LABORATORIO DE EXTRACCIN DE ADN

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

rea de Biologa Molecular., Dr. Giovanni Gonzlez

Objetivo,
Ensear una tcnica de extraccin de ADN convencional, con el objeto de observar todo el
proceso y obtener una concentracin de ADN visible.
La extraccin se compone de tres sencillo pasos:
Alcohol
Detergente
Enzima proteoltica (ablandador de carne)

Primero se necesita encontrar material vegetal y animal para extraer ADN:

Espinacas
Hgado de pollo
Cebollas
Brcoli

Protocolo de extraccin y procedimiento

1. Adicionar y triturar el material vegetal o animal (licuadora):
La finalidad de la trituracin o maceracin del material a extraer ADN siendo la primera
destruccin fsica de la muestra a aislar ADN.
Fuente de ADN (ms o menos 100 ml o 1/2 de taza de espinacas, Hgado, cebollas o Brcoli)
Un pellizco grande de Cloruro de sodio sal de mesa (menos de un ml o 1/8 de cucharadita)
Agua fra (en hielo). El doble de la cantidad de tu fuente de ADN (ms o menos 200 ml o 1
taza)

Maceracin por licuado a alta velocidad por 15 segundos.

El licuado separa las clulas de las unas de otras, por lo que ahora bsicamente se obtiene una
solucin muy diluida de sopa de clulas (vegetal y animal).

Cada grupo sigua estos tres pasos:

1. Vierte el concentrado de clulas a travs de un colador dentro de otro contenedor (como
una taza medidora por ejemplo).
Cunta concentrado de clulas tienes? Aade como 1/6 de esa cantidad de detergente
lquido (ms o menos 30 ml o dos cucharadas soperas) y mzclalo. Deja reposar la mezcla
entre 5 y 10 minutos.
Vierte la mezcla en tubos de ensayo u en otros contenedores pequeos de vidrio, cada uno
como 1/3 lleno.
Prueba usar uno detergentes o el que sea que tengas a mano.
Por qu estoy usando detergente?

2. Aade un pellizquito de enzima a cada tubo de ensayo y agtalo suavemente. Se cuidadoso!

Si lo agitas demasiado fuerte rompers el ADN hacindolo ms difcil de ver.
Usa ablandador de carne como enzima.
(Si no puedes encontrar ablandador proteoltico, jugo de pia o solucin limpiadora para
lentes de contacto)

Qu es una enzima proteoltica?

3. Ladea tu tubo de ensayo y lentamente vierte el alcohol (isoproplico al 70-95% o alcohol

etlico) sobre la pared del tubo de manera que forme una capa sobre la mezcla.
Sigue vertiendo hasta que tengas en el tubo aproximadamente la misma cantidad de alcohol
que de mezcla.
El ADN se elevar desde la mezcla hasta la capa de alcohol. Puede usar pistilo de madera para
arrastrar el ADN que est en el alcohol.

Qu es ese material pegajoso?

El alcohol es menos denso que el agua, por lo que flota en la parte superior. Debido a que se
formaron dos capas separadas, toda la grasa y protena que rompimos en los dos primeros
pasos.
En este caso, la protena y la grasa irn al fondo, que es la capa acuosa, donde se sienten ms
confortables, mientras que el ADN prefiere la capa superior, el alcohol.
El ADN es una larga y pegajosa molcula a la que le gusta formar grumos.
En estos momentos ustedes realizaron una extraccin de ADN

TECNICA DE EXTRACCION DE ADN CONVENCIONAL FENOL-CLOROFORMO

Mtodo Fenol-Cloroformo.

Esta tcnica se usa en laboratorios de Biologia Molecular

convencional. Las muestras son incididas y transferidas a un tubo de 1.5ml que contena 500 ul
de buffer de extraccin CTAB 2X (Bromuro de cetil-trimetil-amonio). Los tejidos son macerados
dentro del tubo con un pistilo plstico y se le adiciono 12 ul de proteinasa K (Promega)
10mg/ml y se incubaron en agitacin a 55C durante toda la noche.
Separacin de ADN

En el proceso de separacin del ADN, se realizaron en total cuatro lavados, dos con PCI
(Phenol-cloroformo-alcohol Isoamilico, 25:24:1) y dos con CI (cloroformo alcohol isoamilico,
24:1).

a.

Posterior a la incubacin se le agreg a cada muestra 500l de PCI, agitndose

manualmente durante un perodo de 5 minutos y se centrifug a 12000 rpm por 3 minutos
a una temperatura de 4C.

b. Al terminar la centrifugacin se transfiri el sobrenadante (fase acuosa) a un nuevo tubo de

1.5 ml para repetir el paso anterior con PCI.
c. Terminado estos dos lavados, se transfiri nuevamente el sobrenadante a otro tubo nuevo
de 1.5ml al cual se le agrego 500l de CI y se agit manualmente por espacio de 5 minutos
y se centrifug a 12000 rpm por 3 minutos a una temperatura de 4C.
d. Nuevamente se transfiri el sobrenadante a nuevo tubo de 1.5ml, se procede a repetir el
paso anterior con CI.