INMUNOHISTOQUMICA

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son glucoprotenas producidas por

los linfocitos B (convertidos en clulas plasmticas) en respuesta a una
protena extraa o antgeno
Los anticuerpos estn formados por dos
cadenas pesadas y dos ligeras. Contienen un
dominio constante y otro variable en cada
una de las cadenas ligera y pesada. La regin
de unin al antgeno est conformada por los
dominios variables de la cadena pesada y
ligera en el extremo amino terminal del
monmero de anticuerpo
La regin constante se llama as porque es
similar en las distintas molculas de
inmunoglobulinas de una especie

INMUNOHISTOQUMICA

En el laboratorio los anticuerpos pueden purificarse del suero de

animales tras inyectrsele el antgeno que se quiere identificar en la
preparacin

El continuacin el anticuerpo que reconoce a la protena que deseamos

identificar puede:

conjugarse con un fluorocromo: inmunofluorescencia

conjugarse con una enzima que catalice una reaccin que genere un
cromforo: mtodos enzimticos

ESTRUCTURA BSICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Propiedades

IgG

IgM

IgA

IgD

IgE

Cadenas pesadas

Cadenas ligeras

% en sangre

80

15

<1

<1

N unidades

12

Activa complemento

++

++++

INMUNOHISTOQUMICA

Existen varios tipos de anticuerpos, de los cuales los IgG son los ms
abundantes en suero y los que ms utilidad tienen en tcnicas de
laboratorio

Antgeno es la molcula a la cual se une el anticuerpo. Son de muy

distinta naturaleza. Fundamentalmente los Ac reconocen protenas,
pero tambin se sintetizan Ac contra carbohidratos, lpidos, ac.
nucleicos, compuestos orgnicos sintticos, etc. La regin del antgeno a
la cual se une el anticuerpo se denomina eptopo. Los eptopos pueden
estar formados por regiones contiguas o no en la secuencia de
aminocidos de una protena.

La unin antgeno-anticuerpo es una unin reversible y de alta afinidad.

La produccin de anticuerpos consiste bsicamente en:

a)

Preparacin del antgeno,

b) Inyeccin de este a un animal y

c)

Obtencin del suero del suero del animal.

INMUNOHISTOQUMICA

Se administran varias inyecciones al animal, separadas por varias

semanas (Generalmente se ponen 3 inyecciones para que la cantidad
de Ac fabricada sea mayor. Una inyeccin cada 4 semanas)

A la 10 semana se desangra el animal

OBTENCIN DEL SUERO:

El suero contiene multitud de anticuerpos diferentes contra

diferentes molculas, incluso en animales superinmunizados contra
un antgeno, los anticuerpos circulantes contra ese antgeno no
superan la dcima parte del total.

Los anticuerpos contra nuestro antgeno presentes en el suero no son

de un slo tipo: hay multitud de ellos, que reconocen diferentes
partes del antgeno (anticuerpos policlonales).

INMUNOHISTOQUMICA
Proceso de obtencin del suero: cromatografa de afinidad

En esta tcnica se une el antgeno (el mismo que se utiliz para la inoculacin)
a unas bolitas

Una vez recubiertas por el antgeno se empaquetan las bolitas en un tubo

fino (se le llama columna) y se hace pasar el suero que se desea purificar

Los anticuerpos especficos para el antgeno son retenidos y el resto de los

anticuerpos y protenas del suero salen

El paso final es la ruptura de las uniones entre antgeno y anticuerpos cosa

que se hace aadiendo a la columna una solucin hipertnica u otra con pH
cido, con lo que los anticuerpos especficos se eluyen (salen) por la parte
inferior

ANTICUERPOS POLICLONALES
Inmunizacin del conejo (rabbit)
Con el antgeno deseado (GFAP-h)

Extraccin de Acs
policlonales del suero
sanguneo del conejo
(Ej. Rabbit anti-human GFAP)

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Reconocen
diferentes regiones
en un antgeno.
Son menos
especficos y ms
baratos. Se
obtienen
directamente del
suero del animal

Inmunizacin del ratn (mouse)

con el antgeno deseado (GFAP-h)
Linfocitos B
(bazo ratn)

C. Mieloma Mltiple
de ratn

HBRIDO
(produce Acs monoclonales)
Clonacin de HBRIDOS
ms productivos
(Ej: Mouse anti-human GFAP)

alta especificidad
(reconocen una
regin especfica
del antgeno). Son
ms caros

OBTENCIN ANTICUERPOS MONOCLONALES

Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B

del bazo de un animal que ha sido expuesto al antgeno. Estas clulas B
son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con clulas
tumorales de mieloma mltiple (un tipo de cncer) que pueden crecer
indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a las membranas
celulares ms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas, llamadas
hibridomas pueden multiplicarse rpida e indefinidamente, puesto que
son clulas tumorales despus de todo y pueden producir gran cantidad
de anticuerpos
Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener
un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales producen slo
un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son
analizados para conocer su capacidad de unirse a un antgeno
determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y para
seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva.

INMUNOHISTOQUMICA
INMUNOHISTOQUMICA DIRECTA: es la ms antigua. Se sirve de un Ac primario maracado con
un fluorocromo. Comprende un solo paso. Seal dbil. Fue reemplazado por los mtodos
indirectos

INMUNOHISTOQUMICA INDIRECTA: Al anticuerpo primario se une ms cantidad de

anticuerpo secundario marcado, efecto de amplificacin. Ms sensible

INMUNOHISTOQUMICA
En el mtodo directo el antgeno especfico es inyectado a un animal ej.
ratn y posteriormente se conjuga con una enzima o un fluorocromo
En el mtodo indirecto el anticuerpo primario se sintetiza de la misma forma
pero no se marca (ej. en un ratn). El anticuerpo secundario debe reconocer
la regin constante del anticuerpo de ratn y por tanto se genera en otro
animal ej. cabra. Los anticuerpos de cabra anti-ratn van a ser capaz de
reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones dado
que reconocen la porcin constante (que no vara) de una inmuglobulina
especfica). Por tanto, en un laboratorio se procurar que el anticuerpo
primario sea desarrollado siempre en el mismo animal (ej. ratn) y se tendr
un nico secundario marcado (ej cabra-anti-ratn) que reconocer a
cualquiera de los primarios independientemente del antgeno que
reconozcan. Su uso presenta ciertas ventajas econmicas, por permitir a un
laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios
marcados

INMUNOHISTOQUMICA
Inmunofluorescencia
El anticuerpo secundario se marca con un fluorocromo y la preparacin se
observa en el microscopio de fluorescencia
La muestra marcada con fluorescencia est hidratada y la vida media de la
preparacin es ms corta, adems la fluorescencia tambin se degrada con
el tiempo

ab2433: anti p53

TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS
A.- DIRECTA

Ac conjugado con fluorforo o enzima

Rpido, caro, poco sensible

B.- INDIRECTAS

B1.- DOS CAPAS DE Acs

Ac 1ario NO conjugado
Ac 2ario Conjugado ej. Fluorocromo
Ms sensible que anterior
B2.- TRES CAPAS:
Muy sensibles, mayor riesgo de uniones inespecficas
B2.1..- Mtodo PAP/APAAP
Acs 1ario y 2ario No conjugados
Ac 2ario en exceso (puente)
Complejo PAP/APAAP realizado en el mismo animal
que el Ac 1ario
B2.2.- Mtodo ABC
Ac 1ario NO conjugado
Ac 2ario biotinilado
Avidina conjugada con peroxidasa
Revelado de la peroxidasa
DAB + H2O2 DAB oxidada(marrn) + 2H2O + O2

Tcnicas enzimticas

INMUNOHISTOQUMICA

El anticuerpo secundario o terciario se conjuga con una enzima que cataliza una reaccin
que genera con cromforo

Peroxidasa-Antiperoxidasa (PAP): tres capas

La peroxidasa es una enzima que en presencia de perxido de hidrgeno es capaz de

oxidar a un compuesto denominado diaminobencidina (DAB) generando un producto
marrn insoluble (Nota: la DAB es altamente txica y cancergena lo que requiere extremo
cuidado durante su manipulacin)

La peroxidasa se inyecta a un animal y se obtienen los anticuerpos anti-peroxidasa. A

continuacin se forma un complejo de peroxidasa-anticuerpo (peroxidasa-antiperoxidasa)

El proceso consta de tres pasos:

Se aade el Ac primario que reconoce el Ag (ej. en ratn)

Se aade el anticuerpo secundario cabra- anti-ratn en exceso. El secundario va a

reconocer tanto al primario como al terciario (complejo peroxidasa-antiperoxidasa)

Se aade el terciario (complejo PAP), que tiene que haber sido desarrollado en el mismo
animal que el primario

Se aade H2O2 y DAB y se forma el precipitado coloreado. Observacin en microscopio

ptico

El aumento de sensibilidad en esta tcnica se debe a que por cada unin antgenoanticuerpo, existen numerosas molculas de peroxisasa

NOTA: es necesario el uso de tres anticuerpos porque en el complejo PAP, la enzima est unida
al anticuerpo en el lugar de reconocimiento al antgeno

TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS
A.- DIRECTA

Ac conjugado con fluorforo o enzima

Rpido, caro, poco sensible

B.- INDIRECTAS

B1.- DOS CAPAS DE Acs

Ac 1ario NO conjugado
Ac 2ario Conjugado
Ms sensible que anterior
B2.- TRES CAPAS
Muy sensibles, mayor riesgo de uniones inespecficas
B2.1..- Mtodo PAP/APAAP
Acs 1ario y 2ario No conjugados
Ac 2ario en exceso (puente)
Complejo PAP/APAAP realizado en el mismo animal
que el Ac 1ario
B2.2.- Mtodo ABC
Ac 1ario NO conjugado
Ac 2ario biotinilado
Avidina conjugada con peroxidasa
Revelado de la peroxidasa
DAB + H2O2 DAB oxidada(marrn) + 2H2O + O2
mayor sensibilidad

INMUNOHISTOQUMICA
Tcnicas enzimticas
Mtodo de la avidina-biotina: Mtodo ABC (Avidin Biotin Complex)

Se basa en la gran afinidad que tienen la avidina y la biotina que se conjugan

fcilmente mediante unin fuerte (no inmune)

Adems la biotina se conjuga muy fcilmente con anticuerpos (se considera que
150 molculas de biotina se unen a una sola molcula de anticuerpo)

El anticuerpo primario no est conjungado y se une al antgeno

El anticuerpo secundario est marcado con biotina (anticuerpo biotinilado)

Tras la incubacin con los anticuerpos se aade a la muestra un complejo de

avidina unida a peroxidasa

Se aade H2O2 y DAB

La sensibilidad se ve aumentada de manera notable al producirse una extensa

malla que contiene molculas de peroxidasa por cada unin de antgeno
anticuerpo

Este mtodo es muy usado debido a la gran sensibilidad y el fuerte enlace no

inmune entre avidina-biotina

VENTAJAS E INCONVENENTES DE INMUNOFLUORESCENCIA VS. TCNICAS

ENZIMTICAS CON PEROXIDASA

La preparacin de inmunofluorescencia tiene una vida media corta dado que la muestra
est hidratada y el fluorocromo se degrada. La imagen se puede conservar digitalizada. Se
necesita tener un microscopio de fluorescencia para observar estas preparaciones

Las preparaciones realizadas mediante el mtodo de las peroxidasa se conservan

deshidratadas en medio de montaje de forma indefinida. Adems la observacin se
realiza mediante un microscopio ptico comn

Obtenido de: Histologa y embriologa del ser humano

Escrito por Aldo R. Eynard,Mirta A. Valentich,Roberto A. Rovasio

Esta diapositiva no la vimos en clase y nicamente es informativa

Factores que influyen en la inmunomarcacin
En la evaluacin de las inmunomarcaciones son importantes dos elementos: 1) el
factor preanaltico (intrnseco) y 2) el factor analtico (extrnseco).
1) El factor pre-analtico se refiere a las caractersticas del tejido y su preservacin
antignica. La conservacin adecuada de las caractersticas antignicas del tejido
depende del tipo de fijador empleado, de la fijacin adecuada, y del tiempo de la
fijacin. El formol buffer al 10% es el fijador ms utilizado. El pH del formol tiene
influencia directa en la conservacin antignica del tejido y la variacin de este
puede alterar la estructura proteica de los eptopes. Algunos procedimientos
tcnicos, como el sobrecalentamiento del tejido, la descalcificacin y la congelacin,
tambin pueden afectar la preservacin antignica.73
2) Los factores analticos (extrnsecos) son los elementos externos al tejido que
pueden controlarse en el laboratorio de inmuohistoqumica e incluyen: el tipo
de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y dilucin, el sistema de deteccin, los
cromgenos empleados, el mtodo de recuperacin utilizado y la interpretacin
de la reaccin.

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Obtenido de: El Diagnstico en Clnica Estomatolgica. Escrito por Eduardo L. Ceccotti

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Falsos positivos por biotina endgena
La biotina es una protena que acta como cofactor en la reaccin de
descarboxilacin, es parte del complejo de la vitamina B, y se encuentra en
clulas ricas en mitocondrias, como en las clulas de los tbulos
contorneados proximales del rin, los hepatocitos, las clulas apcrinas y
las clulas de Hrthle de la tiroides. La forma de solucionar esta marcacin
de biotna endgena es con la inmunomarcacin con un bloqueo avidinabiotina o un sistema de deteccin alternativo que no incluya avidinabiotina, como el sistema peroxidasa-antiperoxidasa
Falsos positivos por peroxidasa endgena
Cualquier mtodo de marcaje con peroxidasa encierra el inconveniente de
que en los tejidos hay peroxidasa endgena que puede dar falsos positivos.
Por eso es muy importante inhibir la actividad endgena de dicha enzima
con agua oxigenada en una solucin tamponada

HIBRIDACIN IN SITU

Hibridacin: describe la capacidad de las molculas monocatenarias de

ADN y ARN de hibridar con secuencias complementarias

Debido a la alta especificidad de la hibridacin es posible demostrar con

gran especificidad la presencia de determinadas secuencias de ADN o ARN
en su localizacin celular

Para la tcnica de hibridacin in situ se utiliza un sonda (probe) formada por

una secuencia de cido nucleico monocatenario con una secuencia de
bases conocida complementaria a la secuencia de bases que se desea
demostrar

Las sondas pueden tener entre 20-40 nucletidos como mnimo y permite
la deteccin de secuencias de nucletidos tan pequeas como 10 o 20
copias de mRNA o DNA por clula

Las sondas se producen en el laboratorio y originalmente se marcaban con

un istopo radiactivo (ej. clonando en bacterias o mediante PCR en
presencia de [-32P]-dCTP)

Los istopos (3H, 32P, 35S, 125I ) emiten radiacin ionizante debido a la
inestabilidad de sus ncleos) capaz de imprimir pelculas/emulsiones
fotogrficas

Esta diapositiva no la vimos en clase y nicamente es informativa

HIBRIDACIN IN SITU

Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro asociado

a la utilizacin de radiactividad. Para evitar este peligro se desarrollaron
otros mtodos de marcaje basados en anticuerpos.

Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula
que puede ser reconocida por anticuerpos como la digoxigenina

La digoxigenina (DIG) se enlaza en la posicin C5 de la uridina. Los

nucletidos marcados con DIG pueden ser incorporados a las sondas de
cidos nucleicos por DNA polimerasas o RNA polimerasas

Las sondas DIG-marcadas son detectadas con una alta especificidad por
anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son conjugados a fosfatasa
alcalina, peroxidasa, fluorocromos (este es el caso de la tcnica FISH) u oro
coloidal

HIBRIDACIN IN SITU
Si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de ADN en las
clulas de un corte histolgico o en un preparado especial de cromosomas:

Primero se expone el preparado a un pH bsico que induce la separacin de

la doble cadena de ADN por desnaturalizacin

Despus se agrega la sonda que puede poseer una cadena complementaria

de ADN o ARN

Una vez hibridada con zonas complementarias en los cromosomas del

ncleo, la sonda se hace visible bien por su marcaje radiactivo mediante
autorradiografa , bien por su marcaje fluorescente en la tcnica FISH o
mediante otras tcnicas

Si se desea demostrar la presencia de molculas especficas de RNA (es

decir, la expresin de determinados genes) no se efecta ningn
tratamiento previo de los cortes a pH elevado, dado que no interesa que las
cadenas de ADN estn separadas y puedan pegarse a la sonda

En este caso es suficiente incubar los cortes con la sonda

TCNICA FISH

Significa hibridacin in situ con fluorescencia

La sonda bien se marca directamente con fluorocromos o indirectamente

(uniendo a la sonda molculas que son reconocidas por anticuerpos
marcados ej. digoxigenina o biotina)

Tiene un uso muy difundido en clnica para las pruebas genticas Ej. la
hibridacin de una sonda con cromosomas en metafase puede usarse para
la localizacin cromosmica de un gen

Tambin puede usarse en expresin gnica y distribucin de productos

gnicos como protenas anormales

Actualmente hay sondas disponibles en el mercado para deteccin de

cncer de cuello uterino, deteccin de clulas infectadas por HIV, para
determinar nmero de translocaciones cromosmicas (ej. en linfocitos de
astronautas son un indicador de la radiacin absorbida)

Tambin se emplea en deteccin de alteraciones cromosmicas en el

diagnstico prenatal

ncleos en interfase de clulas procedentes de lquido amnitico

AUTORRADIOGRAFA

Se utiliza como mtodo de revelado en la tcnica de hibridacin in situ con marcaje

radiactivo que vimos en el apartado anterior

Gracias a l se puede localizar la situacin concreta de material radiactivo dentro de

un tejido concreto, dentro de una clula o de una parte de ella

Tambin se utiliza para seguir el camino de una sustancia. En este caso puede
llevarse a cabo una autorradiografa in vivo o in vitro en cuyo caso, se inyecta al
animal vivo o se aade al cultivo celular las molculas precursoras marcadas con
radiactividad (nucletidos o aminocidos)

Este tipo de autorradiografa ha servido para el estudio de procesos como la sntesis

de ADN y la divisin celular, la sntesis y secrecin de protenas o su ubicacin en la
matriz o en el interior celular

Los cortes de las muestras o los preparados celulares en los que se ha incorporado el
material radiactivo se montan en un portaobjetos

En la oscuridad el portaobjetos se sumerge brevemente en una emulsin fotogrfica

de sales de plata (AgBr)

La radiacin ionizante tiene el mismo efecto que los fotones que inciden en la
pelcula fotogrfica de modo que en el lugar donde exista emisin de radiacin el in
Ag+ se transforma en metal generando una mancha negra

El perodo de exposicin puede durar das o semanas se aplica un revelador qumico

AUTORRADIOGRAFA

Los preparados se pueden teir antes de la exposicin y revelado o despus

En la observacin con microscopio se distinguen los granos de plata

metlica como pequeas manchas o puntos negros en los sitios de
localizacin de sustancia radiactiva

autorradiograga
replicacin bacterias
bidireccional

John Cairns (Australiano)

trabaj con bacterias (E.
Coli) y las cultiv en un
medio con timidina
titriada (H-3), luego
rompi las celulas,
extrajo el ADN y le hizo
una autoradiografa. La
autoradiografa mostr
que el ADN muestra una
burbuja de replicacin,
que crece hasta replicar
totalmente el
cromosoma bacteriano
circular. La replicacin