1.

INTRODUCCIN
En la naturaleza los microorganismos usualmente existen en biofilms
grupos de diferentes microorganismos organizados en cepas sobre
una superficie cooperatividad y competencia.
El crecimiento
implica un aumento ordenado de todos los
componentes celulares de un organismo y no solamente de alguno de
ellos, que puede tener como resultado el incremento de su tamao o
del aumento de la poblacin.

2. FUNDAMENTO TERICO
2.1 Saccharomyces cerevisiae

Las Levaduras comprenden a la actualidad, 39 gneros y 350

especies. Se identifican y clasifican basndose en caractersticas
morfolgicas y fisiolgicas .Entre los aspectos morfolgicos
considerados, se encuentran el tamao y las formas de las clulas, en
medio slido y liquido especificados ya que pueden presentar
Dimorfismo, el modo de reproduccin y si forma velo en la superficie
o sedimenta en un medio lquido. Dentro de las caractersticas
fisiolgicas consideradas, se encuentra si puede crecer y fermentar
en un determinado carbohidrato y si puede usar o no determinadas
fuentes de nitrgeno como los nitratos. Las clulas de levadura
pueden ser ovales, esfricas, tener forma de limn o de cigarro puro,
pueden dividirse mediante gemacin. La levaduras Saccharomyces
cerevisiae son hongos unicelulares Eucariticos, hetertrofos,
osmotrficos (no ingieren sus alimentos lo absorben por digestin
externa del sustrato empleando exoenzimas) se reproducen por
gemacin. Los Hongos son un grupo aparte no son consideradas
clulas animales por que presentan pared celular externa que la
recubre compuesta polisacridos de celulosa y quitina, tampoco son
consideradas clulas vegetales ya que carecen de cloroplastos y no
realizan fotosntesis. Una clula de una levadura de cerveza tpica
tiene, cuando se halla completamente desarrollada entre 8 y 14 m
de dimetro y una masa de materia seca de aproximadamente 40pg.
Por tanto 1012 clulas desecadas pesan unos 40g. En vivo prensado,
ese nmero de clulas pesan unos 200g. TUBB y HAMMOND en
(1987) definieron las caractersticas ms importantes para una
levadura de cervecera: - Una fermentacin rpida pero sin exceso de
crecimiento en biomasa de la levadura - Una buena conversin de la
maltosa y de la maltotriosa en etanol - Resistencia al etanol Resistencia a la presin osmtica - Perfiles aromticos equilibrados y
reproductibles - El carcter de flocular eventualmente - Una buena
estabilidad gentica a lo largo del tiempo.
2.2 Enzimas
Todas las reacciones que se efectan en los seres vivos son
catalizadas por enzimas. Estas hacen posible que las reacciones
metablicas se desarrollen a un ritmo razonable, compatible con la
vida. El trmino catalizador se emplea para referirse a cualquier
sustancia que acelera el transcurso de una reaccin qumica, sin
intervenir en ella ni como reactivo ni como producto. El catalizador no
provoca la reaccin solo afecta la velocidad con que ocurre la misma.
Esto es posible porque los catalizadores disminuyen la energa de
activacin como lo indica el siguiente grfico
Los enzimas son catalizadores especficos: cada enzima cataliza un
solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o

sobre un grupo muy reducido de ellos. En una reaccin catalizada por

un enzima:
La sustancia sobre la que acta el enzima se llama sustrato.
El sustrato se une a una regin concreta del enzima, llamada centro
activo. El centro activo comprende (1) un sitio de unin formado por
los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato y (2) un
sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados
en el mecanismo de la reaccin
Una vez formados los productos el enzima puede comenzar un nuevo
ciclo de reaccin

Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan

reacciones especficas. Sin embargo hay distintos grados de
especificidad. El enzima sacarasa es muy especfico: rompe el
enlace b-glucosdico de la sacarosa o de compuestos muy similares.
As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural,
mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos anlogos. El
enzima acta con mxima eficacia sobre el sustrato natural y con
menor eficacia sobre los sustratos anlogos. Entre los enzimas poco
especficos estn las proteasas digestivas como la quimotripsina, que
rompe los enlaces amida de protenas y pptidos de muy diverso tipo.

2.3 Crecimiento microbiano

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de

microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al
crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino
al demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el
crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tambin para

entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los

virus se produce de otra forma diferente y ser tratada al final de este captulo.
Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo
largo del ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis
de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao
doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas.
La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en
general, de los mismos factores de los que depende este.
El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de
todos los individuos de dicha poblacin.
Los cultivos de microorganismos de los que hemos hablado son
asincrnicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un
punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento
determinado en un cultivo se encuentran clulas que acaban de dividirse,
otras que estn replicando su ADN, otras que estn creciendo, otras que estn
iniciando la divisin celular, etc.
En un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en
la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy
difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a
los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza,
las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas
a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del
cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo la poblaciones naturales
probablemente se comporten como relativamente sincrnicas.
Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes
nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los
microorganismos es en la mayora de los casos depende de su nmero, entender
cmo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o
reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.
2.4 Cultivo de microorganismos

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,

qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En
general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas
del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de
nutrientes en el medio.

2.4.1 Medios de cultivo

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos

qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de
carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el
CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan
carbono orgnico.

La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que

supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del
50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al
1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,
Mb, Cu y Zn.
La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados
en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico
para los hetertrofos y como CO2 para los auttrofos, el N en forma de NH4, de
NO3- o de NO2- o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el
P debe estar en forma de PO43-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO42-, etc.
Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos
aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden
sintetizar.
En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms
concreta es:
C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composicin puede variar ligeramente en
funcin de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la
frmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacin del medio
de cultivo ms adecuado para el mismo.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin
qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn
compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura,
extracto de carne, etc.).
Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn
agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente
agar).
En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser
generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos
mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios),
diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un
tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de
microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos
caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar
Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo
determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran
tamao.
MTODOS DE AISLAMIENTO
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los
casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de
una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones
ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por
individuos iguales (un clon bacteriano).
Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son
cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrnsecas
en el cultivo (microorganismos parsitos de otros), al desconocimiento de los
requerimientos especficos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos

que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofa por
ejemplo).
Se estima que en slo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las
bacterias marinas son cultivables.
Existen procedimientos de enriquecimiento del nmero de bacterias de ambientes
naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski
que crea un microcosmos para enriquecer el nmero de ciertos tipos de
microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su
aislamiento.
4.3 Crecimiento microbiano en medio lquido

Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas

que se producen en cada divisin continan su vida independientemente
formndose una suspensin de clulas libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento
microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es
mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias
consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del
nmero de clulas durante esta fase se explica con los modelos matemticos que
describiremos a continuacin.
3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la
masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan
un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una
acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener
importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque
se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho
que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito
para el crecimiento microbiano.
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con
mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los
ambientes naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables
del cultivo.

4.4 Medida del crecimiento y enumeracin de microorganismos

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos.

Los principales, se enumeran a continuacin:
1.- Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy
pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales
denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es
necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml.
2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin
dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en
suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de
medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser
del orden de 10 por ml.
3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o
muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables
contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de
una clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es
necesario contar ms de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de
microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de
una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana
en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.
4.- Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas.
Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas;
pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas.
5.- Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN,
protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.
6.- Medida de actividad metablica de las bacterias como que respiran producen una
disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del
consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales
como el azul de metileno).
5

4.3 CAMARA DE NEUBAUER IMPROVED PARA EL RECUENTO DE

LEVADURAS
Consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy
pequeos de suspensiones de clulas. Se usan unos portaobjetos
especiales denominados cmaras de Neubauer Improved. Est
diseada de manera de contener una cantidad fija de suspensin
celular lquida. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado
dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez, dividido
en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona
cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que
cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1
mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina que el lquido
quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Para que la medida sea
correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105
clulas/ml.

3. DETALLES EXPERIMENTALES
3.1
Materiales

o
o
o
o

Cultivo puro saccharomyces cereviciae

Erlenmeyer de 250,500 y 1000 mL con caldo YPG
Pipetas de 1 y 10 mL
Tubos de ensayo 10x70 y 13x125 mm con tapones de
algodn
Tubos de centrfuga
Bureta
Tartrato sdico

o
o
o
o
3.2
Procedimiento
En un matraz de 250 conteniendo 25mL de caldo YPG
inocular

4. CLCULOS EXPERIMENTALES
5.
6.
7.
8.
9.

DISCUSIN DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFIA
APNDICE