Relatrio de Bioqumica Cintica

Enzimtica

Professoras: Ana Claudia e Ana Paula

Aluno: Andr Lucas, Felipe Gorgulho e Marcus Raposo
Turma: Bio 231

1.Introduo
As enzimas so as protenas mais notveis e mais altamente especializadas,
possuem um poder cataltico extraordinrio e um alto grau de especificidade para os
seus respectivos substratos. Elas aceleram as reaes qumicas e atuam em solues
aquosas sob condies suaves de temperatura e pH.
As enzimas esto no centro de cada um dos processos bioqumicos. Atuando em
sequncias organizadas, elas catalisam cada reao das centenas de etapas que
degradam as molculas dos nutrientes, que conservam e transformam energia qumica e
que constroem as macromolculas biolgicas a partir de precursores elementares.
A cintica enzimtica o ramo da enzimologia que estuda a velocidade das
reaes enzimticas, assim como os fatores que influenciam nesta velocidade. Portanto
possvel avaliar tal processo com a concentrao de substrato que consumido ou pela
concentrao de produto que formado.
Uma reao enzimtica simples pode ser escrita como:
E + S ES EP E + P
Onde E,S e P representam enzima, substrato e produto; ES e EP
so complexos transitrios da enzima com o substrato e com o
produto.
As reaes que so catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de
catlise no indica uma resposta linear medida que se aumenta o substrato. Se a
velocidade inicial da reao medida sobre uma escala de concentraes de substrato, a
velocidade de reao aumenta com o acrscimo de substrato. Todavia, medida que a
concentrao de substrato aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor
mximo.
Essa ideia foi empregada pelos pesquisadores Michaelis e Menten. Eles
postularam que a enzima primeiramente se liga ao substrato, uma etapa relativamente
rpida, e posteriormente o complexo ES que rompido em uma etapa mais lenta,
formando o produto. Mas antes disso, logo que a enzima misturada com um grande
excesso de substrato h um perodo inicial, o estado pr-estacionrio, durante o qual a
concentrao de ES aumenta, em seguida a reao rapidamente atinge o estado
estacionrio no qual a [ES] permanece constante ao longo do tempo at a formao do
produto. Os pesquisadores ainda criaram uma equao, que permite demonstrar como a
velocidade de uma reao varia com a variao da [S].

Onde Km uma constante denominada constante de Michaelis sendoo valor de

Km equivalente a concentrao do substrato necessria para atingir a metade da
velocidade mxima da reao. Logo quanto maior o valor de Km menor a afinidade da
enzima pelo substrato.
Com a equao de Michaelis-Menten possvel transforma-la algebricamente
para fazer grficos com dados experimentais

Esta forma da equao denominada equao de Lineweaver-Burk, que possui

uma vantagem de permitir uma determinao mais acurada da velocidade mxima que
pode ser obtida apenas aproximadamente nos grficos simples.
Alm da concentrao de substrato existem outros fatores que alteram a
velocidade da reao enzimtica: temperatura, quanto maior a temperatura maior a
velocidade da reao, at atingir a temperatura ideal daquela enzima, passando dela o
efeito contrario e a velocidade diminui; pH: cada enzima possui um valor de pH ideal
para reao, quanto mais prximo dele a velocidade maior e quanto mais distante a
reao tende a no acontecer; inibio enzimtica: os inibidores so molculas que
interferem com a catlise, diminuindo ou interrompendo as reaes enzimticas
podendo ser reversvel ou no.
E Ainda existe enzimas reguladoras como a fosfatase alcalina que esta presente
no organismo em uma ampla distribuio tecidual que catalisam a hidrlise de steres
do cido fosfrico, como o prprio nome diz essa enzima funciona melhor em pH
alcalinos e essa enzima retira grupos fosfatos dos substratos como por exemplo
ocorrncia de fosfatases durante importantes eventos metablicos como nucleognese,
metabolismo do glicognio, sntese de trigliceris e sntese da parede celular bacteriana.
De particular importncia o papel das fosfatases no processo de regulao da atividade
de outras enzimas, juntamente com as quinases, atravs da chamada modulao
covalente da atividade enzimtica.

2.Objetivo
Avaliar a cintica enzimtica da fosfatase alcalina sobre o PNPP nas diferentes
condies de pH, temperatura , com presena e sem presena de inibidor.

3.Materias

Soluo padro de p-nitrofenol(PNP) 0,1 mM em tampo Tris-HCl pH 9,5

Soluo de p-nitro-fenil-fosfato(PNPP) 1 mM em tampo Tris-HCl pH9,5
Solues tampo Tris-HCl 0,2M, pH 7,5 , 8,5 e 9,5
Soluo de Na2HPO4 em tampo Tris-HCl 0,2 M , pH 9,5( sol. Tampo Tris-PiHCl)
Solues tampo borato-NaOH 0,3 M , pH 9,5 , 10,5 e 11,5
Solues tampo citrato HCl 0,2 M, pH 5,5 , 6,5 e 7,5
Soluo de NaOH 2 M
Soluo de enzima: fosfatase alcalina
Pipetador automtico 20-200 L
Pipetas de 1, 2 e 5 mL
Pr-pipetes
Tubos de ensaio
Vortex
Banho de gelo (0C)
Banho-maria (25C)
Banho-maria (37C)
Banho-maria (68C)
Cubetas
Espectrofotmetro

4.Metodos

Construo de uma curva padro de PNP

Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram aliquotados as solues indicadas

para cada tubo de ensaio
Tubo n
B
1
2
3
4
5
6

Soluo padro
de PNP (mL)
0,2
0,4
0,8
1,2
1,6
1,8

Tampo Tris-HCl,
pH 9,5 (mL)
3,2
3,0
2,6
2,4
2,0
1,6
1,4

Soluo de
NaOH 2M (mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Em seguida os tubos foram homogeneizados com auxilio do vortex e

posteriormente foi transferido os contedos dos tubos para cubetas e levados para o
espectrofotmetro para obter os valores de absorbncia de cada tubo.

Tubo
n

Influncia do pH
Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram aliquotados as solues indicadas
para cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH
Soluo tampo
citratato-HCl (ml)

pH5
,5
B1
B2
B3
1
2
3
4
5
6
7
8
9

pH
6,5
2,0

pH
7,5

Soluo tampo
Tris-HCl (mL)

pH
7,5

pH
8,5

pH
9,5

Soluo tampo
borato-NaOH (mL)

pH
9,5

pH
10,5

PNPP
1mM(
mL)

Enzim
a (mL)

NaOH
(mL)

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

pH
11,5

2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0

Em seguida os tubos so incubados durante 5 minutos em temperatura ambiente,

aps esse perodo adicionado a enzima nos tubos com auxilio do pipetador
automtico, com intervalos de 1 minuto. Os tubos foram homogeneizados no vortex e
novamente incubados em temperatura ambiente, agora por 15 minutos.
Aps o perodo de incubao a reao foi paralisada adicionando 1,0 mL de
NaOH 2M aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 1 minuto, continuando o experimento o
contedo dos tubos foram transferidos para cubetas para realizar as a leitura
espectrofotomtrica da absorbncia.

Influncia da temperatura

Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para

cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH , em seguida os tubos
foram incubados 5 min nas temperaturas indicadas para cada.
Tubo n

1B

Tampo
Tris-HCL
pH 9,5
2,0

PNPP 1
mM(mL)

Temperatura
(C)

Enzima(mL)

Soluo de
NaOH (mL)

1,0

0,2

1,0

1
2B
2
3B
3
4B
4

2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

4
Ambiente
Ambiente
37
37
68
68

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Aps o perodo de incubao adicionado a enzima nos tubos 1 a 4 em

intervalos de 1 minuto e homogeneizado e em seguida novamente incubado durante
15 minutos. Posteriormente a reao interrompida adicionando 1,0 mL de NaOH 2 M
aos tubos de 1 a 4 em intervalos de 1 minuto, e posteriormente aos tubos restantes e
homogeneizados. Por fim o contedo dos tubos transferido para cubetas para realizar
as a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.

Curso Temporal

Inicialmente preparado o meio de reao, com auxilio de uma pipeta e prpipete, alquotas das solues para um Erlenmeyer de 100 mL como segue a tabela (obs:
a enzima s adicionada aps pr-incubar por 5 min em temperatura ambiente)
Tampo Tris-HCl
0,2 M pH 9,5 (mL)
20

PNPP 1 mM (mL)

Enzima (mL)

10

Em seguida separado e identificado 9 tubos referentes a cada tempo de reao,

neles seram pipetados 1,0 mL de soluo de NaOH 2 M. No Erlenmeyer contendo o
meio de reao adicionado a enzima, imediatamente retirado uma alquota de 3,2 mL
e colocado no tubo B e iniciada a contagem do tempo. Continuando o experimento
retirado alquotas nos tempos indicados na tabela nos tubos tambm indicados. Aps a
coleta do ltimo ponto de 45 min realizada a leitura espectrofotomtrica da
absorbncia.
Tubo n

NaOH 2 M (mL)

B
1
2
3
4
5
6
7
8

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Tempo de
incubao
0
3
6
9
12
15
20
30
45

Alquota do meio
de reao (mL)
3,2
3,2
3,2
3,2
3,2
3,2
3,2
3,2
3,2

Curva de substrato

Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para

cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH. Com o auxilio do
pipetador automtico adicionado 0,2 mL da soluo de enzima aos tubos em
intervalos de 1 minuto e posteriormente incubado em temperatura ambiente por 15
min. Aps esse perodo paralisado a reao adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos
tubos em intervalos de 1 min. Por fim o contedo dos tubos transferidos para
cubetas para realizar a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.
Tubo n
B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Tampo TrisHCl pH 9,5

2,9
2,9
2,8
2,7
2,6
2,4
2,2
2,0
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3

PNPP 1 mM
(mL)
0,1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7

Enzima (mL)
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

Soluo de
NaOH (mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Influncia do Inibidor

Com o auxlio de pipeta e pr-pipete foram alquotas as solues indicadas para

cada tubo de ensaio, com exceo da enzima e do NaOH. Com o auxilio do pipetador
automtico adicionado 0,2 mL da soluo de enzima aos tubos em intervalos de 1
minuto e homogeneizado e posteriormente incubado em temperatura ambiente por 15
minutos. Aps esse perodo a reao paralisada adicionando 1,0 mL de NaOH 2,0 M
aos tubos em intervalos de 1 minuto. Por fim o contedo dos tubos transferido para
cubetas para realizar a leitura espectrofotomtrica da absorbncia.
Tubo n

B
1
2
3
4
5
6

Tampo
Tris-HCl pH
9,5
2,9
2,4
2,3
2,2
2,1
1,9
1,7

PNPP 1 nM
(mL)

Inibidor
(mL)

Enzima
(mL)

Soluo de
NaOH (mL)

0,1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,6
0,8

0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

7
8
9
10
11
12
13

1,5
1,3
1,0
0,7
0,4
0,1
0

1,0
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

5.Resultados

Curva padro de pnp

Como resultado tem-se diferentes valores de absorbncia que foram utilizados para o
clculo da concentrao de PNP, como mostrado na tabela. Tais concentraes foram
calculadas a partir da frmula de diluio: Ci x Vi = Cf x Vf , tendo em vista que os
volumes de NaOH no foram desconsideradas nesses clculos.
Tubo
B
1
2
3
4
5
6

Nmoles de PNP
0
0,00625
0,0125
0,025
0,0375
0,05
0,05625

ABS. 405nm
0
0,089
0,177
0,335
0,472
0,605
0,653

Curva Padro de PNP

0.80000
0.60000
Abs 405nm

0.40000

f(x) = 11.64x + 0.02

R = 1
Linear ()

0.20000
0.00000
0.00000

0.02000

0.04000

0.06000

nmoles de PNP

Influncia do PH

O experimento resultou em diferentes nveis de absorbncia como mostrado na tabela:

Tubo

Abs. 405
nm

B1
B2
B3
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0
0
0
0,050
0,165
0,133
0,246
0,468
0,579
0,124
0,073
0,022

Influncia do PH
0.0040000
0.0030000
V0

0.0020000
0.0010000
0.0000000
1

pH

Influencia da temperatura
A leitura espectofotomtrica resultou nos seguintes medidas de absorbncia :

Tubo
1B
1
2B
2
3B
3
4B
4

Abs 405 nm
0
0,256
0
0,513
0
0,562
0
0,226

Influncia da Temperatura
0.0040000
0.0030000
V0

0.0020000
0.0010000
0.0000000
4

25

37

68

Temperatura C

Curso Temporal

Aps os diferentes intervalos de incubao, registrou-se as seguintes medidas de

absorbncia :

Tubo

Tempo de Incubao

B
1
2
3
4
5
6
7

0
6
9
12
15
20
30
45

Abs. 405
nm
0
0,071
0,142
0,159
0,209
0,256
0,365
0,535

Curso Temporal
0.0600000
0.0400000
[PNP] mol/L

0.0200000
0.0000000
0

10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (min)

Curva substrato sem inibidor e com inibidor

O experimento sem inibidor e com inibidor resultaram nas seguintes medidas de

absorbncia:

Sem inibidor
Tubo
Abs 405
nm
B
0
1
0,200
2
0,264
3
0,313
4
0,353
5
0,425
6
0,428
7
0,432
8
0,453
9
0,514
10
0,483
11
0,445
12
0,466
13
0,350

Com inibidor
Tubo
Abs 405
nm
B
0
1
0,088
2
0,170
3
0,208
4
0,256
5
0,308
6
0,350
7
0,424
8
0,469
9
0,492
10
0,513
11
0,471
12
0,520
13
0,508

Curva de Michaelis-Mentel

0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
ABS. 405 nm (sem inibidor)
0.03

Velocidade inicial

ABS. 405 nm (inibidor)

0.02
0.01
0
0

0.5

1.5

2.5

PNPP (mL)

Grfico duplo-recpro

f(x) = 5.6x + 8.58

R = 1
ABS. 405 nm (sem
inibidor)
1/V0

Linear (ABS. 405 nm

(sem inibidor))

f(x) = 1.75x + 11.91

R = 0.92

-10

-5

ABS. 405 nm
(inibidor)
10

15

Linear (ABS. 405 nm

(inibidor))

1/PNPP (mL)

Os valores de Km foram calculados a partir da expresso: ponto de interseo do eixo

y= -1/Km.
Os valores de Vmx foram calculados a partir da expresso: ponto de interseo do eixo
x= 1/Vmx

6.Discusso
Consideraes gerais:
Nos experimentos realizados, foram utilizados tubos denominados brancos, os quais no
houve reao j que a soluo de NaOH foi colocada antes da enzima, para referencial na
medioda absorbncia dos outros tubos em que ocorreu reao. Desta forma, garante-se que a
absorbncia medida se refere apenas a concentraes de PNP formado.
A soluo de NaOH 2M utilizada serviu para parar a reao, j que sua alta
concentrao eleva o pH a valores nos quais no ocorre reao. A aplicao desta soluo nos
diferentes tubos foi feita com uma diferena de 1 minuto , de forma que tenha ocorrido o
mesmo tempo de reao para todos os tubos a partir da aplicao da enzima na soluo.

Construo da curva padro de PNP:

A partir dos volumes aliquotados da soluo de PNP e feito a leitura espectofotomtrica,
pde-se criar a respectiva curva padro e o fator de calibrao mdio (FCM). A partir destes
dados, outros valores de absorbncia encontrados nos outros experimentos puderam ser usados
para se calcular a concentrao de PNP na soluo respectiva. Para a construo desta curva,
primeiramente foi zerado o valor de absorbncia do tubo B que continha apenas o tampo TrisHCl e a soluo de NaOH e posteriormente medido os valores dos tubos numerados de 1 a 6
que continham quantidades crescentes de PNP. Desta forma, garante-se que os valores
encontrados de absorbncia se referem apenas ao PNP e diminui erros de aferio.

Influncia do pH:
As enzimas (classe de protenas) possuem uma faixa ideal de pH para realizarem seu
funcionamento. Isto por que nesta faixa, a ionizao dos radicais dos resduos de aminocidos
gera cargas que estabilizam a molcula em uma conformao tridimensional tima para ocorrer
a ao cataltica. De acordo com grfico elaborado, percebe-se que a faixa ideal de pH para a
enzima fosfatase alcalina est entre 9,5 , correspondente ao tampo Tris-HCl, j que nesta faixa
h maior concentrao de PNP, indicando que houve maior taxa de reao. Nas outras solues
tampes utilizadas, Citrato-HCl e Borato-NaOH, as concentraes de PNP formado so baixas,
indicando que nas faixas de pH correspondente aos tampes, a enzima tem sua atividade
dimuda. Isto ocorre devido a alteraes nas cargas dos grupos dos resduos de aminocidos,
principalmente aqueles presentes no stio cataltico, que acabam por alterar a conformidade
ideal da molcula, perdendo sua funcionalidade.

Influncia da temperatura:
Assim como o pH, as enzimas possuem faixas de temperaturas ideiais para seu
funcionamento. Isto se explica novamente pela estabilidade ideal da conformidade
tridimensional para a atividade cataltica. Nesta estabilidade, participam as interaes fracas
entre os resduos de aminocidos, como ligaes de hidrognio e as inicas. Na enzima
fosfatase alcalina, segundo o grfico obtido, esta faixa de temperatura corresponde a 37C, j
que nesta houve maior taxa de formao de PNP. Este resultado condiz com a literatura, j que
a fosfatase participa de vias metablicas humanas. Nas faixas de 0C e 68C, a quantidade de
PNP formada foi mais inferior, indicando que nestas faixas de temperatura, as ligaes fracas
que estabilizam o enovelamento da enzima se desfizeram, causando sua desnaturao e
alterando a funcionalidade cataltica da enzima. Quanto maior a temperatura, maior a energia
cintica das molculas, aumentando a velocidade da reao, porm se essa energia for muita

alta, pode ocorrer tal desnaturao, assim como ocorre em baixas temperaturas que ocasiona
uma maior rigidez da enzima.

Curso temporal:
A partir dos dados obtidos, pde-se distinguir uma curva que representa a produo de
PNP pelo tempo crescente de incubao, ou seja, a velocidade de reao. Percebe-se que os
valores de absorbncia e, consequntemente, a concentrao de PNP crescente de acordo com
o maior tempo de incubao dos tubos. Isto indica que quanto maior o tempo de reao, maior a
quantidade de complexos enzimas-PNPP formados, gerando assim, a partir do stio cataltico o
substrato PNP. Pode-se ainda inferir que se a reao no fosse interrompida pela adio de
NaOH, obteria-se um valor constante de concentrao de PNP, j que todo PNPP teria sido
transformado neste substrato.

Velocidade da reao sem inibidor e com inibidor:

Pelo experimento feito sem o inibidor, pode-se inferir uma curva com formato que se
aproxima a uma hiprbole regular. Esta curva denominada Curva de Michaelis-Mentel, a qual
demonstra a velocidade da reao em funo da concentrao de substrato. Esta apresenta um
estgio de linearidade que vai at a metade da velocidade mxima e que corresponde a
concentrao do substrato igual ao Km. Neste estgio, se estuda a atividade enzimtica. Pela
constante de Michaelis (Km), pode ser comparada a afinidade de enzimas por seus respectivos
substrato. Com o aumento da concentrao de substrato, a velocidade inicial aumenta cada vez
menos at chegar a velocidade mxima, onde os valores do eixo y parecem ser constantes. Neste
estgio, a maioria das enzimas est na sua forma complexada com o substrato, atingindo sua
saturao.
Existem algumas molculas que no so substratos para a enzima, mas que so capazes
de se ligar a esta de forma que alteram sua atividade cataltica, modificando seu Km ou Vmx.
No caso do experimento realizado com presena do inibidor, tambm foi realizado uma curva de
Michaelis-Mentel. Pela anlise comparativa entre as duas curvas (sem e com inibidor) percebese que os valores de Km so diferentes, sendo o Km da curva com inibidor maior do que o Km
da curva sem inibidor, indicando que houve uma diminuio da afinidade da enzima pelo
substrato na presena de inibidor. Percebe-se tambm que com o aumento de concentrao do
substrato na curva com inibidor, sua velocidade mxima se encontra com a velocidade mxima
da curva sem inibidor. Tais caractersticas indicam que esse inibidor do tipo competitivo
reversvel. Tal molcula anloga ao substrato da enzima e se liga no stio ativo desta. Estes
dados so melhor visualizados quando estas curvas so convertidos para o grfico de
Lineweaver-Menten.
Para obteno do grfico de Lineweaver-Mentel, os dados das curvas de MichelisMentel foram invertidos. Com as equaes das retas obtidas, percebe-se que os valores de R 2
no so 1, logo as retas (sem inibidor e com inibidor)no obtiveram o mesmo valor de
interseo do eixo y, mas valores prximos para essa ocorrncia..Essas retas encontram-se no
eixo x em pontos diferentes. Esses valores que interceptam o eixo y correspondem ao inverso da
Vmx, enquanto os valores que interceptam o eixo x correspondem ao inverso do valor de Km.
Tais dados sustentam que o inibidor seja do tipo competitivo reversvel, j que este grfico
caracterstico deste tipo de inibidor.

7.Bibliografia

Nelson, D.L.; COX, M.M; Princpido de bioqumica de Lehninger. 5 edio. Editora

Sarvier,Artmed. So Paulo. 2010