Manual de Laboratorio de Bioquímica Tec

Universidad Autnoma de
Baja California
Facultad de Ciencias Marinas
Manual de Prcticas de Laboratorio de

BIOQUIMICA
Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Responsable de la elaboracin del manual
[Avalado, Validado] el [fecha] por Consejo
Tcnico
Universidad Autnoma de
Baja California
Facultad de Ciencias Marinas
Directorio
Dr. Felipe Cuamea Velzquez

Rector UABC
Dr. Oscar Roberto Lpez Bonilla
Vicerrector, UABC Campus Ensenada
Dr. Juan Guillermo Vaca Rodrguez
Director FCM
Dr. Vctor Antonio Zavala Hamz
Subdirector, FCM
ndice
Introduccin........................................................................................................................1
Encuadre del Sistema de Prcticas.....................................................................................2
Introduccin.....................................................................................................................2
Competencias a las que contribuye.................................................................................3
Niveles de Desempeo.................................................................................................3
Ubicacin dentro del mapa curricular..............................................................................4
Programa del Sistema de Prcticas..................................................................................5
1. BIOMOLECULAS.............................................................................................................6
1.1.
Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert...........................................................7
1.2.
Determinacin del contenido de protena soluble.............................................11
1.3.
Determinacin del punto isoelctrico de una protena......................................15
1.4.
Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin......................................19
1.5.
Determinacin de parmetros de cintica enzimtica.......................................24
1.6.
Determinacin de carbohidratos totales............................................................29
1.7.
Aislamiento y cuantificacin de glucgeno........................................................33
1.8.
Extraccin y cuantificacin de lpidos................................................................37
1.9.
Determinacin de fosfoglicridos.......................................................................41
1.10.
Extraccin y determinacin de pigmentos fotosintticos...................................47
2. METABOLISMO.............................................................................................................51
2.1.
Oxidacin biolgica y transporte de electrones.................................................52
2.2.
Actividad oxidativa de la lactato deshidrogenasa..............................................57
2.3.
Capacidad metablica celular y actividad de citocromo oxidasa.......................62
Anexos..............................................................................................................................67
Normas Generales de Seguridad e Higiene...................................................................67
Medidas Generales en Caso de Accidente.....................................................................69
Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Introduccin
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1
Introduccin
Este manual est estructurado como material didctico de apoyo para
actividades de laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de
Bioqumica, de la carrera de Oceanologa de la Facultad de Ciencias Marinas
de la Universidad Autnoma de Baja California. El contenido del manual
tambin podr ser utilizado por estudiantes en carreras afines y en cursos de
bioqumica general con las adecuaciones que cada actividad de aprendizaje
requiera para coadyuvar en su formacin disciplinaria.
Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Encuadre del Sistema de Prcticas
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2

Introduccin
Se estima que el desarrollo de la asignatura de Bioqumica seria
extraordinariamente rido y de difcil comprensin si no se acompaara de
actividades complementarias de carcter prctico, las cuales permitan
ilustrar y complementar conceptos o mecanismos moleculares complejos de
la qumica de los seres vivos que se asocian a la estructura y a la dinmica
del funcionamiento celular y de tejidos.
Con frecuencia se tiene la concepcin que el desarrollo de las prcticas de

bioqumica conlleva un tiempo prolongado, mtodos complejos y una
diversidad de recursos materiales, por lo cual puede parecer complicado el
adecuar las actividades del laboratorio con el tiempo curricular disponible, la
habilidad y destreza de los estudiantes en la etapa que cursan la asignatura
y los recursos disponibles de la unidad acadmica. De aqu que la serie de
experiencias prcticas que se desarrollan se estima que coadyuvan en forma
adecuada para alcanzar las competencias establecidas en el programa de la
unidad de aprendizaje, lo cual deber ser una premisa indispensable en el
proceso de enseanza-aprendizaje del estudiante, lo cual se reflejara en que
este adquiera los conocimientos y habilidades en bioqumica requeridos para
las etapas disciplinaria y terminal de su formacin profesional. El manual de
Bioqumica se ha preparado con prcticas dirigidas a mostrar algunas de
propiedades de las biomolculas y de la dinmica metablica celular
mediante procedimientos analticos sencillos que no requieren de
equipamientos complejos y de alto costo..

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3
Competencias a las que contribuye

Niveles de Desempeo
Los conocimientos, unidos a las habilidades y a los valores, permiten que se
construyan competencias. Para ello es necesario que el conocimiento se
aplique de manera prctica en la construccin o desempeo de algo, por lo
cual el alumno deber estar capacitado al finalizar una etapa para
desempear o producir lo establecido en su programa de estudio.
El trabajo que se desarrolla en el Laboratorio de Bioqumica contribuye al

desarrollo de las competencias del programa de la unidad de aprendizaje:
Diferenciar la estructura y propiedades de las biomolculas y sus funciones
metablicas, reconocer los principios de los cambios de energa en procesos
biolgicos y distinguir los fundamentos de la regulacin de procesos
metablicos para diferenciar vas metablicas centrales en organismos y
ambientes acuticos, mediante un trabajo individual y en equipo el cual
promueva el desarrollo del pensamiento crtico y la asertividad en el
estudiante.
El nivel de desempeo del alumno estar asociado al desarrollo ptimo de

actividades como: La realizacin de las prcticas en forma y tiempo, lo cual
le requerir de un amplio dominio de diferentes habilidades y conocimientos;
la elaboracin sistemtica y estructurada de informes por prctica, mediante
disciplina y laboriosidad, as como el uso eficiente de herramientas
computacionales. El trabajo en el laboratorio deber ser realizado en equipo,
lo cual requiere de una participacin armnica en el trabajo de conjunto. El
pensamiento crtico deber ser utilizado en forma ptima para realizar los
diversos pasos de la actividad prctica. El reporte de la prctica se deber de
entregar de acuerdo a un formato elaboracin preestablecido, de manera
individual.

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4
Ubicacin dentro del mapa curricular
HC= Horas Clase; HL= Horas Laboratorio; HT= Horas Taller; HPC= Horas Practicas Campo; HE= Horas Ejercicios;
CR=Crditos

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5
Programa del Sistema de Prcticas
Tema
INTRODUCCIN
UNIDAD I:
BIOMOLCULAS
Prctica o prcticas programadas

Revisin de reglas para el trabajo
en el laboratorio.
Descripcin del protocolo para
elaborar un reporte escrito de una
prctica de laboratorio
1.1. Practica 1: Espectrofotometra
y ley de Beer-Lambert.
1.2. Prctica 2: Determinacin del
contenido de protena soluble.
1.3. Prctica 3: Determinacin del
punto isoelctrico de una protena.
1.4. Prctica 4: Efecto de la
temperatura sobre la actividad
enzimtica.
1.5. Prctica 5: Determinacin de
parmetros de cintica enzimtica.
carbohidratos totales.
1.7. Prctica 7: Aislamiento y
cuantificacin de glucgeno.
1.8. Prctica 8: Extraccin y
cuantificacin de lpidos.
fosfoglicridos.
mbito de
desarrollo
Duracin*
Laboratorio
3 horas
Semana 1
Laboratorio
3 horas
Semana
3 horas
Semana
3 horas
Semana
3 horas
Semana
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
3 horas
Semana
3 horas
Semana
3 horas
Semana
3 horas
Semana
6 horas
Semana
11
3 horas
Semana
1.10. Prctica 10: Extraccin y

Laboratorio
determinacin de pigmentos
algales.
1.11. Prctica 11: Oxidacin
Laboratorio
3 horas
biolgica y transporte de
Semana
electrones.
1.12. Prctica 12: Actividad
Laboratorio
3 horas
UNIDAD II:
oxidativa de la lactato
Semana
METABOLISMO
deshidrogenasa.
1.11. Prctica 13: Capacidad
Laboratorio
6 horas
metablica celular y actividad de
Semana
citocromo-oxidasa.
16
* Duracin en horas para cada prctica, y semana del semestre en la que se
realizar.
2
3
4
5
6
7
8
9
10 y
12
13
14
15 y
1. BIOMOLECULAS
Mediante el uso de protocolos experimentales y tcnicas

analticas estudiar caractersticas qumicas y propiedades de las
biomolculas, lo cual permita analizar su relacin con las
funciones bioqumicas que desarrollan en la clula y en los
seres vivos.

[UNIDAD I]
1.1.
Pgina
7
Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert.
1.1.1.
Introduccin.
Los mtodos pticos de anlisis pueden utilizares para determinar en

forma precisa la concentracin de sustancias disueltas, dentro de estos
la espectrofotometra es una de las tcnicas ms comunes en anlisis
bioqumicos. Un espectrofotmetro mide cuanta luz absorbe una
solucin, dicha absorcin se puede usar para medir la concentracin
de los solutos. La mayora de los solutos absorben luz a una
determinada longitud de onda, y entre ms concentrado es el soluto
mas es la luz que se absorbe. El fenmeno es de naturaleza
exponencial y depende de la concentracin del material absorbente de
la luz, del espesor de la capa de solucin interpuesta en el trayecto del
haz luminoso y de la longitud de onda de la luz empleada en la
determinacin. Generalmente la longitud de onda de la luz y el
espesor de la capa que atraviesa, se mantienen constantes y la
intensidad de luz transmitida (I), se compara con la que transmite el
solvente puro (Io). La ley que relaciona la cantidad de luz transmitida
por una solucin con la concentracin del soluto que absorbe luz es la
ley de Beer-Lambert la cual se expresa de la siguiente forma:
A = log Io/I =- log T= b C
Donde:
A: Absorbencia, magnitud adimensional,
Io: Intensidad de la luz incidente,
I: Intensidad de la luz trasmitida,
T: Transmitancia, I/Io,
: Coeficiente de extincin molar, en M-1 cm-1,
b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm,
C: Concentracin del soluto, en moles/litro (M).
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbencia es proporcional a
la concentracin de las especies absorbentes. Dicha ley se cumple en
un intervalo definido de concentraciones ( 0.01 M), en el cual es
vlido obtener una regresin lineal significativa de absorbencia vs
concentracin, denominada curva de calibracin. Para determinar la

[UNIDAD I]
Pgina
8
concentracin desconocida de una solucin se mide su absorbancia y

luego se calcula la concentracin correspondiente mediante el uso de
la ecuacin de la curva de calibracin. Las desviaciones aparentes de
esta ley en soluciones ms concentradas pueden atribuirse a cambios
en las propiedades de las especies absorbentes de la solucin.
Conforme una solucin se vuelve ms concentrada, las molculas de
soluto interactan entre s debido a su proximidad, modificando sus
propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la grfica de
absorbencia en funcin de la concentracin pierde su linealidad.
Hay tres aplicaciones fundamentales
determinaciones bioqumicas:
de
esta
tcnica
en
1) Si se conoce el coeficiente de extincin molar de un compuesto a

una longitud de onda especfica, es factible el determinar la
concentracin de dicho compuesto mediante la medicin de su
absorbencia, como puede ser la cuantificacin de bajas
concentraciones de compuestos como nucletidos (2-4 mg).
2) El curso de una reaccin puede ser determinada mediante la
medicin o aparicin de compuestos que absorban luz. El dinucletido
NADH absorbe fuertemente a 340 nm en tanto que su forma oxidada
(NAD+) no presenta absorbencia a esta longitud de onda, lo cual
permite dar seguimiento a su produccin o gasto en una reaccin.
3) Se pueden identificar ciertos compuestos mediante la determinacin
del espectro de absorcin en que presentan en el intervalo visible o
ultravioleta, como es el caso de pigmentos como las clorofilas.
1.1.2.
Competencia.
Evaluar la absorbencia de protena en solucin con base al fundamento

de la ley de Beer-Lambert, para elaborar una curva de calibracin
precisa, con organizacin y disciplina.
1.1.3.
Material.

[UNIDAD I]
Pgina
9
1.1.3.1.
Materiales.
Tubos de ensayo, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso
precipitado, termmetro, celdas para espectrofotmetro, gradilla,
piseta.
1.1.3.2.
Instrumental.
Agitador de tubos, plancha de calentamiento, espectrofotmetro.
1.1.3.3.
Reactivos.
Solucin estndar de albumina (10 mg/mL), reactivo de Biuret
(3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH en
250 mL de agua destilada), solucin problema.
1.1.4.
Desarrollo.
1. Medir 1 mL de la solucin de albmina y colocar en un tubo de

ensayo.
2. Adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y mezclar.
3. Calentar la solucin en bao de agua a 37C por 10 minutos.
5. Medir la absorbencia en funcin de la longitud de onda entre 400 y
600 nm cada 20 nm.
6.
Determinar la longitud de onda ptima para efectuar la

cuantificacin de la protena a partir de los valores de absorbencia
vs longitud de onda.
7. Elaborar una curva de calibracin mediante cinco distintas

concentraciones de albmina, obtenidas por medio de diluciones
sucesivas de la solucin de estndar de albumina. Ajustar la
absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga
nicamente agua y solucin de Biuret.
8. Medir la absorbencia de una solucin de concentracin desconocida.
1.1.5.
Resultados a reportar.

[UNIDAD I]
Pgina
10
Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la regresin lineal de

los valores de absorbencia vs. concentracin de las soluciones de
albmina analizadas.
Contenido de protena soluble en solucin de concentracin
desconocida.
1.1.6.
Mtodo de Evaluacin.
Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al

profesor el registro de los resultados obtenidos en el desarrollo de la
fase experimental de la prctica. El reporte escrito de la prctica se
deber de entregar al profesor, a ms tardar antes del inicio la
siguiente sesin de laboratorio, la entrega extempornea originara una
deduccin de puntos del orden de 10 puntos/da. El estudiante recibir
el reporte calificado en la siguiente sesin de laboratorio.
1.1.7.
Bibliografa.
Holtzhauer, M., 2006. Basic Methods for the Biochemical Lab. 5th
edition. Chapter 1: Quantitative Methods. Springer-Verlag, Berlin, p. 121.
Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at
practical classes for students of pharmacy: a student-centered
approach. Biochemistry and Molecular Biology Education 28, 327-329.
Prats, M., 1989. Tools in spectrophotometry and
spectrophotometry. Biochemical Education 17(3), 151-153.
differential
Roca, P., Oliver, J., Rodrguez, A.M., 2003. Bioqumica Tcnicas y

Mtodos. Ed. Hlice, Madrid, pp. 70-84.
1.2.
Determinacin del contenido de protena soluble.
1.2.1.
Introduccin.
La cuantificacin de protenas es una de las determinaciones ms

comunes que se efectan en estudios bioqumicos, es un paso
importante para el manejo de muestras en las cuales se requiere el
aislamiento y la caracterizacin de protenas. El determinar el
contenido proteico de una muestra es un requisito comn previo al uso
de mtodos de separacin, anlisis cromatogrficos, electroforesis,
inmunoqumica, entre otros. Cuando se requiere determinar la
concentracin de protenas de una muestra una de las primeras
cuestiones a considerar es la seleccin de un mtodo analtico
adecuado. La eleccin entre los ensayos de protenas disponibles por lo
general se hace en base a considerar la compatibilidad del
procedimiento con las muestras a evaluar. El objetivo es seleccionar un
mtodo que requiera menos manipulacin o tratamiento previo de las
muestras y evitar la presencia de sustancias que puedan interferir en
la determinacin.
Todas las protenas estn conformadas por aminocidos unidos
mediante enlaces peptdicos los cuales se originan por la interaccin
entre los grupos amino terminal y el carboxilo contiguos. En general se
presentan 20 aminocidos formando parte de las protenas. Una
reaccin del enlace peptdico de tripptidos, polipptidos y protenas
con iones de Cu+2 en un medio alcalino y en presencia de tartrato de
sodio da como producto un complejo de quelacin colorido el cual
absorbe a 540 nm, mediante esta reaccin denominada de biuret se
pueden cuantificar pptidos y protenas. El ion cprico forma un
complejo coordinado con los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de 4 enlaces peptdicos, la intensidad del
color es proporcional al total de enlaces peptdicos que participan en la
reaccin.
La reaccin de biuret es la base de un mtodo colorimtrico simple y
rpido para determinar cuantitativamente el contenido de protena
soluble de una muestra. El mtodo es aplicable para determinar
protena en el intervalo de 1 a 160 mg/mL. Compuestos como lpidos,
hemoglobina, EDTA y sales de amonio pueden interferir en el
desarrollo de la reaccin.
Complejo de biuret
1.2.2.
Competencia.
Analizar el contenido de protena soluble en tejidos de un organismo

acutico mediante un mtodo espectrofotomtrico, para contrastar la
funcin tisular con el nivel de protena, con disciplina y disposicin.
1.2.3.
Materiales y reactivos.
1.2.3.1.
Materiales.
Estuche de diseccin, tubos de ensaye, esptula, homogeneizador

manual, pipetas graduadas 5 mL, pipetero, vaso precipitado,
termmetro, celdas para espectrofotmetro, gradilla, piseta.
1.2.3.2.
Instrumental.
Centrifuga, agitador de tubos, plancha de calentamiento,

espectrofotmetro.
1.2.3.3.
Reactivos.
Buffer salino (NaCl 0.15M, citrato de sodio 0.015M, pH 7), reactivo

de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g
NaOH en 250 mL de agua destilada).
1.2.4.
Metodologa.
1. Realizar la diseccin del organismo de estudio, separar 2 tejidos y

colocar cada muestra en un vaso de precipitado en hielo.
2. Cortar cada tejido en trozos pequeos y pesar en una proporcin de
0.2 g por mL de buffer salino que se utilizar para su
homogeneizacin.
3. Homogeneizar cada uno de los tejidos mediante el uso de un
homogeneizador manual de tubo con embolo en un bao de hielo.
4. Centrifugar el homogenado a 3000 rpm por 5 minutos y separar el
sobrenadante.
5. Por duplicado, mezclar 0.2 mL del sobrenadante por tejido con 0.8
mL de agua destilada, adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y
agitar.
6. Calentar la solucin en bao de agua a 37 C por 10 minutos.
7. Enfriar la solucin y leer la absorbencia a 540 nm.
8. Determinar el contenido de protena soluble a partir de los valores
de absorbencia y la ecuacin de la curva de calibracin de albumina
elaborada en la prctica No 1.
1.2.5.
Nombre comn y cientfico de los organismos analizados.

Contenidos de protena soluble en mg por g de tejido analizado.
1.2.6.
Mtodo de evaluacin.

1.2.7.
Bibliografa.
Krohn, R.I., 2001. The colorimetric detection and quantitation of total

protein. Current Protocols in Food Analytical Chemistry B1.1.10B1.1.13.
Janairo, G., Sy, M.L., Yap, L., Llanos-Lazaro, N., Robles, J. 2011.
Determination of the sensitivity range of Biuret test for undergraduate
biochemistry experiments. e-Journal of Science & Technology 5, 77-83.
Roca, P., Oliver, J., Rodrguez, A.M., 2003. Bioqumica Tcnicas y
Mtodos. Ed. Hlice, Madrid, pp. 156-157.
1.3. Determinacin del punto isoelctrico de una

protena.
1.3.1.
Introduccin.
Aun cuando en la formacin de la unin peptdica de los grupos

carboxlicos y aminos de los aminocidos no generan en enlace con
carga, es comn que queden libres algunos de estos grupos, ya sea en
los extremos de las cadenas polipeptdicas, o en las cadenas laterales
de los aminocidos cidos y bsicos. La disociacin de los grupos
ionizables que estn presentes en las protenas, as como la de los
grupos ionizables de los aminocidos individuales, est determinada
por el pH del medio en el cual se encuentra la protena. A pH de 7.0 o
en valores cercanos a este, los cuales son comunes en la mayora de
las clulas, los grupos carboxilo de los cidos asprtico y glutmico se
encuentran en sus formas bsicas con carga negativa, mientras que
los aminocidos lisina y arginina estn presentes en su formas cidas
con carga positiva. La contribucin de los grupos sulfhidrilo de la
cistena, y fenlico de la tirosina es mnima; por ejemplo la tirosina
presenta solo una disociacin del 0.1% del grupo fenlico. La carga
total de la protena depende del pH de la solucin y del nmero
relativo de cada aminocido en la molcula. Cuando el pH de la
solucin es tal que la carga de neta de la molcula proteica es cero, la
cual se presenta cuando el nmero total de cargas positivas y
negativas son iguales, se le denomina punto isoelctrico o pH
isoelctrico de la protena (pI). Los valores de pI de la mayora de las
protenas son menores a 7, aunque se presentan valores desde 1.1
para la pepsina hasta 12 en protaminas. Una protena cida con pI bajo
tendr carga negativa a pH neutro, mientras que una protena bsica
con un pI alto tendr carga positiva a pH de 7. En general el punto
isoelctrico de una protena es tambin el pH en el cual es menos
soluble y ms fcilmente precipita, esto se atribuye a que probable
atraccin entre grupos de carga opuesta de molculas vecinas, ya que
el nmero de cargas opuestas ser el mximo en el punto isoelctrico.
La capacidad de variar la carga de una molcula proteica mediante el
cambio del pH del medio en el cual se encuentra puede utilizarse para
purificar y caracterizar protenas mediante mtodos como
electroforesis o cromatografa de intercambio inico.
Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/
1.3.2.
Competencia.
Evaluar el punto isoelctrico de una protena mediante variacin del

pH del medio en el cual esta disuelta, para relacionar este parmetro
con las propiedades inicas de la estructura, con compromiso y
disciplina.
1.3.3.
1.3.3.1.
Materiales.
Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL, pipetero, vaso

precipitado, gradilla, piseta.
1.3.3.2.
Instrumental.
Potencimetro
1.3.3.3.
Reactivos.
Solucin de casena 5% en acetato de sodio 0.1N, cido actico

0.01, 0.1 y 1N, solucin buffer pH 4 y 7.
1.3.4.
Metodologa.
1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
REACTIVO (mL)
Casena
5% en
acetato de sodio 1
0.1N
Agua destilada
8.4
CH3-COOH 0.01N
0.6
CH3-COOH 0.1N
CH3-COOH 1.0N
-
7.8
1.2
-
8.8
0.2
-
8.5
0.5
-
TUBO
5
8.0
1.0
-
7.0
2.0
-
5.0
4.0
-
1.0
8.0
-
7.4
1.6
2) Agitar los tubos y observar la presencia o ausencia de turbidez en la

mezcla despus de 15 y 30 minutos.
4) Tabular los resultados e indicar el grado de precipitacin con los
siguientes valores:
0 = ningn cambio.
1+ = turbidez.
2+ = notable turbidez.
3+ = precipitacin.
4+ = marcada precipitacin.
5+ = abundante precipitacin.
5) Determinar
potencimetro.
el
pH
de
cada
tubo
mediante
el
uso
de
un
7) Elaborar una grfica con el grado de precipitacin en las ordenadas

y el pH en las abscisas. El punto isoelctrico aproximado
corresponde al pH del tubo donde se present la mxima
precipitacin
1.3.5.
pH experimental en cada tubo de reaccin

pH terico en cada tubo de reaccin de acuerdo a la ecuacin de

Hendersson- Hasselbach.
Punto isoelctrico de la protena analizada.
1.3.6.
Mtodo de evaluacin.

1.3.7.
Bibliografa.
Ayala-Lopera, S.A., 2007. Manual de Laboratorio de Bioqumica.

Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Escuela de
Produccin Pecuaria. Medelln, Colombia, pp. 11-12.
Instituto Politcnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de
Bioqumica Mdica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de
Formacin Bsica Disciplinaria. Academia de Bioqumica Mdica I.
Propiedades de protenas: Determinacin del punto isoelctrico de la
casena. Mxico, p. 18.
Harris, D.C., 2007. Anlisis Qumico Cuantitativo. 6 ed., Editorial
Revert, Barcelona, p. 217-219.
Morris, J., G. 1975. Fisicoqumica para Bilogos. 2 ed., Editorial
Revert, Barcelona, pp. 163-165.
1.4. Efecto de la temperatura en la velocidad de

reaccin.
1.4.1.
Introduccin.
La actividad enzimtica es afectada por la temperatura del medio en el

cual ocurre. Los puentes de hidrgeno y fuerzas de van der Walls, que
participan en la estabilizacin de las estructuras terciaria y cuaternaria
de las protenas, son muy sensibles a incrementos en la temperatura,
ya que aumenta el movimiento de las cadenas de aminocidos y de los
grupos laterales y, por lo tanto la fuerza y las colisiones entre las
enzimas y la molculas que las rodean. El aumento de las colisiones
entre las molculas de la enzima y el sustrato favorece, por el
contacto, las reacciones que estas catalizan. Sin embargo a
temperaturas muy elevadas, las colisiones son capaces de romper los
puentes de hidrgeno y las fuerzas de van der Walls que son
relativamente dbiles, a medida que esto ocurre el rearreglo
tridimensional de la enzima se modifica y se pierde su estructura
funcional. Los cambios caractersticos que se producen con el
incremento de temperatura en la actividad enzimtica se muestran en
siguiente la figura:
La temperatura en la cual la actividad cataltica es mxima se le

denomina temperatura ptima. Por encima de esta temperatura se
presenta la prdida de actividad cataltica debida a desnaturalizacin
trmica, lo cual da como resultado una disminucin de la actividad
enzimtica hasta cesar. Es comn que entre los 0 C y 40 C se
observe un aumento de la actividad enzimtica, intervalo en el cual
ocurren cambios mnimos en la estructura de la enzima. Se postula
que en una reaccin qumica por cada incremento de 10 C aumenta la
velocidad reaccin al doble, lo cual en la reaccin enzimtica tiene un
efecto de la frecuencia de los choques entre las molculas del sustrato
y de la enzima. Si la temperatura aumenta por encima de los 40 C las
colisiones se incrementan y se inicia el rompimiento de enlaces. A los
55 C la actividad enzimtica empieza a disminuir, hasta que cerca de
los 70 C su actividad es cercana a cero como resultado de que
desnaturaliza la protena. La mayora de la enzimas presentan una
actividad ptima entre los 40 y 50 C; sin embargo, algunos
organismos poseen enzimas cuya actividad se da a temperaturas
bajas, como es el caso de la lactato-deshidrogenasa de pez del
antrtico Trematomus bernacchii cuya actividad mxima se observa a
temperaturas muy por debajo de las enzimas homologas, de
organismos que viven en ambientes ms clidos. As mismo,
organismos extremfilos como la

bacteria termfila Thermus
aquaticus presenta la enzima la ADN polimerasa con una temperatura
ptima de funcionamiento alrededor de los 75 C.
1.4.2.
Competencia.
Analizar el efecto de la temperatura en una reaccin enzimtica a

travs de la velocidad de hidrlisis del sustrato, para evaluar el
funcionamiento ptimo de la enzima bajo estudio, con organizacin y
disciplina.
1.4.3.
1.4.3.1.
Materiales.
Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 mL, pipetero, vasos de

precipitado 125 mL, gradilla, piseta.
1.4.3.2.
Instrumental.
Planchas de calentamiento.
1.4.3.3.
Reactivos.
Amilasa (0.02%), almidn (8 mg/mL), glucosa (0.02 M), buffer de

fosfatos pH 7, reactivo de cido 3,5-dinitrosaliclico (disolver 1 g en
20 mL de NaOH 2 M, mezclar con 50 mL de NaKC4H4O6.4H2O
2.13M y aforar con agua destilada a 100 mL).
1.4.4.
Metodologa.
I) Ensayo enzimtico.
1) Preparar y correr una serie de tubos de acuerdo a lo establecido en
la siguiente tabla, mezclar perfectamente al aadir cada reactivo.
2) El tubo 1 ser el testigo negativo por lo que antes de aadir la
enzima, se adicionara 1 mL de cido 3,5-dinitrosaliclico como
inhibidor enzimtico.
3) Al trmino del calentamiento en el bao de agua a ebullicin, enfriar

los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo 1 como
blanco para ajustar el cero.
4) En caso de que las lecturas presenten valores altos de absorbencia
se puede diluir la mezcla final de reaccin, en una proporcin de 1
mL de solucin con 5 mL de agua destilada, para proceder a leer los
valores por tubo. El contenido de glucosa liberada en cada tubo de
reaccin se determinar mediante el uso de una curva de calibracin
de glucosa.
II) Curva de calibracin de glucosa.
1) Preparar una serie de 11 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
2) Calentar los tubos en bao de agua a ebullicin por 10 minutos.

3) Enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo del
blanco para ajustar el cero.
1.4.5.
Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la curva de calibracin

de glucosa.
Grafica de concentracin de glucosa generada en funcin de la

temperatura enzimtica de reaccin.
Temperatura optima de la enzima bajo estudio.
1.4.6.
Mtodo de evaluacin.

1.4.7.
Bibliografa.
Daniel, R.M., Danson, M.J., Eisenthal, R., Lee, C.K., Peterson, M.E., 2008.
The effect of temperature on enzyme activity: new insights and their
implications. Extremophiles 12 (1), 51-59.
Daniel, R.M., Peterson, M.E, Danson, M.J., Price, N.C., Kelly, S.M., Monk,
C.R., Weinberg, C.S., Oudshoorn, M.L., Lee,C.K., 2010. The molecular
basis of the effect of temperature on enzyme activity. Biochemical
Journal 425, 353360.
Cintica enzimtica. Mxico, pp. 30-31, 56.
Somero, G.N., 2004. Adaptation of enzymes to temperature: searching
for basic strategies. Comparative Biochemistry and Physiology, Part
B 139, 321333.
1.5. Determinacin de parmetros de cintica

enzimtica.
1.5.1.
Introduccin.
El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una

reaccin catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener
factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se
realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la
reaccin cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se
mantienen constantes la concentracin de enzima, el pH, la fuerza
inica del medio, la temperatura, entre otros. Se evala la influencia
de estos factores en la reaccin catalizada por enzimas con la finalidad
de determinar los intermediarios en una reaccin y el papel que juegan
en la reaccin enzimtica, es decir, para predecir mecanismos de
reaccin. Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar
nuevas herramientas moleculares, por ejemplo, para combatir
enfermedades en las que se conoce a la enzima que la produce.
Tambin es usual medir la actividad enzimtica con diferentes
sustratos para entender su especificidad o bien, medir la actividad de
la enzima de diferentes tejidos u organismos para entender cmo las
diferencias en actividad estn relacionadas con la funcin y/o la
fisiologa del organismo del que proceden.
El modelo clsico de Michaelis-Menten para explicar la cintica
enzimtica considera la unin de una enzima (E) con un sustrato (S)
para formar un complejo enzima-sustrato (ES), el cual puede generar
el producto (P) ms la enzima (E) o disociarse para dar la enzima y el
sustrato.
Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una

dependencia hiperblica de la velocidad respecto a la concentracin de
sustrato, distinguindose 3 componentes en la curva. En la primera
parte, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es
proporcional a la concentracin de sustrato, de tal manera que si se
duplica la concentracin de sustrato, se duplica la velocidad (reaccin
de primer orden). La segunda parte de la curva, a concentraciones
intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que en la
primera parte con el incremento de la concentracin, iniciando

alrededor de la de la Vmax. La ltima parte de la curva, a altas
concentraciones de sustrato, la velocidad es independiente de la
concentracin de sustrato (reaccin de orden cero), as la velocidad
alcanzada es cercana a la mxima.
Figura 5.1. Representacin de la cintica de Michaelis-Menten.

La ecuacin de Michaelis- Menten expresa la relacin matemtica de la
hiprbola cuadrtica que existe entre las variables:
En la ecuacin de Michaelis-Menten hay dos variables que son la

velocidad (v) y la concentracin de sustrato [S]. La Km y la Vmax son
constantes. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El
valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la
concentracin del sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la
mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad terica
mxima de la reaccin catalizada por la enzima. A concentraciones
muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la
velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los
valores de Km y Vmax son caractersticos de una enzima, y se conocen
como parmetros cinticos de la enzima. Aunque son constantes,
dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reaccin, la
enzima es una protena cuya estructura y carga elctrica se modifican
cuando los componentes de la solucin cambian.
Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es

graficando los valores de velocidad contra la concentracin de
sustrato. Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva
y no una lnea recta, por lo que la interpolacin es difcil. Otra manera
para obtener los valores de Km y Vmax es la de utilizar expresiones
matemticas que producen una lnea recta como la de LineaweaverBurk, tambin denominada de dobles recprocos, la cual se utiliza
frecuentemente:
Figura 5.2. Representacin de Lineaweaver-Burk

Michaelis-Menten.
1.5.2.
de la cintica de
Competencia.
Investigar la cintica enzimtica de una hidrolasa mediante el modelo

de Michaelis-Menten, para evaluar sus parmetros cinticos y
contrastar con los establecidos en la literatura, con un enfoque
propositivo y compromiso.
1.5.3.
1.5.3.1.
Materiales.
Matraces Erlenmeyer 50 mL, pipetas graduadas de 1, 10 y 5 mL,

pipeteros, vasos de precipitado 500 mL, bureta 25 mL, pinzas para
bureta, soporte universal, piseta.
1.5.3.2.
Instrumental.
Bao de temperatura controlada.
1.5.3.3.
Reactivos.
Urea 0.01 M, solucin de ureasa (2.5 mg/mL), CuCl2 2%, HCl 0.01M,
solucin de fenolftalena 1%.
1.5.4.
Metodologa.
1) Preparar una serie de matraces de acuerdo a lo establecido en la

siguiente tabla:
Matraz
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Urea
0.01M
(ml)
0
5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
24
Agua
(ml)
24
19
14
11.5
9
6.5
4
1.5
0
2) Colocar los matraces en un bao de agua a 40 C y esperar que

alcancen la temperatura del mismo.
3) Aadir 1 ml de la solucin de ureasa a cada matraz y esperar que
transcurra la reaccin enzimtica durante 20 minutos.
4) Adicionar 1 ml de CuCl2 2% a cada matraz y agitar vigorosamente
para suspender la actividad de la enzima.
5) Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.01N y fenolftalena
como indicador, hasta el vire de rosa a incoloro.
1.5.5.
Velocidad de reaccin enzimtica en mEq de NH3/minuto.

Grfica de Michaelis-Menten.
Grfica de Lineweaver-Burk.
Valores de Km y Vmax de la enzima.
1.5.6.
Mtodo de evaluacin.

1.5.7.
Bibliografa.
Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer,

Heidelberg. Chapter 5: Enzyme Kinetics, p. 81-122.
Grunwald, P., 1984. Imparting some biochemical fundamentals in the
course of basic education of chemistry students with the system
urease/urea as an example. Biochemical Education 12(4), 170-173.
Minch, M.J., 1989. Experiments in Biochemistry. Prentice Hall, New
Jersey, pp. 164-167, 182-184.
Sorensen, R., Novak, N., 1996. The use of Michaelis-Menten kinetics in
cell biology and physiology teaching laboratories. Biochemical
Education 24(1), 26-28.
Tayyab, S., Qamar, S., 1992 A look into enzyme kinetics: some
introductory experiments. Biochemical Education 20(2), 116-118.
Bezerra, R.M.F., Dias, A.A., 2007. Utilization of integrated MichaelisMenten equation to determine kinetic constants. Biochemistry and
Molecular Biology Education 35 (2), 145150.
1.6.
Determinacin de carbohidratos totales.
1.6.1.
Introduccin.
Los carbohidratos o sacridos son compuestos de gran importancia

para los seres vivos, los cuales son muy abundantes en la naturaleza.
Las unidades bsicas de los carbohidratos son los monosacridos, los
cuales no hidrolizables en unidades ms pequeas. La glucosa es el
monosacrido, aldohexosa, es el combustible principal para la mayora
de los organismos. Los oligosacridos contienen de dos a diez unidades
de monosacridos unidas covalentemente. Por su parte, los
polisacridos estn constituidos por gran nmero de unidades de
monosacridos unidos covalentemente, los cuales pueden alcanzar
pesos moleculares de hasta 106 daltons. Los polisacridos
desempean dos funciones biolgicas principales: almacenar energa
metablica y aportar elementos estructurales a la clula.
Monosacridos como la glucosa y sus derivados, son piezas
fundamentales en muchas rutas metablicas esenciales para la
obtencin de energa. La glucosa acta en el organismo como
combustible energtico de uso inmediato, mientras polisacridos y
grasas son biomolculas de reserva que deben ser catabolizadas antes
de su aprovechamiento como fuentes de energa. Los carbohidratos
estn ampliamente en organismos vegetales y animales con funciones
metablicas y estructurales. En los vegetales la glucosa es sintetizada
por fotosntesis a partir de CO2 y agua, y es almacenada como almidn
o convertida en celulosa para formar parte de la pared celular. Los
animales obtienen sus carbohidratos principalmente de fuentes
vegetales, una forma de acumularlos es como glucgeno, pero en
casos de deficiencia pueden sintetizar algunos como la glucosa a partir
de fuentes de carbono derivadas de lpidos y protenas.
Es frecuente que durante la transformacin o el aislamiento de los
carbohidratos se requiere el cuantificar la cantidad total del producto
obtenido. Un mtodo para cuantificar el contenido de carbohidratos
totales, el cual incluye a los reductores y no reductores, es mediante
su reaccin con un cido fuerte y a alta temperatura, bajo estas
condiciones ocurre una deshidratacin simple y la catlisis cida da
como productos como furfural e hidroximetilfurfural que se reaccionan
con compuestos como el fenol para producir compuestos coloridos.
El mtodo es simple, rpido, sensible a bajas concentraciones de

carbohidratos (10 g/mL) y genera resultados con una buena precisin
( 2%). Los reactivos son de bajo costo, el color producido es estable y
la determinacin no presenta interferencia con protenas. Ya que la
intensidad del color que se genera como producto final de la reaccin
vara de acuerdo al tipo carbohidrato, se debe seleccionar el estndar
adecuado para una cuantificacin precisa. La proporcin de cido
sulfrico, como fuente de calor, deber ser la apropiada para favorecer
que la reaccin se complete.
1.6.2.
Competencia.
Evaluar el contenido de carbohidratos totales en una muestra

biolgica, para evaluar sus parmetros cinticos y contrastar con los
establecidos en la literatura, con un enfoque propositivo y compromiso.
1.6.3.
1.6.3.1.
Materiales.
Tubos de ensayo con tapn, pipetas graduadas de 1 y 5 mL,

pipetero,
gradilla,
piseta, celdas
para
espectrofotmetro,
termmetro, vaso de precipitado 125 mL.
1.6.3.2.
Instrumental.
Bao de temperatura controlada, espectrofotmetro.

1.6.3.3.
Reactivos.
Fenol acuoso 5%, cido sulfrico concentrado.
1.6.4.
Metodologa.
1) Preparar una solucin acuosa de la muestra, el contenido de los

carbohidratos deber estar en el intervalo de sensibilidad del
mtodo (10-100g/mL).
2) En tubos de ensaye etiquetados colocar 0.5 mL de la solucin de la
muestra.
3) Adicionar a cada tubo 0.5 mL de solucin de fenol al 5%, mezclar
perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de
cido sulfrico concentrado y homogeneizar.
4) Calentar los tubos en bao de agua a 90 C por 15 minutos.
5) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva
absorbencia a 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de
la misma manera reemplazando la muestra con agua.
6) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a
partir de una curva patrn preparada con el carbohidrato de inters
en el intervalo del mtodo (10-100 g de glucosa/mL), tratada de la
misma manera que el problema.
1.6.5.

de glucosa.
Contenido de carbohidratos totales en la muestra analizada.
1.6.6.
Mtodo de evaluacin.

1.6.7.
Bibliografa.
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956.
Colorimetric method for determination of sugars and related
substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356.
Fournier, E., 2001. Colorimetric quantification of carbohydrates.
Current Protocols in Food Analytical Chemistry E1.1.1-E1.1.3.
Kochert, G., 1978. Carbohydrate determination by the phenol-sulfuric
acid method. En: Hellebust. J.A., Craigie, J.S., (eds.), Handbook of
Phycological Methods. Physiological & Biochemical Methods.
Cambridge University Press, New York, pp. 95-97.
Masuoka, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S.I., Lee,
Y.C., 2005. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in
microplate format. Analytical Biochemistry 339, 69-72.
1.7.
Aislamiento y cuantificacin de glucgeno.
1.7.1.
Introduccin.
Los seres vivos almacenan glcidos en forma de polisacridos, que

sirven como materiales de reserva. En los vegetales superiores se
acumulan principalmente como almidn, en los animales se presentan
en forma de glucgeno. El glucgeno es una biomolcula que est
conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces glucosdicos
(1-4) con ramificaciones mediante enlaces (1-6).
El glicgeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos

animales. El depsito principal de glicgeno son el hgado (de 2 a 5%)
y los msculos (de 0.5 a 2%), en los cuales esta acumulado hasta en
un 60% de su contenido en el organismo. En situacin de inanicin, el
glucgeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la
glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del
glucgeno est asociado al nivel de la glucosa sangunea, durante una
buena alimentacin se presenta su sntesis o glucogenognesis, en
condiciones de ayuno ocurre su degradacin o glucogenlisis El
glucgeno del msculo esqueltico tiene como finalidad suministrar
glucosa para que sea degradada oxidativamente y se pueda obtener
ATP para la actividad muscular. En contraste, el glucgeno heptico
sirve como fuente de glucosa para los tejidos extrahepticos, incluido

el msculo esqueltico, ante un descenso de la glucemia. Una vez
agotado el suministro de glucosa va glucogenlisis y para cubrir
requerimientos tejidos del organismo la ruta para sntesis de glucosa
es a travs de la gluconeognesis, la cual procede a partir de
sustancias distintas a los carbohidratos, tales como aminocidos y
lactato glicerol. La extraccin del glucgeno de tejidos, como el hgado,
se realiza mediante un proceso de homogenizacin y ruptura celular,
as como la extraccin y la eliminacin de las protenas para evitar
interferencias en el anlisis posterior del polisacrido.
1.7.2.
Competencia.
Determinar el contenido de glucgeno en tejidos de un animal

acutico, para estimar su capacidad de almacenamiento y relacionar
con su funcin metablica, con organizacin y compromiso.
1.7.3.
1.7.3.1.
Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, tubos de

ensaye, pipetas volumtricas de 1 y 5 mL, pipeteros, tubos de
centrifuga, celdas para espectrofotmetro.
1.7.3.2.
Instrumental.
Balanza analtica, bao de temperatura controlada, centrifuga,

espectrofotmetro.
1.7.3.3.
Reactivos.
KOH acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4

concentrado.
1.7.4.
Metodologa.
1) A partir de peces recin sacrificados obtener muestras de hgado y

musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hgado y 2 g de
msculo.
2) Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de KOH al 30%.

3) Calentar los homogenizados en un bao de agua a ebullicin por 15
minutos, agitar ocasionalmente.
4) Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la
capa de cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye.
5) Tomar 0.1 ml del sobrenadante y aadir 3 mL de etanol y 0.1 ml
de K2SO4 al 10%, agitar.
6) Reposar los tubos con la mezcla en bao de hielo por 5 minutos.
7) Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el
sobrenadante y separar el glucgeno precipitado.
8) Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua.
9) Colocar en dos tubos de ensaye alcuotas de 0.5 mL de la solucin
de glucgeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solucin de fenol al
5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente
2.5 mL de cido sulfrico concentrado y homogeneizar.
10) Calentar los tubos en bao de agua a 90 C por 15 minutos
11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la
respectiva absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco
preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua
destilada.
12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a
partir de una curva patrn preparada con glucgeno en el intervalo
de sensibilidad del mtodo colorimtrico.
1.7.5.

de glucgeno.
Contenido de glucgeno (mg/g) en los tejidos analizados.
1.7.6.
Mtodo de evaluacin.

1.7.7.
Bibliografa.
Dalrymple, R. H., Hamm, R., 1973. A method for the extraction of

glycogen and metabolites from a single muscle sample. International
Journal of Food Science & Technology 8 (4), 439444.
Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F., 1956.
Colorimetric method for determination of sugars and related
substances. Analytical Chemistry 28(3), 350-356.
Moraes, G., Choudhuri, J. V., Souza, R. H. S., Neto, C. S., 2004.
Metabolic effects of exercise in the golden fish Salminus maxillosus
"dourado" (Valenciennes, 1849). Brazilian Journal of Biology 64(3B),
655-660.
Ojea, J., Martnez,
D., Novoa, S., Pazos, A. J., Abad, M., 2002.
Contenido y distribucin de glucgeno en relacin con el ciclo
gametognico de Ruditapes decussatus (L., 1758) en una poblacin
natural de las lagunas de Baldaio (Galicia, noroeste de Espaa). Boletn
Instituto Espaol de Oceanografa 18 (1-4), 307-313.
1.8.
Extraccin y cuantificacin de lpidos.
1.8.1.
Introduccin.
A diferencia de otras biomolculas los lpidos son un grupo

heterogneo que no poseen un grupo funcional caracterstico. Los
lpidos son sustancias presentes en tejidos animales y vegetales que
comparten la propiedad de ser solubles en solventes orgnicos no
polares, como benceno, hexano y cloroformo, ter, con escasa o nula
solubilidad en agua. Como consecuencia de ello, el trmino lpido
abarca a un gran nmero de compuestos orgnicos con estructuras
muy diversas; no obstante, poseen algo en comn, la parte principal
de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y sta es la razn de
su carcter hidrfobo.
En general los lpidos pueden ser clasificados de acuerdo a sus
propiedades en dos grupos: No polares o lpidos neutros, los cuales
comprenden
triacilglicridos,
diacilglicridos,
ceras,
esteroles,
terpenos; polares integrados por fosfolpidos y glucolpidos. Los lpidos
son una fuente muy importante de energa metablica los cuales
aportan 9.5 kcal/g, en contraste con carbohidratos y protenas, que
generan 4.1 y 5.6 kcal/g, respectivamente. Los triacilglicridos son los
lpidos ms abundantes en la naturaleza, en tanto que los fosfolpidos
son constituyentes principales de membranas celulares.
Triacilglicrido
Fosfolpido
R1, R2, R3: cidos grasos; X: hidrgeno o radical (p.ej. etanolamina,
colina, serina, glicerol, mio-inositol)
Los lpidos pueden ser utilizados por los organismos animales como
una fuente de energa, a travs del metabolismo oxidativo de cidos
grasos, de igual forma pueden aportar cidos grasos esenciales. Por
presentar un estado de oxidacin ms reducido con relacin a
carbohidratos o protenas proporcionan mayor energa al oxidarse. Los

lpidos son componentes de reserva y estructurales de las clulas,
aportan cidos grasos insaturados para el mantenimiento e integridad
de membranas celulares, participan el transporte de lipdico (v. gr.
fosfolpidos, actan como agentes emulsificantes) y son precursores de
hormonas (p. ej. el cido araquidnico, 20:4n-6, es precursor de
prostaglandinas).
En animales marinos los lpidos muestran importancia en la boyancia,
debido a su baja densidad y al volumen que ocupan sin requerir
osmoregulacin, mantenimiento de estructura corporal (v. gr. la
presencia de cidos grasos de la serie n-3 permite retener la fluidez de
la membrana celular a bajas temperaturas) y en osmoregulacin
(integran un espacio osmticamente inactivo que no requiere gasto de
energa). Los lpidos son requeridos como fuente de energa y en el
aporte de lpidos polares necesarios en la formacin de membranas
celulares. Este carcter dual es reflejado en la compartamentalizacin
de
los
lpidos
corporales
en
tejido
adiposo,
integrado
fundamentalmente por triglicridos, y lpidos de membranas celulares
compuestos por lpidos polares y colesterol.
Un procedimiento para la determinacin de lpidos a partir de muestras
animales o vegetales se basa en la digestin de la muestra en cido
concentrado que hidroliza y disuelve componentes proteicos, en tanto
que los lpidos que se separan puede ser extrados mediante el uso de
solventes orgnicos no polares, como una mezcla de ter etlico-ter
de petrleo.
1.8.2.
Competencia.
Extraer y cuantificar el contenido de lpidos en tejidos de un organismo

acutico, para evaluar su relacin con la funcin metablica tisular,
con compromiso y disciplina.
1.8.3.
1.8.3.1.
Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, pipetas graduadas de 5 y 10 mL,

termmetro, pipetas Pasteur, vaso de precipitado de 5 mL,
desecador.
1.8.3.2.
Instrumental.
Balanza analtica, bao de temperatura controlada, centrifuga,

plancha de calentamiento, estufa de conveccin.
1.8.3.3.
Reactivos.
HCl 6M, metanol, ter de petrleo, NaCl 30%.
1.8.4.
Metodologa.
1) Pesar 1 g de una muestra picada de un tejido o alimento y colocarla

en un tubo de ensayo con tapn, adicionar 5 mL HCl 6M y 5 mL de
metanol, mezclar y tapar los tubos. Efectuar la determinacin por
triplicado.
2) Calentar en bao de agua a 70 C por 30 minutos.
3) Enfriar el digerido a temperatura ambiente y adicionar 10 mL de ter
de petrleo, agitar, aadir 5 ml de NaCl 30%, reposar y centrifugar la
mezcla (3000 rpm, 10 min.) para separar la capa orgnica con el
extracto lipdico.
4) Remover con pipeta Pasteur la capa de ter con el extracto lipdico y
colocarla en un tubo de ensayo limpio y seco.
5) Medir un volumen conocido (5 mL) de la solucin del extracto y
colocarlo en un vaso de precipitado o vial de 10 mL a peso
constante, evaporar el solvente a 60 C en la campana de
extraccin. Colocar el recipiente + extracto de lpidos en estufa de
conveccin a 60 C hasta peso constante, enfriar en desecador y
pesar los lpidos.
% Lpidos = (Peso del extracto /peso de muestra*) x 100
* Peso de muestra correspondiente al volumen evaporado del
extracto.
1.8.5.
Contenido de lpidos (g/100 g) en los tejidos analizados.

Contenido de lpidos que se reportan en la literatura para el tipo de
muestra analizada.
1.8.6.
Mtodo de evaluacin.

1.8.7.
Bibliografa.
AOAC, 1990. Official Methods of Analysis of the Association of Official

Analytical Chemists. Chapter 35: Fish and Other Marine Products.
948.15 Fat (crude) in seafood. Acid hydrolysis method. 15th edition.
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Aveldao, M.I., Horrocks, L.A., 1983. Quantitative release of fatty acids
from lipids by a simple hydrolysis procedure. Journal of Lipid Research
24, 1101-1105.
Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994, Bienes y Servicios.
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Mxico. Diario Oficial de la Federacin 26 de junio de 1996. Apndice
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1150.
Serwata, R.D., 2007. Nutritional evaluation of rendered animal byproducts and blends as suitable partial alternatives for fish meal in
diets for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Thesis MPhil, University
of Stirling, Stirling, Scotland. Chapter 2: General materials and
methods. 2.9.1. Determination of total lipid, p. 59.
1.9.
Determinacin de fosfoglicridos.
1.9.1.
Introduccin.
La principal clase de fosfolpidos que existe en la naturaleza son los

fosfoglicridos, se le encuentra como componentes esenciales de las
membranas biolgicas. Estos son lpidos con grupos de cabeza que
contienen fosfato. Se encuentran conformados por glicerol, polialcohol
de tres carbonos, con dos enlaces acilo de cidos grasos unidos en la
posiciones 1 y 2 del glicerol y un grupo fosfato esterificado en el tercer
hidroxilo el cul a su vez se encuentra unido a grupo sustituyente, el
cual dependiendo de su naturaleza que da nombre al tipo de
fosfoglicrido.
Estructura general de un fosfoglicrido

Los diferentes fosfoglicridos difieren en el tamao, forma y carga
elctrica de los grupos (X) de la cabeza polar. A su vez, cada tipo de
fosfoglicrido puede presentarse en especies qumicas distintas que se
diferencian en los grupos acilos asociados a los cidos grasos (parte
apolar). Comnmente hay un grupo acilo saturado y otro insaturado,
se presenta una cabeza polar (grupo X) y una cola apolar (cadena
hidrocarbonada), lo cual les confiere a las molculas una naturaleza
anfiptica con un extremo hidroflico y otro hidrfobo. Esta
caracterstica estructural posee una gran importancia en la estructura
celular ya que los fosfoglicridos pueden agruparse al interaccionar las
partes apolares, dando lugar a estructuras ms complejas como las
membranas biolgicas celulares.
Tipos de fosfoglicridos:
Fosfatidilcolina (PC)
Fosfatidiletanolamina (PE)
Fosfatidilserina (PS)
Fosfatidilinositol (PI)
Fosfatidilglicerol (PG)
Fosfatidildiglicerol (DPG)
Los fosfoglicridos ms abundantes en las membranas de las clulas
de animales y de plantas superiores son la fosfatidiletanolamina y la
fosfatidilcolina, mientras que el fosfatidilglicerol y el difosfatidilglicerol
son ms frecuentes en membranas bacterianas.
Un mtodo utilizado con frecuencia para el anlisis de fosfolpidos es la
cromatografa de capa fina, en la cual es posible separarlos mediante
la participacin de estos entre la fase estacionaria polar y la fase mvil
de baja polaridad del solvente. El tipo de sistema de solventes utilizado
determina el patrn de separacin de los lpidos bajo estudio.
1.9.2.
Competencia.
Determinar los tipos principales de fosfoglicridos presentes en tejidos

de un organismo acutico, para evaluar su relacin con caractersticas
tisulares estructurales, con compromiso y disciplina.
1.9.3.
1.9.3.1.
Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, mortero, pipetas graduadas de 5 y

10 mL, tubos de ensaye con tapn, pipetas Pasteur, placa de vidrio,
micropipetas, cuba cromatogrfica, regla.
1.9.3.2.
Instrumental.
Balanza analtica, centrifuga, estufa de conveccin.

1.9.3.3.
Reactivos.
Mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v), HCl

1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo:metanol: cido
actico:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v, cristales de yodo.
1.9.4.
Metodologa.
1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de hgado.

2) Homogeneizar 2 g de hgado, en un mortero con 10 mL con una
mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v) por
10 minutos.
3) Adicionar 3 mL de HCl 1N y mezclar, centrifugar 2000 rpm por 10
minutos.
4) Descartar la fase metanlica (superior), con el uso de una pipeta
Pasteur remover la fase clorofrmica inferior y transferirla a un tubo
de ensaye.
5) Adicionar 0.5 mL de la fase clorofrmica en un tubo de ensaye y
agregar 0.5 mL de cloroformo.
6) Mediante una micropipeta aplicar una 1 gota de la dilucin en 3
puntos equidistantes en una placa de silica gel previamente
preparada (suspensin de 25 g silicagel/50 mL de agua destilada,
secado al aire, activacin a 100 C por 30 min.), a 2 cm de altura de
la base. Evaporar el cloroformo en la campana de extraccin.
7) Colocar la placa en una cuba cromatogrfica saturada que
contenga
como
fase
mvil
el
sistema
de
solventes
cloroformo:metanol: cido actico:H2O (50:37.5:3.5:2 v/v).
8) Desarrollar el cromatograma hasta que el solvente alcance 1 cm
antes del borde superior de la placa, remover esta de la cubeta y
secar a temperatura ambiente en la campana de extraccin.
9) Revelado: Colocar las placas en un recipiente que contenga
cristales de yodo, tapar y dejarlas hasta observar marchas color
marrn-amarillas bien definidas. El yodo forma complejos
moleculares reversibles por adicin a los dobles enlaces C=C de
los cidos grasos componentes de los lpidos, lo cual permite su
visualizacin.
10) Retirar la placa y marcar con lpiz las manchas observadas ya que
el yodo se evapora y la mancha desaparece. Calcular los Rf para
cada mancha y compararlos con los Rf esperados para el sistema
de solventes utilizado.
Rf
dist ( cm ) recorrida soluto

dist ( cm ) recorrida solvente
1.9.5.
Valores de Rf
cromatografa.
de los compuestos separados mediante la
Tipos de fosfolpidos identificados en la muestra de lpidos del tejido

analizado.
1.9.6.
Mtodo de evaluacin.

1.9.7.
Bibliografa.
Fried, B., 2003. Lipids. En: Sherma, J. Fried, B. (eds.), Handbook of ThinLayer Chromatography. 3rd edition. Marcel Dekker, Inc., New York, pp.
826-875.
Holub, B., Skeaff, C.M., 1987. Nutritional regulation of cellular
phosphatidylinositol. En: Conn, P.M., Means, A.R. (eds.), Methods in
Enzymology, Volume 141. Academic Press, Orlando, pp. 234-244.
Mucio Hidalgo, C. A., Smano Njera, J.B., 2008. Manual de prcticas
de bioqumica metablica.
Universidad Autnoma del Estado de
Mxico, Facultad de Qumica. Prctica No 2: Separacin de fosfolpidos
por cromatografa en capa fina. Mxico, pp. 17-19.
Parker, F., Peterson, N. F., 1965. Quantitative analysis of phospholipids
and phospholipid fatty acids from silica gel thin-layer chromatograms.
Journal of Lipid Research 65, 455-460.
Peterson, B.L., Cummings, B.S., 2006. A review of chromatographic
methods for the assessment of phospholipids in biological samples.
Biomedical Chromatography 20, 227243.
1.10. Extraccin y determinacin de pigmentos

fotosintticos.
1.10.1.
Introduccin.
Los pigmentos fotosintticos (clorofilas, carotenoides, etc.) son

fundamentales para transformar la energa lumnica en energa
qumica, por medio de la fotosntesis. En plantas superiores se
encuentra, en su mayora, la clorofila a (PM=893.4) y en menor
proporcin la clorofila b (PM=907.4). La relacin entre ambas depende
de las condiciones ambientales y de crecimiento. Una relacin (a/b) de
3-4 se espera en plantas que han crecido bajo altas intensidades de luz
y una relacin de 2.5-3 se espera en plantas que han crecido con poca
luz (sombra). La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se
conocen al menos siete tipos) se encuentran en los sustituyentes que
presentan; la clorofila a (verde azulada) presenta un grupo metilo (CH3) en el carbono 3, y la clorofila b (verde amarillenta) contiene un
grupo aldehdo (-CHO) en la misma posicin.
Estructura de la clorofila a y b
Los carotenoides, por su parte, pueden dividirse en dos grupos: (a)
Carotenoides sin oxgeno como los -carotenos; (b) Carotenoides que
contienen oxgeno, denominados xantofilas. Entre las xantofilas se
encuentran la violaxantina, anteraxantina, zeaxantina, entre otras.
Los pigmentos vegetales en base a su solubilidad pueden dividirse en

dos grandes grupos: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas,
que se encuentran en el jugo vacuolar; b) Solubles en solventes
orgnicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo, naranja y amarillo),
que se encuentran en las granas y tilacoides de los cloroplastos. Son
los responsables de la captacin de la energa luminosa en el proceso
de la fotosntesis. Las clorofilas poseen unas estructura porfirnica,
formada por cuatro anillos pirrlicos con un tomo de magnesio en su
centro, un anillo de ciclopentanona y un ster de fitol unido a uno de
los anillos de pirrol que provee a la molcula de una cola lipfila.
Existen plantas que contienen solamente clorofila a, como las algas
azules, las diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo
muchas de ellas contienen en los plastidios, pigmentos adicionales
tales como otras clorofilas (c, d, e), fucoxantinas (amarillo pardo) y
ficocianina (azulado), que comunican sus respectivos colores a las
algas. Las clorofilas tienen tpicamente dos picos de absorcin en el
espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm), y otro
en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la
parte media del espectro, correspondiente al color verde (500-600
nm). Esta caracterstica origina que las clorofilas presenten un color
verde, el cual se asocia con organismos o tejidos que contienen
cloroplastos activos en sus clulas.
1.10.2.
Espectro de absorcin de la clorofila a y b
Competencia.
Analizar el tipo y contenido de pigmentos fotosintticos presentes en

un vegetal acutico, para estimar la relacin con funciones
metablicas del organismo de estudio, con organizacin y compromiso.
1.10.3.
1.10.3.1. Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, mortero, pipetas graduadas de 5 y
10 mL, tubos de ensaye con tapn, pipetas Pasteur, placa de vidrio,
micropipetas, cuba cromatogrfica, regla.
1.10.3.2. Instrumental.
Balanza analtica, centrifuga, estufa de conveccin.
1.10.3.3. Reactivos.
Mezcla de cloroformo-metanol-cido clorhdrico (20:10:0.1 v/v), HCl
1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo-metanol-cido
actico-H2O (50:37.5:3.5:2 v/v), cristales de yodo.
1.10.4.
Metodologa.
1) Pesar 1 gramo de un vegetal fresco y macerar en un mortero con

arena calcinada hasta obtener una pasta homognea.
2) Aadir 15 mL de acetona y mezclar al abrigo de la luz durante 5
minutos, enseguida filtrar a travs de papel filtro para remover
slidos de la solucin con pigmentos.
3) Centrifugar el filtrado a 3000 rpm durante 5 min para separar los
restos de arena y partculas en suspensin.
4) Medir el volumen del sobrenadante, tomar 1 mL en un tubo de
ensayo y diluir con 4 mL de acetona.
5) Medir el espectro de absorbancia de la solucin en el intervalo de
380 a 700 nm.
6) Estimar el contenido de clorofila a en el tejido midiendo la
absorbencia (A) a 663 nm y mediante el uso de la siguiente
ecuacin:
Clorofila a (mg/g peso fresco) = A x 11.9 mg/L x (volumen total del

extracto/g de muestra)
1.10.5.
Espectro de absorcin del extracto con pigmentos del vegetal.

Tipo de pigmentos identificados en la muestra analizada.
Contenido de clorofila a por g de peso fresco del vegetal.
1.10.6.
Mtodo de evaluacin.

1.10.7.
Bibliografa.
Dawes, C.J., 1991. Botnica Marina. Editorial Limusa, Mexico, D.F., pp.
421-429.
Dunn, J.L., Turnbull, J.D., Robinson, S.A., 2004. Comparison of solvent
regimes for the extraction of photosynthetic pigments from leaves of
higher plants. Functional Plant Biology 31, 195-202.
Hagerthey, S.E., Louda, J.W., Mongkronsri, P., 2006. Evaluation of
pigment extraction methods and a recommended protocol for
periphyton chlorophyll a determination and chemotaxonomic
assessment. Journal of Phycology 42, 1125-1136.
Schagerl, M., Knzl ,G., 2007. Chlorophyll a extraction from freshwater
algae a reevaluation. Biologia 62(3), 270-275.
Vicente, E., De Hoyos, C., Snchez, P., Cambra, J., 2005. Protocolos
para el muestreo y anlisis para fitoplancton. Ministerio de Medio
Ambiente, Confederacin Hidrogrfica del Ebro, Zaragoza, pp. 25-27.
2. METABOLISMO
Analizar cambios bioqumicos asociados a procesos biolgicos lo

cual permita para desarrollar una visin general de rutas
metablicas centrales.

[UNIDAD II]
Pgina
53
Oxidacin biolgica y transporte de electrones.

2.1.1.
Introduccin.
Los organismos animales son hetertrofos, es decir, no pueden

sintetizar su propia energa, como lo hacen las plantas en la
fotosntesis, sino que deben ingerir esa energa en los alimentos que
consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante su
oxidacin mediante una serie de reacciones bioqumicas. La oxidacin
de los compuestos orgnicos se asocia a la ganancia de oxgeno,
perdida de hidrgeno o perdida de electrones; en tanto que la
reduccin implica prdida de oxgeno, ganancia de electrones o
ganancia de hidrgeno.
Las principales fuentes de energa para los animales son los

carbohidratos, lpidos y protenas, el metabolismo energtico de estos
compuestos incluye reacciones como la gluclisis, ciclo de Krebs y la
cadena respiratoria. Las clulas oxidan los compuestos orgnicos para
generar ATP, necesario para su trabajo til. Es en la mitocondria donde
se llevan a cabo las reacciones oxidativas para la obtencin de energa.
En la mitocondria se halla un conjunto de enzimas que hacen posible la
oxidacin de los metabolitos en el ciclo de Krebs del cual se derivan
electrones hacia la cadena respiratoria, la cual se efecta en la
membrana interna de la mitocondria donde ocurre un transporte de
electrones para formar como producto final H2O.
Reacciones de la cadena respiratoria

La generacin de ATP en la mitocondria a travs de la fosforilacin
oxidativa es el resultado de la transferencia de electrones desde el

[UNIDAD II]
Pgina
54
NADH o el FADH2 al oxgeno. Los pares de electrones derivados de los

intermediarios del ciclo de Krebs fluyen a lo largo de una cadena de
varios eslabones, constituidos por enzimas de transporte electrnico,
con niveles de energa sucesivamente inferiores hasta reducir al
oxgeno molecular, que es el ltimo aceptor electrnico, en la
respiracin. Durante este proceso se conserva gran parte de la energa
libre de estos electrones en forma de energa del enlace fosfato del
ATP; el proceso se le denomina fosforilacin oxidativa.
Una forma de estudiar la produccin de energa por parte de la

mitocondria, la cual implica el transporte de electrones a lo largo de
una cadena de reacciones, es mediante la oxidacin de un sustrato
como el succinato y el uso de un compuesto qumico colorido aceptor
de electrones, con el cual pueda estimarse la velocidad de
transferencia de dichos electrones con la perdida de color del
compuesto. Un aceptor artificial de electrones es el ferrocianuro de
potasio, esta sustancia es de color amarillo y a medida que capta
electrones se decolora y adquiere una tonalidad ms plida. El proceso
de cambio de color en una solucin de ferrocianuro por efecto de la
cantidad de electrones aceptados como resultado de la oxidacin del
succinato se puede evaluar mediante uso de espectrofotometra en el
intervalo del espectro visible.

[UNIDAD II]
2.1.2.
Pgina
55
Competencia.
Analizar la oxidacin de un sustrato orgnico y el transporte de

electrones presentes en el tejido de un animal acutico, para estimar
la capacidad biolgica para producir energa, con disciplina y
dedicacin.
2.1.3.
2.1.3.1.
Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, pipetas

graduadas de 1 y 25 mL, embudo de vidrio, tubos de ensaye con
tapn, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipeteros, gradilla, pipetas
Pasteur, vasos de precipitado 250 mL, tubos de centrifuga,
celdas para espectrofotmetro, papel filtro.
2.1.3.2.
Instrumental.
Balanza analtica,
espectrofotmetro.
plancha
de
calentamiento,
centrifuga,
2.1.3.3.Reactivos.
Buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), succinato de sodio 0.01M (en
buffer de fosfatos), malonato de sodio 0.01M (en buffer de
fosfatos), cianuro de potasio 0.01M, ferrocianuro de potasio
0.01M, cido tricloroactico 10%.
2.1.4.
Desarrollo
1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de corazn.

2) Picar finamente las muestras y pesar 1 g de tejido y colocarlo en 19
mL de buffer de fosfatos fro.
3. Homogeneizar la muestra mediante un homogeneizador manual de
tubo con embolo en un bao de hielo durante un 1 minuto.
4. Filtrar a travs de una capa de gasa fina o papel filtro de poro
abierto y separar el filtrado, colocar este en un bao de agua con
hielo.

[UNIDAD II]
Pgina
56
5. Numerar 3 series tubos de ensayo por triplicado y proceder de

acuerdo a la siguiente tabla:
Solucin
Buffer de fosfatos pH
7.4
Succinato de sodio
0.01M
Malonato de sodio
0.01M
Extracto del tejido
Serie 1
Serie 2
Serie 3
3 mL
2 mL
1.9 mL
1 mL
1 mL
0.1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 gota (0.06
1 gota (0.06
1 gota (0.06
Cianuro de potasio
mL)
mL)
mL)
6. Colocar los tubos en un bao de agua a 37 C por 5 minutos.
7. Aadir a cada tubo 1 mL de ferrocianuro de potasio 0.01 M y reposar
por 10 minutos.
8. Adicionar 5 mL de cido tricloroactico a cada tubo y mezclar en
forma homognea.
9. Centrifugar los tubos a 2000 rpm por 5 minutos y separar el
sobrenadante obtenido.
10. Leer la absorbencia de las soluciones a 420 nm. Ajustar la
absorbencia del aparato a cero con un blanco que contenga
nicamente solucin buffer.
11. Calculo del contenido de micromoles de ferrocianuro contenidas en
cada serie de reaccin:
M Ferrocianuro = A/E*L= A/(1x10-3 mol-1 cm-1)*1 cm
A: absorbencia; E: coeficiente de extincin molar del ferrocianuro; L:
longitud de la celda de lectura.
2.1.5.
Micromoles de ferrocianuro de potasio contenidas en la serie de

tubos sin succinato.

tubos con succinato.

tubos con malonato.
Micromoles de succinato oxidadas.

[UNIDAD II]
2.1.6.
Pgina
57
Mtodo de Evaluacin

2.1.7.
Bibliografa
Devlin, T.M., 2004. Bioqumica. 4 edicin. Editorial Revert, S.A.,

Barcelona, pp. 566-575.
Heidelberg.
Chapter
10:
Electron
Transport
and
Oxidative
Phosphorylation, p. 223-238.
Hatefi, Y., 1985. The mitochondrial electron transport and oxidative
phosphorylation system. Annual Review of Biochemistry 54, 10151069.
Martnez Montes, J.M., 2011. Practica de bioqumica para veterinaria No
10. Oxidacin mitocondrial del succinato [en lnea, fecha de consulta:
18
julio
2013].
Disponible
en:
http://practicasdebioqumica.blogspot.mx/2010/11/practica-debioquimica-para-veterinaria.html
Quaciliariello, E. & Palmieri, P., 1968. Control of succinate oxidation by
succinate-uptake by rat-liver mitochondria. European Journal of
Biochemistry 4, 20-27.
2.2.
Actividad oxidativa de lactato deshidrogenasa.
2.2.1.
Introduccin
La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima citoplasmtica que se

encuentra en forma soluble o ligada a membrana, se presenta
ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en
microorganismos, la cual cataliza la siguiente reaccin:
Piruvato + NADH + H+
Lactato + NAD+
La LDH es una enzima que abunda en hgado, msculo esqueltico y

eritrocitos; tambin se encuentra en menor cantidad en corazn, rin
y en mucho menor concentracin en pncreas y pulmn. A pH 7.3 7.8
el equilibrio de la reaccin est desplazado hacia el lactato, pero a pH
ms alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato;
la reaccin puede ocurrir en cualquiera de los dos sentidos,
dependiendo del pH y de la concentracin de los sustratos que se
encuentren presentes. Presenta un papel importante en el
metabolismo de carbohidratos, interviniendo en el ltimo paso de la
glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeognesis a
partir de lactato. Adems, aporta combustible al ciclo de Krebs en
tejidos consumidores de lactato como el msculo cardiaco. La enzima
no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre
otros -ceto o -hidroxicidos estructuralmente similares al pirvico,
como el -cetobutrico. De igual forma, puede utilizar tambin el
NADPH, como coenzima, aunque las velocidad de reaccin es mucho
menor con relacin al NADH. Su peso molecular es aproximadamente
135 kDa y su estructura es la de un tetrmero dispuesto
tetradricamente, en el que las subunidades van unidas por enlaces
hidrfobos, puentes de hidrgeno y fuerzas electrostticas. Existen dos
tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles
dan lugar a cinco formas moleculares (LDH 1, LDH2, LDH3, LDH4, LDH5)
con actividad lactato deshidrognica y con caractersticas cinticas y
fisicoqumicas diferentes, que se han denominado isoenzimas. En
mamferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporcin
que utiliza cada rgano como fuente de combustible es variable.
Durante una actividad fsica el requerimiento energtico del msculo
esqueltico y el corazn aumenta considerablemente. En los dos
primeros minutos de esta actividad el miocardio obtiene esa energa a

partir de glucosa tanto sangunea como de sus propias reservas de
glucgeno, y aunque el consumo de oxgeno aumenta unas cuatro
veces, un 50% del piruvato formado se convierte en lactato
(participacin de la LDH1 y LDH2), Este cambio metablico temporal le
permite al corazn obtener la energa necesaria hasta que adapte su
metabolismo para lograr un incremento en el consumo de cidos
grasos. El msculo esqueltico utiliza (en los primeros segundos) la
energa almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la
degradacin del glucgeno muscular para aportar glucosa como fuente
de energa. Aunque en este tejido durante una actividad intensa el
consumo de oxgeno aumenta unas veinte veces, gran parte del
piruvato formado se convierte en lactato (participacin de la LDH 5 y
LDH4). Este cambio metablico le permite a este rgano obtener
energa extra utilizando la gluclisis anaerbica. El cambio de piruvato
a lactato es una va de recuperacin de NAD+ para que la gluclisis
contine. La mayor parte del lactato formado en esta etapa es
recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en el hgado
mediante un proceso que requiere el aporte de energa (Ciclo de Cori).
Aqu la oxidacin de lactato a piruvato es favorecida por la baja
relacin NADH/NAD+ y la escasa presencia de piruvato intracelular. La
LDH es una enzima cercana al equilibrio, regulada por la razn
NADH/NAD+ y por presentar formas isoenzimticas con caractersticas
distintas tanto cinticas como de inhibicin por sustrato. La inhibicin
por exceso de sustrato tiene lugar por la formacin de un complejo
NAD-piruvato que compite con el NADH por el centro activo del
enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibicin por intermediarios de
ciclo tricarboxlico: oxalacetato y citrato.
2.2.2.
Competencia.
Evaluar la capacidad redox de la enzima lactato deshidrogenasa de

musculo esqueltico e hgado de un animal acutico, para estimar su
relacin con el metabolismo tisular de carbohidratos, con organizacin
y disciplina.
2.2.3.
2.2.3.1.Materiales.
graduadas de 5 y 1 mL, tubos de ensaye, micropipetas,
pipeteros,
gradilla,
tubos
de
centrifuga,
celdas
para
espectrofotmetro.
2.2.3.2.Instrumental.
Balanza analtica, centrifuga refrigerada, espectrofotmetro.
2.2.3.3.Reactivos.
Sacarosa 0.25M, buffer de fosfatos 0.1M (pH 7.4), NADH 3.5 mM,
piruvato de sodio 21 mM.
2.2.4.
Desarrollo.
1) Disecar peces recin sacrificados y obtener muestras de hgado y

msculo.
2) Homogenizar 1 g de cada muestra en 10 mL de solucin de
sacarosa 0.25 M fra.
3) Centrifugar a 15,800 rpm durante 20 minutos en centrfuga
refrigerada.
4) Separar el sobrenadante y diluirlo en una relacin 1:50 con sacarosa
0.25 M.
5) Preparar series de tubos por duplicado de acuerdo con la siguiente
tabla:
Solucin
Serie 1
Serie 2
Serie 3
Buffer de fosfatos pH
2 mL
7.4
2.8 mL
2 mL
NADH 3.5 mM
0.1 mL
0.1 mL
0.1 mL
Extracto del tejido
1 mL
1 mL
6) Adicionar 0.1 mL de piruvato de sodio 21 mM a cada tubo y leer la
absorbencia a 340 nm cada 30 segundos durante un intervalo de 10
minutos.
7) Calcular la actividad especfica de la enzima, en M/ min x g de
tejido, con base en los valores de absorbencia (A) registrados y de
acuerdo a la siguiente expresin:
A = x c x l
= Coeficiente de extincin del NAD+ = 6.22 cm-1 mM-1; c:

concentracin en moles/L; l: longitud en cm de la celda de lectura.
2.2.5.
Valores y grfica de absorbencia contra tiempo de la oxidacin

del NADH.
Actividad especfica de la enzima lactato deshidrogenasa en

cada tejido.
2.2.6.
Mtodo de Evaluacin

2.2.7.
Bibliografa
Crabtree, B., Newsholme, E. A., 1972. The activities of phosphorylase,

hexokinase, phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and the
glycerol 3-phosphate dehydrogenases in muscles from vertebrates and
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Heidelberg. Chapter 8: Carbohydrate Metabolism A: Glycolysis and
Gluconeogenesis, pp. 163-204.
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Tseng, Y.-C., Lee, J.-R., Chang, J. C.-H., Kuo, C.-H., Lee, S.-J., Hwang, P.P., 2008. Regulation of lactate dehydrogenase in tilapia (Oreochromis
mossambicus) gills during acclimation to salinity challenge. Zoological
Studies 47(4), 473-480.
2.3. Capacidad metablica celular y actividad de

citocromo oxidasa.
2.3.1.
Introduccin
La citocromo C-oxidasa es un enzima que est presente en todos los

organismos aerobios, la cual en la cadena respiratoria cataliza la
transferencia de electrones al oxgeno como ltimo aceptor de
electrones para formar agua. La citocromo oxidasa conforma el
Complejo IV dentro de los complejos de transportadores y protenas
que integran la cadena respiratoria, el cual cataliza la formacin de
H2O a partir de 2e-, O y 2H+. Este complejo contribuye con la
generacin de un gradiente de protones para generar un ATP. La
reduccin del oxgeno para generar agua permite liberar energa por
flujo de electrones el cual favorece la fosforilacin de ADP a ATP, este
proceso se denomina fosforilacin oxidativa y tiene lugar en la
membrana interna de la mitocondria.
La citocromo oxidasa cataliza la transferencia de electrones del

citocromo C al oxgeno para formar agua de acuerdo a la siguiente
redaccin:
4Citocromo c (Fe+2) + 4H+ + O2
4Citocromo c (Fe+3) + 2H2O
La actividad de la citocromo oxidasa se puede determinar mediante el

uso de dimetil-para-fenilendiamina, indicador de reduccin-oxidacin,
compuesto que al ser oxidado y en presencia de -naftol genera un
cromforo colorido denominado azul de indofenol.
2.3.2.
Competencia
Evaluar la capacidad de oxidacin de la citocromo oxidasa de corazn

e hgado de un animal acutico, para estimar su relacin con la
capacidad metablica celular del tejido, con voluntad y disposicin.
2.3.3.
Material
2.3.3.1.
Materiales

graduadas de 10, 2 y 1 mL, tubos de ensaye, pipeteros, gradilla,
tubos de centrifuga, cronometro.
2.3.3.2.
Instrumental
Balanza analtica, centrifuga refrigerada, bao de temperatura

controlada.
2.3.3.3.
Reactivos
KCl 0.15M, -Naftol 0.15% en

fenilendiamina 0.15%, KCN 0.01%.
2.3.4.
etanol
10%,
dimetil-para-
Desarrollo
I) Separacin de fracciones.
1) Disecar peces recin sacrificados y remover el hgado y el corazn.
2) Pesar los rganos extrados y mantenerlos en bao de hielo.
3) Picar finamente las muestras y preparar un homogeneizado por
tejido con 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo de tejido.
4) Centrifugar el homogeneizado en frio, a 500 rpm por 15 minutos.
5) Decantar el sobrenadante en un recipiente limpio y fro y desechar

el residuo.
6) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 3000 rpm por 15
minutos.
7) Separar el sobrenadante en un recipiente limpio y frio y etiquetar
como "sobrenadante de hgado" o sobrenadante de corazn segn
corresponda. De igual forma, separar y pesar en frio el precipitado,
mezclar en 9 mL de KCl 0.15M frio por gramo y etiquetar como
"suspensin de hgado" o suspensin de corazn segn
corresponda.
II) Actividad enzimtica.
1) Preparar series de 5 tubos de sobrenadante y suspensin de cada
tejido, de acuerdo a la tabla siguiente:
Reactivos
-Naftol 0.15% en etanol 10%
Dimetil-para-fenilendiamina
0.15%
Agua destilada
Mezclar y calentar en bao de
KCN 0.01%
Sobrenadante o suspensin
del tejido
1
0.5
0.5
2
0.5
Tubo
3
0.5
4
0.5
0.5
5
0.5
0.5
1
1.5
1.5
0.5
2
agua a 37C por 10 minutos
0.5
1
1
1
1
2) Calentar los tubos en bao de agua a 37 C con agitacin suave.

3) Registrar los cambios de color en cada tubo al tiempo 0, 15, 30, 45 y
60 minutos despus de la adicin de los extractos de tejidos.
4) Los colores esperados se asocian a las siguientes condiciones en el
medio de reaccin:
Caractersticas de reaccin
Color
Oxidacin de la dimetil-para-fenilendiamina e
interaccin con el -naftol para formar azul de
indofenol
Oxidacin de la dimetil-para-fenilendiamina,
ausencia de -naftol
Sustrato en forma reducida y presencia de naftol
Inhibicin de la reaccin de oxidacin
2.3.5.
esperado
Morado
Caf
Violeta
Lila
Tiempo de deteccin de la oxidacin de la dimetil-parafenilendiamina por tipo de muestra y fraccin de extracto

analizados.
Fracciones de extractos con actividad positiva de la citocromo
oxidasa.
2.3.6.
Mtodo de Evaluacin

2.3.7.
Bibliografa
Chance, B., Saronio, C., Leigh, J. S., 1975. Functional intermediates in

the reaction of membrane-bound cytochrome oxidase with oxygen.
Journal of Biological Chemistry 250, 9226-9237.
Goolish, E. M., Adelman, I. R., 1987. Tissue-specific cytochrome oxidase
activity in largemouth bass: the metabolic costs of feeding and growth.
Physiological Zoology 60 (4), 454-464.

Oxidaciones biolgicas: Obtencin de la fraccin mitocondrial del
tejido; Determinacin de la actividad de citocromo-oxidasa. Mxico.,
pp. 42-45.
Kuboyama, M., Yong, F.C., King, T.E., 1972. Studies on cytochrome
oxidase . VIII. Preparation and some properties of cardiac cytochrome
oxidase. Journal of Biological Chemistry 247, 6375-6383.
Ludwig, B., Bender, E., Arnold, S., Httemann, M., Lee, I., Kadenbach,
B., 2001. Cytochrome c oxidase and the regulation of oxidative
phosphorylation. ChemBioChem 2(6), 392-403.
Speers-Roesch, B., Ballantyne, J. S., 2005. Activities of antioxidant
enzymes and cytochrome c oxidase in liver of Arctic and temperate
teleosts. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &
Integrative Physiology 140(4), 487-494.

Anexos
Pgina
68
Anexos
Normas Generales de Seguridad e Higiene
1. El uso de bata es obligatorio.
2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con
los elementos de seguridad disponibles.
3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se
diese el caso de una evacuacin por fuego o por cualquier otro incidente,
as como conocer la localizacin exacta de extintores, duchas de
seguridad y duchas de ojos.
4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se est en el
laboratorio.
5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente
las salpicaduras de productos qumicos o sus vapores pueden pasar
detrs de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar
las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o
de gafas de seguridad cerradas.
6. S un producto qumico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una
ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos
sin interrupcin. Acta siempre con urgencia, en menos de 10 segundos.
No dirijas una corriente de alta presin de agua de un grifo directamente
al ojo porque podras lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo
que ha sucedido y si es necesario pide asistencia mdica.
7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodn) es obligatorio, ya que por
mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos
qumicos son inevitables.
8. 8. As mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.
9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que
los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos qumicos.
10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo
y conservacin de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras
instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.
11. Lavarse siempre las manos despus de hacer cualquier anlisis y antes
de salir del laboratorio.
12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.
13. Est prohibido fumar en el laboratorio por razones higinicas y de
seguridad.

Anexos
Pgina
69
14. No inhales, pruebes o huelas productos qumicos si no ests

debidamente informado.
15. Cerrar hermticamente los frascos de productos qumicos despus de
utilizarlos.
16. Para pipetear los lquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no
absorber directamente con la boca.
17. Cuando caliente tubos de ensaye hgalo siempre en la parte superior
del lquido y con agitacin suave, nunca por el fondo del tubo, y debe
estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona.
18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para
otro del laboratorio. S tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las
botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogindolas por el
fondo, nunca por la boca de la botella.
19. El rea de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada,
sin libros, abrigos, bolsas, productos qumicos vertidos.
20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr,
jugar, empujar, gritar, etc.
21. No se puede hacer ningn experimento no autorizado.
22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su
funcionamiento.
23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo
de accidentes.
24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios
y en perfecto estado de uso.
25. Todos los productos qumicos tienen que ser manejados con mucho
cuidado de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las
sustancias.
26. No inhales los vapores de productos qumicos y trabaja siempre en
vitrinas extractoras, especialmente cuando manipules productos txicos,
irritantes, corrosivos o lacrimgenos.

Anexos
Pgina
70

Anexos
Pgina
71
Medidas Generales en Caso de Accidente

Plan general de emergencia
Dar la alarma.
Ponerse a salvo.
Ayudar a las personas.
Luchar contra el fuego.
Avisar al responsable del departamento.
Evacuacin del edificio en caso necesario.
Avisar a ambulancias, bomberos.
Fuego en el laboratorio
Evacuar el laboratorio, por pequeo que sea el fuego, por la salida principal o
por la salida de emergencia, s la principal est bloqueada.
Avisar a todos los compaeros de trabajo sin que se extienda el pnico y
conservando siempre la calma.
S el fuego es pequeo y localizado, apagarlo utilizando un extintor

adecuado, arena cubriendo el fuego con un recipiente de tamao
adecuado que lo ahogue.
Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del fuego. No
utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamacin
de un disolvente.
Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, s el
fuego no se puede controlar rpidamente accionar la alarma de fuego,
avisar al servicio de extincin de incendios y evacuar el edificio.
Fuego en el cuerpo
S se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda.

Estrate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas.
No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que est muy
cerca de ti.
Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se est quemando, cbrele
con una manta anti-fuego, condcele hasta la ducha de seguridad, si est
cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una
persona.

Anexos
Pgina
72
Una vez apagado el fuego, mantn a la persona tendida, procurando que

no coja fro y proporcinale asistencia mdica.
Quemaduras
Las pequeas quemaduras producidas por material caliente, baos,

placas, etc., se tratarn lavando la zona afectada con agua fra durante
10-15 minutos.
Las quemaduras ms graves requieren atencin mdica inmediata.
No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
Cortes
Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo

comn en el laboratorio.
Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente,
durante 10 minutos como mnimo.
S la cortada es pequea y deja de sangrar en poco tiempo, lvala con
agua y jabn y tpala con una venda.
S la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia
mdica inmediata.
Derrame de productos qumicos sobre la piel
Los productos qumicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser
lavados inmediatamente con agua corriente abundantemente, como
mnimo durante 15 minutos.
Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios sern utilizadas en
aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea
suficiente el lavado en una pila.
Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo
antes posible mientras est bajo la ducha.
Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la
gravedad y la extensin de la herida.
Proporcionar asistencia mdica a la persona afectada.
Corrosiones en la piel por cidos y lcalis
Cuando ocurre una corrosin por cidos, corta lo ms rpidamente posible

la ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la

Anexos
Pgina
73
acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso

de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento leocalcreo o parecido.
Cuando se produce una corrosin por lcalis, lave la zona afectada
abundantemente con agua corriente y aclrala con una disolucin de
cido actico al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de
cido tnico.
Corrosiones en los ojos
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes

se lave el ojo, menos grave ser el dao producido.
Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos
como mnimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar
los ojos.
Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para
facilitar el lavado debajo de los prpados.
Es necesario recibir asistencia mdica, por pequea que parezca la lesin.
Ingestin de productos qumicos
Antes de cualquier actuacin pide asistencia mdica.

S el paciente est inconsciente, ponerlo en posicin lateral de seguridad,
con la cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera.

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Manual de Prcticas de Laboratorio de

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Dr. Felipe Cuamea Velzquez

Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert...........................................................7

Determinacin del contenido de protena soluble.............................................11

Determinacin del punto isoelctrico de una protena......................................15

Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin......................................19

Determinacin de parmetros de cintica enzimtica.......................................24

Determinacin de carbohidratos totales............................................................29

Aislamiento y cuantificacin de glucgeno........................................................33

Extraccin y cuantificacin de lpidos................................................................37

Extraccin y determinacin de pigmentos fotosintticos...................................47

Oxidacin biolgica y transporte de electrones.................................................52

Actividad oxidativa de la lactato deshidrogenasa..............................................57

Capacidad metablica celular y actividad de citocromo oxidasa.......................62

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Encuadre del Sistema de Prcticas

Con frecuencia se tiene la concepcin que el desarrollo de las prcticas de

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Competencias a las que contribuye

El trabajo que se desarrolla en el Laboratorio de Bioqumica contribuye al

El nivel de desempeo del alumno estar asociado al desarrollo ptimo de

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Ubicacin dentro del mapa curricular

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

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Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Programa del Sistema de Prcticas

Prctica o prcticas programadas

1.10. Prctica 10: Extraccin y

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Mediante el uso de protocolos experimentales y tcnicas

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Espectrofotometra y ley de Beer-Lambert.

Los mtodos pticos de anlisis pueden utilizares para determinar en

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

concentracin desconocida de una solucin se mide su absorbancia y

1) Si se conoce el coeficiente de extincin molar de un compuesto a

Evaluar la absorbencia de protena en solucin con base al fundamento

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

1. Medir 1 mL de la solucin de albmina y colocar en un tubo de

Determinar la longitud de onda ptima para efectuar la

7. Elaborar una curva de calibracin mediante cinco distintas

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Manual de Prcticas de Laboratorio de BIOQUIMICA

Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la regresin lineal de

Al final de la sesin de laboratorio, el estudiante deber mostrar al

Roca, P., Oliver, J., Rodrguez, A.M., 2003. Bioqumica Tcnicas y

Dr. Eduardo Durazo Beltrn

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Determinacin del contenido de protena soluble.