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Am-s FACULDADE DE FARMÁCIA UNIVERSIDADE DE LISBOA Estudos de estabilidade por HPLC de um composto híbrido

FACULDADE DE FARMÁCIA UNIVERSIDADE DE LISBOA

Estudos de estabilidade por HPLC de um composto híbrido para o tratamento do glioma

Relatório da Unidade Curricular de Projecto II Julho, 2014

Ana Sofia Cruz Fernandes Ferreira

Orientador: Professora Doutora Maria Eduarda Mendes Co-orientador: Professora Doutora Maria de Jesus Perry

RESUMO

A temozolomida (TMZ) é o principal agente antitumoral para gliomas. É um triazeno alquilante do ácido desoxirribonucleico (DNA) e, devido à sua lipofilia, tem duas caraterísticas que o tornam num antitumoral de eleição: pode ser administrado oralmente e é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica. No entanto, a eficácia terapêutica é frequentemente dececionante, devido em grande parte, à falta de seletividade para células tumorais, à baixa concentração do fármaco no local de ação e à ocorrência de resistências do tumor ao tratamento. É importante desenvolver abordagens terapêuticas alternativas. Os inibidores das deacetilases de histonas (iHDAC) têm vindo a emergir como potenciais componentes úteis à terapêutica antitumoral devido aos seus efeitos de aumento da sensibilidade às radiações usadas em radioterapia, influenciado pela expressão da proteína p53 (codificada pelo gene supressor tumoral p53), e de aumento da especificidade para as células malignas. Estes inibidores induzem a acumulação de histonas hiperacetiladas que leva ao aumento da expressão de um pequeno conjunto de genes silenciados e, consequentemente, diminui a proliferação celular maligna, aumenta o grau de maturação celular (diferenciação) e aumenta a apoptose das células malignas. Dentro deste âmbito, a equipa de investigação esteve envolvida no design de uma nova molécula com duas unidades, um triazeno antitumoral e um iHDAC, o ácido valpróico (VPA). Este híbrido é denominado HYBCOM. Neste trabalho foram feitos estudos cinéticos de estabilidade em tampão fosfato (0.01 M, pH 7.4) e no plasma humano e a determinação das suas propriedades lipofílicas através da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Palavras-chave:

glioma;

triazeno;

(iHDAC); ácido valpróico

inibidor

das

deacetilases

de

histonas

ABSTRACT

Temozolomide (TMZ) is the most widely used antitumor agent for gliomas. It is a triazene that alkylates deoxyribonucleic acid (DNA) and, due to its lipophilicity, it has two features that make it an antitumor of choice: it can be administered orally and is capable of crossing the blood-brain barrier. However, the therapeutic efficiency is often disappointing largely due to lack of selectivity for tumor cells, the low concentration of the drug at the site of action and the occurrence of tumor resistance to the treatment. It is important to develop alternative therapeutic approaches. Histone deacetylase inhibitors (iHDAC) are emerging as potentially useful components of the antitumor therapy due to its effects of increased sensitivity to radiation used in radiotherapy, influenced by protein p53 expression (encoded by the tumor suppressor gene p53), and increased specificity for malignant cells. These inhibitors induce the accumulation of hyperacetylated histones that leads to increased expression of a small subset of silenced genes and thus reduces the malignant cell proliferation, increases the level of cell maturation (differentiation) and increases apoptosis in malignant cells. Within this context, the research team was involved in the design of a new molecule with two units, an antitumor triazene and an iHDAC, valproic acid (VPA). This hybrid is called HYBCOM. In the present study, kinetic stability studies were made in phosphate buffer (0.01 M, pH 7.4) and in human plasma and the determination of its lipophilic properties by high performance liquid chromatography (HPLC) was also made.

Keywords: glioma; triazene; histone deacetylase inhibitors (iHDAC); valproic

acid

ÍNDICE

RESUMO

 

ii

ABSTRACT

iii

LISTA

DE

FIGURAS

v

LISTA DE TABELAS

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

vii

1.

INTRODUÇÃO

 

1

1.1. Gliomas malignos

1

1.2. Tratamento do glioma maligno

1

1.2.1.

Triazenos: agentes alquilantes

1

1.2.2. Resistência das células tumorais aos triazenos e inespecificidade do

 

tratamento

3

 

1.2.3.

Inovações no tratamento do glioma maligno

4

 

1.3.

Objetivos

5

2.

MATERIAIS E MÉTODOS

6

2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

6

2.2. Determinação do comprimento de onda máximo de absorção dos compostos

6

2.3. Curvas de calibração

7

2.4. Estudos cinéticos

7

2.4.1. Tampão fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4)

8

2.4.2. Plasma humano (80% v/v)

8

2.5.

Determinação do logaritmo do coeficiente de partição

8

2.5.1. Fundamento teórico

8

2.5.2. Procedimento experimental

9

2.5.3. Método computacional

10

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

11

 

3.1. Estudo de estabilidade em tampão fosfato salino

11

3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano

12

3.3. Determinação do logaritmo do coeficiente de partição

13

4. CONCLUSÃO

15

AGRADECIMENTOS

16

BIBLIOGRAFIA

17

ANEXOS

 

20

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação química do composto triazeno genérico

2

Figura 3 - Variação da concentração de pró-fármaco ao longo do tempo no ensaio em

1

12

Figura 4 - Variação da concentração de pró-fármaco ao longo do tempo no ensaio em

13

tampão fosfato pH 7.4

plasma humano 80% (v/v)

LISTA DE TABELAS

6

Tabela 2 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas ao longo do

Tabela 1 - Comprimentos de onda máximos de cada

tempo no estudo cinético em tampão fosfato

11

Tabela 3 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas ao longo do

12

Tabela 4 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas no estudo da

13

tempo no estudo cinético em plasma humano

determinação do Log P

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AAI Amina aromática inativa

ACN

Acetonitrilo

DNA

Ácido desoxirribonucleico

iHDAC Inibidor das deacetilases de histonas HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (High-performance liquid chromatography) Log P Logaritmo do coeficiente de partição octanol-água MMT Monometiltriazeno

OGAT O 6 -alquilguanina-DNA transferase OMS Organização Mundial de Saúde PBS Tampão fosfato-salino

PF

RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa

Pró-fármaco

TMZ

Temozolomida

UV

Ultravioleta

λ

Comprimento de onda

1. INTRODUÇÃO

1.1. Gliomas malignos

Os gliomas malignos são tumores das células gliais (estas células protegem, nutrem e dão suporte aos neurónios). O sistema de classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) agrupa os gliomas em quatro classes histológicas definidas por graus crescentes de indiferenciação, anaplasia e agressividade (Anexo I). Segundo a OMS, os gliomas malignos incluem os tumores de classe III (variantes anaplásicas de astrocitoma, oligodendroglioma e oligoastrocitoma) e os tumores de classe IV (glioblastoma e as suas variantes). É um dos tipos de tumor maligno mais comuns a nível mundial na espécie humana com uma incidência anual de 5.26 por 100 000 habitantes ou 17 000 novos diagnósticos por ano. Estes tumores são tipicamente associados a fatores hereditários e má qualidade de vida. Têm origem principalmente no encéfalo e possuem a capacidade de se infiltrar no tecido cerebral saudável e formar tumores satélite. Esta migração faz com que o tratamento se torne extremamente complicado e invariavelmente fatal [1, 2].

1.2. Tratamento do glioma maligno

O tratamento de doentes com gliomas malignos é paliativo e inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Grande parte dos compostos farmacêuticos antitumorais disponíveis no mercado caracteriza-se pela interação com o DNA ou com os seus percursores, de modo a inibir a replicação celular ou provocando lesões irreparáveis na cadeia [3]. A maioria dos agentes quimioterapêuticos pode ser dividido em agentes alquilantes, antimetabolitos e agentes intercalantes de DNA [4, 5, 6].

1.2.1. Triazenos: agentes alquilantes

Os triazenos são espécies químicas constituídas por cadeias abertas contendo três átomos de azoto ligados entre si (grupo diazoamina), como observado na Figura 1. Estas cadeias de azoto podem ser facilmente estabilizadas por substituintes orgânicos nos azotos terminais, levando à formação de diversos análogos [7].

terminais, levando à formação de diversos análogos [7]. Figura 1 - Representação química do composto triazeno

Figura 1 - Representação química do composto triazeno genérico

Estes compostos são alvo de muitas pesquisas científicas, uma vez que,

alterando a sua estrutura química, os derivados podem adquirir diferentes propriedades, entre elas: atividade antimicrobiana, antifúngica, mutagénica, anticarcinogénica e teratogénica [8]. O grupo diazoamina é responsável pelas propriedades químicas, físicas e antitumorais destas moléculas [9].

A quimioterapia em monoterapia com agentes quimioterapêuticos é a estratégia

mais usada no tratamento de gliomas em estado avançado [5]. Os triazenos, como a

temozolomida (TMZ), são agentes alquilantes que são usados atualmente no tratamento de gliomas malignos como terapêutica de primeira linha [10].

A TMZ é um agente de alquilação de 2ª geração da classe das imidotetrazinas

que tem sido amplamente utilizado no tratamento de gliomas de alto grau [11]. Pode ser administrada oralmente, atravessa a barreira hemato-encefálica e tem efeitos secundários mínimos (genotoxicidade, náuseas, obstipação, anorexia e fadiga) em relação a outros fármacos alquilantes usados [12]. É uma molécula de baixo peso molecular que, após ingestão oral, é totalmente absorvida e, após 8h da ingestão, é completamente eliminada e, por este motivo, representa um risco reduzido de toxicidade para a medula óssea. A sua eficácia no tratamento de gliomas envolve um primeiro evento caracterizado por alterações na organização da heterocromatina e o seu silenciamento, que é seguido por apoptose e senescência [13]. A TMZ utilizada em clínica é um pró-fármaco (PF), ou seja, é um derivado químico farmacologicamente inativo que, só após a sua transformação, quer por metabolização quer por hidrólise química espontânea, se torna farmacologicamente ativo, libertando o metabolito de ação citotóxica [14, 15, 16] (Figura 2).

o metabolito de ação citotóxica [14, 15, 16] (Figura 2). Figura 2 - Mecanismo de ativação

Figura 2 - Mecanismo de ativação da temozolomida e mecanismo de alquilação do DNA adaptado de

[10]

Após a ingestão, a TMZ é convertida no seu metabolito ativo, sem necessidade de desmetilação enzimática por hidrólise no fígado [12, 17]. Depois de absorvida no intestino, a TMZ sofre um ataque nucleofílico por parte da água e dá-se a abertura do anel heterocíclico formando-se um derivado do monometiltriazeno citotóxico (MMT) e dióxido de carbono. Os MMTs, em meio aquoso, sofrem decomposição espontânea, resultando na formação de uma amina aromática inativa (AAI) e do ião metildiazónio, num processo de conversão irreversível dependente do pH. Este ião, por sua vez, alquila os ácidos nucleicos impossibilitando a divisão celular. A interação final do agente com o DNA consiste na transformação da base guanina através da metilação nas posições N 7 -guanina, O 6 -guanina e O 3 -adenina do DNA [10]. Os efeitos citotóxicos/mutagénicos deste fármaco baseiam-se na presença de aductos de O 6 -Metilguanina que geram desemparelhamentos de bases com a citosina e a timina. Estes aductos conduzem à morte celular ou, se a célula sobreviver, provocam mutações pontuais somáticas representadas por uma transição C:G → T:A na hélice do DNA [15, 16, 18]. No entanto, as células humanas conseguem desenvolver mecanismos de defesa e de reparação dos danos causados pelos triazenos, o que leva à resistência aos fármacos [10].

1.2.2. Resistência das células tumorais aos triazenos e inespecificidade do tratamento

A resistência inata ou adquirida das células de glioma à terapia com triazenos é um problema que tem surgido devido à diminuição da ação alquilante destes agentes. O mecanismo de resistência destas células está relacionado com a capacidade de reparação das células humanas face aos danos induzidos pelos triazenos. Como foi referido anteriormente, a O 6 -Metilguanina é a principal lesão citotóxica e mutagénica. Após estas alterações no DNA dá-se a reparação celular mediada pela proteína O 6 - alquilguanina-DNA transferase (OGAT), codificada pelo gene O 6 -metilguanina-DNA- metiltransferase. Esta proteína remove os aductos de DNA através de um mecanismo de reação S N 2. Não é considerada uma verdadeira enzima, uma vez que remove o grupo alquilo da lesão por uma reação estequiométrica e a enzima ativa não é regenerada depois de alquilada, sendo assim referida como uma enzima suicida [19, 20]. Os níveis elevados de atividade de OGAT são o principal elemento responsável pela resistência a estes fármacos. Apesar disto, os triazenos têm a capacidade de inativar esta proteína por mecanismos diretos e indiretos [16, 20, 21]. Os fármacos usados atualmente na prática clínica com ação antitumoral afetam células em proliferação de modo sistémico, principalmente as células em divisão ativa,

independentemente da fase em que se encontram. Deste modo, têm capacidade para eliminar um grande número de células malignas (que se encontram em divisão descontrolada) [22]. O maior obstáculo destes fármacos é a falta de especificidade para as células tumorais, pois a concentração do fármaco que atinge o tecido-alvo é reduzida. Além disso, como há uma fraca seletividade, pode provocar uma toxicidade sistémica pois não existe distinção entre as células saudáveis e as células malignas, provocando grandes alterações na proliferação das células saudáveis [23, 24].

1.2.3. Inovações no tratamento do glioma maligno

Como referido anteriormente, a eficácia terapêutica dos triazenos é frequentemente dececionante, devido em grande parte, à falta de seletividade para células tumorais, à baixa concentração do fármaco no local de ação e à ocorrência de resistências do tumor ao tratamento. Deste modo, é importante desenvolver abordagens terapêuticas alternativas, como a síntese de pró-fármacos com melhor atividade terapêutica [25]. A síntese de um pró-fármaco é um importante meio de aumentar a eficiência do fármaco, podendo ser constituído por várias moléculas que, combinadas, tenham uma maior eficácia terapêutica que o fármaco já existente e usado na prática clínica. Um requisito importante do pró-fármaco é que este deve ser convertido rapidamente, ou a uma taxa controlada, no agente terapêutico ativo in vivo e, ao mesmo tempo, ser suficientemente estável in vitro de modo a que possa ser desenvolvido um produto farmacêutico estável [26]. Neste âmbito, os iHDAC têm vindo a emergir como potenciais componentes úteis à terapêutica antitumoral. Estes compostos têm um efeito radiossensibilizador, mas a sua contribuição neste aspeto não é clara. Pensa-se que a radiossensibilização pelos iHDAC é, em alguns casos, influenciada pela expressão da proteína p53 [16]. A proteína p53 é codificada pelo gene supressor de tumor p53, tendo uma importante função no ciclo celular que consiste em reparar o DNA quando ocorre uma mutação nas bases da molécula. Quando não consegue completar a reparação, a proteína induz a apoptose da célula mutada. Esta proteína demonstrou sensibilizar as células de glioma à TMZ por supra-regulação da via apoptótica extrínseca [27]. Outra característica importante destes inibidores é a sua seletividade em termos de alteração da expressão génica em células transformadas. Os iHDAC induzem a acumulação de histonas hiperacetiladas. Este aumento da acetilação das histonas leva ao aumento da expressão de um pequeno conjunto de genes silenciados e, consequentemente, diminui a proliferação celular maligna, aumenta o grau de diferenciação celular e aumenta a apoptose das células malignas [28, 29]. As modificações nas histonas podem criar, estabilizar, romper ou ocluir domínios de

interação na cromatina para proteínas reguladoras, como fatores de transcrição, proteínas envolvidas na condensação da cromatina e reparação do DNA [30, 31].

O ácido valpróico (VPA) é um antiepilético da classe dos iHDAC e é usado em

combinação com a TMZ por ter um efeito sinergético, aumentando a eficiência da apoptose induzida por danos no DNA [32]. Como iHDAC, este aumenta a sensibilidade aos tratamentos de radiação nas linhas celulares do glioma mediada por alterações na expressão genética [16, 33]. O VPA tem efeitos indutivos em certos genes, suprimindo fatores relacionados com o fator nuclear eritróide 2 (Nrf2), fatores de transcrição redox- sensíveis, que participam na resposta antioxidante. Deste modo, induz a produção de espécies reativas de oxigénio, que têm um papel importante na indução da apoptose

[34]. O VPA provoca também a depleção de glutationa e a perda do potencial de membrana mitocondrial, que são efeitos pró-apoptóticos, e é um potente inibidor da enzima citocromo P450 do fígado, que possui interações metabólicas importantes com fármacos utilizados na terapia do glioma. No entanto, a TMZ não necessita de metabolismo hepático que envolva o sistema P450 e demonstra uma fraca interação com o VPA [32]. Neste projeto avalia-se a estabilidade de um híbrido em que se combina um monometiltriazeno e o ácido valpróico numa só molécula.

1.3. Objetivos

A resistência dos tumores aos fármacos triazenos é um grande obstáculo no

tratamento de gliomas. Uma maneira de contornar este problema é associar o triazeno a um composto que diminua a resistência e aumente sinergeticamente o efeito do fármaco [32]. Para tal, fez-se uma associação de um triazeno com o ácido valpróico, dando origem ao pró-fármaco HYBCOM.

O presente projeto consiste na avaliação deste composto híbrido quanto à sua

estabilidade em tampão fosfato salino (pH=7.4) e no plasma humano, assim como a determinação das suas propriedades lipofílicas para determinar a facilidade de absorção

do pró-fármaco. Para o efeito, procedeu-se à análise do híbrido HYBCOM por HPLC.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

HPLC com detetor ultravioleta (UV) é um tipo de cromatografia utilizada em análise de compostos não voláteis ou instáveis termicamente, sendo o seu campo de aplicação muito vasto [35]. Para realizar os estudos de estabilidade por HPLC foi necessário escolher o melhor eluente (fase móvel), para que os tempos de retenção de cada um dos compostos (pró-fármaco e seus produtos de degradação) não ficassem sobrepostos permitindo calcular as integrações das áreas dos mesmos nos cromatogramas. O eluente (fase móvel) escolhido foi uma mistura de acetonitrilo (ACN) J. T Baker de grau HPLC, um solvente orgânico polar que dissolve os compostos sem os decompor, e água desionizada no aparelho desionizador Millipore Direct-Q UV 3. Neste estudo, todas as análises foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC), em que a fase estacionária escolhida foi uma coluna RP-18. Usou-se o detetor Merck Hitachi LaChrom UV Detector L-7400, a bomba Merck Hitachi LaChrom Pump L-7110 e o integrador Merck Hitachi Integrator D-7500.

2.2. Determinação do comprimento de onda máximo de absorção dos compostos

Para determinar o comprimento de onda (λ) no qual ocorre o máximo de absorção do composto híbrido e dos seus produtos de reação recorreu-se à espetroscopia UV/visível no espetrofotómetro Shimadzu UV-160 no intervalo de 200 a 400 nm de comprimento de onda. Na Tabela 1 encontram-se os valores máximos de λ para a amina, MMT e pró-fármaco.

Composto

Comprimento de onda máximo (nm)

Amina

273.4

MMT

286.0

PF

295.4

Tabela 1 - Comprimentos de onda máximos de cada composto.

Os compostos apresentaram máximos de absorção entre 273.4 e 295.4 nm. Optou-se por selecionar o comprimento de onda de 300 nm para os estudos em HPLC pois é um valor próximo dos obtidos no espetrofotómetro e todos os compostos absorvem a esse comprimento de onda.

2.3. Curvas de calibração

Com o objetivo de identificar e quantificar a amina, o monometiltriazeno e o pró- fármaco por comparação com os respetivos padrões foram feitas curvas de calibração. Recorreu-se a várias soluções-padrão com diferentes concentrações de cada composto

em ACN que foram analisadas por HPLC por ordem crescente de concentrações. Para a amina e o MMT foram preparadas soluções-mãe de concentração 10 -4 mol L -1 pesando rigorosamente a quantidade apropriada de composto, na balança analítica Mettler Toledo AB204, e dissolvendo em acetonitrilo. A solução-mãe do pró- fármaco tinha uma concentração de 1 mol L -1 , a partir da qual se fez uma solução de concentração 10 -4 mol L -1 para se proceder às diluições nas mesmas condições que as soluções-mãe preparadas. As soluções usadas para a realização das curvas de calibração foram preparadas por diluição a partir das soluções previamente referidas usando como solvente o acetonitrilo.

A tabela com os dados da preparação das soluções-padrão encontra-se no

Anexo III. As tabelas e representações gráficas das curvas de calibração podem ser

observadas nos Anexos IV e V.

2.4. Estudos cinéticos

A hidrólise do pró-fármaco foi monitorizada por HPLC através da quantificação

do desaparecimento do substrato e aparecimento dos produtos da reação. Para identificar os produtos fez-se a comparação dos seus tempos de retenção com os tempos de retenção dos padrões da amina, MMT e pró-fármaco. Os cromatogramas efetuados podem ser observados no Anexo II. Foi realizada uma eluição isocrática em todos os ensaios e a mistura usada foi acetonitrilo:água (65:35) v/v. Antes da análise, fez-se a desgaseificação da fase móvel por ultra-sons no aparelho de banho ultrassónico Bandelin Sonorex TK 52 durante 20 minutos para evitar a existência de bolhas de ar que interferem na análise.

2.4.1.

Tampão fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4)

Uma alíquota de 10 µL de uma solução do PF em ACN com concentração de 10 - 2 M foi adicionada a 10 mL de PBS (0.01 M, pH=7.4) a 37˚C. A diferentes tempos foram retiradas várias alíquotas da mistura durante 48 horas e analisadas por HPLC a λ=300 nm e fluxo de 1.0 mL/min. O ensaio foi feito em duplicado.

2.4.2. Plasma humano (80% v/v)

2.4.2.1. Procedimento geral para a obtenção de plasma humano Foi recolhido sangue de vários doadores saudáveis em heparinato de sódio. Depois de centrifugado, o sobrenadante foi separado e distribuído por vários frascos de vidro contendo cada um 2 mL de plasma. Estes frascos foram conservados a -70˚C. Antes da sua utilização teve o cuidado de se fazer uma descongelação gradual para evitar uma possível desnaturação das proteínas plasmáticas.

2.4.2.2. Estudos cinéticos em plasma humano Uma mistura de 2 mL de plasma humano e 0.5 mL de PBS foi termostatizada a 37˚C. A esta mistura foi adicionada uma alíquota de 10 µL de uma solução do PF de concentração 10 -2 M em ACN. Várias alíquotas (200 µL) da mistura reacional foram retiradas a diferentes tempos durante 48 horas e colocadas em eppendorfs com 400 µL de ACN em gelo. Os eppendorfs foram centrifugados a 14000 rotações por minuto por 5 minutos e o sobrenadante foi analisado por HPLC com um fluxo de 1.0 mL/min. O ensaio foi feito em duplicado.

2.5. Determinação do logaritmo do coeficiente de partição

2.5.1. Fundamento teórico

A determinação do logaritmo do coeficiente de partição é importante para entender a solubilidade dos pró-fármacos em meio aquoso, em ambiente fisiológico e a sua permeabilidade às membranas celulares (lipídicas). Através desta determinação é possível aferir sobre a capacidade dos pró-fármacos atravessarem as membranas biológicas das células do glioma [14]. Em estudos prévios verificou-se a existência de uma correlação entre a solubilidade de alguns fármacos em lípidos e a sua atividade biológica. Sendo assim, surgiu um modelo que simula o transporte dos fármacos até ao seu local de ação: a capacidade de um composto se distribuir entre o 1-octanol (que simula a membrana lipofílica) e a água (que simula a fase aquosa). O 1-octanol é constituído por uma cadeia alquílica saturada longa e tem um grupo hidroxilo polar que forma ligações de hidrogénio

com a água, o que faz com que se dissolva nesta numa concentração de 1.7 M, levando à saturação. A combinação das cadeias lipofílicas, grupos hidrofílicos e moléculas de água confere ao 1-octanol propriedades bastante semelhantes às das membranas naturais [36]. De modo a determinar a lipofilia de um fármaco, foi proposto o logaritmo do coeficiente de partição (Log P) entre a água e o 1-octanol:

Log P = log [ (composto)

(composto) tampão ]

octanol

(Equação 1)

Este coeficiente indica a tendência preferencial do fármaco para se dissolver numa fase ou noutra. Com base nesta equação, é possível verificar que se um composto for mais solúvel na fase aquosa (tampão), P<1, portanto Log P é negativo. Se o composto for mais solúvel na fase orgânica (octanol), P>1, logo o valor de Log P é positivo [37]. Até um certo limite, os compostos mais lipofílicos interagem mais com a fase lipídica, ou seja, penetram nas membranas lipofílicas facilmente. Contudo, a relação entre o Log P e a penetração não é linear, sendo que, para valores extremos, esta interação torna-se demasiado forte e impede o fármaco de atravessar a fase aquosa ou de se dissolver nesta pois fica retido na camada lipídica. Inversamente, se o Log P tiver um valor próximo de zero, o fármaco fica retido na fase aquosa e não atravessa a fase lipídica. De acordo com estudos de correlação dos fenómenos de dissolução e transporte, pode afirmar-se que os fármacos com um coeficiente de partição octanol- água igual ou superior a 100 (Log P>2) são bem absorvidos. O valor de lipofilia ideal, que corresponde à máxima absorção dos fármacos, é Log P≈2 e poderá ir até 3 [37, 38]. Segundo a Regra dos 5 de Lipinski, um fármaco terá provavelmente uma má absorção oral se Log P>5 [39]. A avaliação da lipofilia através do valor do logaritmo do coeficiente de partição pode ser realizada experimentalmente por HPLC. Paralelamente pode ser feita a sua determinação por um método computacional [40].

2.5.2. Procedimento experimental

A determinação experimental do Log P do pró-fármaco foi realizada no sistema octanol-tampão fosfato. A saturação deste sistema foi conseguida colocando-se uma mistura de 1:1 de octanol e tampão fosfato isotónico (pH 7.4) numa ampola de decantação que ficou em repouso durante a noite.

Para determinar o Log P exp , num eppendorf adicionou-se aproximadamente 2 mg de pró-fármaco a um sistema bifásico constituído por 0.5 mL de octanol (previamente saturado de tampão fosfato isotónico) e 0.5 mL de tampão fosfato isotónico (previamente saturado de octanol). A mistura foi agitada no vortex durante 4 minutos, centrifugada durante 5 minutos e deixada em repouso durante 15 minutos. A alíquota da fase orgânica foi previamente diluída numa proporção de 1:10 em acetonitrilo e só depois analisada por HPLC. O eluente usado foi a mistura ACN:água (65:35) e o fluxo foi de 1 mL/min. A alíquota da fase aquosa foi injetada sem qualquer diluição. O Log P exp foi obtido pela razão das áreas dos picos a 300 nm, correspondentes aos compostos em questão. O ensaio foi feito em duplicado.

2.5.3. Método computacional

De modo a fazer uma previsão teórica do valor de Log P, usou-se o programa ALOGPS 2.1. Através da introdução da fórmula SMILES (simplified molecular-input line- entry system), que é uma especificação para descrever a estrutura de moléculas em forma de notação que usa caracteres ASCII (American Standard Code for Information Interchange), determinou-se o Log P teórico [41]. O valor dado pelo programa foi 4.53.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Estudo de estabilidade em tampão fosfato salino

Realizou-se o estudo da hidrólise do pró-fármaco com tampão fosfato (0.01 M, pH=7.4) a 37˚C, como descrito anteriormente. As reações foram monitorizadas por HPLC. Os produtos da reação foram identificados por comparação com os respetivos padrões (Anexo II). Não foi possível visualizar a amina e o MMT pois não foram detetados no cromatograma picos com os tempos de retenção correspondentes a estes compostos, portanto não foi feita a quantificação destes produtos da reação. O único pico visível e identificável foi o pico correspondente ao pró-fármaco. No Anexo VI é possível observar cromatogramas deste ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 2 encontram-se os valores médios de área detetados ao longo do tempo, relativos ao pró- fármaco.

Tempo / h

Área / mAU

0.00

36570.5

2.50

37657.5

4.75

38802.5

22.50

38967.5

30.50

41008.0

46.50

39552.5

71.75

37795.5

77.00

34463.0

Tabela 2 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas ao longo do tempo no estudo cinético em tampão fosfato

Recorrendo à curva de calibração correspondente ao pró-fármaco (Anexo V), calculou-se a concentração do híbrido ao longo do tempo e pode afirmar-se que é estável em condições semelhantes às fisiológicas. Na Figura 3 estão representadas as concentrações do pró-fármaco ao longo de 77 horas.

6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 [PF] /
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0
20
40
60
80
100
[PF] / µmol L -1

Tempo / h

Figura 3 - Variação da concentração de pró-fármaco ao longo do tempo no ensaio em tampão fosfato pH 7.4

Pela análise da representação gráfica observa-se que a concentração do híbrido se manteve constante ao longo do tempo. Deste modo, os resultados deste estudo cinético mostraram que o pró-fármaco é suficientemente estável em condições fisiológicas, sendo também interessante a avaliação da sua estabilidade em plasma humano.

3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano

O estudo cinético em plasma humano (80% v/v) foi, igualmente, seguido por HPLC. Tal como no estudo anterior, o único pico identificável detetado foi o correspondente ao pró-fármaco. No Anexo VI é possível observar cromatogramas deste ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 3 encontram-se os valores médios de área detetados ao longo do tempo, relativos ao pró-fármaco.

Tempo / h

Área / mAU

0

1204886.0

2.50

1296815.0

6.50

1281402.0

21.50

1391722.5

26.00

1402908.0

28.00

1382506.0

48.00

1252533.5

Tabela 3 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas ao longo do tempo no estudo cinético em plasma humano

Do mesmo modo, recorreu-se à curva de calibração do pró-fármaco (Anexo V) para calcular a sua concentração ao longo do tempo com o objetivo de avaliar a sua degradação. Na Figura 4 estão representadas as concentrações do pró-fármaco ao longo de 48 horas.

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
[PF] / µmol L-1

Tempo / h

Figura 4 - Variação da concentração de pró-fármaco ao longo do tempo no ensaio em plasma humano 80% (v/v)

Analisando os resultados obtidos é possível observar-se que o pró-fármaco apresenta boa estabilidade em plasma humano durante 48 horas pois não houve grandes variações da concentração detetada do híbrido.

3.3. Determinação do logaritmo do coeficiente de partição

Para se conseguir determinar o valor de Log P exp fez-se a análise de alíquotas das fases aquosa e orgânica por HPLC. As análises foram feitas em triplicado. Os valores de área da fase orgânica foram multiplicados por 10 (fator de diluição) após a análise. Na Tabela 4 pode observar-se os valores de área correspondentes às duas fases. Os cromatogramas correspondentes podem ser observados no Anexo VIII.

Área / mAU

Fase aquosa

3103.167

Fase orgânica

27628355

Tabela 4 - Valores das áreas correspondentes ao pró-fármaco detetadas no estudo da determinação do Log P

De acordo com a Equação 1, efetuou-se o cálculo do valor de Log P exp .

Log P = log [ 27628355

3103.167 ]= 3.95

Comparando os valores dos logaritmos dos coeficientes de partição teórico (4.53) e experimental, verificou-se que o valor experimental se encontra próximo do que se espera obter teoricamente. Sendo este um valor positivo e superior a 1, é indicativo de que a molécula é mais solúvel em octanol, ou seja, apresenta um comportamento lipofílico. Isto também permite explicar o fato dos picos do cromatograma da fase aquosa serem tão pequenos, pois o pró-fármaco é pouco solúvel em água.

4. CONCLUSÃO

Analisando os resultados obtidos, é possível concluir que o híbrido em estudo tem uma grande probabilidade de sucesso como pró-fármaco no tratamento do glioma maligno. No que respeita aos estudos cinéticos de estabilidade em tampão fosfato 0.01 M pH 7.4 a 37˚C, o pró-fármaco mostrou ser estável durante um longo período de tempo (77 horas). Por este motivo, terá uma semi-vida bastante longa pois não se verificou degradação durante o período do estudo. Relativamente aos ensaios em plasma humano 80% (v/v), estes possibilitam determinar o comportamento do composto híbrido no plasma, que contém diversas enzimas que podem ou não interferir no mecanismo do pró-fármaco. Através deste estudo verificou-se que o composto se manteve estável durante 48 horas estando na presença de enzimas plasmáticas. Isto significa que não foi degradado antes de alcançar o local alvo, as células gliais malignas. Na determinação do logaritmo do coeficiente de partição, o valor obtido foi semelhante ao teoricamente previsto, portanto considera-se que os valores são concordantes. O pró-fármaco apresenta um valor de Log P próximo de 4, o que demonstra a sua afinidade para com a membrana lipídica. É de referir que, como o valor de Log P desta molécula é inferior a 5, o híbrido obedece a um dos parâmetros da Regra dos 5 de Lipinski, tendo uma maior probabilidade de ter uma boa absorção oral. Um próximo passo neste estudo pode passar por realizar ensaios com culturas de células com o objetivo de averiguar se o híbrido tem uma maior seletividade para as células gliais malignas. Outros estudos podiam ser feitos no sentido de esclarecer a influência da ação do ácido valpróico no pró-fármaco em relação a outros iHDAC.

AGRADECIMENTOS

Desejo expressar os meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste projeto:

À Professora Maria Eduarda Mendes pela oportunidade que me deu, pela sua orientação e disponibilidade prestadas no decorrer do trabalho, assim como pelas críticas, correções e sugestões apontadas a este documento;

À Professora Maria de Jesus Perry pela disponibilidade, auxílio e conhecimentos transmitidos no decorrer do projeto;

À Susana Lucas por todos os conhecimentos transmitidos relativamente aos aparelhos a utilizar, pela sua paciência e boa disposição;

A todos os amigos que me ajudaram a concretizar este objetivo, em especial à Sara Reis e à Inês Ferreira pela paciência e prontidão na ajuda na revisão do presente manuscrito. Ao Rodrigo Murteira, Joana Camilo e Bruno Segurado pela amizade, palavras de encorajamento e força.

À minha família por toda a motivação e compreensão durante o decorrer do projeto.

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ANEXOS

Anexo I

ANEXOS Anexo I Figura A.1 - Classificação da OMS dos tumores do Sistema Nervoso Central [2]

Figura A.1 - Classificação da OMS dos tumores do Sistema Nervoso Central [2]

Anexo II

Anexo II Figura A.2 - Cromatograma correspondente ao padrão de amina aromática Figura A.3 - Cromatograma

Figura A.2 - Cromatograma correspondente ao padrão de amina aromática

- Cromatograma correspondente ao padrão de amina aromática Figura A.3 - Cromatograma correspondente ao padrão de

Figura A.3 - Cromatograma correspondente ao padrão de monometiltriazeno

Figura A.4 - Cromatograma correspondente ao padrão de pró-fármaco 22

Figura A.4 - Cromatograma correspondente ao padrão de pró-fármaco

Anexo III

[composto] / µmol L -1

V solução-mãe / mL

V

acetonitrilo

0.50

0.05

 

9.95

1.00

0.10

 

9.90

2.50

0.25

 

9.75

5.00

0.50

 

9.50

7.50

0.75

 

9.25

10.00

1.00

 

9.00

Tabela A.1 - Preparação das soluções de amina, MMT e pró-fármaco para as curvas de calibração

Anexo IV

[amina] / µmol L -1

Área / mAU

Média das Áreas / mAU

0.50

47966

47213.0

46460

1.00

105051

105912.5

106774

2.50

185289

194200.0

203111

5.00

406015

395668.5

385322

7.50

610696

568865.5

527035

10.00

883725

843361.5

802998

Tabela A.2 - Curva de calibração para a amina aromática em ACN

[MMT] / µmol L -1

Área / mAU

Média das Áreas / mAU

 

Sinal não

  Sinal não

0.50

detectado

 

Sinal não

  Sinal não

1.00

detectado

 

66881

 

2.50

49908

56435.7

52518

5.00

86146

91376.5

96607

 

114996

 

7.50

77246

113477.3

148190

10.00

204057

190949.5

177842

Tabela A.3 - Curva de calibração para o monometiltriazeno em ACN

[PF] / µmol L -1

Área / mAU

Média das Áreas / mAU

 

Sinal não

  Sinal não

0.50

detectado

 

Sinal não

  Sinal não

1.00

detectado

2.50

20071

21809.0

23547

5.00

42351

43634.0

44917

7.50

63921

63625.5

63330

10.00

87939

85459.0

82979

Tabela A.4 - Curva de calibração para o pró-fármaco em ACN

Anexo V

1000000 y = 80529x + 3535,3 800000 R² = 0,9927 600000 400000 200000 0 0
1000000
y
= 80529x + 3535,3
800000
R² = 0,9927
600000
400000
200000
0
0
2
4
6
8
10
12
Área / mAU

[amina] / µmol L -1

Figura A.5 Representação gráfica da curva de calibração para a amina aromática em ACN

250000 200000 y = 17026x + 6649,2 R² = 0,9297 150000 100000 50000 0 0
250000
200000
y
= 17026x + 6649,2
R² = 0,9297
150000
100000
50000
0
0 2
4
6
8
10
12
Área / mAU

[MMT] / µmol L -1

Figura A.6 - Representação gráfica da curva de calibração para o monometiltriazeno em ACN

100000 y = 8437,7x + 896,5 80000 R² = 0,9997 60000 40000 20000 0 0
100000
y
= 8437,7x + 896,5
80000
R² = 0,9997
60000
40000
20000
0
0 2
4
6
8
10
12
Área / mAU

[PF] / µmol L -1

Figura A.7 - Representação gráfica da curva de calibração para o pró-fármaco em ACN

Anexo VI

Anexo VI Figura A.8 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 0

Figura A.8 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 0

h)

ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 0 h) Figura A.9 - Cromatograma correspondente ao

Figura A.9 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 30.5 h)

Figura A.10 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 77 h)

Figura A.10 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em tampão fosfato (tempo 77 h)

Anexo VII

Anexo VII Figura A.11 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 0

Figura A.11 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 0 h)

Figura A.12 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 21.5 h)

Figura A.12 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 21.5 h)

Figura A.13 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 48 h)

Figura A.13 - Cromatograma correspondente ao pró-fármaco no estudo em plasma humano (tempo 48 h)

Anexo VIII

Anexo VIII Figura A.14 - Cromatograma correspondente à fase aquosa para a determinação de Log P

Figura A.14 - Cromatograma correspondente à fase aquosa para a determinação de Log P

Figura A.15 - Cromatograma correspondente à fase orgânica para a determinação de Log P 33

Figura A.15 - Cromatograma correspondente à fase orgânica para a determinação de Log P