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Road map through different laboratorial techniques Fluorescence

Spectroscopy
Gonalo Figueir1
1

Departamento Cincias da Vida, Faculdade de Cincias e Tecnologia, Universidade de Coimbra.

Resumo: O estudo da biodisponibilidade de uma molcula (como por exemplo um frmaco) pode ser feito
atravs da interao desta com protenas e biomembranas. Esta parte do projeto tem como objetivo estudar a
interao de uma amina gorda fluorescente, em que uma poro fluorescente de 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4ilo (NBD) se encontrava ligada covalentemente a um grupo amina, a butilamina (NBD-C4), com a protena BSA
usando a espectroscopia de fluorescncia. Foi determinada a constante de ligao do NBD-C4 BSA, Kb, cujo
valor foi de 1,96x104 M-1, na mesma ordem de grandeza de outros estudos, o que indica que esta molcula
anfiptica interage eficientemente com a BSA. Foi tambm analisado o processo de quenching de fluorescncia
da BSA o que permitiu calcular constante de Stern-Volmer e as constantes de ligao para diferentes percursos
ticos (10 mm: Kb=4,51x104 M-1; 5 mm: Kb=0,0508x104 M-1; 3 mm: Kb=0,0336 x104 M-1), que diferem do calculado
pelo mtodo anterior. Assim utilizando mtodos diferentes podemos chegar a concluses diferentes, e por isso
necessrio ter ateno a certos parmetros.
Palavras-chave: Fluorescncia, NDB-C4, BSA, Ligao BSA NBD-C4, Efeito de Filtro Interno, Quenching.

Introduo
A emisso de luz a partir de qualquer
substncia designada de luminescncia, e ocorre
atravs da passagem de estados eletronicamente
excitados para o estado fundamental. A luminescncia
dividida em duas categorias, dependendo do estado
natural do estado excitado: Fluorescncia e
Fosforescncia. Num estado excitado singleto, o
eletro que se encontra na orbital excitada apresenta
um spin oposto ao eletro na orbital do estado
fundamental. Consequentemente, o regresso do
eletro ao estado fundamental permitido pelo spin e
ocorre rapidamente pela emisso de um foto. Atravs
do diagrama de Jablonski (Figura 1) consegue-se
ilustrar os processos que ocorrem entre absoro e
emisso de luz. No diagrama aqui apresentado so
excludas as interaes (como o quenching, a
transferncia de energia e as interaes do solvente)
que podem ocorrer em soluo e influenciar o
processo de fluorescncia [2].

Figura 1 Diagrama Jablonski. Legenda: A Absoro do foto; F


Fluorescncia (emisso); P Fosforescncia; Sn Estado singleto nvel
n; Tn Estado tripleto nvel n; IC Converso interna; ISC
Cruzamento
inter-sistema.

Adaptado:[http://sp3.fotolog.com/photo/35/46/88/pety18rbf/12275
07197144_f.jpg]

Pelo diagrama de Jablonski, para ocorrer


fosforescncia necessrio transies eletrnicas
permitidas entre o estado fundamental singleto (S0) e
o estado excitado singleto (Sn), aquando da excitao.
Aps isto, verifica-se uma converso interna (internal
conversion IC) entre os estados singletos de mais alta
energia, que levam o eletro a um estado menos
energtico. Posteriormente, ocorre um cruzamento
intersistemas (intersystem crossing - ISC) deste ltimo
estado singleto para um estado tripleto de menor
energia (T2). A partir deste estado vai ocorrer ento
uma IC para um estado tripleto de mais baixa energia
(T1), e a partir daqui vai ser emitida a fosforescncia.
A fluorescncia semelhante fosforescncia.
No entanto em vez de se suceder um ISC para um
estado tripleto, ocorre uma transio do estado
singleto (S1) para o estado singleto fundamental (S0)
levando emisso de fluorescncia. A luz produzida na
fluorescncia e fosforescncia vai possuir um
comprimento de onda maior (menos energtica) do
que a que foi absorvida. A esta diferena entre o
comprimento de onda mximo a que o fluorforo
absorve e emite designada de desvio de Stokes [2].
O quenching, isto a diminuio da
intensidade de fluorescncia, pode ser causada por
vrios fatores, como por exemplo pela interao entre
o composto fluorescente e outras substncias
presentes em soluo, pela temperatura, pelo efeito de
filtro interno, pela presena de oxignio ou de
impurezas na soluo [2]. A medio do quenching da
fluorescncia intrnseca protena permite analisar a
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interao de frmacos com protenas, descobrir a


acessibilidade dos quenchers aos grupos fluorforos da
protena; e ajuda a perceber o mecanismo de ligao da
protena a frmacos [4].
A espectroscopia de fluorescncia apresenta
inmeras aplicaes, sendo que pode ser usada, como
por exemplo, na monitorizao da conformao de
protenas (saber se uma determinada protena se
encontra no estado nativo ou desnaturado), no estudo
da interao de molculas com protenas e na
microscopia de fluorescncia (em que a fluorescncia
aplicada ao nvel microscpio permitindo o estudo de
tecidos, clulas e estruturas intracelulares, sendo, por
isso, de grande importncia).
O NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo)
uma sonda fluorescente muito utilizada no estudo de
propriedades das membranas e de protenas, j que a
sua fluorescncia depende da polaridade do meio em
que se encontra. Atravs de uma substituio
nucleoflica (de um cloreto por um grupo amina ou
tiol), esta sonda pode-se encontrar ligada a diversos
compostos, como por exemplo colesterol e ceramida,
tendo por isso vrias aplicaes. Estas aplicaes
incluem o estudo do complexo de Golgi, da
distribuio e organizao espacial de lpidos e
protenas na membrana biolgica, de monocamadas
lipdicas, e de muito mais [3]. Neste trabalho utilizouse o NBD ligado a uma amina primria com uma
cadeia hidrocarbonada com 4 carbonos (butilamina),
designada por NBD-C4. Todavia poderia ter sido
usado uma cadeia com mais ou menos carbonos
(Figura 2), influenciando o carcter hidrofbico da
molcula e da vrios parmetros que j foram
estudados, como por exemplo o Kb e o H da ligao
[1].

eliminar radicais livres de oxignio. Assim, o estudo


desta protena ao nvel da sua biodisponibilidade e da
taxa a que chega a um local ativo de grande
importncia. A albumina do soro humano (HSA)
apresenta uma estrutura constituda por trs domnios
homlogos (I, II e III) e tem a capacidade de se ligar a
7 cidos-gordos (FAs), pelo que os locais de ligao
so designados de FAn, onde n varia de 1 a 7. Estes
locais no possuem apenas afinidade pelos cidos
gordos, podendo tambm ligar-se a outra molculas
como por exemplo a varfarina que actua como um
anticoagulante e apresenta afinidade pelo local FA1
[10]. Sendo a estrutura entre a albumina do soro
bovino (BSA) e a HSA ser muito semelhante e o custo
da
BSA
ser
muito
menor,
utilizou-se,
preferencialmente, a BSA como protena neste estudo
[5].
A albumina do soro emite fluorescncia
quando excitada a 280 nm, que o comprimento de
onda () a que se observa o mximo de absoro
devido principalmente a resduos aromticos na sua
estrutura. Essa fluorescncia apresenta um mximo na
regio dos 350 nm, pelo que se encontra associada aos
aminocidos triptofano, tirosina e fenilamina da sua
estrutura. Dos trs aminocidos, a emisso por parte
dos resduos de triptofano da BSA (o Trp-134, que se
encontra superfcie, e o Trp-212, localizado dentro
de uma bolsa hidrofbica) e da HSA (Trp-214) a mais
significativa, devido natureza qumica do
microambiente ao redor desses resduos (Figura 3) [4].
O espectro de emisso destes aminocidos um
indicador da conformao de uma protena j que
altera com a polaridade do solvente utilizado, sendo
que a emisso pode ser desviada para comprimentos
de onda menores se encontrarem no interior de uma
protena ou pode ser desviado para comprimentos de
onda maiores se forem expostos ao solvente. Como a
BSA possui um triptofano superfcie um desvio para
comprimentos maiores no espectro de emisso poder
ser devido a este aminocido e no a uma alterao
conformacional, com o caso de uma desnaturao.

Figura 2 - Estruturas qumicas da molcula de NBD-Cn (em que n varia


de 4 a 16).Adaptado de [9].

A protena mais abundante no plasma a


albumina do soro e produzida pelo fgado. Esta
responsvel por inmeras funes, entre as quais
transportar cidos gordos, ies, nutrientes, frmacos e

Figura 3 Estrutura tridimensional da BSA e HSA e representao dos


triptofanos
responsveis
pela
fluorescncia.
[http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/198/3344939/3344939_pone.003
6723.g001.png]

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Com isto tudo em mente e utilizando


espectroscopia de fluorescncia fomos descrever
cineticamente a interao do NDB-C4 com a BSA, pela
fluorescncia do NBD-C4 e pelo do quenching da
fluorescncia intrnseca BSA em diferentes percursos
ticos.

Materiais e Mtodos
Reagentes. A albumina do soro de bovino
(BSA) sem lpidos, HEPES, EDTA bem como NaCl,
NaN3, HCl e NaOH foram obtidos da Sigma-Aldrich
Qumica S.A. (Sintra, Portugal). O composto NBD-C4
foi sintetizado no grupo de Qumica Biologia do
Centro de Qumica de Coimbra, de acordo com o
protocolo estabelecido [1] e gentilmente cedido pela
Dr Maria Joo Moreno. importante referir que a
BSA no possua lpidos, de maneira a que NBD-C4
interagisse simplesmente com a BSA.
Soluo tampo HEPES. Pesou-se 0.596 g
de HEPES, 2.1915 g de NaCl, 73.1 mg de EDTA e 50
mg de NaN3, com o objetivo de fazer uma soluo de
HEPES 10mM com 0.15M de NaCl, 1mM EDTA e
0.02% NaN3. Aps a dissoluo, procedeu-se ao acerto
do pH a 7.4 com uma soluo de NaOH 2.5M.
Soluo NBD-C4 em soluo tampo. O
NDB-C4 fornecido encontrava-se em metanol, pelo
que foi necessrio evaporar esse mesmo de forma a
diluir o fluorforo em soluo tampo, obtendo uma
concentrao inicial de 200 nM.
Estudo da ligao de NBD-C4 Albumina
do Soro Bovino. Com a finalidade de estudar a
afinidade que o NBD-C4 tem pela BSA, variou-se a
concentrao de BSA (de 0 a 150 M) e manteve-se a
concentrao de NBD-C4 constante, no valor 100 nM.
As amostras controlo no possuam NBD-C4 somente
BSA. Antes de realizar a medio da fluorescncia das
amostras, procedeu-se incubao das mesmas
durante 1-2 horas a 25C. A quantidade de NBD-C4
ligada albumina foi avaliada pelo aumento da sua
fluorescncia aps a ligao.
Estudo do quenching da protena. Neste
estudo, alterou-se a concentrao de NBD-C4, variar
de 1 a 68.2 M, e usou-se uma concentrao constante
de BSA, 5 M. As amostras de controlo no
continham BSA mas apenas as diferentes
concentraes de NBD-C4. Quando da obteno dos
espectros de fluorescncia, fez-se variar o percurso
tico (10 mm, 5 mm, 3 mm) influenciando a obteno
dos vrios parmetros e permitindo uma anlise do
quenching pela relao de Stern-Volmer. Tal como na
experincia anterior, antes das medies de

fluorescncia incubou-se as solues a 25C e durante


1-2 horas.
Espectroscopia de Fluorescncia. Os
espectros de fluorescncia foram obtidos num
espetrofotmetro de fluorescncia Cary Eclipse
equipado com um suporte de mltiplas clulas,
controlo de temperatura e um polarizador automtico.
Os espectros foram adquiridos entre 475 nm e 650 nm
utilizando um exc de 460 nm para NBD-C4 ( a que
esta molcula absorve mais), e, tambm, entre 285 e
500 usando um exc de 280 nm para BSA, usando
cuvettes de quartzo de percurso ptico 10 mm, 5 mm
e 3 mm. Os espetros de absoro foram obtidos num
espectrofotmetro Uv-Vis Unicam UV500 entre 200 e
800 nm.

Resultados e Discusso
Estudo ligao da NBD-C4 Albumina do
Soro Bovino.
Antes da realizao dos seguintes estudos
obtiveram-se espectros de absoro do NBD-C4 e da
BSA, em que se observou que o mximo de absoro
ocorria para um de 460 nm e 280 nm, respetivamente
(Figura 4).

A)
=)

B)
=)

Figura 4- Espectro de absoro para a BSA (A) e para o NBD-C4 (B).

A biodisponibilidade de uma molcula


determinada atravs da sua ligao a protenas
presentes nos fludos biolgicos. A albumina a
protena mais no soro pelo que muitas vezes utilizado
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como protena modelo para estudos relacionados com


a biodisponibilidade. Neste trabalho medida que a
concentrao de BSA na amostra foi aumentando, a
fluorescncia do NBD-C4, quando excitada a 460 nm,
tambm foi aumentando, demonstrando que ocorria
ligao do NBD-C4 BSA, como podemos ver pela
Figura 5.

Figura 5 Espectros de fluorescncia representando a variao da


intensidade de fluorescncia da NBD-C4 com o aumento da
concentrao de BSA, utilizando um de 460 nm . [BSA] (M) = 0 (i), 5
(ii), 10 (iii), 15 (iv), 20 (v), 25 (vi), 50 (vii), 75 (viii), 100 (ix), 125 (x), 150
(xi), 200 (xii).

A ligao entre o NBD-C4 e a BSA, a pH 7.4 e


a 25C, pode ser observada na Figura 6. Atravs do
melhor ajuste das equaes (1) e (2) [1], conseguiu-se
calcular a constante de ligao, Kb, entre a BSA e o
NBD-C4. Este valor foi de 1,96x104 M-1, que apesar
de ser ligeiramente superior ao calculado em [1], est
na mesma ordem de grandeza.

140
120

If

100
80
60
40
20
0
0

50

100
[BSA] (M)

150

200

Figura 6 Representao grfica da intensidade de fluorescncia (If) em


funo da concentrao de BSA, para uma concentrao constante de
NBD-C4 de 100 nM, a pH 7.4 e a 25C.

A albumina apresenta um papel muito


importante na homeostasia dos cidos gordos,
transportando-os do tecido adiposo para rgos que os
utilizam para obteno de energia [7]. Para tal a
albumina necessita de ligar com grande afinidade s
cadeias hidrocarbonadas dos cidos gordos e como
podemos constatar pelo Kb obtido e pelos valores
conseguidos no trabalho da professora Maria Joo
Moreno [1], isso acontece, sendo que para uma cadeia
hidrocarbonada maior a constante de ligao ,
tambm, maior e que na presena de um cido gordo
(FA-Cn) a constante de ligao para o NBD-Cn
maior do que se esperava, o que mostra a existncia de
alosterismo [1].
Sendo a concentrao fisiolgica de cidos
gordos na gama dos 5 - 10 nM e a concentrao de
albumina no sangue cerca de 640 M (superior que
estamos a utilizar) [6, 7], surge uma questo de como
que tecidos, como o corao e o msculo, conseguem
obter, com alta eficincia, os cidos gordos do plasma.
Ao entender melhor este processo torna-se mais fcil a
concepo de um frmaco que utiliza a albumina do
soro como meio de transporte para atingir o seu alvo
de ao.
Quenching da protena.
A intensidade de fluorescncia proporcional
concentrao do fluorforo em solues muito
diludas (absorvncia muito baixa). Para absorvncia
<0.1, isto concentraes baixas de fluorforo, a luz
incidente ligeiramente atenuada ao longo da cuvette.
No entanto para concentraes altas, uma parte
significativa da luz incidente absorvida antes de
chegar ao ponto onde a fluorescncia observada,
ocorre por isso efeito de filtro interno (Figura 7). O
efeito de filtro interno pode, ainda, ser secundrio
quando a luz emitida reabsorvida antes de sair da
cuvette. Assim a intensidade de fluorescncia de um
composto proporcional sua concentrao apenas
para uma gama restrita de densidades ticas. Ser
necessrio, em alguns casos, aplicar fatores de correo
(correo dos efeitos de filtro interno) [8]. Podemos
observar na Figura 6, que o ponto com menor
concentrao de BSA (5 M) corresponde a uma
absorvncia de 0.218, que necessitava de ser menor que
0.1 para que a intensidade de fluorescncia da BSA
fosse proporcional concentrao. No entanto como
o valor de concentrao de BSA muito pequeno no
dever existir grandes problemas de efeito de filtro
interno. Assim, foi escolhido o valor de 5 M para a
concentrao de BSA a utilizar para os estudos que se
seguem.
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notar que a diminuio da intensidade de fluorescncia


com a diminuio do percurso tico deve-se,
simplesmente, ao facto de existir menos BSA na
cuvette (Figura 8).

If

160
140
120
100
80
60
40
20
0

1000
900
0,218; 54,839

A)

800
700

2
Abs 280 nm

600

Figura 5 Variao da intensidade de fluorescncia da BSA com a


absorvncia a 280 nm (proporcional [BSA]) - Efeito de filtro interno.

Para interpretar os dados de estudo da extino


de fluorescncia (quenching), importante
compreender que tipo de interao ocorre entre o
fluorforo e o quencher. Existem duas formas de
quenching, de acordo com a natureza do fluorforo e
o quencher: esttico e dinmico. O quenching esttico
resulta da formao de um complexo no fluorescente
no estado fundamental entre o fluorforo e o
quencher. Enquanto o quenching dinmico o
resultado de encontros colisionais entre fluorforo e
quencher [9]. Em ambos os casos, necessrio
contacto molecular entre o fluorforo e o quencher
para ocorrer quenching da fluorescncia. A anlise dos
resultados de quenching normalmente realizada
atravs das relaes de Stern-Volmer para o quenching
dinmico (equao 3) e esttico (equao 4), onde F0 e
F representam a intensidade da protena na ausncia e
presena de quencher, respetivamente, [Q] a
concentrao de quencher, KSV/S a constante de SternVolmer para o quenching dinmico e esttico, 0 e o
tempo de vida do estado excitado na ausncia e
presena de quencher, respetivamente.

500
400
300
200
100
0
285

335

385
nm

435

485

450
400

B)

350
300

250
If

If

200
150
100
50
0
285

335

385
nm

435

485

250

C)

200

If

150
100

Podemos constatar pela Figura 8 que medida


que a concentrao de NBD-C4 (quencher) foi
aumentando, a fluorescncia intrnseca BSA foi
diminuindo, ocorrendo, por isso, quenching. Isto
acontece porque a molcula de NBD-C4, para alm de
absorver a 460 nm, vai tambm absorver a
comprimentos de onda semelhantes emisso da BSA,
isto , cerca de 350 nm (Figura 9). Assim, a ligao da
NBD-C4 BSA poder promover a uma proximidade
a resduos de triptofano da BSA, que permitir a uma
absoro da luz emitida por estes aminocidos. de

50
0
285
0 M
5 M
20 M
50 M

335

nm 385
1 M
10 M
30 M
68,2 M

435
3 M
15 M
40 M

Figura 8 - Espectros de fluorescncia da BSA (exc=280nm e


em=350nm) com a concentrao de NBD-C4, numa cuvette de
A) 10, B) 5 e C) 3 mm de percurso de ptico.

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Absorvncia (U.A)

Fluorescncia (U.A)

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300

350

400 nm 450

500

550

Figura 9 Espectro de Absoro da NDB-C4 a laranja e do Espectro


de Fluorescncia da BSA a azul.

Ao analisarmos o quenching da protena pela


relao de Stern-Volmer (Figura 10), apercebemo-nos
de uma relao linear at aos 20 M de NBD-C4 e de
um desvio na linearidade que se move para cima para
alm desta concentrao. Ao realizar a regresso linear
dos dados de quenching da protena (Figura 9),
conseguiu-se calcular a constante de quenching de
Stern-Volmer (Ksv) para os diferentes percursos ticos
pelo declive da reta. Assim, verificou-se que esta
constante varia com o percurso tico: 3 mm:
Ksv=0,0148 M-1; 5 mm: Ksv=0.0195 M-1; 10 mm: Ksv=
0.0263 M-1. No entanto como o erro das regresses
lineares, nomeadamente para cuvette de 3 mm e 5 mm
foi elevado, ter-se-ia de realizar mais experincias de
forma a confirmar se varia ou se mantm constante, j
que se encontram na mesmo ordem de grandeza.
importante referir que os valores de menor
concentrao de NBD-C4 foram repetidos por estarem
fora da linearidade, assim escolheu-se os melhores
pontos que definiam uma reta para estudar o
quenching da protena.
Podemos observar, ainda, na Figura 10, que
para todas as cuvettes, a curva de Stern-Volmer
apresenta uma curvatura para cima, cncava na direo
do eixo dos ys para concentraes superiores a 20 M
de NBD-C4. Isto ocorre porque o quenching do BSA
est a ocorrer quer por coliso quer pela formao de
um complexo fluorforo-quencher, mas tambm
porque est acontecer efeito de filtro interno
secundrio.
3

(F0/F) - 1

2,5
2

1,5
1

0,5
0
-0,5

20

40

60

80

[NBD-C4] (M)

Figura 10 Curvas de Stern-Volmer que descrevem o quenching da BSA


causado pelo NBD-C4 e a regresso linear para concentraes de NBD-

C4 baixas. 10 mm: y = 0,0263x - 0,0136, R2= 0,9772; 5 mm: y =


0,0195x + 0,0375, R = 0,8258; 3 mm: y = 0,0148x + 0,0202, R =
0,7511.

Como o quenching da fluorescncia intrnseca


do triptofano da BSA por NBD-C4 segue o tipo de
interao esttica possvel calcular a constante de
ligao (Kb) pelo seguinte mtodo.
O equilbrio entre o NBD-C4 e a BSA pode ser
representado esquematicamente pelo equilbrio (5),
onde Q o NBD-C4, M o BSA, n representa o
nmero de locais de ligao na protena e M.Qn o
complexo entre o fluorforo e o quencher:

Assim, a constante de ligao (Kb) pode ser


calculada pela equao (6):

Sendo a concentrao de protena total (ligada


e no ligada) igual [M]0 e sabendo que
[M]/[M]0=F/F0, conseguimos calcular K pela equao
(7):

Na Figura 11 encontra-se a representao


grfica de aos resultados obtidos na gama de
concentraes baixas de NBD-C4, obtendo a constante
de ligao para cada percurso tico.
Pelas equaes adquiridas na Figura 10,
conseguimos retirar a constante de ligao e o nmero
de locais de ligao da interao entre o NBD-C4 e a
BSA. Estes valores encontram-se organizados na
Tabela 1 para cada percurso ptico.
Tabela 1 Valores de constante de ligao (Kb) e locais de ligao (n) na
interao da NBD-C4 com a BSA, para diferentes percursos ticos e
obtidos pela Figura 10.

Percursos ticos
3 mm
5 mm
10 mm

Kb (x104 M-1)
0,0336
0,0508
4,51

n
0,662
0,666
1,054

Pode-se constatar que os valores da constante


de ligao obtidos para os diferentes percursos so
muito diferentes entre si, sendo que para um percurso
tico maior, maior ser a constante de ligao.
Podemos, ainda, reparar que os resultados para o
nmero de locais de ligao no variam tanto. Em
teoria estes valores deveriam manter-se pois as
amostras em estudo so a mesma (s o nmero de
locais de ligao que se manteve constante). A
explicao deste acontecimento a existncia de um
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efeito de filtro interno secundrio, isto o NBD-C4


que no se encontra ligado BSA absorve o que esta
emite fazendo com que parea que haja mais NBD-C4
ligado. Ento o quenching da protena vai ocorrer por
dois efeitos: o efeito de filtro interno secundrio e
transferncia de energia por ressonncia devida
ligao do NBD-C4 BSA.
O efeito de filtro interno secundrio tanto
maior quanto maior for a cuvette, porque existe mais
NBD-C4 no ligado em soluo que pode absorver o
que BSA est a emitir. Assim era de esperar obter um
valor de Kb mais correto na cuvette de 3 mm, mas
como R2 foi baixo ter-se-ia de realizar mais
experincias de forma a conseguir uma melhor
regresso linear.

A)
=)

Concluso
2

Nesta parte do projeto foi analisado a interao


da BSA e NBD-C4 foi analisado pelo aumento da
fluorescncia do NBD-C4 na presena de concentrao
crescente de BSA e por quenching da fluorescncia
intrnseco do triptofano da BSA em diferentes
percursos pticos pela adio de concentrao
crescente de NBD-C4.
Atravs dos resultados obtidos conseguiu-se
perceber que o 1 mtodo (ligao albumina do soro
bovino) era mais exato na obteno da constante de
ligao (Kb) que o 2 mtodo (quenching da protena),
uma vez que neste h a influncia do percurso tico a
utilizar e da gama de concentraes de quencher
(NBD-C4) que se usa. Assim necessrio ter em
ateno estes dois parmetros, para que as medies
no levem a artefactos. Apesar do mtodo de
quenching no ser to exato na obteno de Kb,
permite fazer outros estudos interessantes como a
difuso de oxignio em membranas, localizar resduos
de triptofano ligados a membranas e estudar o efeito
das mudanas conformacionais na acessibilidade ao
triptofano.

Referncias

B)

C)

Figura 11 Representao grfica de log([Q]) vs log(F0-F/F), para


valores baixos de concentrao de NBD-C4 ([Q]= 4; 8; 9; 12; 16 M) e
que permite determinar Kb e n. A) utilizao de uma cuvette de 10 mm,
B) utilizao de uma cuvette de 5 mm e C) utilizao de uma cuvette de
3 mm.

[1] Moreno, M.J.: Chain Length Effect on the Binding


of Amphiphiles to Serum Albumin and to POPC
Bilayers. J. Phys. Chem. B. 2010, 114, 1633716346;
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