacin
95C
5 min
Desnaturalizacin
94C
45 s
Anillamiento
56C
1 min
Extensin
72C
45 s
Extensin
72C
10 min
pblicas
(GenBank:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Ribosomal
40
Material y mtodos
inositol,
manitol,
arbutina,
sorbitol,
sorbosa,
ramnosa,
tagatosa,
amigdalina, gluconato y salicina. Los pocillos de las placas se inocularon con 150 l de
una suspensin de las cepas en el medio de fermentacin de la casa suministradora, y
se incubaron durante 48 h a 37C en cabina de anaerobiosis.
Con los resultados obtenidos, codificados como 0 (reaccin negativa) y 1 (reaccin
positiva), se realiz un anlisis numrico empleando el programa MVSP (Multi-Variate
Statistical Package) versin 3.1 (Kovach Computing Service). A partir de las bases de
datos dicotmicas obtenidas se calcularon las similitudes entre las cepas utilizando el
ndice de Sokal y Mitchener (SM o Simple Matching Coefficient), que es el cociente
entre la suma de las pruebas coincidentes entre dos cepas, dividido por las cuatro
combinaciones posibles:
a+b
a+b+c+d
a=(1,1), b=(1,0), c=(0,1) y d=(0,0)
Una vez obtenidas las matrices de similitud se formaron los grupos mediante el
mtodo de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
41
Material y mtodos
Averages) (Priest y Austin, 1995). Este algoritmo asocia las distintas cepas en funcin
de su grado de similitud, obtenindose as dendogramas que permiten evaluar la
formacin de grupos y subgrupos y establecer las posibles relaciones entre los
aislados.
7.2. RAPD-PCR.
Se utiliz la tcnica RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) para la
tipificacin genotpica de cepas de bifidobacterias. A partir de cultivos en caldo MRSC
de 24 h se obtuvo ADN cromosmico mediante la utilizacin del kit comercial GenElute
Bacterial Genomic DNA (Sigma), siguiendo bsicamente las recomendaciones de la
casa suministradora y empleando adems 50 mg/ml de lisozima y 100 U/ml de
mutanolisina (Sigma) en la solucin de lisis inicial.
El ADN purificado se utiliz en una subsiguiente amplificacin por PCR, en la que
se uso un nico oligonucletido de 10 pb con un contenido en G+C del 60% (OPA 18:
5'-AGGTGACCGT-3') (Vincent y cols., 1998). La reaccin se realiz en un volumen final
de reaccin de 50 l, adicionando el oligonucletido a una concentracin de 1 M junto
con 200 M de cada uno de los dNTPs, 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Eppendorf) y 3
l de la solucin de ADN bacteriano. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:
1 ciclo
35 ciclos
1 ciclo
Desnaturalizacin
95C
5 min
Desnaturalizacin
95C
1 min
Anillamiento
32C
1 min
Extensin
72C
2 min
Extensin
72C
10 min
42
Material y mtodos
2a
2a+b+c
a=(1,1), b=(1,0), c=(0,1) y d=(0,0)
8. ANLISIS MOLECULAR.
8.1. AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DEL ADN TOTAL.
El ADN bacteriano total se aisl a partir de dos muestras de heces de dos sujetos y
de dos muestras de mucosa intestinal de otros dos individuos. Las muestras se
diluyeron y homogenizaron en tampn fosfato salino o PBS (tampn fosfato 100 mM
pH 7,4 con NaCl al 0,9%) a razn 1:10 (p/v). Esta suspensin se agit vigorosamente
en presencia de esferas de vidrio de 106 m (Sigma), separndose el material no
soluble y las bolas de vidrio mediante centrifugacin a baja velocidad (800 rpm 2 min).
El sobrenadante se centrifug posteriormente a 14.000 rpm durante 5 min y el
sedimento de clulas bacterianas se congel a -20C. La lisis bacteriana se llev a cabo
43
Material y mtodos
44
Material y mtodos
de la reaccin fueron esencialmente las descritas por Kok y cols. (1996), adicionando 2
l del ADN total purificado como ADN molde. La PCR se realiz con el siguiente
programa de temperaturas:
1 ciclo
20 ciclos
1 ciclo
Desnaturalizacin
95C
5 min
Desnaturalizacin
95C
1 min
Anillamiento
62C
45 s
Extensin
72C
1 min
Extensin
72C
5 min
45
Material y mtodos
grupo
filogentico
se
realiz
http://www.cme.msu.edu/bergeys/
con
la
ayuda
(Bergeys
de
Manual
las
pginas
on
Web:
line),
3'
46
Material y mtodos
47
Material y mtodos
estudi
la
resistencia
de
bifidobacterias
lactobacilos
diversos
antibiticos
analizados
fueron:
penicilina,
amoxicilina,
amoxicilina+cido
48
Material y mtodos
49
Material y mtodos
fue MRSC con baja concentracin de glucosa (0,2%), inoculado con el indicador entre
un 2 y un 5%.
Mediante la tcnica de difusin en agar se ensay la actividad antimicrobiana de
los sobrenadantes libres de clulas o CFS (Cell free supernatant). Los sobrenadantes
se obtuvieron por centrifugacin (8.000 rpm 10 min) a 4 C de cultivos activos de 24 h.
Con la ayuda de un sacabocados se excavaron pocillos de 5 mm de dimetro en placas
de 20 ml de MRSC suplementado con agar al 1,5% e inoculado con el indicador al 5%
en profundidad. Cada pocillo se rellen con 30 l del sobrenadante a ensayar. La
actividad antimicrobiana se puso de manifiesto por la aparicin de halos de inhibicin
en el crecimiento en csped de la cepa indicadora.
50
Material y mtodos
51
Material y mtodos
permiten la penetracin del colorante y aparecen azules, mientras que las clulas
viables se muestran refringentes al repeler el colorante.
52
53
Individuo B
Log 10 ufc/g
12
10
8
6
4
2
0
1
Muestra/Da
M. totales
Bifidobacterias
Lactobacilos
Enterobacterias
Mohos y levaduras
Clostridios
Bacteroides
Coliformes
Enterococos
Estafilococos
Individuo D
12
Log 10 ufc/g
10
8
6
4
2
0
1
Muestra/Da
54
10
11
condiciones de anaerobiosis
dificulta an ms su cultivo.
Los recuentos de bifidobacterias fueron bastante estables en niveles de 109 -1011
ufc/g en ambos individuos, mientras que los lactobacilos solo se detectaron en algunas
de las muestras. El medio de recuento utilizado para ambos microorganismos fue el
mismo ya que con ninguno de los medios ensayados para el cultivo selectivo de
lactobacilos (incluso en MRS acidificado a pH 4,5) se pudo inhibir el crecimiento de las
bifidobacterias, lo que situaba el lmite de deteccin para los primeros en torno a 106
ufc/g. En las muestras en las que fue posible estimar su nmero, los niveles se
situaron alrededor de 108 ufc/g en el individuo B y 107 ufc/g en el individuo D.
Los recuentos de microorganismos aerobios (estafilococos, enterococos y mohos y
levaduras) presentaron mayores fluctuaciones, sobre todo en el Individuo D. Estos
grupos, cuyos niveles oscilaron entre 103 y 106 ufc/g, se encontraron en proporciones
inferiores a los de la microbiota anaerobia estricta, tal y como esta descrito en la
literatura (Drasar y Barrow 1985; Mitsuoka, 1992b; Conway, 1995; Tannock, 1999b).
Los recuentos de enterobacterias se correspondieron en la mayora de las muestras
con los de coliformes. Las muestras 6, 7 y 8 en el individuo D constituyeron una
excepcin. En stas, los coliformes se mostraron desplazados por una poblacin de
enterobacterias lactosa negativa, que se identific posteriormente en el Hospital de
Cabuees como Salmonella sp. Este desplazamiento microbiano coincidi en el tiempo
con una perturbacin diarreica acompaada de fiebre sufrida por el sujeto durante tres
55
elevados
con
ciertas
patologas
tendencias
hacia
determinadas
56
Individuo B
Valor Modal
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
Individuo D
Valor Modal
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
-Fucosidasa
N-Acetil--glucosaminidasa
-Glucosidasa
-Glucosidasa
-Glucuronidasa
-Galactosidasa
-Galactosidasa
Val-arilamidasa
Leu-arilamidasa
Esterasa-lipasa (C8)
Esterasa (C4)
Fosfatasa cida
Fosfatasa alcalina
Enzima
Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa
19 77 19 14 10 19 ND 38 67 58 29 48 58 10
19
38
14
14
38
38
29
48
77
29 29 19 29
29 38 19
67
38 38 67
38
48 48
77 77
38 38 29 38 19 29 ND 10 58 38 58 10 58 10
5
19
19
77
29
19
19
19
77 19
10
19
19
10
19
10
29 38
29 29 38
5
77
5
5
: 1 Unidad de actividad equivale a 1mol de substrato hidrolizado por hora y por g de heces.
ND: No detectado.
57
Resultados similares han sido puestos de manifiesto por Mykknen y cols. (1998),
quienes describieron que las variaciones diarias en las actividades enzimticas en
heces eran significativamente menores a las variaciones existentes entre individuos.
En el sujeto B se detect un aumento considerable de los niveles de diversas
actividades en las dos ltimas muestras del seguimiento, que fue especialmente
notable en varias glicosidasas. Este aumento no se asoci con ningn cambio aparente
en los recuentos microbianos. Las glicosidasas son, sin embargo, unas de las
actividades enzimticas bacterianas ms importantes en el colon. Los vegetales de la
dieta contienen una gran variedad de glicsidos que son pobremente adsorbidos y
pasan al colon donde se hidrolizan mediante glicosidasas bacterianas, principalmente
58
largo del tiempo. Por ltimo, en este periodo pusimos a punto las tcnicas para la
extraccin, deteccin y cuantificacin de cidos grasos de cadena corta (SCFAs) y la
medida de la concentracin de amonio en heces; parmetros relacionados con la
actividad microbiana intestinal (Cummings, 1997; Parodi, 1999).
Bifidobacterias
Lactobacilos
12
ufc/g
10
log
log10 ufc/g
10
4
2
0
0
A1
C2
E3
4
F
G5
6
H
7L
8M
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
A
C2
E3
Individuos
4F
5
G
6H
7L
8
M
Individuos
Coliformes
M. Anaerobios totales
10
14
12
8
7
log 10 ufc/g
log10 ufc/g
10
8
6
6
5
4
3
1A
2
C
3E
4F
5
G
Individuos
6H
7L
8
M
1
A
C2
3
E
4F
5
G
6H
7L
8
M
Individuos
59
60
Tabla 5. Medias, desviaciones estndar y resultados del ANOVA de los recuentos microbianos en heces durante el seguimiento a lo
largo de un ao en 8 voluntarios.
Recuentos microbianos (Log 10 ufc/g de heces)
N de
Microorganismos
muestras
anaerobios totales
Mohos y
Clostridios
Bifidobacterias
Bacteroides
Coliformes
Lactobacilos
Enterococos
Estafilococos
10,78 0,32
9,93 0,56
9,37 1,05
9,15 1,05
6,23 0,91
8,56 0,37
5,94 0,55
3,80 0,50
2,77 0,76
10,32 0,47
10,30 0,26
9,24 0,71
8,79 0,20
6,94 1,17
6,24 0,61
5,51 0,84
4,23 1,81
3,02 1,33
10,24 0,38
10,31 0,49
9,13 0,50
8,98 0,09
7,50 0,76
7,04 0,20
6,48 0,81
5,02 1,23
2,39 0,42
10,76 0,44
9,97 0,30
9,14 0,71
8,94 0,71
6,62 0,95
7,10 1,07
5,87 0,51
3,60 1,07
3,21 1,14
10
10,27 0,63
10,47 0,08
10,34 0,26
8,66 0,62
8,27 0,59
5,95 0,58
5,54 1,06
4,35 0,68
3,97 0,81
10,11 0,27
9,69 0,37
8,68 0,89
8,80 0,44
6,51 0,67
6,58 0,50
5,95 1,28
4,84 1,29
3,33 0,81
9,89 0,34
9,66 0,40
9,30 0,41
8,28 0,99
7,76 0,83
ND
5,84 0,76
5,12 0,96
2,50 0,44
9,84 0,47
9,83 0,49
9,19 0,44
8,65 0,07
7,88 0,80
ND
4,92 0,68
4,77 0,45
3,79 0,44
NS
***
***
**
Individuo
ANOVA
: Los recuentos de coliformes se correspondieron con los de enterobacterias en todos los casos.
ND: No detectado.
NS: Diferencias no significativas, : p<0,1, *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001.
levaduras
61
mostraron
mayor
variabilidad
que
la
presentada
por
los
62
fosfatasa alcalina, que presentaba en todos los casos la mxima actividad. Al igual que
en el estudio precedente, en algunos casos se reconocan perfiles de actividad
personales. As por ejemplo, el sujeto E present de forma frecuente baja actividad
63
64
INDIVIDUOS
Unidades de actividad
Esterasa-lipasa (C8)
10
10
10
19
29
29
14
Esterasa (C4)
19
10
19
29
38
19
19
19
Leu-arilamidasa
10
38
77
10
38
19
31
Val-arilamidasa
10
ND
ND
38
ND
ND
ND
ND
Fosfatasa alcalina
77
77
77
77
77
77
77
77
Fosfatasa cida
58
29
10
38
29
38
19
29
Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa
19
19
10
29
19
19
19
29
-Fucosidasa
10
10
10
10
ND
-galactosidasa
48
38
19
48
29
29
38
38
-galactosidasa
77
48
77
38
38
29
58
58
-glucuronidasa
38
77
19
38
58
38
19
34
-glucosidasa
58
67
58
38
29
19
48
58
-glucosidasa
38
38
38
38
77
48
38
29
N-acetil--glucosaminidasa
77
58
38
58
58
48
58
58
11
13
11
12
N de muestras
ND: No detectado.
: 1 Unidad de actividad equivale a 1 mol de substrato hidrolizado por h y g de heces.
: No se pudo establecer un valor modal, por lo que se muestra la media aritmtica.
sujeto G mostr valores de actividad -glucosidasa de casi el doble que el resto de los
individuos.
Es difcil una comparacin directa de nuestros resultados con los que hay descritos
en la literatura debido fundamentalmente a las diferentes metodologas utilizadas. Sin
embargo, s estn descritas variaciones notables entre sujetos en enzimas como la
65
40
35
30
mmol/Kg de heces
25
20
15
10
0
0
1A
2C
3E
4F
5G
6
H
7L
Individuos
66
Individuo A
9,5 13,0
Individuo G
Individuo C
22,3 12,5
Individuo H
6,5 5,7
Individuo E
14,3 7,0
Individuo L
12,8 6,7
Individuo F
5,8 3,4
Individuo M
9,0 5,3
14,3 7,4
8M
Aunque estos valores de dispersin se consideran muy elevados, est descrito que
los metabolitos bacterianos, particularmente los productos de putrefaccin, pueden
variar ampliamente entre muestras diarias (Ikeda y cols., 1994). Estas diferencias, que
se observan incluso en adultos aparentemente sanos, pueden ocurrir como resultado
de diversos factores como la dieta y el tiempo de trnsito intestinal (Rowland y cols.,
1985; Stephen y cols., 1987).
En los distintos estudios de la concentracin de amonio en heces se emplean
diferentes mtodos analticos (Benno y Mitsuoka, 1992; Fujiwara y cols., 2001a;
Fujiwara y cols., 2001b) que dificultan la comparacin de resultados. No obstante,
nuestros datos se corresponden con los descritos por Ikeda y cols. (1994), quienes
reportan unas concentraciones de amonio y rangos de variacin similares.
67
detectados y los niveles de significacin del ANOVA para aquellos que presentaron
diferencias entre individuos.
La concentracin total oscil en funcin del sujeto entre 60 y 100 mmol/Kg. El
actico fue el compuesto mayoritario en todas las muestras, con niveles de alrededor
de 60 mmol/Kg de heces, triplicando, de forma habitual, las cantidades del segundo
SCFA ms frecuente en heces: el butrico o el propinico, dependiendo del individuo.
Se encontraron adems, trazas de cido valrico e isovalrico en todos los sujetos. El
cido caproico y el isobutrico se detectaron solo en algunas muestras de ciertos
individuos y curiosamente nunca de forma conjunta en la misma persona. En los
individuos M y L, estos cidos grasos no se detectaron en ninguna ocasin. Debido a
su aparicin puntual, el anlisis estadstico de ANOVA no pudo aplicarse para estos dos
ltimos SCFAs. Para el resto, exceptuando el isovalrico, el ANOVA puso de manifiesto
la existencia de diferencias estadsticamente significativas entre individuos.
120
100
Caproico
80
Isovalrico
60
Valrico * p<0,05
40
Isobutrico
Butrico *** p<0,001
20
Actico ** p<0,01
A
Individuos
68
Tanto los niveles totales como las cantidades relativas de los distintos cidos
difirieron entre los individuos, observndose en algunos casos perfiles de produccin
personales. As por ejemplo, en las muestras del sujeto G se encontr siempre una
notable cantidad de cido caproico. El individuo L, por su parte, se caracteriz por una
baja produccin de SCFAs, con unos niveles de butrico y propinico mucho ms bajos
que los del resto de sujetos.
Las concentraciones y las proporciones relativas de los SCFAs en heces se
corresponden bastante bien con las que se relacionan en la literatura. La mayora de
los autores describen el actico como el SCFA ms comn y detectan de forma
frecuente una mayor cantidad de cido propinico que de butrico (Hovertad y cols.,
1984; Midtvedt y Midtvedt, 1992; Ikeda y cols., 1994).
69
cuatro de los individuos se realizaron recuentos para los distintos grupos microbianos,
mientras que la muestra intestinal del sujeto M se utiliz exclusivamente para aislar y
caracterizar cepas de bifidobacterias. En la Figura 11 se muestran los recuentos
microbianos de las cuatro muestras de mucosa intestinal de los individuos A, C, F y G,
comparados con la media de los correspondientes grupos encontrados en heces.
Como puede verse, los recuentos microbianos de las diversas poblaciones fueron
diferentes en los distintos individuos. En general, los clostridios y las bifidobacterias
presentaron niveles entre 105 y 108 ufc/g de tejido. Las poblaciones de coliformes
oscilaron tambin dentro de estos rdenes de magnitud.
Individuo C
Bi
C
lo
st
ri
ta
le
s
.T
o
En
te
ro
co
co
s
Es
ta
filo
co
co
s
ifo
rm
es
Bi
Co
l
st
rid
io
s
Cl
o
.T
o
M
fid
ob
ac
te
r ia
s
log
10
6
4
2
0
12
10
8
6
4
2
0
di
os
fid
ob
ac
te
r ia
s
Co
lifo
rm
es
En
te
ro
co
co
s
Es
ta
filo
co
M
co
oh
s
os
y
le
va
du
ra
s
ufc/g
12
10
8
ta
le
s
log
10
ufc/g
Individuo A
Mucosa Intestinal
le
va
du
ra
s
y
co
co
s
oh
os
M
st
af
ilo
E
nt
er
oc
oc
os
E
ifo
rm
es
Co
l
st
ri
Cl
o
.T
o
M
di
os
12
10
8
6
4
2
0
ta
le
s
fid
ob
ac
te
r ia
s
C
ol
ifo
rm
es
La
ct
ob
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En
te
ro
co
co
s
Es
ta
filo
M
co
oh
co
os
s
y
le
va
du
ra
s
log
10
ufc/g
Individuo G
di
os
Bi
C
lo
st
ri
.T
o
M
70
Heces
12
10
8
6
4
2
0
ta
le
s
log
10
ufc/g
Individuo F
71
72
N de
aislados
Homologa con
secuencias de clones
y amplicones
Clostridium
subgrupo XIVa
Actinobacteria
AY169422 Clostridium
clostridioforme
AB080865 Clon de
97
96 firmicute no cultivado
99
NB2A8
92
AY328370 Bacteria no
cultivada A-44
98
96
AB064887 Firmicute
intestinal humano CO13
98
Clostridium
AF499841 Clon de
88 bacteria no cultivada
98
Bacteroidete
(grupo CFB)
98
Actinobacteria
98
-Proteobacteria
99
LCLC2
subgrupo XIVa
73
99
De los aislados del individuo C, dos mostraron una homologa del 98% con
secuencias de la especie Bifidobacterium longum. El resto de los aislados presentaron
un porcentaje de identidad inferior al 97% con secuencias de diversas especies
cultivables pertenecientes al subgrupo de Clostridium coccoides XIVa (Collins y cols.,
1994). Estas ltimas secuencias mostraron una identidad ms alta con secuencias de
las bases de datos obtenidas por procedimientos independientes de cultivo.
Entre los aislados del individuo G se encontr una mayor diversidad; 5 aislados se
relacionaron filogenticamente con el subgrupo de Cl. coccoides XIVa, 5 con la clase
-proteobacteria (Escherichia coli), un aislado con la clase de las actinobacterias
(Collinsella aerofaciens) y otro con la clase de los bacteroides. Excepto 3 de los
aislados del subgrupo Cl. coccoides XIVa, el resto mostraron porcentajes de identidad
superiores al 98% con secuencias de especies cultivables. La presencia de una alta
proporcin de aislados de E. coli (5 de 12) concuerda con los datos obtenidos de los
recuentos microbianos en este individuo, en el que habamos registrado unos altos
niveles de coliformes (108 ufc/g) en todas las muestras de heces (ver Tabla 5).
74
N de
aislados
100
100
99
98
98
17
99
AY278485Citrobacter freundii
AF025368 Citrobacter braakii
99
Grupo BLS
98
Clostridiales
98
-Proteobacteria
Grupo BLS*
-Proteobacteria
75
haban mostrado altos niveles de enterobacterias, del orden de 107-108 ufc/g (ver
Figura 11). Especies de los gneros Klebsiella o Citrobacter forman parte de la
microbiota intestinal humana, aunque pueden llegar a comportarse como patgenos
oportunistas, dando lugar a diarreas o infecciones extraintestinales (Hagiage, 1994;
Struve y Krogfelt, 2004). Miembros del gnero Streptococcus (St. salivarius, St.
76
77
longum y C. aerofaciens).
N de
clones
Homologa con
secuencias de clones y
amplicones
98
98
AB064754 Clon de
AY169411 Ruminococcus obeum 94 Ruminococcus no
cultivado N044
Clostridium
subgrupo
XIVa
Clostridium
grupo IV
X85022 Faecalibacterium
prausnitzii
AY169429 Faecalibacterium
prausnitzii
AY166537 Bifidobacterium
longum
AF052417 Bacteria no
cultivada A20
AB064752 Clon de
95 Ruminococcus sp. no
cultivado NO54
AB064753 Clon de
97 Ruminococcus sp. no
cultivado NB2F4
99
97
98
97
96
AF052411 Bacteria no
cultivada A10
99
95
99
99
97
AJ131149 Coriobacterium
sp. CCUG 33917
99
Actinobacteria
1
AB011816 Collinsella
aerofaciens
78
N de
clones
Homologa con
secuencias de clones y
amplicones
98
96
99
90
AB080865 Clon de
bacteria no cultivada del
intestino humano
JW1A1
99
94
AB064740 Clon de
firmicute no cultivado
NO62
99
95
AF371596 Clon de
bacteria no cultivada
p-2431-55G5
99
AY341237 Ruminococcus
94
AF371597 Clon de
bacteria no cultivada
p-1561-b5
98
Clostridium
subgrupo XIVa
Clostridium
grupo IV
Clostridium
grupo XVIII
AY169411 Ruminococcus
obeum
AY169411 Ruminococcus
obeum
AY169427 Faecalibacterium
prausnitzii
99
96
AB064753 Clon de
Ruminococcus sp. no
cultivado NB2F4
99
98
99
100
99
89
AB030225 Catenibacterium
97
Clostridiales
-Proteobacteria
79
gnavus
AF371595 Clon de
bacteria no cultivada
p-596-a5
mitsuokai
X96964 Shigella sonnei
AE016991 Shigella flexneri
98
AB099797 Clon de
clostridio no cultivado
OLDB-C1
AF445227 Bacteria
fecal porcina FPC54
-
99
98
-
En la muestra del sujeto G la mayor parte de los clones se asociaron con la clase
de los clostridiales. La identidad con bacterias cultivables oscil entre un 89 y un
100%. 16 secuencias se relacionaron con el subgrupo XIVa de Cl. coccoides, 4 con el
grupo IV de Cl. leptum y 2 con miembros del grupo XVIII, cuya especie tipo es Cl.
Aislados
Clones
Individuo C
-Proteobacterias
Bacteroidetes
Actinobacterias
grupo IV
subgrupo XIVa
Clostridiales
grupo XVII
otros
-Proteobacterias
Bacteroidetes
Actinobacterias
grupo IV
subgrupo XIVa
Clostridiales
grupo XVII
otros
3
2
11
7
Individuo G
5
1
1
5
1
4
16
2
1
80
Gram-positivas
con
bajo
contenido
en
G+C,
estando
relacionados
principalmente con miembros de los grupos XIVa y IV de los clostridiales. Estos grupos
aparecen como constituyentes mayoritarios de la microbiota fecal humana en muchos
trabajos (Wilson y Blitchington, 1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999;
Hayashi y cols., 2002b; Matsuki y cols., 2002).
La escasa deteccin de secuencias relacionadas con el grupo de los bacteroides se
corresponde bien con los reducidos niveles de estas poblaciones encontrados mediante
los
recuentos
microbianos.
Aunque
se
han
descrito
grandes
diferencias
81
96
AB099735 Clon de
bacteria no cultivada
OLDB-F3
98
96
AJ270484 Bacteria
productora de butirato
A2-231
99
95
AF371596 Clon de
bacteria no cultivada
p-2431-55G5
99
Clostridium
subgrupo XIVa
Clostridium
grupo IV
Homologa con
secuencias de clones y
amplicones
N de
clones
AY341237 Ruminococcus
gnavus
100
96
AJ408996 Clon de
bacteria no cultivada
HuCB21
99
95
AB064773 Clon de
firmicute no cultivado
NS2F9
99
98
Bacteroidete
(grupo CFB)
Grupo BLS
-Proteobacteria 2
AJ413954 Faecalibacterium
prausnitzii
AJ420107 Megamonas
hypermegale
M58839 Streptococcus
salivarius
L37785 Sutterella
wadsworthensis
94
AF371724 Clon de
bacteria no cultivada
p-2840-6C5
98
96
AB064837 Clon de
Gram-positivo no
cultivado NB4B4
100
100
95
AB064866 Clon de
-Proteobacterium no
cultivado NB2C10
100
-Proteobacteria 1
99
-Proteobacteria 1
99
82
83
84
32
Bifidobacterias
75
B. longum/infantis
31
B. pseudocatenulatum
B. bifidum
B. adolescentis
B. catenulatum
B. dentium
B. animalis/lactis
35
2
2 2
3
Lactobacilos
11
23
4
5
5
15
8
L. gasseri
L. casei/paracasei
L. delbrueckii
L. rhamnosus
L. ruminis
L. brevis
L. plantarum
L. johnsonii
L. parabuchneri
Lactobacillus sp.
L. vaginalis
L. sakei
En muchas ocasiones las cepas presentaban homologas del mismo porcentaje con
secuencias de dos o ms especies, no pudiendo llegar a asignarse a una nica especie
de forma inequvoca con este criterio. Este es el caso de B. animalis y B. lactis, para las
que Masco y cols. (2004) han propuesto su unificacin en una nica especie: B.
85
Especies
B. longum
18
B. pseudocatenulatum
26
16
12
11
B. catenulatum
B. bifidum
B. adolescentis
20
10
B. dentium
B. animalis
L. gasseri
L. casei
1
5
16
L. rhamnosus
L. delbrueckii
L. brevis
1
3
4
3
L. johnsonii
L. parabuchneri
L. vaginalis
L. plantarum
L. ruminis
L. sakei
Lactobacillus sp.
N de aislados
23
17
13
29
41
24
15
24
27
14
N de muestras
86
87
L. gasseri fue la especie aislada con mayor frecuencia, siendo predominante entre
los lactobacilos de dos de los tres individuos en los que apareci. L. casei y L.
L. plantarum, as como los dos aislados que no pudieron asignarse a ninguna especie.
Un nmero considerable de las cepas del individuo B se identificaron como L. ruminis.
Esta especie se haba aislado en el pasado del rumen de bovinos (Kandler y Weiss,
1986), pero recientemente, mediante tcnicas independientes de cultivo, se ha
encontrado tambin como componente regular de la microbiota de las heces humanas
(Reuter, 2001; Heilig y cols., 2002).
En general, tanto las especies aisladas de heces como su proporcin relativa
coinciden con lo observado por otros autores. As, L. gasseri, L. casei, L. rhamnosus y
88
distintas poblaciones son muy variados y no existe ningn consenso respecto a las
especies dominantes.
Especies de
Aislados en mucosa
Aislados en heces
Individuos
Individuos
bifidobacterias
B. longum
10
18
11
15
14
20
10
14
B. pseudocatenulatum
N de aislados
89
18
Sin embargo, en el sujeto M, aunque se encontraron tambin las dos especies, sus
proporciones relativas aparecen invertidas. As, mientras que de las 14 cepas aisladas
de heces solo tres se identificaron como B. pseudocatenulatum, 15 de los 20 aislados
de mucosa pertenecan a esta especie.
Aunque el nmero de aislamientos no es muy grande, los resultados se
corresponden en general con lo observado por Hold y cols. (2002). Estos autores
tampoco encuentran grandes diferencias en los mayores grupos microbianos de
muestras fecales y mucosa del colon. Sin embargo, en otros estudios se describen
diferencias cualitativas y cuantitativas importantes entre las poblaciones mayoritarias
de heces y mucosa (Marteau y cols., 2001; Zoetendal y cols., 2002; Ouwehand y cols.,
2004).
90
Especies de
Individuo C
Individuo G
bifidobacterias
B. longum
Clones
Aislados
Clones
26
B. pseudocatenulatum
B. dentium
Aislados
3
1
21
B. animalis
B. minimum
B. psychroaerophilum
91
(Simpson y cols., 2004). La mayora de las secuencias se identificaron sin embargo con
92
Especies de
Individuo A
Individuo M
bifidobacterias
Clones
Aislados
Clones
Aislados
B. longum
29
B. pseudocatenulatum
20
15
B. animalis
pseudocatenulatum.
93
N de
aislados de
heces
N de
aislados de
mucosa
C
H
L
M
2 heces + 1 mucosa
3 heces
2 heces
3 heces + 1 mucosa
7
8
6
8
E
M
6 heces
2 heces + 1 mucosa
10
3
Especies
Individuos
B. longum
B. pseudocatenulatum
2
4
94
Figura 13. Fotografa de una microplaca PhP-LB, utilizada para determinar los perfiles
de fermentacin de azcares de las cepas de bifidobacterias.
95
B. pseudocatenulatum
*: cepas de mucosa.
Figura 14. Dendograma obtenido por el mtodo UPGMA a partir de los perfiles de fermentacin de carbohidratos de los aislados.
B. longum
96
II.5.2. RAPD-PCR.
El RAPD-PCR ha sido utilizado con xito para describir la heterogeneidad y
relacionar aislados de bifidobacterias de diversos orgenes (Vincent y cols., 1998;
Simpson y cols., 2003; Mtt y cols., 2004). Por esta razn, los 50 aislados de las
especies de B. longum y B. pseudocatenulatum, tipificados mediante fermentacin de
carbohidratos y relacionados en la Tabla 17, se sometieron a una tipificacin gentica
mediante esta tcnica. En la Figura 15 se muestran los distintos perfiles de bandas
obtenidos con el oligonucletido OPA-18 en las dos especies y en la Figura 16 se
representa el dendograma que se obtuvo tras la aplicacin del anlisis de similitud
utilizando el ndice de Dice y mediante el mtodo UPGMA.
Dependiendo de la cepa, se observaron entre 6 y 11 bandas de amplificacin, la
mitad de ellas de intensidad fuerte y con un tamao comprendido entre las 500 y las
3000 pb. Se encontraron 16 patrones RAPD distintos, 12 entre los aislados de B.
97
Ind. C
Ind. H
Ind. L
Ind. M
B. pseudocatenulatum
PM
PM
C51 C72 C64 H82 H94 L23 L43 L45 L47 M27 M62 M19 M119 M63 E74 E137
*
*
*
*: aislados de mucosa.
98
B. pseudocatenulatum
*: cepas de mucosa.
B. longum
*
*
*
Individuo M
Individuo E
Individuo H
99
Individuo M
Figura 16. Dendograma obtenido por el mtodo UPGMA a partir de los perfiles RAPD de los aislados.
100
Captulo
III:
Caracterizacin
seleccin
de
101
102
B. animalis
B. dentium
0,25%
B. catenulatum
0,5%
1%
B. adolescentis
2%
B. bifidum
B. pseudocatenulatum
B. longum
0
20
40
60
80
100
Nmero de aislados
L. sakei
L. plantarum
L. vaginalis
Lactobacillus sp.
0,25%
L. parabuchneri
0,5%
L. johnsonii
1%
L. brevis
2%
L. ruminis
L. rhamnosus
L. casei
L. delbrueckii
L. gasseri
10
15
20
25
Nmero de aislados
103
104
capaz de iniciar el crecimiento por debajo de este pH. La tolerancia a la acidez de los
lactobacilos fue mayor que la mostrada por las bifidobacterias. As, mientras que slo
un 18% de las bifidobacterias analizadas creci a pH 3,5, un 55% de los lactobacilos
fueron capaces de crecer en estas condiciones, entre ellos los aislados de L. casei (5),
B. longum
B. pseudocatenulatum
B. bifidum
B. adolescentis
B. catenulatum
B. dentium
B. animalis
Lactobacilos
L. casei
L. brevis
L. ruminis
L. gasseri
Lactobacillus sp.
L. johnsonii
L. parabuchneri
L. rhamnosus
L. sakei
L. delbrueckii
L. vaginalis
L. plantarum
N aislados
3,5
4,5
5,5*
68
12
10
26
20
28
25
7
3
3
1
1
5
3
2
3
4
6
13
1
2
1
1
15
6
2
3
29
16
5
4
4
4
2
2
2
2
1
1
1
1
5
1
1
2
1
2
2
1
1
3
1
1
1
*: control
105
seguras
(GRAS)
no
infectivas,
stas
pueden
comportarse
en
106
nociva
107
Naftol-AS-BIfosfohidrolasa
Fosfatasa cida
Esterasa (C4)
Esterasa-lipasa (C8)
Leu-arilamidasa
Val-arilamidasa
Cis-arilamidasa
-Galactosidasa
-Galactosidasa
-Glucuronidasa
-Glucosidasa
-Glucosidasa
-Fucosidasa
Tabla 19. Actividades enzimticas (en nmoles de substrato hidrolizado) de las cepas
de lactobacilos y bifidobacterias seleccionadas.
A21 L. gasseri
F71 L. gasseri
F76 L. casei
40
30
10
B63 L. casei
>40
30
10
G92 L. rhamnosus
2,5
15
10
30
30
2,5
2,5
20
2,5
G42 L. brevis
2,5
10
2,5
2,5
40
20
10
40
15
25
C32 L. vaginalis
2,5
2,5
10
2,5
20
20
>40
G46 L. parabuchneri
2,5
2,5
25
10
10
40
20
30
2,5
2,5
10
15
>40
15
C63* B. pseudoactenulatum
15
10
25
>40
10
20
E72 B. pseudocatenulatum
2,5
2,5
15
15
E113 B. pseudocatenulatum
15
20
30
20
25
2,5
2,5
15
25
30
10
H34 B. pseudocatenulatum
2,5
10
10
10
2,5
L21 B. catenulatum
2,5
15
15
40
25
20
L48 B. catenulatum
2,5
25
30
>40
25
15
L51 B. catenulatum
30
25
>40
35
20
2,5
2,5
25
>40
20
2,5
Enzimas
Lactobacilos
Bifidobacterias
L25 B. longum
C62* B. longum
M115* B. pseudocatenulatum
E43 B. animalis
108
109
Penicilina
Amoxicilina
Cefoxitina
Moxifloxacino
Vancomicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Clindamicina
Tetraciclina
Metronidazol
A21 L. gasseri
0,06
0,25
>32
F71 L. gasseri
0,12
0,5
32
>32
F76 L. casei
0,12
0,5
>64
>8
>32
B63 L. casei
0,25
>64
0,25
>8
0,5
>32
G92 L. rhamnosus
0,25
0,5
>64
0,25
>8
0,5
>32
>64
>8
>8
16
16
>32
0,5
0,25
>64
>8
>8
0,5
>16
>32
0,25
0,5
>8
0,5
>32
L25 B. longum
0,25
0,5
0,5
C62* B. longum
0,25
0,25
0,5
>32
C63* B. pseudoactenulatum
0,25
0,25
0,5
0,5
E72 B. pseudocatenulatum
0,06
0,5
0,5
0,5
E113 B. pseudocatenulatum
0,06
0,25
0,5
0,5
16
0,5
>32
H34 B. pseudocatenulatum
0,06
0,25
0,5
0,5
L21 B. catenulatum
0,06
0,25
0,5
16
L48 B. catenulatum
0,06
0,25
>8
0,5
>32
L51 B. catenulatum
0,12
0,25
0,5
>32
E43 B. animalis
0,12
0,25
>8
0,5
16
en
infecciones
Antibiticos
Lactobacilos
G42 L. brevis
C32 L. vaginalis
G46 L. parabuchneri
Bifidobacterias
M115* B. pseudocatenulatum
El
metronidazol
es
un
antibitico
de
uso
habitual
por
110
pseudomembranosa causada por Cl. difficile (Freeman y cols, 1997). Por esta razn, la
resistencia a este antibitico en cepas probiticas podra ser una caracterstica
deseable.
Ninguna de las cepas analizadas se consider resistente al cloranfenicol (CIM8
g/ml en todos los aislados), siendo las bifidobacterias ms susceptibles que los
lactobacilos. Los aislados de B. animalis, L. brevis y L. vaginalis fueron resistentes a las
tetraciclinas (CIM16 g/ml). Estos dos aislados de lactobacilos mostraron adems
CIMs elevadas frente a clindamicina y/o eritromicina (CIM8 g/ml). Aunque nada
sabemos por el momento del carcter transmisible de estas resistencias, estas cepas
se apartaron del proceso de seleccin.
111
monocytogenes 1078
Listeria
LT2 UK1
serotipo Typhimurium
Salmonella enterica
555
Escherichia coli wt
Staphylococcus
Lactobacilos
A21 L. gasseri
++
+/-
F71 L. gasseri
F76 L. casei
+/-
B63 L. casei
++
+/-
G46 L. parabuchneri
+/-
UCC118 L. salivarius
++
++
C63* B. pseudocatenulatum
+/-
H34 B. pseudocatenulatum
+/-
++
L21 B. catenulatum
++
++
L48 B. catenulatum
+/-
+/-
L51 B. catenulatum
+/-
+/-
+/-
Bifidobacterias
L25 B. longum
E43 B. animalis
Ninguna de las cepas ensayadas fue capaz de inhibir a la cepa Bacillus cereus
NCIMB 1771. La mayora de los aislados de las especies L. casei, L. gasseri, B. longum,
112
(Ibrahim y Bezkorovainy, 1993; Ashara y cols., 2001; Bruno y Shah, 2002). Sin
embargo, son muchos los autores que han descrito la produccin, tanto en lactobacilos
como en bifidobacterias, de compuestos antimicrobianos no relacionados con la
acidificacin y activos in vitro contra patgenos Gram-positivos y Gram-negativos
(Gibson y Wang, 1994; Bernet y cols., 1997; Livin y cols., 2000; Lee y cols., 2003;
Gagnon y cols., 2004). En el caso de los lactobacilos, la produccin de bacteriocinas
est bien establecida (Zhu y cols., 2000; Boris y cols., 2001; Kawai y cols., 2004;
Ocaa y Nader-Macias 2004), pero muy poco se conoce de la naturaleza de estas
sustancias en las bifidobacterias. Slo recientemente se ha empezado ha especular con
la posible implicacin de pptidos antimicrobianos (Yildirim y cols., 1999; Toure y cols.,
2003).
113
longum L25) presentaba actividad inhibitoria, siendo otro cepa de la misma especie (B.
longum L13) el indicador ms sensible.
L13
B. longum
C102
L. delbrueckii
906
Cepas indicadoras
L. sakei CECT
Cepas seleccionadas
L25 B. longum
+/-
+/-
++
L48 B. catenulatum
L51 B. catenulatum
H34 B. pseudocatenulatum
++
++
L. plantarum LL 441
++
+/-
+/-
Controles
114
Algunos
autores
han
descrito
la
produccin
de
compuestos
115
116
Los lactobacilos se ensayaron con las dos lneas celulares, mientras que las
bifidobacterias se examinaron slo frente a las clulas Caco-2. La capacidad de
adhesin de nuestros aislados se compar con la de la cepa comercial L. rhamnosus
GG. Los niveles de adherencia se expresaron como ufc/10 cm2 de monocapa epitelial.
En las Figuras 20 y 21 se representa la media y la desviacin estndar de los tres
ensayos realizados.
Tres de las cuatro cepas de lactobacilos fueron capaces de adherirse a las lneas
celulares HT-29 y Caco-2 con niveles similares a los de la cepa estndar. En general,
las cepas se adhirieron mejor a las clulas de la lnea HT-29 que a las de Caco-2,
mientras que el control L. rhamnosus GG se adhiri a ambas por igual.
Las bifidobacterias mostraron tambin variaciones en su capacidad para adherirse
a las clulas Caco-2. As, de las tres cepas de B. catenulatum ensayadas, dos
presentaron niveles de adhesin altos, mientras que la tercera exhibi una adherencia
menor. La cepas de B. longum y B. pseudocatenulatum mostraron valores intermedios.
En el estudio se tuvo en consideracin el hecho de que los niveles de adhesin
pueden depender de la concentracin inicial de la cepa a ensayar (Greene y
Klaenhammer, 1994; Tuomola y Salminen, 1998). Por ello se calcul tambin la
adhesin expresando los resultados como porcentaje de bacterias adheridas respecto
de la cantidad total de bacterias aadidas en el ensayo. Los valores de adhesin
oscilaron en este caso entre el 40 el 80% y coincidieron, en general, con los niveles de
adhesin de las cepas que se muestran en las Figuras 20 y 21.
Varios autores, utilizando distintos modelos de adhesin, han puesto de manifiesto
una enorme variabilidad entre cepas de la misma especie en la capacidad de adhesin
(Crociani y cols., 1995, Tuomola y Salminen, 1998; He y cols., 2001), lo que sugiere
que sta es una particularidad de cada cepa.
117
Caco-2
1,00E+08
HT-29
1,00E+07
ufc/10 cm2
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
B63
L. casei
F76
L. casei
F71
L. gasseri
A21
L. gasseri
GG
L. rhamnosus
1,00E+07
1,00E+06
ufc/10 cm2
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
L51
L48
B. catenulatum B. catenulatum
118
L21
H34
L25
B. catenulatum B. pseudocatenualtum B. longum
Discusin general
119
Discusin general
obvias razones ticas de muestreo, en la mayora de los trabajos los anlisis se llevan a
cabo fundamentalmente en muestras de heces, en las que en la actualidad se han
establecido los grupos y gneros mayoritarios en diversos grupos humanos, pero slo
se poseen datos puntuales en cuanto a la composicin en especies y cepas. Tampoco
se conoce la importancia y el papel fisiolgico de las poblaciones minoritarias que, sin
duda, pueden ser determinantes en posiciones especficas o en algunas situaciones
(Cummings, 1997). S parece claro que factores como la edad, el sexo, el genotipo o
los hbitos alimenticios influyen en la microbiota intestinal (Holdeman y cols., 1976;
Noack-Loebel y cols., 1983; Moore y Moore, 1995; Hopkins y cols., 2001; Zoetendal y
cols., 2001; Hayashi y cols., 2002a). En cualquier caso y tal como hemos resaltado en
los apartados precedentes, resulta necesario, como as lo recomiendan autores de
reconocido prestigio (Salminen y cols., 1998a; Tannock, 1998; Tannock, 1999b),
estudiar la microbiologa del TGI en el mayor nmero posible de comunidades
humanas para poder llegar a extraer unas conclusiones lo ms generales posibles.
Aunque en muchos estudios ya se apunta hacia la existencia de una microbiota
personal y caracterstica para cada individuo.
En nuestro pas, los estudios sobre la microbiota intestinal humana son escasos y,
por tanto, nos vemos en la necesidad de extrapolar los resultados descritos en otras
comunidades humanas. La mayora de los estudios sobre microbiota intestinal, y
especialmente los ms modernos en los que se utilizan novedosas tcnicas
independientes de cultivo, se han llevado a cabo mayoritariamente en Japn y en otros
pocos pases industrializados. Estos grupos humanos tienen regmenes alimenticios
muy alejados de los nuestros. Si aceptamos la hiptesis de que la dieta modula o
determina la composicin de las poblaciones intestinales, habremos de asumir tambin
que en nuestro caso estos grupos microbianos pueden ser distintos a los que estn
120
Discusin general
121
Discusin general
las bacterias del cido lctico. Los resultados que obtuvimos mediante la construccin
y anlisis de genotecas de secuencias del ADNr 16S concordaron tambin con los que
la literatura refiere utilizando ste y otros mtodos moleculares (Wilson y Blitchington,
1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999; Sghir y cols., 2000; Hayashi y cols.,
2002b). Conviene mencionar que la diversidad microbiana total que se pone de
manifiesto mediante esta metodologa est en funcin del nmero de clones que se
analicen. En nuestro caso, dado el reducido nmero de clones analizados, estimamos,
tomando como base otros estudios similares (Suau y cols., 1999; Wang y cols., 2003),
que se ha puesto de manifiesto entre un 40 y un 50% de la diversidad existente. Tanto
en heces como en mucosa, los constituyentes mayoritarios estaban formados por
diversas especies pertenecientes al subgrupo XIVa de Clostridium (Collins y cols.,
1994), seguidas por otros clostridiales, bifidobacterias, bacteroides y enterobacterias.
Algunos de los microorganismos anaerobios estrictos, probablemente aquellos con una
mayor sensibilidad al oxgeno y/o unos requerimientos de cultivo ms complejos, slo
se detectaron mediante la tcnica molecular, especialmente en las muestras de
mucosa intestinal, que por su naturaleza y procesado estn ms fcilmente expuestas
al oxgeno A pesar de que los bacteroides se encontraron entre las poblaciones
mayoritarias en los recuentos, los niveles que stos presentaron y la proporcin de sus
secuencias en el anlisis molecular fueron menores que los descritos en la literatura
para otras comunidades humanas, siendo quizs el dato ms discordante de nuestros
resultados. El resultado, no obstante, se obtuvo mediante las dos tcnicas empleadas
(cultivo y molecular), por lo que hay posibilidades de que sea una caracterstica propia
de la microbiota intestinal de nuestra comunidad. El escaso nmero de muestras
analizadas mediante la tcnica molecular y las grandes variaciones individuales
(Zoetendal y cols., 1998; Hayashi y cols., 2002b) pueden ser responsables tambin de
122
Discusin general
aislada
de
heces,
seguida
en
proporciones
similares
por
B.
123
Discusin general
longum (Schell y cols., 2002), otra de L. johnsonii (Pridmore y cols., 2004) y otra de L.
gasseri (http://spider.jgi-psf.org/JGL_microbial/htm; http://compbio.ornl.gov/channel)
revela la existencia de maquinarias bioqumicas distintas para la bifidobacteria y los
lactobacilos, sugiriendo que quiz no sean competidores en las mismas posiciones del
TGI.
La microbiota intestinal, cualquiera que sea su composicin, va a ser responsable
de la mayor parte de las actividades enzimticas de las heces y de muchos de los
metabolitos que all se detectan. Algunos autores proponen que son los compuestos
generados por las actividades microbianas los verdaderos efectores de la capacidad
protectora o daina de la microbiota intestinal (Cummings, 1997; Parodi, 1999). Al
igual que en nuestro caso, la existencia de variabilidad en las determinaciones
bioqumicas en heces es una constante en muchos trabajos, que apuntan al efecto de
la ingesta alimentaria como principal factor modulador (Rowland y cols., 1985; Ikeda y
cols., 1994). No obstante, los perfiles bioqumicos (incluyendo actividades y
metabolitos) presentaron, las mismas propiedades de singularidad que las poblaciones
microbianas. Estamos convencidos de que ambos perfiles personales han de estar
conectados, aunque no hemos sido capaces de establecer correlaciones entre el
componente microbiano y el bioqumico, en algunos casos porque no se dispona de los
datos de todas las variables en estudio en una misma muestra, y en otros porque la
correlacin no fue estadsticamente significativa. Ya sabamos que era difcil establecer
asociaciones entre los parmetros bioqumicos y microbiolgicos, puesto que ni
siquiera es posible relacionarlos en modelos artificiales del TGI ms sencillos (van de
Wiele y cols., 2004; van Neunen y cols., 2004). Poblaciones no cultivables y otras
124
Discusin general
125
Discusin general
126
Discusin general
cidos
grasos
de
cadena
corta,
etc.),
la
inhibicin
de
patgenos
la
127
Discusin general
128
Discusin general
mayores, pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, etc.). En ltimo trmino los
conocimientos pueden ser la base para aprovechar en toda su potencialidad los
beneficios de los probiticos (mediante la utilizacin de microorganismos especficos),
los prebiticos (seleccionando compuestos que favorezcan el crecimiento de nuestras
poblaciones beneficiosas) y dems alimentos funcionales. Para ello sern necesarios
ms estudios que, dada la complejidad del ecosistema intestinal, habrn de ser
necesariamente interdisciplinarios para tratar de correlacionar la presencia de
determinados tipos microbianos con actividades y efectos en el hospedador; as como
establecer su relacin con la salud.
129
Conclusiones
presencia
de
microorganismos
anaerobios
estrictos,
principalmente
130
Conclusiones
131
Bibliografa
Molecular
102-103: 81-98.
analysis
of
bacterial
species
K,
Sandholm
1999.
human
T,
Persistence
von
of
Wright
A.
colonization
of
Bruce
WR,
Mitsuoka
T.
1986.
351-354.
Bergogne-Brzin
E.
2000.
associated
3402.
35: 483-489.
administration
of
bifidobacteria
and
diarrhoea.
Int J Antimicrob
secretes
nonbacteriocin
antibacterial
acid
39-45.
Bacteria:
Axelsson
LT.
1998.
Microbiology
Lactic
and
Functional
Heijenoort
York. pp 1-72.
Becker
MR,
Paster
BJ,
Leys
EJ,
casei,
J,
van
species
Gutmann
highly
L.
1997.
resistant
to
132
Bibliografa
glycopeptide
antibiotics.
Bacteriol
maintenance
of
the
gut-associated
179:6208-6212.
18.
1513-1523.
Collins
Blum S,
Reinero
R,
Schiffrin
EJ,
1998a.
Development
and
T,
determine
the
potencially
probiotic
759-768.
Crittenden
R,
Mattila-Sandholm
bacteriocin
produced
delbrueckii
subsp.
of
and
UO004,
an
tolerance
Lactobacillus
Lactobacillus
by
lactis
transit
Borruel
N.
2003.
Interacciones
intestinal:
inmunomodulacin.
and
future
requirements.
Lebensmittel
pathogenic
and
microorganisms
by
putrefactive
Bifidobacterium
sp.
bile
concentrations
of
human
small
120: 652-668.
Shroff
133
KF.
1998.
Development
and
Bibliografa
allows
regular
updates
and
the
new
45:1025-1033.
31: 442-443.
Cummings
Chair
Bruselas.
JH.
Monograph,
1997.
The
Instituto
large
Danone,
HN.
phylogeny
of
the
genus
Clostridium:
2001.
Prebiotic
digestion
and
415S-420S.
Susceptibility
GT
(eds).
Human
Colonic
Danielsen
M,
of
Wind
Lactobacillus
A.
2003.
spp.
to
82:1-11.
monoclonal
antibodies.
Appl
Environ
Microbiol 62:735-738.
134
Bibliografa
Microbiology.
American
Society
for
comparison
with
other
dairy
Lactate-utilizing
bacteria,
isolated
from
composition
and
Microbiol 70:5810-5817.
Acta
development.
S,
Agriculture
Expert
http://www.fao.org/ESN/Probio/probio.htm.
Akkermans
monitoring
Dunne
C,
Murphy
L,
Flynn
Organization of
the
Consultation
United
Report.
2002.
succession
Molecular
of
bacterial
Fecal
probiotic
bacteria
of
human
origin:
flora
in
Seventh
Day
135
Bibliografa
Holo
H,
Nes
IF,
Collins
Characterization
of
the
JK.
2002.
genetic
locus
67.
novel
bacteriocin
produced
by
the
973-84.
Prebiotics,
probiotics
and
human
gut
165-172.
412-420.
orally
administered
ripfampicin-resistant
streptomycinvariant
of
90: 43-52.
J 8: 535-544.
H.
gasseri
90: 343-352.
Lactobacillus
of
orally-
administered
Establishment
78
Goldin
BR.
1996.
The
metabolic
136
Bibliografa
factors
that
alter
intestinal
metabolic
Gmez-Zavaglia A, Kociubinski G,
865-873.
to
Caco-2
cells.
Appl Environ
infants
by
different
characterization
of
plantaricin
C,
Guarner
F,
methods
Schaafsma
GJ.
of
1998.
238.
512-51.9
53: 845-855.
in
de
Guslandi M,
maintenance
Mezzi G, Sorghi M,
treatment
of
Crohn's
lquilibre
au
dsquilibre.
Vigot,
Francia.
acid
of
clinical
acts
as
an
adhesion
factor
for
management
trials
of
of
probiotics
inflammatory
137
in
the
bowel
Bibliografa
pp 109-135.
Harmsen
HJ,
Wildeboer-Veloo
AC,
535-548.
JG,
Welling
GW.
2000a.
Analysis
of
259-262.
Roberfroid
2000b.
specific
MB,
Welling
rRNA-based
GW.
probes
for
the
Londres. pp 95-104.
during
developing
of
B27/beta2-microglobulin
colitis
Hill
MJ.
1995a.
Carbohidrate
in
HLA-
transgenic
rats.
Hill
MJ.
1995b.
The
normal
gut
Londres. pp 3-17.
46: 819-831.
Prev 6: S43-S45.
138
Bibliografa
9: 788-792.
Med 4: 41-43.
48: 198-205.
344: 1846-1850.
bacterial
subpopulations
producing
the
normal
human
feces.
Scand
Gastroenterol 19:375-381.
Selection
Hooper
LV,
Gordon
JI.
2001.
for
probiotic
Longworth
DL.
1997.
Lactobacillus
Inhibition
139
Escherichia
of
coli
by
concentrations
of
bacterial
metabolites,
Bibliografa
enzyme
and
activities,
Ishibashi
N,
moisture,
pH
Yamazaki
S.
2001.
465-470.
Bergeys
Manual
of
Systematic
USA. pp 1208-1234.
Bacteriocins
of
gram-positive
bacteria.
bacteria
activities
of
forty-seven
strains
of
Kim DH,
Jin
YH
2001.
beta-glucuronidase
Intestinal
activity
of
24: 564-567.
63:3394-3398.
1998.
Acid
Lactobacillus
and
bile
isolated
tolerance
from
of
chicken
140
Bibliografa
formulas
and
human
milk
on
the
human
gastrointestinal
detection
analysis
of
probiotic
exert
microflora
Lin
HC,
Visek
WJ.
1991.
Large
Kolars
JC,
Savaiano
DA.
Levitt
MD,
1984.
Aouji
Yogurt;
M,
843.
an
selection
of
probiotic
strains.
Appl
Welling
GW.
fluorescence
in
1995.
situ
Quantitative
hybridization
of
16S
Mignot
rRNA-targeted
probes
and
its
Aeschlimann
JM.
1994.
1292-1294.
Identification
and
screening
for
141
Bibliografa
Human
colonic
physiology
microbiota:
and
metabolic
ecology,
potential
of
S222: 3-9.
endocarditis
caused
by
probiotic
1037.
within
113-120.
4939-4942.
Majamaa
Probiotics:
H,
novel
Isolauri
E.
approach
1997.
in
the
the
human
cecal
and
fecal
121-127.
Swings
2004.
Polyphasic
taxonomic
pylori
management
of
Helicobacter
J.
142
Bibliografa
459-470.
GW.
composition
Molecular
of
the
analysis
of
the
bifidobacterial
and
Ballongue
J,
Petitdemange
Appl
Screening
of
bifidobacteria
targeted
species-specific
primers.
1990.
strains
for
575-580.
The
16S
rRNA-gene-targeted
group-specific
Metchnikoff
E.
1907.
15: 395-403.
of
bifidobacteria.
Curr
Issues
Intest
Midtvedt
AC,
Midtvedt
T.
1992.
Microbiol 4: 61-69.
carbohydrate
Scand
disposition.
Mattila-Sandholm T, Myllrinen P,
Mishra
Ch,
Lambert
J.
1996.
173-182.
143
Mitsuoka
T.
1992b.
The
human
Bibliografa
activities
Londres. pp 69-114.
and
associations
with
bowel
Chapelle
3049.
De
Wachter
R.
1993.
3202-3207.
relation
and
132-148.
to
gastrointestinal
health
Butel
MJ,
Doucet-Populaire
F.
2005.
Zimmermann
Influence
different
rRNA
primers
for
the
regiments
upon
of
dietary
1983.
the
144
Bibliografa
Bacteria:
139-160.
Microbiology
and
Functional
568
52.
Oberman
H,
Libudzisz
Z.
1998.
289.
composition
308-350.
2004.
Production
of
antimicrobial
the
intestinal
mucosa:
1997.
268:347-353.
Discovery
classification
of
and
40-49.
Eradication of small
145
3503-3506.
intestinal
bacteria
Bibliografa
clinical
330.
Probiotics:
Ferguson
A.
1997.
Mucosa-associated
Reid
En:
Tannock
Critical
G,
Jass
GW
Review.
J,
(ed).
Horizon
Sebulsky
MT,
Microbiol 46:85-91.
K,
detection,
GW.
and
2002.
Identification,
enumeration
of human
the
sequence
of
the
probiotic
intestinal
transaldolase
gene.
Appl
Environ
and
autores).
its
Therapeutic
Application.
Yale
Modern
Bacterial
Taxonomy.
Ed.
Lactobacillus
rhamnosus
strain
146
Bibliografa
Birkeland
SE,
Sandholm
TM.
1998b.
Colonic
Nutrition,
and
Bacteria:
Role
in
gastrointestinal
physiology
and
S171.
107-110.
probiotics:
J 75: 1-13.
54-9.
130.
of
scientific
Sanders
Sanders
ME.
ME.
1993.
1998.
Effects
Overview
of
of
1951.
food
147
the
market:
microbiological,
Bibliografa
Sanders
ME.
2003.
Probiotics:
Schillinger
U,
Lcke
FK.
1989.
61: 91-99.
Sanders
JW,
Tribble
DR.
2001.
AD,
M,
de
Vos
WM.
2001.
Schleifer
KH,
Ludwig
W.
1995a.
467.
detected
and
by
genus-specific
PCR
Schleifer
KH,
Ludwig
W.
1995b.
Probiotics,
identification
of
bifidobacteria
and
(2 Suppl): 361S-364S.
and
synbiotics;
Scardovi
V.
1986.
Genus
52: 72-76.
Shah
NP.
1997.
Isolation
and
Bifidobacterium
longum
reflects
its
Lactobacillus
and
supplement
with
148
Bibliografa
Lactobacillus
reuteri
in
rotavirus
1103-1107.
Simon
GL,
Gorbach
SL.
1982.
66: 557-74.
Pathogenic
Microbiol 6:584-590.
Stanton
C.
Bifidobacterium
2004.
psychraerophilum
sp.
nov.
Struve
C,
Krogfelt
potential
of
KA.
2004.
environmental
and
Inc, USA.
(eds).
and
Practise
of
Principles
Kato
H,
Watanabe
identification
of
11
K.
Rapid
intestinal
2000.
human
173.
reassociation
and
16S
rRNA
sequence
149
Bibliografa
development
of
postinfectious
irritable
Tannock
GW.
Normal
1995.
normal
Hall, Londres.
et
pathologique)".
Thse
de
527-533.
Inglaterra.
infant
stools
active
against
Listeria
1069.
Lactobacillus
rhamnosus
Appl
DR20.
Pestka
JJ.
1999.
Ingestion
of
yogurt
Bifidobacterium
potentiate
to
from
food.
Antonie
van
Vanderhoof
prevention
of
JA,
Whitney
DB,
antibiotic-associated
150
Bibliografa
568.
CM,
primers
2578-2585.
K,
and
Hammes
denaturing
WP.
2001.
gradient
gel
healthy
individuals
patients
with
sequencing:
49: 485-491.
an
effective
strategy
for
69.
1-12.
16S
Leeuwenhoek 82:341-352.
rDNA
sequence
analysis.
J Appl
L,
amplified
intestinal
Microbio. 23:504-509.
Ventura M,
Callegari
GF,
ML.
Casas
2000.
IA,
Rapid
Morelli
taxonomy,
R.
2004.
genetics
Insights
and
into
physiology
the
of
tract
DNA
sequence
analysis.
Appl
Environ
86: 205-223.
Scand
bacteria.
Microbiol 43:185-193.
151
Bibliografa
Xanthopoulos V, Litopoulou-Tzanetaki
Zoetendal
EG,
von
Wright
A,
Ben-Amor
K,
Vilpponen-Salmela
associated
215.
gastrointestinal
T,
bacteria
tract
in
the
are
human
uniformly
M,
Yazid
AM,
Ali
AM,
Shuhaimi
1998.
Yildirim
Z,
Johnson
MG.
1991.
Phylogeny
of
the
prototrophic
WM.
1998.
Temperature
gradient
gel
communities
of
active
Zoetendal
EG,
Akkermans
ADL,
152
Anexos
INDIVIDUO A
Edad
45
Talla
1,73
Peso
84
Sexo
Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
1/semana
Leguminosas
1/semana
Patatas
Diario
Pan y cereales
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
1/semana
Cerdo
2/semana
Aves
1/semana
Mantequilla
Aceite
5/semana
Margarinas
Consumo de productos lcteos:
Diario
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Consumo de bebidas:
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
2/semana
1/semana
Gases
Si
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
153
Anexos
INDIVIDUO B
Edad
43
Talla
1,53
Peso
51
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
4/semana
Leguminosas
2/semana
Patatas
1/semana
Pan y cereales
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
1/semana
Cerdo
1/semana
Aves
1/semana
Mantequilla
Aceite
Diario
Margarinas
Consumo de productos lcteos:
2/semana
Otras
Leche
Yogures y quesos
Consumo de bebidas:
4/semana
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Diario (cerveza
o vino)
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
154
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
Anexos
INDIVIDUO C
Edad
46
Talla
1,87
Peso
105
Sexo
Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas
5/semana
Patatas
4/semana
Pan y cereales
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Consumo de bebidas:
Salud intestinal
Molestias intestinales:
1/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
1/semana
Cerdo
2/semana
Aves
3/semana
Mantequilla
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Gases
Si
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
Diario
Pescado azul
Aceite
Diario
Leve
-
155
Anexos
INDIVIDUO D
Edad
41
Talla
1,53
Peso
56
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Diario
Leguminosas
3/semana
Patatas
1/semana
Pan y cereales
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
2/semana
Cerdo
2/mes
Aves
1/semana
Mantequilla
Aceite
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Yogures y quesos
Consumo de bebidas:
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Diario (cerveza)
Gases
Ocasional
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
156
Diario
Ocasional
Anexos
INDIVIDUO E
Edad
38
Talla
1,62
Peso
59
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas
4/semana
Patatas
2/semana
Pan y cereales
Hbitos alimenticios:
Consumo de pescados:
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Consumo de bebidas:
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
2/semana
Ternera
2/semana
Cerdo
3/semana
Aves
Mantequilla
Aceite
Diario
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Diario
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
157
Anexos
INDIVIDUO F
Edad
57
Talla
1,70
Peso
89
Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Hbitos alimenticios:
Consumo de pescados:
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Diario
Leguminosas
Diario
Patatas
Diario
Pan y cereales
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
2/semana
Cerdo
Aves
Mantequilla
Aceite
Consumo de bebidas:
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Diario
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
158
Diario (vino)
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
Anexos
INDIVIDUO G
Edad
66
Talla
1,68
Peso
80
Sexo
Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Ms tres/da
Frutas y verduras frescas
Diaria
Leguminosas
Diaria
Patatas
Diaria
Pan y cereales
Diaria
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
3/semana
Ternera
4/semana
Cerdo
2/semana
Aves
Mantequilla
Diario
Aceite
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Yogures y quesos
Consumo de bebidas:
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
Diario (queso)
Diario (vino)
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
159
Anexos
INDIVIDUO H
Edad
36
Talla
1,67
Peso
58
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas
3/semana
Patatas
1/semana
Pan y cereales
Hbitos alimenticios:
Consumo de pescados:
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
160
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
2/semana
Ternera
1/semana
Cerdo
1/semana
Aves
1/semana
Mantequilla
Aceite
Diario
Margarinas
Diario
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
4/semana
Leches fermentadas
3/semana
Probiticos
Consumo de bebidas:
Diario
T y caf
Diario
Refrescos
1/semana
Bebidas alcohlicas
1/semana
Gases
A veces
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
Anexos
INDIVIDUO L
Edad
34
Talla
1,75
Peso
77
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas
4/semana
Patatas
6/semana
Pan y cereales
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
2/semana
Pescado blanco
1/semana
Ternera
2/semana
Cerdo
3/semana
Aves
Mantequilla
1/semana
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Consumo de bebidas:
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
Diario
Pescado azul
Aceite
Diario
3/semana
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos
161
Anexos
INDIVIDUO M
Edad
40
Talla
1,55
Peso
56
Sexo
Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:
Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas
Consumo de pescados:
Hbitos alimenticios
Consumo de carnes:
Consumo de grasas:
Consumo de bebidas:
Salud intestinal
Molestias intestinales:
Deposicin
Tratamiento con antibiticos
162
5/semana
Patatas
Diario
Pan y cereales
Diario
Pescado azul
1/semana
Pescado blanco
2/semana
Ternera
2/semana
Cerdo
1/semana
Aves
Mantequilla
Aceite
Diario
Diario
Margarinas
Otras
Leche
Diario
Yogures y quesos
Diario
Leches fermentadas
Probiticos
T y caf
Diario
Refrescos
Bebidas alcohlicas
Gases
Diarreas
Dolores intestinales
Estreimiento
Uso de anticidos