Você está na página 1de 62

MINISTRIO DA SADE

Imuno-Hematologia
L A B O R AT O R I A L
Braslia DF
2014

MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Ateno Sade
Departamento de Ateno Hospitalar e de Urgncia

ImunoHematologia

l a b o r a t o r i a l

Braslia DF
2014

2014 Ministrios da Sade.


Esta obra disponibilizada nos termos da Licena Creative Commons Atribuio No Comercial Compartilhamento
pela mesma licena 4.0 Internacional. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte.
A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade:
<www.saude.gov.br/bvs>.
Tiragem: 1 edio 2014 2.500 exemplares
Elaborao, distribuio e informaes:
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Ateno Sade
Departamento de Ateno Hospitalar e de Urgncia
CoordenaoGeral de Sangue e Hemoderivados
SAF Sul, trecho 2, Ed. Premium, torre II, ala B, 2 andar, sala 202
CEP: 70070600 Braslia/DF
Tel.: (61) 33156169
Site: www.saude.gov.br/sangue
Email: sangue@saude.gov.br
Coordenao:
Maria de Fatima Pombo Montoril CGSH/DAHU/SAS/MS
Helder Teixeira Melo CGSH/DAHU/SAS/MS
Priscila Murador CGSH/DAHU/SAS/MS

Elaborao e Reviso Tcnica do Texto Final:


ngela Melgao Ferreira
Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro
Priscila Murador
Rodolfo Joo Ramos
Shirley Lopes de Castilho
Colaborao:
Frieda Reffert de Arajo
Maria do Socorro Ferreira Ferreira
Srgio Roberto Lopes Albuquerque
Thaiane Cristine Evaristo
Normalizao:
Delano de Aquino Silva Editora MS/CGDI
Capa, projeto grfico e diagramao:
Fabiano Bastos

Impresso no Brasil / Printed in Brazil


Ficha Catalogrfica
Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Ateno Sade. Departamento de Ateno Hospitalar e de Urgncia.
Imunohematologia laboratorial / Ministrio da Sade, Secretaria de Ateno Sade, Departamento de Ateno Hospitalar
e de Urgncia. Braslia : Ministrio da Sade, 2014.
60 p. : il.
ISBN 978-85-334-2160-8
1. Servios de hemoterapia. 2. Coleta de sangue. 3. Transfuso de Sangue. I. Ttulo.
CDU 616.36
Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2014/0086
Ttulos para indexao:
Em ingls: Laboratory Immunohematology
Em espanhol: Inmunohematologa laboratorial

Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Noes Bsicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Controle de Qualidade Interno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Equipamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tcnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Equipe Tcnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Principais reagentes imunohematolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Metodologias mais utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fatores que influenciam na qualidade dos ensaios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Utilizao de plasma ou soro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Separao e preparo de amostras de sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Preparo das suspenses de hemcias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Leitura das reaes de aglutinao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade das reaes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Qualidade dos reagentes imunohematolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Controle de Qualidade dos Antissoros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anlise dos reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Determinao da reatividade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Reagentes Eritrocitrios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hemcias para classificao reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hemcias para triagem de anticorpos antieritrocitros irregulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anlise dos resultados do controle de qualidade de reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Controle de qualidade externo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11
11
11
12
12
12
12
13
13
14
14
15
15
16
16
17
18
20
20
23
23
23
23
23

Captulo 2 Sistema ABO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


Histrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antgenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Subgrupos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anticorpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipagem em tubo prova direta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipagem em tubo prova reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Causas de discrepncias na classificao ABO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Problemas na prova direta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25
25
25
26
26
28
29
30
31
31

Captulo 3 Sistema Rh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antgenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Os antgenos D fraco e D parcial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antgenos D fraco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antgenos D parciais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anticorpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Consideraes sobre a classificao RhD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Interpretao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

33
33
36
36
36
37
38
41

Captulo 4 Teste de Antiglobulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Teste da antiglobulina direto (TAD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Teste da antiglobulina direto e complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Indicaes do teste da antiglobulina direto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anemias hemolticas autoimunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anemias hemolticas induzidas por drogas (medicamentos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Anemias hemolticas aloimunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Teste da antiglobulina indireto (TAI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

45
45
45
46
48
49
49
50
51

Consideraes finais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

Apresentao
A CoordenaoGeral de Sangue e Hemoderivados CGSH, do Ministrio da Sade, comprometida com
a misso de elaborar polticas que promovam o acesso da populao ateno hematolgica e hemo
terpica de forma segura e com qualidade, desenvolve suas aes em consonncia com os princpios e
as diretrizes do Sistema nico de Sade SUS.
Uma das principais aes nesse sentido a disponibilizao do Programa de Avaliao Externa da
Qualidade emImunohematologia AEQIH para os servios da Hemorrede Nacional. Desde 2010,
o AEQIH disponibilizado pelo Ministrio da Sade aos laboratrios pblicos que fazem triagem de
doadores de sangue e testes prtransfusionais nos servios de hemoterapia de todo o pas.
O AEQIH conta com a cooperao de comisso de assessoramento tcnico em imunohematologia
CATIH, composto por especialistas das instituies de referncia da Hemorrede Nacional. O CATIH
produz, distribui as avaliaes prticas e tericas e analisa os resultados obtidos pelos servios de he
moterapia.
Nas ltimas anlises dos indicadores de desempenho do programa, foi demonstrada a necessidade de
apoio tcnico aos servios.
Assim, para realizar essa ao a CGSH publica a Cartilha: Imunohematologia laboratorial para tipagens
ABO, RhD, Teste da Antiglobulina Direta (TAD) e Pesquisa de Anticorpos Antieritrocitrios Irregulares
(PAI). Esperamos que este instrumento possa servir como orientao aos Servios de Hemoterapia de
todo o pas, auxiliando os profissionais que atuam no laboratrio a realizar os testes de imunohematolo
gia com maior padronizao das tcnicas, por meio da descrio de diretrizes bsicas para a investigao
laboratorial adequada.
CoordenaoGeral de Sangue e Hemoderivados
DAHU/SAS/Ministrio da Sade

Introduo
A Cartilha Imunohematologia Laboratorial tem como objetivo principal abordar o controle de quali
dade em imunohematologia, alm dos testes laboratoriais essenciais em imunohematologia: tipagem
ABO, RhD, Teste da Antiglobulina Direta (TAD) e Pesquisa de Anticorpos Antieritrocitrios Irregulares
(PAI). As indicaes aqui apresentadas visam correta realizao dos testes imunohematolgicos em
auxlio para uma transfuso segura, contando com a participao de profissionais atuantes em labora
trio, que reuniram informaes relevantes e atualizadas sobre as tcnicas e mtodos empregados em
laboratrio de imunohematologia. Sero abordados vrios temas relacionados prtica laboratorial,
como: mtodos, reagentes, equipamentos, manuseio de amostras, anlise de qualidade e validao.
Esta cartilha no deve ser utilizada como fonte de referncia nica sobre o tema, ficando a cargo dos
profissionais atuantes na rea a complementao das informaes e a atualizao contnua com relao
teoria e prtica dos testes imunohematolgicos.

Captulo 1 Controle de Qualidade


em Imunohematologia

Noes Bsicas
Implantar os procedimentos de controle de qualidade em imunohematologia conforme legisla
es vigentes e normatizaes estabelecidas pelos servios de hemoterapia.
Estabelecer programas de controle de qualidade interno (equipamentos, tcnicas, equipe profis
sional e reagentes) e participar de programas de controle de qualidade externo obrigatoriamente.
Estabelecer registros dos procedimentos e condutas executados nos servios por meio de manu
ais, procedimentos operacionais padro, formulrios e outros documentos.
Gerenciar as atividades de maneira a identificar e investigar inadequaes e adotar medidas pre
ventivas, corretivas e de melhoria.

Controle de Qualidade Interno


Monitora a estabilidade dos processos e procedimentos aumentando a confiana nos resultados e tem
vrias funes, como:
Controlar o desempenho dos materiais, equipamentos e mtodos analticos;
Identificar mudanas na estabilidade dos processos;
Criar sinais de alerta para prevenir a liberao de resultados no conformes e identificar a neces
sidade de aes corretivas;
Identificar necessidades de melhorias nos processos.

11

MINISTRIO DA SADE

Equipamentos
Adquirir equipamentos que atendam as necessidades do laboratrio;
Manter o equipamento calibrado e os manuais acessveis aos usurios;
Manter protocolos com registro de manuteno preventiva e corretiva;
Obedecer s instrues do fabricante em relao ao manuseio e frequncia da manuteno pre
ventiva;
Contratar profissionais especializados para realizao da manuteno preventiva e corretiva;
Gerenciar as informaes fornecidas pelos registros relacionados aos equipamentos.

Tcnicas
Obedecer s instrues do fabricante (bula) em relao aos procedimentos tcnicos;
Utilizar amostras controle positivas e negativas durante a realizao dos testes;
Utilizar hemcias sensibilizadas com anticorpos da classe IgG para validao dos testes antiglo
bulnicos realizados na metodologia tubo;
Utilizar obrigatoriamente o Controle de Rh e o soro antiD do mesmo fabricante para realizao
da fenotipagem RhD;
Gerenciar as informaes fornecidas pelos registros relacionados s tcnicas.

Equipe Tcnica
Estabelecer programa de orientao inicial;
Realizar treinamento e educao continuada;
Toda a equipe de trabalho deve trabalhar de forma padronizada e de acordo com os procedi
mentos tcnicos e condutas documentadas estabelecidos pelas legislaes vigentes e normas
internas dos servios.

Reagentes
Implantar programa de qualificao de fornecedores e reagentes e verificar seu desempenho continua
mente por meio dos registros estabelecidos.
Obedecer s instrues do fabricante em relao aos procedimentos tcnicos, armazenamento, inspeo
visual.

12

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

Principais reagentes imunohematolgicos


Antissoros: Reagentes utilizados para identificar antgenos eritrocitrios: classificao sangunea e feno
tipagem eritrocitria.
Lectinas: Reagentes utilizados para identificar antgenos eritrocitrios: classificao sangunea e fenoti
pagem eritrocitria. Ex: Lectina antiA1 origem Dolichos bifflorus ou Helix pomatia.
Reagentes eritrocitrios: Reagentes utilizados nas provas reversas da fenotipagem ABO e para deteco
e identificao de anticorpos antieritrocitrios irregulares.
Potencializadores: so substncias adicionadas ao teste com objetivo de facilitar a interao entre o
antgeno e o anticorpo e aproximar as hemcias, favorecendo dessa forma a aglutinao e encurtando
o tempo de reao.
Os mais utilizados na rotina imunohematolgica so:
Enzimas proteolticas papana, bromelina, ficina e tripsina;
Meio de baixa fora inica soluo de LISS;
Substncia macromolecular albumina bovina 22%;
Polmero linear solvel em gua polietilenoglicol (PEG) 10% e 20%.

Reagente antiglobulina humana (AGH): A AGH um heteroanticorpo que reconhece protenas hu


manas. um artifcio imunolgico para se visualizar o fenmeno da aglutinao. A frao Fab das imu
noglobulinas se liga frao Fc e/ou s protenas do sistema complemento.

Metodologias mais utilizadas


Tcnica em tubo
So utilizados tubos de vidro ou plstico medindo 10 mm ou 12 mm x 75 mm, onde so dispensados
reagentes e amostras. Aps centrifugao procedese a anlise da aglutinao.

13

MINISTRIO DA SADE

Microplacas
O mtodo consiste na utilizao de microplacas de acrlico com fundo em U ou fundo em V. Existem
tambm microplacas com membrana imunoativa fixada na superfcie dos poos. Tratase de micro
tcnica em que as hemcias podem ser suspensas em solues enzimticas.
Gel Teste
Microtcnica em que se utilizam cartes contendo micro tubos com Gel Sephadex 6100 ou
Poliacrilamida. As reaes so estveis e podem ser revistas at 48 horas aps a realizao dos testes.
Ocorrendo reao antgenoanticorpo, os aglutinados formados so retidos na coluna do gel quando
submetidos os cartes a baixa centrifugao, determinando o padro de positividade do teste. As he
mcias livres iro se depositar no fundo do micro tubo.

Fatores que influenciam na qualidade dos ensaios


Coleta do sangue em tubo apropriado.
Qualidade da coleta.
Uso de vidrarias limpas e sem resduos de detergente (que podem causar resultados falsoposi
tivos).
Tcnica de separao do soro adequada.
Preparo correto das suspenses de hemcias (concentrao muito abaixo ou acima da estabele
cida pelos fabricantes podem causar resultados falso negativos).
Qualidade dos reagentes empregados.
Padronizao dos ensaios tcnicos.
Qualidade dos equipamentos empregados.
Pessoal tcnico capacitado

Utilizao de plasma ou soro


Existe uma discusso a respeito da utilizao de soro ou plasma na realizao dos testes imunohema
tolgicos.

14

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

A pesquisa de anticorpos antieritrocitrios irregulares (PAI) realizada rotineiramente com reagente


antiglobulina humana poliespecfico (antiIgG + anticomplemento) com amostras de soro. Quando
se utiliza o plasma, amostra coletada com EDTA (anticoagulante quelante de ons Clcio), no ocorre
a fixao do complemento in vitro. Nesse caso, a utilizao da AGH monoespecfica (antiIgG) est
mais indicada.
Inmeros estudos foram realizados para definir a importncia da utilizao de reagente anticomple
mento para evidenciar anticorpos:
Roubinet et al. (1999) estudaram 3.264 amostras coletadas em paralelo com tubo seco e com
anticoagulante e no encontraram diferena na identificao de 240 amostras positivas;
Yales (1998) demonstrou que anticorpos IgG antiKidd so incapazes de fixar complemento.
Apenas anticorpos com capacidade de determinar aglutinao direta podem fixar complemento;
Garatty (1984) estimou que a frequncia de anticorpos detectveis pela presena do comple
mento aderido membrana da hemcia estimada em 1 para 8.000 soros testados.

A maioria dos autores aceita a utilizao de amostra anticoagulada, pois evita a coleta de sangue excessi
va, alm de possibilitar a realizao dos testes de classificao ABO, RhD, fenotipagem eritrocitria, teste
de Coombs direto e tcnicas de eluio do anticorpo.

Separao e preparo de amostras de sangue


Na separao do plasma/soro e hemcias de amostras de sangue total devem ser observados o tempo
e velocidade ideal para a centrifugao, e os equipamentos devem ser calibrados periodicamente.

Preparo das suspenses de hemcias


No preparo das suspenses de hemcias devemos observar em que concentrao as hemcias devem
ser preparadas para o ensaio a ser realizado.
Suspenso de hemcias a 2%

0,1 mL de concentrado de hemcias + 4,9 mL de salina


1 gota de concentrado de hemcias + 49 gotas de salina

15

MINISTRIO DA SADE

Suspenso de hemcias a 5%

0,1 mL de concentrado de hemcias + 1,9 mL de salina


1 gota de concentrado de hemcias + 19 gotas de salina

Suspenso de hemcias a 10%

0,1 mL de concentrado de hemcias + 0,9 mL de salina


1 gota de concentrado de hemcias + 9 gotas de salina

Suspenso de hemcias a 50%

0,4 mL de concentrado de hemcias + 0,4 mL de salina


4 gotas de concentrado de hemcias + 4 gotas de salina

Leitura das reaes de aglutinao


A velocidade e tempo de centrifugao podem variar conforme as orientaes do fabricante e as mar
cas das centrfugas utilizadas. Determinar a velocidade da centrifugao a partir da fora g. Os testes
imunohematolgicos devem ser centrifugados entre 900g e 1.000g e a transformao em rpm ir
variar conforme o raio da centrfuga utilizada. O manual da AABB descreve os procedimentos de ca
librao para definio do melhor tempo e velocidade de centrifugao (rpm) referentes aos testes
imunohematolgicos.

Intensidade das reaes


A padronizao da leitura das reaes extremamente importante. No quadro 1, descrito o padro
utilizado na maioria dos laboratrios de imunohematologia.

16

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

quadro 1 Intensidade das reaes


Graduao
4+
3+
2+
1+
(+) Fraco
0 Negativo
CM (Campo Misto)
He

Descrio
Boto slido com pequenos grumos e fundo claro
Grumos grandes e numerosos com fundo claro
Grumos pequenos e numerosos com fundo rseo
Grumos pequenos e fundo bastante rseo
Presena de minsculas aglutinaes em fundo bastante rseo
Ausncia de aglutinao, fundo bastante rseo com hemcias em suspenso
Presena de aglutinaes e de hemcias em suspenso, com fundo rseo
Hemlise total ou parcial das hemcias. indicador de positividade

Fonte: autoria prpria.

Qualidade dos reagentes imunohematolgicos


Todos os reagentes devem ser inspecionados quanto ao aspecto visual a cada lote e diariamente.
Avaliao do rtulo

Deve ser avaliado a cada lote.


Devem estar contidas no rtulo informaes que permitam uma rpida identificao do reagente,
do lote e seu prazo de validade. Deve conter:
Nome do produto;
Nome do fabricante;
Nmero da licena no pas de origem;
Data de validade/expirao;
Nmero de lote e designao de sublote;
Volume do produto;
Temperatura de armazenagem;
Fonte do produto caso no seja de origem humana; e
Tcnica para a qual ele recomendado: salino, lmina, tubo, etc.

17

MINISTRIO DA SADE

Avaliao da bula
Deve ser avaliada a cada lote e utilizada pelo laboratrio rotineiramente para obedincia s ins
trues do fabricante.
Devem estar contidas na bula as seguintes informaes em lngua portuguesa:
Nome do produto;
Composio;
Instrues de uso, interpretao de resultados e limitao do teste;
Nome do fabricante, endereo e nmero da licena;
Conservante utilizado;
A bula deve indicar que o produto foi testado sorologicamente para os principais patgenos
transmitidos pelo sangue e que apresentou resultados negativos; e
Cuidados na manipulao.

Avaliao do frasco

Deve ser avaliado a cada lote:


A embalagem deve ser de vidro transparente e neutro;
O contagotas deve tambm ser transparente, e uma gota dever equivaler a 50L; e
O rtulo no deve recobrir totalmente o frasco a fim de permitir a inspeo visual de seu
contedo.

Avaliao da aparncia

Deve ser avaliada a cada lote e diariamente antes de utilizarse o reagente na rotina:
Ausncia de precipitados, gelatina, partculas, fungos e turvao; e
Ausncia de hemlise.

Controle de Qualidade dos Antissoros


A seguir esto descritas as especificaes tcnicas para qualificao de alguns reagentes imunohema
tolgicos utilizados nas tcnicas em tubos:

18

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

Soro antiA (monoclonal ou policlonal)


O soro antiA deve reconhecer somente o antgeno A na membrana eritrocitria, ter colorao azul,
reatividade (intensidade de reao) com hemcias A1 de pelo menos 3+, avidez de at 15 segundos,
ttulo 256 e escore 72.
Soro antiB (monoclonal ou policlonal)
O soro antiB deve reconhecer somente o antgeno B na membrana eritrocitria, ter colorao amarela,
reatividade com hemcias B de pelo menos 3+, avidez de at 15 segundos, ttulo 256 e escore 72.
Soro antiAB (monoclonal ou policlonal)
O soro AntiAB deve reconhecer somente os antgenos A e B na membrana eritrocitria, ser incolor,
ter reatividade com hemcias A1, B ou A1B de pelo menos 3+, avidez de at 15 segundos, ttulo 256 e
escore 72.
Obs: no caso de serem usados antissoros monoclonais, a utilizao do soro anti-AB no obrigatria.
Soro antiRhD (monoclonal ou policlonal)
O soro antiRhD deve reconhecer somente o antgeno D na membrana eritrocitria, apresentar reativi
dade de pelo menos 3 + com hemcias de grupo O RhD positivas (R1r, R2r, R0r), ttulo 32 e avidez de at
30 segundos. Deve ainda reconhecer hemcia RhD positivo fraca.
Reagente controle de RhD
Controle de RhD constitudo apenas do meio diluente do soro antiRhD correspondente. Deve ser
lmpido e no reagir com hemcias RhD positivas nem negativas, alm de ser da mesma marca do soro
antiRhD.
Reagente antiglobulina humana poliespecfico ou monoespecfico
O reagente deve determinar reaes positivas de pelo menos (2+) quando testado com hemcias sen
sibilizadas por anticorpo tipo IgG antiD (Monoespecfico) e por IgG e/ou fraes do complemento
(Poliespecfico). Podese utilizar tambm amostras com pesquisa de anticorpos antieritrocitrios irre
gulares positiva cujo anticorpo seja da classe IgG.

19

MINISTRIO DA SADE

Reagente controle do soro antiglobulina humana


Suspenso de hemcias humanas de 3% a 5% do grupo O, sensibilizadas por anticorpos IgG, para
validar resultados negativos em testes antiglobulnicos. Deve apresentar reao de aglutinao quando
adicionado aos testes antiglobulnicos negativos.
Albumina bovina 22%
A albumina uma protena que atua aumentando a constante dieltrica do meio, diminui o potencial
Zeta, facilitando a aglutinao. Deve ter aspecto lmpido e no determinar aglutinao quando testada
frente a hemcias no sensibilizadas.

Anlise dos reagentes


Soro AntiA, AntiB, AntiAB, AntiD
Estes devem ser inspecionados quanto especificidade e reatividade (intensidade de aglutinao, avidez,
ttulo e escore) a cada lote, transporte ou estoque inadequado. Os resultados devem ser registrados em
planilha prpria, para acompanhamento, gesto e qualificao dos reagentes.
Determinao da Especificidade
Caracterstica inerente ao anticorpo que o torna capaz de reconhecer apenas as hemcias portadoras
do antgeno correspondente.
A especificidade estabelecida testandose o reagente com hemcias negativas em relao ao
determinante antignico especfico. Ex: soro antiA e antiB so testados com hemcias O.
utilizada a tcnica convencional de anlise da aglutinao em tubos.

Determinao da reatividade
Avidez
Afinidade do anticorpo pelo antgeno. Define o quanto o anticorpo complementar ao antgeno por
meio da velocidade e intensidade com as quais o antgeno e o anticorpo reagem. feita em lmina e
observase o resultado macroscopicamente.

20

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

Tcnica:
Colocase em uma lmina:
Soros antiA, antiB ou antiAB: colocar uma gota da suspenso a 20% de hemcias lavadas, sele
cionadas segundo o antissoro a ser testado;
No caso de antiRhD, a concentrao da suspenso de hemcias deve ser de 40%;
Ao lado colocar uma gota do antissoro a ser testado;
Misturar formando um halo com cerca de 2,5cm e, ao mesmo tempo, acionar o cronmetro;
Marcar o intervalo entre a mistura e o incio da aglutinao;
Aplicar movimentos de rotao na lmina homogeneizando bem a mistura. No caso de antiRhD
aconselhase utilizar o aglutinoscpio;
O tempo total marcado a partir da homogeneizao da amostra e do reagente at incio da aglu
tinao denominado AVIDEZ;
Ao final de 3 minutos anotar a intensidade da aglutinao em nmero de cruzes (0 a 4 +).

figura 1 Tcnica em lmina


1 gota Hm

1 gota antissoro

2,5 cm

llustrao: ngela Melgao Ferreira

Ttulo
Mtodo utilizado para se determinar a concentrao de anticorpos presentes no soro em anlise. So
realizadas diluies sucessivas, e o ttulo corresponde ltima diluio do soro onde houve aglutinao
de (1+).
Por exemplo: se a ltima aglutinao com graduao de (1+) acontecer na diluio 1/64, o ttulo ser 64.
Tcnica:
Numerar 13 tubos: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048 + tubo 13;
Nos tubos 1 e 2 colocar 2 gotas do soro a titular;

21

MINISTRIO DA SADE

Nos tubos 2 a 13, colocar 2 gotas de soluo salina 0,9%;


Homogeneizar (sem fazer bolhas), transferir duas gotas do tubo 2 para o tubo 3, e deste para o 4,
e assim sucessivamente at o tubo 13. Este ltimo tubo dever ser reservado para se prosseguir
com as diluies caso haja aglutinao de (1+) no tubo 12;
Acrescentar duas gotas de suspenso de hemcias fenotipadas 3%5% at o tubo 12;
Quando os antissoros a serem titulados apresentarem reatividade temperatura ambiente (TA),
centrifugar e ler, anotando na planilha o resultado final;
Antissoros com reatividade na fase de antiglobulina humana, aps realizar o item 5, incubar a rea
o a 37 C conforme instrues do fabricante, lavar as hemcias com soluo salina 0,9% (mnimo
3 vezes) e acrescentar o soro antiglobulina humana. Posteriormente realizar a centrifugao, leitura
e anotao na planilha de controle de qualidade.

figura 2 Titulao de soro


100L

1
1

1
2

1
4

100L

1
8

100L

1
16

100L

1
32

1
64

100L

1
128

100L

1
256

100 L de salina 0,9% para diluir o soro

Soro a ser titulado (100L)


Suspenso de hemcias a 3% (100L) A ser colocada aps a diluio seriada

llustrao: ngela Melgao Ferreira

22

100L

1
512

Captulo 1 Controle de Qualidade em Imunohematologia

Reagentes Eritrocitrios
Hemcias para classificao reversa
Conjunto de reagentes constitudo por suspenses de hemcias A1 e B. Deve apresentar concentrao
de 3% a 5% para as tcnicas em tubo, ser RhD negativo e no apresentar sinais de hemlise. Realizar
testes de especificidade e reatividade.
Especificidade: testar as hemcias A e B com plasmas AB
Reatividade: testar as hemcias A com plasmas B e as hemcias B com plasmas A

Hemcias para triagem de anticorpos antieritrocitros irregulares


Conjunto de reagentes constitudo por no mnimo duas suspenses de hemcias do grupo O, com perfil
fenotpico conhecido em relao aos principais sistemas, na concentrao de 3% a 5% para as tcnicas
em tubo; no devem apresentar sinais de hemlise.
As suspenses de hemcias devem ser preferencialmente R1R1 e R2R2 e apresentar, pelo menos, uma clu
la positiva dos principais antgenos D, C, c, E, e, K, P1, Jka, Jkb, Fya, Fyb, M, N, S, s, Lea, Leb e Dia , se possvel.

Anlise dos resultados do controle de qualidade de reagentes


Verificar a cada lote e transporte as condies de recebimento dos reagentes e proceder anlise
do produto conforme as instrues acima. Todos os ensaios devem ser registrados e julgados
segundo as especificaes estabelecidas pelo servio;
Devese elaborar de forma clara o laudo tcnico da anlise que libera o reagente para uso;
As no conformidades devem ser descritas em formulrio prprio e comunicadas Chefia do
Laboratrio que deve tomar as aes corretivas e preventivas;
Os resultados do Controle de Qualidade devem ser registrados e arquivados por perodo mnimo
de cinco anos ou conforme legislaes vigentes.

Controle de qualidade externo

Segundo a Portaria Ministerial n 2.712/2013, os servios de hemoterapia devem participar de


programas de proficincia.

23

MINISTRIO DA SADE

So programas elaborados por Institutos de referncia para avaliar a adequao dos resultados de
uma anlise e envolve a interao com outras organizaes.
So compostos por painis prticos e tericos.
Permitem aos servios participantes:
Avaliar a qualidade das atividades imunohematolgicas;
Diagnosticar desempenhos inadequados;
Utilizar os resultados como ferramenta de gerncia para promover adequaes e melhorias;
Melhorar o padro de desempenho das equipes.

24

Captulo 2 Sistema ABO

Histrico
O Sistema ABO foi o primeiro sistema de grupos sanguneos, descrito em 1900 por Landsteiner, que
descreveu os antgenos A, B e C (depois renomeado como O). Landsteiner descobriu que, misturando
soro e hemcias de diferentes pessoas, poderiam ser definidos trs grupos e, alguns anos aps, Decastello
descreveu o fentipo AB. Em 1910 Von Dungern e Hirchfeld confirmaram que a herana gentica do A
e B obedeciam as leis de Mendel, com a presena do A e B como dominantes.

Gentica
O genes ABO se localizam no brao longo do cromossoma 9 (posio 9q34.1q34.2).
Foram definidos quatro genes: A1, A2, B, O.
Esses genes codificam a produo de duas enzimas glicosiltransferases A e B.
A transferase A (1,3 N acetilgalactosaminil transferase), que adiciona o acar N acetil galactosamina
e produz o antgeno A; e a transferase B (1,3 galactosil transferase), que adiciona a galactose e produz
o antgeno B num substrato precursor na membrana da hemcia, o antgeno H. O gene O no produz
transferase ativa.
A sequncia de DNA do gene O idntica ao do gene A, exceto pela deleo (G261) na regio
Nterminal, o que codifica uma protena truncada.
O gene alelo A2 difere de A1 pela simples deleo de uma base na regio Cterminal, na posio 467,
sendo o nucleotdeo T em A2 e C em A1; o gene A2 produz uma transferase A2 que tem uma atividade
reduzida, quando comparada com a transferase A1.

25

MINISTRIO DA SADE

A diferena entre genes A e B so sete nucleotdeos no DNA, que resultam em quatro aminocidos
diferentes nas transferases A e B.

Antgenos
Os antgenos do Sistema ABO no so restritos membrana eritrocitria, mas tambm esto presentes
na saliva e outros lquidos biolgicos, exceto fluido espinhal. A presena de substncia ABO especfica
nos lquidos biolgicos ocorre em indivduos que apresentam o gene secretor (Se) 80% das pessoas.
Os antgenos ABO so encontrados ainda na maioria das clulas epiteliais e endoteliais. A presena nos
linfcitos e plaquetas parece ser devido absoro do plasma.
Foram descritos quatro antgenos no sistema ABO: A (001); B (002); AB (003); A1 (004), e esto expres
sos desde a 5 semana de vida intrauterina, embora o recmnascido tenha uma expresso fraca, cerca
de 1/3 dos stios antignicos totais em relao ao adulto (Molisson, 1992). A expresso aumenta com a
idade e mxima em torno dos dois a quatro anos de vida.

Subgrupos
Os antgenos A e B apresentam subgrupos que se caracterizam por diferenas na quantidade e forma
de expresso na membrana das hemcias devido a alteraes genticas (mutaes na estrutura dos
genes) que codificam transferases diferentes das transferases A e B, levando em geral a uma expresso
enfraquecida dos antgenos (A e B) na membrana da hemcia.
Os subgrupos, nos testes imunohematolgicos, apresentam intensidade de reao mais fraca com
reagentes antiA, antiB e antiAB, o que pode levar a discrepncias entre a prova direta e reversa da
classificao ABO.
O uso de lectinas especficas antiA1 (Dolichos biflorus) e antiH (Ulex europeaus) pode auxiliar na de
terminao dos subgrupos. As hemcias A1 apresentam reao positiva com lectina antiA1 e negativa
com lectina antiH. Nos subgrupos de A, a reao com lectina antiA1 apresenta reao negativa e a
antiH, reao positiva.

26

Captulo 2 Sistema ABO

Os subgrupos tambm ocorrem nos indivduos AB. Cerca de 80% dos indivduos A e AB so A1/A1B, 19%
so A2/A2B e 1%, outros subgrupos (A3, Aint, Ael, Am, Ax, Ay, etc.). Os subgrupos de B so raros (B3, Bx, Bm, Bel).
A reao de aglutinao com antissoros A e B s visvel quando mais de 2.000 stios antignicos esto
presentes na membrana das hemcias.
Na medicina transfusional, em geral, no importante distinguir os subgrupos de A e de B. A transfuso
de subgrupos, em geral, no leva a reao transfusional.
Subgrupo A2
o subgrupo mais comum depois do alelo A1. O alelo A2 codifica uma transferase A menos eficaz que
aquela produzida pelo alelo A1. As hemcias dos indivduos A2 possuem somente cerca de 500.000
stios antignicos A na membrana eritrocitria.O alelo A2 uma mutao do alelo A1. A transferase A1
capaz de adicionar a Nacetilgalactosamina ao antgeno H sobre todas as cadeias precursoras tipo I
a IV. A enzima produzida pelo alelo A2, entretanto, menos eficiente quando adicionado o acar em
substncia H a cadeias dos tipos III e IV. Por isso as hemcias A2 so aglutinadas por reagentes antiH, pois
nem todo antgeno H transformado em antgeno A na membrana da hemcia.
Subgrupo A3
O subgrupo A3 o mais comum depois do A2.Existem vrias mutaes genticas do gene A, relaciona
das ao subgrupo A3, que produzem transferases com trs padres diferentes de atividade:
Enzima sem nenhuma atividade transferase A;
Enzima com melhor ao em pH 6 e com 1/3 de atividade da enzima A1;
Enzima com melhor ao em pH 7 e com atividade de transferase A muito baixa.
O resultado, na classificao, a reao em campo misto ou dupla populao, isto , hemcias aglutina
das e no aglutinadas observadas quando utilizamos antissoro monoclonal antiA.

Alguns indivduos A3 apresentam apenas 3%4% dos antgenos A em relao aos indivduos A1. Outros
indivduos apresentam duas populaes diferentes de hemcias: uma com antgeno A e outra total
mente desprovida do antgeno.

27

MINISTRIO DA SADE

Anticorpos
Os anticorpos do Sistema ABO esto ausentes no nascimento e so detectveis aps os quatro meses de
idade. Uma das teorias propostas para seu aparecimento consiste na heteroimunizao (flora bacteriana
intestinal, anatoxinas diftricas ou tetnicas, soroterapia antitetnica, medicamentos de origem animal,
vacina antigripal, infeco por Toxocara canis etc.).
A gravidez ABO incompatvel, assim como a transfuso incompatvel, pode determinar a aloimunizao
eritrocitria e o aparecimento das imunoglobulinas da classe IgG.
Os anticorpos ABO so potentes IgM ou IgG e determinam forte aglutinao direta com hemcias A ou
B. So capazes ainda de ativar a cascata de complemento at C9, portanto, levando a hemlise aguda
intravascular. So extremamente importantes do ponto de vista transfusional, estando relacionados
reao transfusional grave. Esto tambm envolvidos em casos de Doena Hemoltica Perinatal, porm,
em geral, de forma clnica moderada, levando a ictercia leve.
AntiA: ocorre naturalmente no soro de todos os indivduos do Grupo B.
AntiB: ocorre naturalmente no soro de todos os indivduos do Grupo A.
AntiAB: ocorre naturalmente no soro de todos os indivduos do Grupo O.
AntiA1: pode ocorrer naturalmente nos indivduos A2, quase sempre uma aglutinina fria, tipo IgM,
encontrada em cerca de 1% a 4% dos indivduos A2 e em 25% dos indivduos A2B. Geralmente no est
associada a reao hemoltica transfusional ou doena hemoltica perinatal. Na presena de antiA1, s
necessrio selecionar hemcias A2 para transfuso se o anticorpo reagir a 37 oC.
Consideraes sobre a classificao ABO
A tipagem ABO deve ser realizada obrigatoriamente por meio de duas provas:

28

Prova direta ou globular (Beth Vincent): consiste em pr em contato sorosteste conhecidos


antiA, antiB e antiAB com glbulos vermelhos (GV) a serem testados, para identificar a
presena ou no dos antgenos A e B. Assim, sero definidos os grupos sanguneos: A, B, AB, O.

Captulo 2 Sistema ABO

Prova reversa, srica (Simonin): consiste em colocar em contato o soro a testar com pelo menos
GV conhecidos A1 e B, permitindo reconhecer a presena ou no de anticorpos dirigidos contra
esses antgenos.
Essas duas provas, direta e reversa, devem ser realizadas preferencialmente por dois tcnicos diferentes,
sendo que cada teste realizado confirma o outro.

Tipagem em tubo prova direta


1. Rotular trs tubos de ensaio: A, B, AB;
2. Nos tubos adequadamente rotulados, colocar uma gota dos soros antiA, antiB e antiAB, res
pectivamente;
3. A cada tubo acrescentar uma gota de suspenso de hemcias da amostra = 50mL, sendo essa
suspenso a 5% em soro fisiolgico;
4. Agitar os tubos e centrifugar adequadamente (1.000 rpm durante um minuto ou 3.400 rpm
durante 15 segundos);
5. Fazer a leitura da aglutinao contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o boto
de aglutinao.
figura 1 Tipagem em tubo - prova direta

AB

AB

Fonte: Geoff Daniels, 2008.

29

MINISTRIO DA SADE

Tipagem em tubo prova reversa


1.
2.
3.
4.
5.

Rotular dois tubos de ensaio com a e b;


Colocar duas gotas do soro da amostra = 100 mL a testar em cada tubo;
Adicionar ao tubo a uma gota de hemcias A1 a 5% e, ao tubo b, uma gota de hemcias B a 5%;
Agitar os tubos e centrifugar adequadamente;
Fazer a leitura da aglutinao contra um fundo iluminado, ressuspendendo gentilmente o boto.

figura 2 Tipagem em tubo - prova reversa

Fonte: Geoff Daniels, 2008.

figura 3 Interpretao dos resultados


Soro Anti-A

Soro Anti-B

Soro Anti-A+B

Hemcia A

Hemcia B

Grupo A

Grupo B

Grupo AB

Grupo O

Ausncia de aglutinao
Fonte: Geoff Daniels, 2008.

30

Presena de aglutinao

Captulo 2 Sistema ABO

figura 4 Quantificao da reao intensidade

Determinao da intensidade das reaes


4 + Boto slido e fundo claro
3 + Grumos grandes e numerosos com fundo claro
2 + Grumos pequenos e numerosos com fundo rseo
1 + Grumos pequenos e fundo bastante avermelhado
4+

3+

2+

1+

Fonte: Manual Tube Testing. Image created by Jaye Parsley <http://emedicine.medscape.com/article/1731198-overview#aw2aab6b4>.

Causas de discrepncias na classificao ABO


Discrepncia de classificao ABO ocorre quando o resultado na prova direta e na prova reversa so
divergentes, ou seja, definem fenotipagens ABO diferentes entre si.

Problemas na prova direta


Antgenos A e B fracos, em que os antgenos correspondentes s podem ser demonstrados por
tcnica de fixao e eluio, pela pesquisa de substncias ABH na saliva, por estudo gentico ou
por pesquisa de transferases sricas;
Poliaglutinao de hemcias, fenmeno imunolgico em que um antgeno exposto ou existe
anormalmente na superfcie da hemcia e reconhecido por um anticorpo: antiT, antiTn, etc.;
Aglutinao inespecfica pela presena de gelia de Wharton em amostras de sangue de cordo.
Aqui vale a pena lembrar que na determinao do grupo ABO em recmnascidos s podemos rea
lizar a classificao direta, porque os anticorpos naturais nesse momento ainda no so detectveis;

31

MINISTRIO DA SADE

Rouleaux: o empilhamento das hemcias tornando todas as reaes falsamente positivas na


determinao ABO, inclusive os controles. Ocorre em macroglobulinemias, nos mielomas, nas
hiperfibrinemias.
Problemas na prova reversa:

Subgrupo de A e AB com presena de antiA1;


Presena de autoaglutinina fria na amostra;
Ausncia ou diminuio de anticorpos naturais antiA e antiB, como em recmnascidos, idosos
e imunodeprimidos;
Presena de anticorpo irregular no plasma ou soro.

32

Captulo 3 Sistema Rh

Captulo 3 Sistema Rh
O sistema Rh o mais complexo dos sistemas eritrocitrios e o 2 mais importante, depois do sistema
ABO, na medicina transfusional. Foi descoberto em 1939, por Levine e Stetson, por meio de um caso de
Doena Hemoltica Perinatal (DHPN). Uma mulher, ao dar luz uma criana com anemia hemoltica,
necessitou ser transfundida com o sangue ABO compatvel de seu marido e, a seguir, apresentou rea
o transfusional grave. O soro dessa mulher aglutinava as hemcias do marido e de cerca de 80% dos
doadores caucasianos tambm ABOcompatveis. Na mesma poca, Landsteiner e Wiener observaram
que o soro de coelhos imunizados com hemcias do macaco Rhesus tambm aglutinava cerca de 85%
das hemcias humanas. Inicialmente foi pensado que, nos dois casos, os anticorpos identificavam o
mesmo antgeno na superfcie das hemcias humanas e do macaco Rhesus (Ag Rh). Posteriormente, foi
observado que no se tratava do mesmo antgeno, porm a nomenclatura Rh foi mantida para o siste
ma. O anticorpo do coelho (heteroanticorpo) passou a ser chamado de antiLW e o anticorpo humano
(aloanticorpo) foi renomeado como antiD.

Antgenos
Os antgenos do sistema Rh so encontrados exclusivamente nas hemcias. So protenas codificadas
por um par de genes homlogos, RHD e RHCE. O gene RHD codifica a produo do antgeno RhD e o
gene RHCE, a produo de dois pares de antgenos antitticos: C, c, E, e. Embora o sistema apresente mais
de 50 antgenos, apenas a classificao RhD, que se refere a presena ou ausncia do antgeno RhD, deve
ser realizada obrigatoriamente nas rotinas prtransfusionais e em doadores de sangue.
A tabela 1 relaciona os principais antgenos do sistema, assim como ano de sua descoberta e prevalncia
em caucasianos.

33

MINISTRIO DA SADE

tabela 1 Principais antgenos do sistema, ano de descoberta e prevalncia em caucasianos


Antgenos
D
C
c
E
E
Cw
Hr0
f
Bea
Cx
Ex
V
Goa
G
Ce(rhi)
Hr
hrs
VS
cE
CE
CG
Dw
Rh26
hrII
Rh29

Ano de
Descoberta
1939
1941
1941
1943
1945
1946
1950
1953
1953
1954
1955
1955
1958
1958
1958
1960
1960
1960
1961
1961
1962
1962
1964
1964
1967

Fonte: Geoff Daniels, 2008.

34

Prevalncia em
caucasianos (%)
85
70
80
30
98
1
> 99
64
<1
<1
<1
<1
<1
85
70
> 99
98
<1
30
<1
70
<1
80
<1
> 99

Antgenos
Evans
Rh32
Rh33
Rh35
HrB
hrB
Tar
Rh39
Rh41
Rh42
Crawford
Nou
Dav
Riv
FPIT
Sec
BARC
JAL
STEM
LOCR
MAR
JAHK
DAK
CENR

Ano de
Descoberta
1968
1971
1971
1971
1972
1972
1975
1979
1980
1980
1980
1981
1982
1983
1988
1989
1989
1990
1993
1994
1994
1995
2003
2004

Prevalncia em
caucasianos (%)
<1
<1
<1
<1
> 99
98
<1
> 99
70
<1
<1
> 99
> 99
<1
<1
> 99
<1
<1
<1
<1
> 99
<1
<1
<1

Captulo 3 Sistema Rh

Como o sistema complexo, diferentes pesquisadores formularam nomenclaturas diversas para seus
antgenos e anticorpos. Na tabela 2 esto representadas as nomenclaturas propostas pela Sociedade
Internacional de transfuso sangunea (numrica), por Wienner e de Fisher e Race, e suas correspon
dncias.
tabela 2 Nomenclaturas do sistema Rh
Nomenclatura numrica
RH: 1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5
RH:1,2,3,4,5

Wienner Fentipo
R1
R2
Ro
Rz
r
r
r
ry

Fisher e Race Antgenos expressos


C, D, e
c, D, E,
c, D, e
C, D, E
c, e
C, e
c, E
C, E

Fonte: Geoff Daniels, 2008.

O antgeno RhD apresenta um extenso polimorfismo. Pode se apresentar como um antgeno com fraca
expresso (D fraco) ou como um antgeno modificado (D parcial). Essas caractersticas muitas vezes s
podem ser determinadas por estudos moleculares.
Esse polimorfismo causa dificuldades na classificao RhD. O reconhecimento de amostras com fraca
expresso do antgeno RhD depende do mtodo e da qualidade do reagente antiD empregado. O
surgimento dos reagentes monoclonais e o desenvolvimento das tcnicas moleculares nos trouxeram
grande contribuio para o esclarecimento dessas diferentes formas de expresso do antgeno RhD.
Assim, mesmo apresentandose enfraquecido ou parcial, o antgeno RhD pode determinar formao
de anticorpos em indivduos RhD negativos. Por outro lado, indivduos classificados como positivo,
apresentando o antgeno RhD parcial, tambm podem produzir antiD se expostos ao antgeno RhD. Os
reagentes monoclonais apresentam caractersticas especificas e, segundo o clone desenvolvido, reagem
seletivamente com as diferentes variantes do antgeno RhD. A escolha do reagente apropriado conduzir

35

MINISTRIO DA SADE

a uma melhor definio da classificao RhD para pacientes e doadores. Em virtude de caractersticas
to particulares, a determinao do antgeno RhD uma tarefa ainda difcil e merece ateno especial
na escolha do reagente antiD.

Os antgenos D fraco e D parcial


O antgeno D pode apresentar variaes em sua expresso fenotpica devido a alteraes em sua quali
tativas e/ou quantitativas. Esses antgenos so globalmente denominados D variantes.

Antgenos D fraco
Os antgenos D fracos so variaes quantitativas do antgeno RhD e todos os eptopos (regies reco
nhecidas por anticorpos) esto ntegros na membrana eritrocitria, porm expressos fracamente.
As variaes no antgeno, quando acontecem, so transmembranares ou intracelulares e por isso os
indivduos que possuem o fentipo D fraco no produzem aloanticorpos antiD. Nos testes sorolgicos,
os antgenos D fracos so detectados somente com o uso de potencializadores (antiglobulina humana
ou enzimas), mas atualmente, com o uso dos reagentes monoclonais, aqueles que no apresentam uma
densidade antignica muito baixa so detectados por reao imediata, sem necessidade de potencia
lizadores.

Antgenos D parciais
Os antgenos D parciais so caracterizados pela ausncia de um ou mais eptopos da protena D, que
so substitudos por eptopos da protena CcEe. Estas alteraes ocorrem por alteraes moleculares
no gene RhD, que leva a substituies dispersas de aminocidos nas alas extracelulares da protena, em
especial nas alas extracelulares. Vrios eptopos apresentamse alterados devido presena de amino
cidos diferentes da protena D normal. Dependendo do tipo de antgeno D a densidade antignica varia.
Alguns antgenos tm baixa densidade antignica e, portanto, alm de parcial, apresenta uma expresso
fraca (D fraco Tipo 17), enquanto que outros apresentam uma densidade antignica alta, semelhante
ao antgeno D normal (D parcial tipo DIIIc).

36

Captulo 3 Sistema Rh

Receptores de sangue ou gestantes que possuem antgenos D parciais podem se sensibilizar caso sejam
expostos aos antgenos D positivo. Por isso cada vez mais se investe na obteno de reagentes que sejam
capazes de realizar a deteco de todos esses antgenos D variantes.
A tabela 3 relaciona diferentes antgenos D parcial, demostrando os eptopos alterados.
tabela 3 Antgenos D parcial eptopos presentes e ausentes
D Parcial
II
III
IVa
IVb
Va
VI
VII

Eptopos Presentes
1, 2, 3, 5, 6/7, 8
1, 2, 3, 4, 5, 6/7, 8, 9
4, 5, 6/7, 8
5, 6/7, 8
2, 3, 4, 6/7, 8, 9
3, 4, 9
1, 2, 3, 4, 5, 6/7, 9

Eptopos Ausentes
4, 9

1, 2, 3, 9
1, 2, 3, 4, 9
1, 5
1, 2, 5, 6/7, 8
8

Fonte: Imelda Bromilow, 2007.

Anticorpos
Os anticorpos do sistema Rh, em especial o antiD, no so naturais. Eles so produzidos a partir de um
estmulo imunolgico, seja a gestao de um feto RhD positivo, ou transfuso de um componente RhD
positivo. Eles so de natureza IgG, ativos a 37 oC e so melhor detectados por meio da utilizao da anti
globulina humana ou por meio da utilizao de painis de hemcias tratadas por enzimas proteolticas.
Como so IgG, atravessam a barreira placentria e esto envolvidos em casos de doena hemoltica
perinatal. Esses anticorpos no fixam complemento e a destruio das hemcias extracelular, podendo
estar associados a casos de reao transfusional por destruio das hemcias no meio extravascular.

37

MINISTRIO DA SADE

Consideraes sobre a classificao RhD


A classificao rotineira do RhD referese somente a presena ou ausncia do antgeno RhD. Contraria
mente ao sistema ABO, no h prova reversa, pois os indivduos no apresentam naturalmente anticor
pos sricos contra o antgeno RhD.
A classificao RhD inicialmente era baseada na presena ou ausncia de aglutinao frente ao reagente
antiD policlonal temperatura ambiente (TA). Assim era estabelecido se o indivduo era Rh positivo ou
negativo. A variante fraca do antgeno era pesquisada nos casos de resultados negativos temperatura
ambiente, por meio do emprego da antiglobulina humana (AGH). Frente a um resultado positivo apenas
com a antiglobulina humana, a tipagem RhD era liberada como Rh negativo Du positivo. Atualmente o
termo correto antgeno D positivo fraco. Sua frequncia era estabelecida por meio desses critrios e
varivel de acordo com a populao estudada. Estimavase que 0,1%1% de caucasianos apresentava
o antgeno D fraco.
No cenrio mundial a produo de reagentes antiD policlonais vem sendo descontinuada devido ao
fato de que a fonte destes reagentes humana. Os programas de preveno da aloimunizao eritroci
tria, assim como a restrio aos programas de aloimunizao remunerada, diminuram consideravel
mente a disponibilidade de doadores sensibilizados. Acrescido a esse fato, consenso que fontes de soro
humano contendo antiD devem ser reservadas para a produo de imunoglobulinas para tratamento
e preveno de diversas patologias, entre elas a Doena Hemoltica Perinatal. O desenvolvimento dos
reagentes monoclonais para tipagem sangunea trouxe grande contribuio ao arsenal imunohemato
lgico. Hoje esses reagentes vm substituindo os reagentes policlonais com total eficcia.
Os anticorpos monoclonais so projetados em laboratrio para reconhecer especificamente marcadores
proteicos especiais na superfcie das hemcias
Os reagentes monoclonais antiD so de origem humana e, dependendo do clone, podem ser IgG
ou IgM. Eles so comercializados separadamente (Reagente IgG ou IgM) ou em misturas de clones
(IgG+IgM). Esses reagentes com mais de um clone apresentam grande probabilidade de detectar a
maioria dos antgenos D variantes.
Uma boa escolha do reagente a ser utilizado na prtica laboratorial essencial para resultados adequa
dos. importante a identificao de reagentes monoclonais com abrangncia bem estabelecida, pois
certamente eles viro a substituir os reagentes policlonais.

38

Captulo 3 Sistema Rh

Existe uma grande preocupao em relao ao antgeno D parcial VI. Indivduos com esse fentipo so
susceptveis formao de antiD quando expostos ao antgeno RhD, pois esses antgenos possuem
mltiplas alteraes em seus eptopos.
Muitos laboratrios escolhem os reagentes baseados na capacidade de deteco ou no do antgeno
D VI. recomendvel a utilizao de dois diferentes reagentes. Um deve detectar e o outro no deve
detectar a variante DVI. Na tcnica de gelteste, muitos cartes para a classificao j apresentam dois
microtubos contendo diferentes reagentes antiD. J esto tambm disponveis no mercado antissoro
antiD lquidos com diferentes clones, podendo ser adquiridos reagentes compostos por mistura de
clones ou reagentes apresentando apenas um clone IgG ou IgM. Alguns cartes
A tabela 4 relaciona alguns clones antiD, o(s) eptopos por eles identificados e a capacidade de deteco
da Variante DVI.
tabela 4 Clones antiD e os eptopos identificados
Clone
ESD1
MS26
1752
MS 201
LDM3
TH28
RUM1
LDM1

Tipo
IgG
IgG
IgM
IgM
IgM
IgM
IgM
IgM

Eptopo
9
3/9
6/7
6/7
6/7
6/7
6/7
6/7

DVI
+
+

Fonte: Imelda Bromilow, 2007.

Uma classificao correta da presena ou ausncia do antgeno RhD e de suas variantes na membrana
eritrocitria de um indivduo de grande importncia, pois o antgeno RhD o mais imungeno em
relao aos demais antgenos eritrocitrios conhecidos.

39

MINISTRIO DA SADE

Etapas importantes na classificao RhD:


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Escolher o reagente antiD de acordo com a sua aplicao (doadores ou pacientes);


Conhecer seu clone e sua abrangncia;
Utilizar o reagente controle quando estiver preconizada sua utilizao;
Pesquisar a variante fraca sempre que o resultado inicial for negativo;
No liberar o resultado em caso de dvida e sempre que o controle de RhD for positivo;
Se possvel. usar dois reagentes com clones diferentes (IgG e IgM);
Seguir as diretrizes estabelecidas na Portaria GM/MS n 2712/2013.

Sugesto de Tcnica em tubos de hemlise:


1. Identificar dois tubos de ensaio, como RhD e CTL;
2. No tubo identificado como RhD, colocar uma gota do reagente antiD e, no tubo identificado
como CTL, uma gota do reagente Controle de RhD;
3. Aos dois tubos adicionar uma gota de suspenso de GV a 3% 5% em soluo salina;
4. Homogeneizar e centrifugar os dois tubos a 3400 rpm por 15 segundos;
5. Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos, e ler macroscopicamente a aglu
tinao;
6. Se o teste for negativo (aglutinao ausente), proceder conforme indicado no teste para pesquisa
de RhD fraco.
figura 1 Tcnica para tipagem RhD

Ctl

Ilustrao: Shirley Lopes de Castilho

40

Ctl

Captulo 3 Sistema Rh

Pesquisa da variante fraca do antgeno D:


1.
2.
3.
4.

Incubar ambos os tubos (D e CTL) por 15 minutos em banhomaria a 37 oC;


Lavar os glbulos vermelhos (GV) de cada tubo trs vezes, em soluo salina fisiolgica;
Decantar completamente por inverso rpida dos tubos, aps a ltima lavagem;
A cada tubo, acrescentar duas gotas de soro antiglobulina humana de amplo espectro ou soro
de Coombs;
5. Centrifugar a 3.400 rpm por 15 segundos;
6. Ressuspender o boto de GV, por agitao delicada, e examinar para aglutinao macroscpica;
7. Anotar os resultados.
figura 2 Tcnica para pesquisa do antgeno D fraco

Ctl

Ctl

Ctl

Ctl

Ilustrao: Shirley Lopes de Castilho

Interpretao dos resultados


Havendo ausncia de aglutinao em ambos os tubos (item 5), classificase o sangue como RhD negativo.
Quando ocorre aglutinao apenas no tubo marcado D (item 5), o sangue deve ser classificado como
RhD positivo fraco.

41

MINISTRIO DA SADE

Se ambos os tubos, D e CTL, aglutinarem, no considerar o indivduo como RhD positivo. Nesse caso,
considerlo como tendo um teste de Coombs direto positivo, provavelmente por sensibilizao de
seus GV por autoanticorpos.
Caso no haja tempo de realizar estudos mais aprofundados, na vigncia de uma transfuso de urgncia,
escolher para essa transfuso hemcias RhD negativo.
figura 3 Interpretao da tipagem RhD

Ctl

Aglutinao com anti-D


e ausncia de aglutinao
no reagente Ctl.

Ilustrao: Shirley Lopes de Castilho

42

Ctl

Ctl

Aglutinao com o reagente


controle invalida a interpretao
dos resultados.

Ctl

Ctl

Ausncia de Aglutinao
nos 2 tubos anti-D e Ctl
Realizar pesquisa de D fraco.

RhD positivo

Aglutinao com anti-D e


ausncia de aglutinao no
reagente Ctl.
RhD positivo fraco
(D fraco)

Captulo 3 Sistema Rh

figura 4 Fluxograma de Interpretao


Classificao Sangunea RhD Anti-D IgG + IgM

Reagente Controle
Positivo Teste Invlido

Reagente Controle
Negativo

Teste
validado

Possibilidade
Hemcias previamente sensibilizadas in vivo

Resultado com o reagente anti-D

Causas
Devido a
presena de
autoanticorpos

Devido presena de
aloanticorpos
Aloimunizao maternofetal transfuso recente

Positivo

Negativo

RhD+

Pesquisar D Fraco (AGH)

Conduta
Realizar teste de Coombs direto utilizar
Anti-D Policlonal Salino ou
Anti-D IgM Monoclonal
Tratamento das hemcias com reagentes
especiais como cloroquina ou glicina cida

Negativo

Positivo

RhD-

RhD+
D Fraco ou
D Parcial

Ilustrao: Shirley Lopes de Castilho

43

Captulo 4 Teste de Antiglobulina

Captulo 4 Teste de Antiglobulina

Introduo
Coombs, Mourant e Race descreveram em 1945 o teste da antiglobulina indireta (TAI). Tcnica que,
apesar de ter sido previamente demonstrada por Moreschi em 1908, no havia sido divulgada na poca.
O teste permitia a deteco no soro de anticorpos no aglutinantes do sistema Rh, utilizando o soro
antiglobulina humana (TAI). Os mesmos autores demonstraram posteriormente em recmnascidos
com doena hemoltica perinatal (DHPN), hemcias sensibilizadas por anticorpos antiD. Para tanto,
utilizaram o soro antiglobulina em uma tcnica que futuramente passou a ser denominada teste da
antiglobulina direto (TAD).
A utilizao do soro antiglobulina humana, na avaliao imunolgica eritrocitria, pode ser considerada
como a mais importante descoberta da medicina transfusional, depois do sistema de grupo sanguneo
ABO. A facilidade de execuo do teste antiglobulina e a informao diagnstica que fornece contribu
ram para sua utilizao em larga escala at os dias de hoje.

Teste da antiglobulina direto (TAD)


O TAD considerado um mtodo simples, que permite detectar hemcias revestidas in vivo por imu
noglobulinas e/ou fraes do complemento.
A realizao do teste depende do soro antiglobulina humana (AGH), que pode ser obtido a partir da
sensibilizao de animais com globulinas humanas e/ou anticorpos monoclonais. Soros monoespecfi
cos (antiIgG, antiIgM, antiIgA, antiC3, antiC3d) e poliespecficos (antiIgG associado a antiC3d) so
disponveis comercialmente.

45

MINISTRIO DA SADE

O TAD caracterizase pela reao de hemcias diretamente com o soro AGH. Na tcnica em tubo, a
lavagem de hemcias importante para remover todo o resduo de plasma, anticorpos livres e outras
protenas do meio, evitando um resultado falso negativo com a neutralizao do soro AGH. As antiglo
bulinas combinamse preferencialmente com a poro Fc das molculas de anticorpos ligadas s hem
cias, e os stios Fab formam pontes entre os anticorpos produzindo uma aglutinao visvel (figura1). As
clulas que no apresentam anticorpos ligados no so aglutinadas.
O teste da antiglobulina pode detectar de 100 a 400 molculas de IgG por hemcia e de 350 a 1100 mo
lculas de C3d por hemcia. A investigao laboratorial deve prosseguir quando o TAD realizado com
o soro AGH poliespecfico positivo. Nessa situao, utilizar soros AGH monoespecficos e a tcnica
de eluio do anticorpo, visando a melhor caracterizao da protena ligada membrana da hemcia.
O procedimento de eluio caracterizase pela remoo de anticorpos da membrana das hemcias
sensibilizadas por meio de diferentes tcnicas, como calor (56 C), congelamento, solventes orgnicos
(clorofrmio, ter) e meio cido (glicinaHCl / EDTA, digitonina cida) (tabela 1) .
tabela 1 Principais tcnicas de eluio
Mtodo
Calor
Congelamento
Meio cido

Caractersticas
Temperatura: 56 C. Indicado na eluio de anticorpos do sistema ABO e anticorpos IgM; fcil
execuo.
Indicado na eluio de anticorpos do sistema ABO; necessita de pequenos volumes de amostra;
fcil execuo
Boa capacidade de recuperao dos anticorpos removidos da hemcia; fcil execuo.

Fonte: Tabela Modificada do Manual Tcnico da AABB 17ed pginas 501 e 503.

Teste da antiglobulina direto e complemento


Fraes do complemento podem se ligar s hemcias in vivo ou in vitro. Anticorpos ligados a antge
nos eritrocitrios formam imunocomplexos capazes de ativar a via do complemento. O outro mecanis
mo descrito est relacionado a complexos imunes inespecficos, presentes no plasma e adsorvidos pela
membrana da hemcia. Nesse caso, a via do complemento nem sempre ativada.

46

Captulo 4 Teste de Antiglobulina

As hemcias ligadas ao complemento geralmente so hemolisadas. Entretanto, nas situaes em que a


cascata no ativada, fraes como C3 e raramente C4 podem ser detectadas por reagentes anticom
plemento, sem evidncia de hemlise.
O TAD dificilmente identifica anticorpos antiIgM, em parte porque essas molculas so pentmeros e
podem dissociarse durante o processo de lavagem. Outro fator que contribui para isso est relacionado
baixa atividade dos soros antiIgM, presentes nos reagentes comerciais. Os anticorpos IgM ativam a via
do complemento; assim, C3 pode ser detectado na superfcie da hemcia mesmo aps procedimentos
de lavagem.
Avaliao do teste da antiglobulina direto
Os eritrcitos normais podem apresentarse na membrana IgG e fraes do complemento aderidos de
forma inespecfica e em quantidades to pequenas (inferiores a 100 molculas/hemcia) que no so
detectados por meio de um TAD de rotina. Sabese que acima de 100 molculas de IgG e de aproxima
damente 400 de complemento por eritrcito usual a positividade do TAD, e que esse resultado mais
forte quanto maior for o nmero de molculas que revestem a hemcia. No existe uma relao direta
entre um TAD positivo e hemlise. Assim, o resultado do TAD deve ser analisado juntamente com a
histria clnica do paciente e com os resultados dos testes laboratoriais que investigam o quadro he
moltico. Alguns dados da histria clnica, como o uso de medicamentos, antecedentes transfusionais e
gestaes, so fundamentais e podero inclusive orientar a avaliao imunohematolgica especializada.
Em pacientes com TAD positivo que no apresentam evidncias de hemlise, no existe a necessidade
de prosseguir a investigao imunolgica eritrocitria, exceto quando houver indicao de transfuso.
Aproximadamente 3% dos pacientes com hemlise imune possuem o TAD negativo. O valor preditivo
do teste de 83% em pacientes com anemia hemoltica e apenas de 1,4% em paciente sem hemlise.
O resultado do TAD positivo pode ser encontrado em pacientes recentemente transplantados, trans
fundidos e recebendo imunoglobulina intravenosa.

47

MINISTRIO DA SADE

tabela 2 Principais causas de TAD positivo


Reao
transfusional
hemoltica:

Drogas
(medicamentos):

Anemia hemoltica
autoimune (AHAI):

Doena hemoltica
perinatal (DHPN)
Protenas
adsorvidas /
No especficas:

Aloanticorpos do receptor de uma transfuso recente reagem com antgenos


presentes nas hemcias do doador.
Anticorpos presentes no plasma do doador reagem com antgenos nas hemcias
de um receptor de transfuso.
Anticorpos drogas dependentes. Anticorpo IgG e complemento podem ser
detectados na membrana da hemcia quando a droga participa da reao.
Exemplos: penicilinas e cefalosporinas.
Anticorpos drogas independentes. Droga induz formao de um anticorpo
indistinguvel dos autoanticorpos encontrados nas AHAI. No necessria a
adio da droga in vitro para a deteco do anticorpo. Exemplos: metildopa e
fludarabine.
AHAI a quente: autoanticorpos IgG e/ou C3 reagem in vivo com hemcias.
Doena da aglutinina a frio : autoanticorpos IgM e complemento ligamse s
hemcias na circulao perifrica e podem ser posteriormente eludos em reas
mais aquecidas, restando apenas o complemento aderido hemcia.
Hemoglobinria paroxstica ao frio: autoanticorpos IgG reagem com hemcias
na periferia e podem posteriormente ativar a via do complemento.
Aloanticorpos maternos (IgG) atravessam placenta e reagem com hemcias
fetais.
Administrao de globulina imune em altas doses: globulinas ligamse
membrana das hemcias do receptor.
Hipergamaglobulinemia.

Ilustrao: Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro

Indicaes do teste da antiglobulina direto


O TAD uma ferramenta importante no diagnstico das anemias hemolticas imunes, incluindo as
anemias: hemolticas autoimunes, hemolticas induzidas por drogas e as hemolticas aloimunes (doena
hemoltica perinatal e reao hemoltica transfusional) (tabela 2).

48

Captulo 4 Teste de Antiglobulina

Anemias hemolticas autoimunes


A anemia hemoltica autoimune (AHAI) caracterizada pela reduo da sobrevida eritrocitria, conse
quncia da ligao de imunoglobulinas e/ou complemento na membrana da hemcia. Nas AHAI, o TAD
positivo, acompanhado de eluato reativo e sem especificidade. Apenas 2% a 4% das hemlises imunes
apresentam TAD negativo. Em aproximadamente 70% dos casos, o teste positivo para anticorpos
IgG e/ou associados a fraes do complemento so as chamadas anemias hemolticas a quente. Nas
anemias hemolticas por anticorpos a frio, que representam de 15% a 30% dos casos, o TAD geralmente
detecta a presena de fraes do complemento. Nas anemias hemolticas mistas, aproximadamente 8%
dos casos, o TAD detecta a presena de IgG e C3 (Tabela 3).
tabela 3 Classificao laboratorial das anemias hemolticas autoimunes
AHAI
AHAI a quente
Doena da aglutinina a frio
AHAI mista
Hemoglobinria paroxstica a frio (hemolisina bifsica)

DAT
IgG ou IgG+C3
C3
IgG+C3
IgG; C3; C3d

Eluato
IgG
Negativo
IgG
Negativo

Fonte: Tabela Modificada do Manual Tcnico da AABB 17ed pginas 501 e 503.

Anemias hemolticas induzidas por drogas (medicamentos)


Drogas raramente causam anemia hemoltica imune (AHI). Estimase uma incidncia de um caso em
um milho de indivduos.
A maioria dos medicamentos possui baixo peso molecular e, portanto, no apresentam imunogenici
dade. Entretanto, diversas drogas podem causar hemlise e numerosas teorias tm sido propostas para
explicar como a droga induz resposta imune e qual a relao dessa resposta com a presena do TAD
positivo e com a hemlise. Abaixo, a classificao mais aceita para a AHI induzida por medicamentos:
(1) Anticorpos dependentes da droga nesse caso, anticorpo IgG e complemento podem ser detec
tados na membrana da hemcia in vitro quando a droga participa da reao (figura 2). Nessa condio,
o TAD positivo quando realizado com soro antiIgG e anticomplemento. O eluato e os anticorpos
presentes no soro reagem somente com hemcias tratadas pela droga ou na presena de soluo con
tendo a droga. Exemplos: penicilinas, quinidina, cefalosporinas.

49

MINISTRIO DA SADE

(2) Anticorpos independentes da droga. Nesse caso no necessria a adio da droga in vitro para
a deteco do anticorpo. Exemplos: metildopa e fludarabine. Essas drogas induzem formao de um
anticorpo indistinguvel dos autoanticorpos encontrados nas AHAI. A mais importante droga nessa ca
tegoria a (alfa) a metildopa. Aproximadamente 10% a 35% dos pacientes que utilizam o medicamento
apresentam resultado do TAD fortemente positivo pela presena de molculas de IgG na membrana
da hemcia. Nesse caso os anticorpos presentes no soro e no eluato reagem a 37 C com eritrcitos
homlogos na ausncia da droga.
As cefalosporinas tambm podem acarretar um TAD positivo em aproximadamente 5% dos pacientes,
devido adsoro no especfica de protenas do plasma na membrana eritrocitria.
O TAD apenas est indicado em pacientes que apresentam histria de ingesto de drogas, que podem
induzir formao de anticorpos antieritrocitrios na vigncia de quadro clnico de hemlise.

Anemias hemolticas aloimunes


Doena hemoltica perinatal
A doena hemoltica perinatal (DHPN) caracterizase pela reduo da sobrevida de hemcias fetais,
decorrente de um quadro de hemlise imune desencadeado pela ligao de anticorpos de procedn
cia materna com antgenos fetais herdados do pai. Os anticorpos da classe IgG atravessam a placenta e
atingem a circulao fetal . A forma mais grave da DHPN decorrente da aloimunizao RhD, ou seja,
me RhD negativa com filhos RhD positivos. A DHPN pelo sistema ABO praticamente limitada s mes
do grupo sanguneo O, com filhos do grupo A ou B, e que possuem predomnio de anticorpos antiA
e antiB da classe IgG. Geralmente o quadro clnico moderado e raramente responsvel pela morte
do recmnascido. Vrios outros anticorpos podem estar associados com DHPN de gravidade varivel,
como antiC, c, E, e, K1, Fya, M, Jka, Dib.
Reaes hemolticas transfusionais
A reao hemoltica transfusional (RHT) caracterizase pela destruio de hemcias transfundidas como
consequncia de uma incompatibilidade imunolgica. A RHT pode ocorrer quando hemcias com um
determinado antgeno so transfundidas em pacientes previamente aloimunizados contra este antgeno
especfico ou quando um paciente recentemente transfundido produz um novo aloanticorpo.

50

Captulo 4 Teste de Antiglobulina

Na investigao das RHT, devese coletar uma amostra para realizao do TAD imediatamente aps a
reao. O resultado do teste pode ser positivo, se as hemcias sensibilizadas no forem destrudas, ou
negativo, caso ocorra hemlise com rpida eliminao das hemcias sensibilizadas da circulao.

Teste da antiglobulina indireto (TAI)


O TAI tem como objetivo determinar a sensibilizao de hemcias in vitro. O teste largamente empre
gado na investigao imunohematolgica para a deteco e identificao de anticorpos incompletos
(no aglutinantes) de importncia clnica no soro de doadores e pacientes, na fenotipagem eritrocitria
e titulao de anticorpos incompletos (tabela 4). O mtodo para a deteco de anticorpos antieritroci
trios irregulares deve incluir uma fase de incubao a 37 C, para facilitar a ligao do anticorpo ao
antgeno eritrocitrio e a utilizao do soro de antiglobulina humana (AGH). A AGH poliespecfica
contm atividade antiIgG e antiC3. A indicao de antiIgG monoespecfica versus poliespecfica em
testes prtransfusionais ainda motivo de discusso entre os especialistas. A maioria dos anticorpos
clinicamente significativos, detectados durante a investigao imunohematologica transfusional, so da
classe IgG, o que poderia justificar a utilizao do soro antiIgG monoespecfico, evitando assim reaes
positivas no desejveis (falso positivo). Entretanto a utilizao do soro poliespecfico pode proporcionar
a deteco de anticorpos capazes de ativar a via do complemento.
tabela 4 Aplicaes do teste da antiglobulina indireto (TAI)
Testes
Deteco de anticorpos
antieritrocitrios:
Identificao de anticorpos
antieritrocitrios:
Titulao de anticorpos:
Fenotipagem eritrocitria:

Sensibilizao in vitro
Pesquisa de anticorpos antieritrocitrios irregulares (PAI): anticorpos
reagem com reagentes eritrocitrios / triagem.
Prova cruzada: anticorpos do receptor reagem com hemcias do doador.
Painel de hemcias: anticorpos reagem com hemcias do painel.
Anticorpos (diferentes diluies) reagem com hemcias selecionadas.
Deteco de antgenos eritrocitrios (K, Fy, etc...)
Pesquisa de antgenos de fraca expresso.

Fonte: Tabela Modificada do Manual Tcnico da AABB 17ed pginas 501 e 503.

51

MINISTRIO DA SADE

tabela 5 Causas de erro no teste da antiglobulina humana


Resultados falsos positivos

Amostra inadequada (no refrigerada, coagulada, contaminao bacteriana)


Contaminao bacteriana da salina usada na lavagem
Clulas autoaglutinveis
Clulas com teste da antiglobulina direto positivo
Salina contaminada por metais pesados ou slica coloidal
Anticorpos contaminantes no reagente antiglobulina humana
Tubos de vidro sujos
Centrifugao excessiva
Resultados falsos negativos

Lavagem inadequada ou imprpria de clulas


Reagente antiglobulina humana no reativo
Reagente antiglobulina humana no adicionado
Soro no adicionado no teste indireto
Condies de incubao inadequada
Suspenso de clulas muito diluda ou concentrada
Pouca ou excessiva centrifugao
Erro na leitura do resultado
Fonte: Maria de Lourdes Barjas-Castro.

Com o objetivo de se evitar resultados falso negativos no teste de antiglobulina indireto em tubo,
devese utilizar o reagente de controle de antiglobulina humana (controle de Coombs), que compos
to por hemcias sensibilizadas por anticorpos de classe IgG. Essas hemcias reagiro com o reagente
antiglobulina humana do sobrenadante na fase final em um teste negativo. Aps a adio do reagente
controle e centrifugao (15 segundos a 3.500 rpm), o teste dever se tornar positivo, significando que
o resultado verdadeiramente negativo. Se aps a adio do controle, o teste continuar negativo este
dever ser repetido, pois se trata de um falso negativo que pode ter sido causado por algum dos motivos
descritos na tabela 5.

52

Consideraes finais

Consideraes finais
Numerosos estudos efetuados nas ltimas dcadas demonstraram que o TAD:
No deve ser includo na avaliao imunolgica eritrocitria de doadores de sangue;
No deve fazer parte dos testes de rotina prtransfusional de pacientes.
O TAD deve ser realizado em:
Pacientes com suspeita de hemlise imune, com o objetivo de diagnstico ou de monitoriza
o teraputica. Nessas situaes o teste possui um alto valor preditivo;
Recmnascidos, na presena de:
Aloanticorpos clinicamente significativos no soro materno;
Ictercia neonatal e anemia nos primeiros dias de vida.

O TAD positivo no significa que o paciente apresenta anemia hemoltica imune e o teste nega
tivo no exclui hemlise imune
Todo paciente com TAD positivo deve ser submetido a criteriosa avaliao clnica.

figura 1 Hemcias sensibilizadas aglutinadas pelo soro antiglobulina humana


Antiglobulina
Humana

Hemcias
sensibilizadas
Aglutinao
Ilustrao: Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro

53

MINISTRIO DA SADE

O teste da antiglobulina direto demonstra a ligao in vivo de hemcias com anticorpos, utilizando o
soro antiglobulina humana (AGH).
figura 2 Anticorpos dependentes da droga nesse caso, anticorpo IgG e complemento podem
ser detectados na membrana da hemcia quando a droga participa da reao. O eluato e os anticor
pos presentes no soro reagem somente com hemcias tratadas pela droga ou na presena de soluo
contendo a droga

droga

Metablito da droga

Soro paciente + droga


Ilustrao: Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro

54

Consideraes finais

figura 3 Fluxo para investigao de anemia hemoltica imune (AHI) induzida por drogas
(medicamentos)
Drogas em uso ou
Antecedente uso do medicamento

TAD 3+

PAI +
Painel + com todas as clulas
Auto controle +

Eluato
PAI

Eluato

Pensar AHI
Ac droga dependente

Eluato +

AHI droga/ independente


Dx diferencial: AHAI > frequncia

AHI drogas: retirada da droga /2 semanas desaparecimento da hemlise


+: positivo

: negativo

Dx: diagnstico

Ac: anticorpo

PAI: pesquisa de anticorpos

Ilustrao: Maria de Lourdes Rios Barjas de Castro

55

Referncias

Referncias
AMERICAN ASSOCIATION OF BLOOD BANKS. Technical Manual. 17th ed. Bethesda, MD, 2011.
AVENT, N. D.; REID, M. E. The Rh blood group system: a review. Blood reviews, Edinburgh, v. 95, p. 375-387, 2000.
BARJASCASTRO, M. L. Aplicaes do teste de antiglobulina direta. In: BORDIN, J. O.; COVAS, D. T.; LANGHI, D.
Fundamentos em Hemoterapia. So Paulo: Atheneu, 2006.
BARROS, C. et al. Avaliao de Reagentes AntiD na deteco dos antgenos D fraco e parcial. Res. Bras.
hematol. Hemoter., So Paulo, v. 28, n. 4, p. 269-274, 2006.
BCSH BLOOD TRANSFUSION TASK FORCE. Guidelines for compatibility procedures in blood transfusion
laboratories. Transfusion medicine, Oxford, v. 14, p. 59-73, 2004.
BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n 57,
de 16 de dezembro de 2010. Disponvel em: <http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/
fd337280474597529fcbdf3fbc4c6735/RDC_n%C2%BA_57.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 1 nov. 2013.
BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria n 2.712, de 12 de novembro de 2013. Dirio Oficial da Unio, Poder
Executivo, Braslia, DF, 13 nov.2013. Seo1.
BRASIL. Ministrio da Sade. Resoluo de problemas nos testes prtransfusionais: controle de qualidade
dos reagentes. Braslia, 2001.
CARRITT, B.; KEMP, T. J.; POULTER, M. Evolution of the human RH (rhesus) blood group genes: a 50 year old
prediction (partially) fulfilled. Human molecular genetics, Oxford, v. 6, p. 843-850, 1997.
DURAN J. A.; RODRIGUES, M. J. Teste de antiglobulina direto: ausncia de significado clnico como teste prtransfusional. Revista ABO, v. 1, p. 915, mar. 2000.
EUROPEAN COMMITTEE. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood componentes.
16th Ed, 2013. Disponvel em: <http://www.edqm.eu/en/Guide-to-the-Preparation-Use-and-Quality-Assuranceof-Blood-Components-1586.html?mbID=116>. Acesso em: 1 nov. 2013.

57

MINISTRIO DA SADE

FLEGEL, W. A. et al. On the complextity os D antigen typing: a handy decision three in the age of molecular
blood group diagnostics. JOGC, v. 29, n. 9, p. 746752, 2007.
GARRATTY, G. The significance of complement in immunohematology. Rev. Clin. Lab. Sci., v. 1, p. 25 56, 1984.
DANIELS, Geoff. Human Blood Groups. 2nd. ed. New Jersey: John Wiley & Sons, 2008.
HILLYER, C. D. et al. Blood bank and transfusion medicine. 2nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone Elsevier,
2007.
BROMILOW, Imelda. D ou no D: eis a questo (Diamed AG). ABO: revista de medicina transfusional, Lisboa, v.
31, Jul./Set. 2007.
ISSIT, P. D. Review: the Rh blood group system: historical calendar. Immunohematology, Filadlfia, v. 21, n. 4, p.
141-145, 2005.
JONES, J.; SCOTT, M. M.; VOAK, D. Monoclonal antiD specificity and Rh D structure: criteria for selection of
monoclonal antiD reagents for routine typing of patients and donors. Transfusion medicine, Oxford, v. 5, p.
171184, 1995.
MANNESSIER M.; ROUBINET F. Detection of irregular anti-erythrocyte antibodies using the indirect
antiglobulin test in a low-ionic-strength medium. Immunohematology Group of the French Blood Transfusion
Society. Transfusion Clin. Biol., v. 6, p. 174179, 1999.
MANUAL Tube Testing. Image created by Jaye Parsley. In: GONSORCIK, Victoria K. et al. ABO Grouping. 2013.
Disponvel em: <http://emedicine.medscape.com/article/1731198-overview#aw2aab6b4>.
NASCIMENTO, F. Teste de antiglobulina. Revista ABO, v. 1, p. 78, 2000.
PETZ, L. D.; GARRATY, G. In Immune Hemolytic anemia. 2nd ed. [S.l.]: Ed Churchill Livingstone Elsevier, 2004.
ROSENFIELD, R. E. Solid phase serology for the study of human erythrocyte antigen: antibody reactions.
Paris, 1976. Proc. Fifteen Congr. Int. Soc. Blood Trans.
SIMPSON, P. P.; HALL, P. E. Teste de antiglobulina. In: HARMENING, D. M. Tcnicas modernas de banco de
sangue e transfuso. 4. ed. Rio de Janeiro: Revinter, 2006.
SONNEBORN, H.H.; VOAK, D. A review of 50 years of the Rh blood group system. Biotest bulletin, v. 5, 389
552, 1997.

58

Referncias

TELEN, M.J. Erythrocyte blood group antigens: polymorphisms of functionally importante molecules. Seminars
in hematology, Orlando, v. 33, p. 302-314, 1996.
VAN KIM, C.; COLIN, Y.; CARTRON, J. Rh proteins: key structural and functional components of the red cell
membrane. Blood reviews, Edinburgh, v. 20, p. 93-110, 2006.
WAGNER, F. F. et al. Molecular basis of weak D phenotypes. Blood reviews, Edinburgh, v. 93, 385-393, 1999.
WESTHOFF, C.M. (2007) The structure and function of the Rh antigen complex. Seminars in hematology,
Orlando, v. 44, p. 4250, 2007.
YATES, J. et al. IgG anti-Jka/Jkb antibodies are unlikely to fix complement. Transfusion Med., v. 2, p. 133140,
1998.

59

ISBN 978-85-334-2160-8

9 788 533 42 160 8