UNIVERSIDAD CATLICA DE SANTA MARA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACUTICAS, BIOQUMICAS Y

BIOTECNOLGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERA BIOTECNOLGICA
ASIGNATURA: BIOTECNOLOGA MDICA

EXTRACCIN DE ACIDOS NUCLEICOS

Ing. Cinthia Crdova Barrios

cinthia.biotech@yahoo.es

EXTRACCIN DE CIDO NUCLEICOS

OBJETIVO

Explicar el fundamento, mtodo y aplicaciones de la extraccin, resolucin y

deteccin de cidos nucleicos en el diagnstico molecular, adquiriendo destrezas y
habilidades en el desarrollo de ensayos, valorando su importancia en el desarrollo de
metodologas en un Laboratorio de Diagnstico gentico molecular.

EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS

1. Introduccin.

2. Extraccin de DNA.

3. Extraccin de RNA.

4. Resolucin y deteccin de cidos nucleicos.

5. Bibliografa.

INTRODUCCIN:

Protenas, lpidos,
carbohidratos y cido
nucleico

Target
cido nucleico

EXTRACCIN DE DNA

EXTRACCIN DE DNA:
Extraccin de DNA
Antecedentes.
Tipo de muestra.

Obtencin y Preparacin de la muestra.

Mtodos de extraccin convencionales:
orgnico e inorgnico.
Mtodos de extraccin no
convencionales: en fase slida.
Aislamiento de DNA mitocondrial

ANTECEDENTES:

Friedrich Miescher (1869)

ANTECEDENTES:

ANTECEDENTES:

Watson y Crick (1953)

ANTECEDENTES:

Meselson y Stahl (1958)

INTRODUCCIN:

Meselson y Stahl (1958)

ANTECEDENTES:

Diferencias en las propiedades de

desnaturalizacin y renaturalizacin del
DNA plasmdico y DNA cromosmico

INTRODUCIN:

Postanaltica
Analtica
Preanaltica

TIPO DE MUESTRAS:

TIPO DE MUESTRAS:

Convencionales

Microorganismos.
Saliva.
Tejidos.
Sangre.

TIPO DE MUESTRAS:

No
convencionales

Pelo
Uas.
Dientes.
Semen.
Saliva.

Restos
seos.

Restos
placentarios
y fetales

TIPO DE MUESTRAS:
SANGRE

Es la muestra mas comn.

Solo los glbulos blancos contienen ADN.
La cantidad estimada de ADN en sangre completa es de 30 60 g/mL.
Se obtiene por puncin venosa o dactilar.
Puede encontrarse como manchas secas (soporte absorbentes y no
absorbentes) y hmedas.

TIPO DE MUESTRAS:
TEJIDOS

Cualquier tejido que tenga clulas nucleadas.

Las clulas de descamacin se originan por rozamiento de distintas
partes del cuerpo con prendas y objetos.

TIPO DE MUESTRAS:
MICROORGANISMOS

A partir de cultivos microbiolgicos de muestras obtenidas por biopsias

tisulares o fluidos corporales.

TIPO DE MUESTRAS:
SALIVA

Es una dilucin acuosa que carece por si misma de ADN, pero se

encuentra en el interior de la mucosa bucal.
La secrecin salivar de un ser humano varia entre 1 a 1.5 L diarios.
Las muestras de saliva suelen contener en suspensin clulas de
descamacin del interior del epitelio bucal.
Se obtiene por frotacin con hisopos estriles o partir de soportes.

TIPO DE MUESTRAS:
SEMEN

Se presenta con una frecuencia notable sobre todo en los delitos contra
la libertad sexual .
El semen es una suspensin de espermatozoides en el plasma seminal.
El eyaculado normal de un varn es entre 2 a 6 mL y contiene 100
millones de clulas/mL.
La cantidad estimada de ADN en semen es de 480 g/mL.

TIPO DE MUESTRAS:
DIENTES

Es una muestra de inters extraordinario.

Se compone del esmalte, la dentina, la cmara pulpar y el cemento.
La mayor cantidad de clulas nucleadas se encuentran en la zona mas
interna de los dientes, las clulas del revestimiento interior de la cmara
pulpar.
Son de inters la piezas dentales sanas, preferiblemente molares.

TIPO DE MUESTRAS:
RESTOS OSEOS

El tejido seo esta compuesto por sustancia intercelular y clulas seas.

Tanto osteocitos como osteoblastos son clulas nucleadas y su nmero
oscila entre 20000 y 26000 por mm3 en el hueso.
Son de inters los huesos con abundante medula sea como un fmur,
una tibia, un humero, un esternn o una costilla.

TIPO DE MUESTRAS:
UAS

Estn constituidas por clulas muertas que contienen queratina.

El crecimiento de las uas se debe a la divisin de clulas en la base y en
la cara interna del cuerpo de la ua. Estas clulas emigran hacia el
exterior al tiempo que experimentan queratinizacin.
Las uas no contienen DNA en si mismas, pero pueden arrastrar clulas
de descamacin.

TIPO DE MUESTRAS:
PELO

Es una formacin queratinizante derivada de la epidermis. Esta formado

por un extremo libre (tallo piloso) y por una raz que termina en un
ensanchamiento (bulbo piloso) implantado en un hueco (folculo).
La parte mas alejada del cuero cabelludo esta formada por clulas sin
ncleo. La zona del bulbo presenta clulas nucleadas activas.
Se debe obtener 10 cabellos arrancados con raz de tres zonas.

TIPO DE MUESTRAS:
RESTOS PLACENTARIOS Y FETALES

Pruebas de diagnostico y en abortos ilegales.

Recoleccin de vellosidades coriales, liquido amnitico y restos
abortivos, segn el caso.

OBTENCION Y PREPARACIN DE LA
MUESTRA:
SANGRE Y ASPIRADOS DE MDULA SEA
WBC (MN)

En solucin isotnica
y Ficoll Hypaque.

Centrifugacin en
gradiente de
densidad:

Fragilidad osmtica
diferencial
Incubacin con
solucin hipotnica y
posterior
centrifugacin.

OBTENCION Y PREPARACIN DE LA
MUESTRA:
TEJIDO
Clulas

Fijados
Es congelado en
Nitrgeno lquido y
posteriormente
homogenizado.

Fresco

Debe ser
desparafinado
rehidratado y
digestin con
proteinasa K.

OBTENCION Y PREPARACIN DE LA
MUESTRA:

OBTENCION Y PREPARACIN DE LA
MUESTRA:

MTODOS DE EXTRACCION:

OBJETIVO: Aislar la molcula en su forma nativa y con sus mnimas

condiciones, obtener:
Una minina cantidad de DNA.
Integridad de las molculas de DNA.
DNA de calidad.

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO ORGANICO

Lisis celular

Precipitacin

2
Fenolizacin

4
Lavado y
resuspensin

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO ORGANICO
LISIS

PROCEDIMIENTO:
Lavados con tampn de lisis.
Incubacin a 56 C entre 4 y 24 h.
Centrifugaciones que favorecen la ruptura
celular.
El resultado de la lisis es que el contenido
celular esta distribuido en la solucin.

COMPOSICION DEL TAMPN DE LISIS

Tris HCl pH 8 - 9: pH no optimo para las
enzimas degradativas.
EDTA: quela Mg 2+, que es un cofactor de las
DNAsas.
SDS: Detergente aninico que solubiliza las
membranas celulares lipoproteicas y
desnaturaliza las protenas del DNA.
NaCl: Estabiliza el DNA como doble hlice y
favorece la solubilidad y la accin del
detergente.
Proteinasa K: Digiere las proteinas.

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
MICROORGANISMOS
LISIS

Lisozima o
zimoliasa

Mtodos
enzimticos

Mtodos
mecnicos

Agitacin vigorosa
con perlas de
vidrio

SDS, CTAB, Triton

X-100, en
presencia de
EDTA y Tris-Base.

Mtodos qumicos

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO ORGANICO
FENOLIZACIN

PROCEDIMIENTO:
Adicin de fenol/cloroformo/alcohol
isoamlico.
Adicin de sales y disminucin en el
pH

COMPOSICION DE LA MEZCLA
Fenol: Desnaturaliza y disuelve las
protenas desnaturalizadas.
Cloroformo: Desnaturaliza protenas.
Alcohol isoamlico: Separa las
protenas del DNA.
Las sales interrumpen los puentes de
hidrogeno entre el agua y las
molculas del DNA.

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO ORGANICO
PRECIPITACIN

PRECIPITACIN:
El DNA es precipitado con etanol e
isopropanol.
Para la recuperacin de mnimas cantidades
se aade molculas carriers.
En la presencia de cationes, el etanol induce
a un cambio estructural en las molculas del
DNA que causa que se agreguen y
precipiten.
El pellet del DNA es depositado en el fondo
por centrifugacin y el sobrenadante
eliminado.

LAVADO Y RESUSPENSIN:
Lavado con una solucin de etanol al 70
80% para eliminar sales y otras impurezas
solubles en agua.
Resuspensin: El DNA es resuspendido en
buffer o agua segn las condiciones de
almacenamiento.

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO ORGANICO

MTODOS DE EXTRACCION
CONVENCIONALES:
METODO INORGANICO

MTODOS DE EXTRACCION NO
CONVENCIONALES:
FASE SOLIDA: SILICA
VENTAJAS: Mtodo rpido, de una sola reaccin, efectivo

Extraccin
Utiliza matrices solidas
basadas en silica en forma
de perlas o conformando
columnas (spin columns)

Matriz de silica

Lisis celular.
Precipitacin por salting
out.
Adsorcin del DNA
(adicin de carriers)
Lavado.
Elucin.

MTODOS DE EXTRACCION NO
CONVENCIONALES:
FASE SOLIDA: SILICA

MTODOS DE EXTRACCION NO
CONVENCIONALES:
FASE SOLIDA: SILICA

Acondicionamiento

Enjuague

Adsorcin

Elucin

MTODOS DE EXTRACCION NO
CONVENCIONALES:
FASE SOLIDA: CHELEX
VENTAJAS: Mtodo rpido, de una sola reaccin, de costo efectivo y que no
requiere de compuestos txicos.
Extraccin
Conformado por
copolmeros de estireno
divinilbenceno con iones de
iminodiacetato.
Preparar una solucin al 5 %
en agua estril desionizada.
Mezclar en un hotplate y
ajustar el pH a 9
Preparacin de CHELEX

Pretratamiento a la muestra.
Adicin de la suspensin
Incubacin a 56 C: Lisis
celular..
Ebullicin a 100 C: ssDNA
Centrifugacin/recuperacin
del sobrenadante.

MTODOS DE EXTRACCION NO
CONVENCIONALES:
FASE SOLIDA: FTA
VENTAJAS: Mtodo rpido y de una sola reaccin.

Es una matriz qumicamente

tratada, destinada a la recoleccin,
transporte y extraccin de DNA.
Las muestras pueden almacenarse
a temperatura ambiente en forma
indefinida.
Pasa directamente a la PCR.

Tarjetas FTA

Extraccin
Depositar la muestra,
El DNA es inmovilizado y
estabilizado en la matriz.

METODOS DE EXTRACCIN:
COMPARACIN

METODOS DE EXTRACCION:
METODOS AUTOMATIZADOS

EXTRACCION DE DNA MITOCONDRIAL:

Centrifugacin a alta
velocidad.
Lisis.
Precipitacin alcohlica.
Adicin de mercaptoetanol.
Extraccin de
mitocondrias

Extraer el DNA
genmico
Extraccin por
hibridacin o PCR.

EXTRACCIN DE RNA

EXTRACCIN DE DNA:
Extraccin de RNA
Introduccin.
Tipo de muestras.

Obtencin y Preparacin de la muestra.

Mtodo de extraccin convencional:
orgnico.
Mtodo de extraccin no convencional:
en fase slida.
Aislamiento de mRNA.

INTRODUCCIN:

Northern
blot

Microarrays

RT-PCR

RNAseq

INTRODUCCIN:
Tipos de RNA
(Procariotas y
eucariotas)

rRNA
(80 90%)

mRNA
(2.5 5 %)

tRNA
(10 15 %)

INTRODUCCIN:

Asignar en el
laboratorio un
rea RNF

Utilizar materiales
descartables

PRECAUCIONES
ESTRICTAS PARA
TRABAJAR CON
RNA

TIPO DE MUESTRAS:

PREPARACIN DE LA MUESTRA:
INACTIVACIN DE RNAsas
LISIS: N liquido

Mtodo biolgicos
DEPC.
VNDR.
GITC.

Mtodos qumicos

Ribonucleasa.
Anticuerpos
monoclonales.

MTODO DE EXTRACCIN
CONVENCIONAL:
METODO ORGANICO

MTODO DE EXTRACCIN NO
CONVENCIONAL:
FASE SOLIDA: SILICA

AISLAMIENTO DE POLI A mRNA:

Referencias Bibliogrficas:

BUCKINGHAM, L.Molecular Diagnostics. Fundamentals,

Methods and Clinical Applications. Second Edition. F.A. Davis
Company. United States of America. 2012.

Referencias Bibliogrficas:

COLEMAN, W. and TSONGALIS, G.Molecular Diagnostics.

Fort he Clinical Laboratorian. Second Edicin. Humana Press. United
States of America. 2010.