HOMOGENIZACIN

DE TEJIDOS
Los tejidos son ricos en protenas las cuales tienen caractersticas propias y por ende cumplen
diferentes funciones. Segn las caractersticas de las protenas son posibles solubilizarlas,
separarlas y purificarlas mediante diversos mtodos.
El primer paso en la purificacin de la mayora de las protenas y estructuras subcelulares es la
rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular en el que la protena, el
complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su
aislamiento. Esto se consigue homogenizando el tejido empleando procedimientos mecnicos
suaves. Estos mtodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se
libera el contenido celular, dentro de los que se encuentran: shock osmtico, mortero (friccin) y
sonicacin.
Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es
suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin
hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al
interior de la clula, causando su hinchamiento y rotura.
Destruccin mecnica. Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin (hacer pasar las
clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero y la
sonicacin (someter las clulas a vibraciones de ultrasonido).
Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a un cambio brusco de
temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a
temperatura ambiente (25 C).
Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de
extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales, soluciones acuosas de
tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se
pretende purificar protenas asociadas a membranas.
Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que
pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la
accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos) son los principales factores
que pueden desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de
las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas,
a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo ms corto posible, adems en

ocasiones es necesario aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales

especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas.

El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de
enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin (10.000 15.000
rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas
solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a
membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En
cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se
encuentra la protena de inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener
en cuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los
rotores estn fijos.
Actividades
Realizacin de un protocolo para la homogenizacin de tejido y solubilizacin de protenas
Homogenizacin de tejido
1) Extraer tejido de pltano
2) Poner en un mortero y homogenizar, moliendo por completo.
3) Mezclar con el buffer en un tubo falcn en una relacin 1:5 (v/v)
4) Homogenizar con vortex
5) Alcuotar en Tubos eppendorf de 1,5 ml.
6) Centrifugar a 12000 rpm por 20 minutos
7) Rescatar sobrenadante
8) Conservar a -20C.

CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Una de las operaciones ms frecuentes utilizadas en los laboratorios de investigacin es la
determinacin de la concentracin total de protenas presentes en una preparacin. El mtodo a
seguir para determinar la cantidad de protenas presentes en la muestra va a depender de las
caractersticas de la muestra, rango de deteccin, tolerancia a diferentes interferentes y
sensibilidad del mtodo. Los diferentes mtodos existentes pueden detectar las protenas
mediante la absorcin de luz en UV, unin a colorantes o formacin de complejos. Los mtodos
ms usados son: Biuret, BCA, Lowry y Bradford.
Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante
especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y
slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por
ejemplo en suero).

Mtodo de BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso
con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de
monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio
alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo
para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran
tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos.

Mtodo de Bradford
El mtodo de Bradford es muy utilizado, el ensayo se basa en la observacin del cambio de
absorbancia mxima de la solucin cida Azul de Comassie Brillante que vara de 465 a 595 nm
cuando ocurre la unin con la protena. Esta unin se debe a la estabilizacin de la forma aninica
del colorante mediante interacciones hidrofbicas e inicas, causando un cambio visible de color.
Este mtodo es sensible, simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

En estos ensayos se requiere la realizacin de una curva de calibracin para la determinacin de la

concentracin de protenas de una muestra, utilizndose comnmente BSA (albumina de suero
bovino) como protena patrn. Existen otros mtodos como se resumen en la siguiente tabla

ACTIVIDAD PRCTICA
Construccin de la curva de calibrado con BSA
Se preparan 100 l de cada dilucin de acuerdo a la siguiente tabla.
El stock de BSA utilizado estar a 1 g/l.

 Se transfieren las soluciones a cubetas espectrofotomtricas.

Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford a cada cubeta.
Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3 minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.
Se construye una regresin lineal graficando Absorbancia v/s Concentracin de BSA.

Determinacin de la concentracin de protena total en la muestra

Se agregan 100 l de cada muestra de protenas a cubetas espectrofotomtricas (si estn muy
concentradas se deben hacer diluciones).
Se agregan 1000 l de reactivo de Bradford.
Se sellan las cubetas con parafilm, se homogeniza la solucin y se deja reaccionar por 3 minutos.
Se mide la absorbancia de cada cubeta a 595 nm.
Se calcula la concentracin total de protena, interpolando la absorbancia de la muestra en la
curva estndar. El intercepto (n) debe ser cero.
Donde: y= absorbancia
x= concentracin de protena.
y = mx + n

BIBLIOGRAFIA
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