Universidade Tecnolgica Federal do Paran

Campus Campo Mouro

Coordenao de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Mrcia R. F. G. Perdoncini
AULA PRTICA 9 e 10: Tcnicas de
semeaduras de microrganismos
INTRODUO
Ao se inocular um microrganismo em um
meio de cultura adequado para seu crescimento
in vitro, esse microrganismo inicia o seu
desenvolvimento nesse meio. A inoculao
correta da amostra um dos passos mais
importantes na identificao de um patgeno e
pode ser feita por meio de swabs, ou de outras
fontes, com uso de alas de inoculao
devidamente esterilizadas. Os meios devem ser
sempre examinados antes da inoculao a fim de
que se verifique a presena de contaminantes j
existentes na placa.
Bactrias so semeadas em meios
lquidos ou em meios slidos. Aps a inoculao,
a placa ou o tubo, devidamente rotulado,
colocado em uma incubadora a 37C por 24 a 48
horas. Quando ocorre o crescimento bacteriano
em um meio slido, as bactrias so
representadas em padres caractersticos,
denominados colnias, grandes grupos de
clulas bacterianas. Em meios lquidos, o
crescimento mostra-se evidente pela existncia
de turvao do lquido. As estrias da semeadura
so feitas a fim de que se consiga o isolamento
dos organismos. Como cada espcie possui um
tipo morfolgico colonial diferente, deve ser feita
a anlise quanto elevao, forma, ao
tamanho, s bordas e pigmentao. Em um
meio de cultura, um nico tipo de colnia
observado denominado cultura pura. Se forem
observados vrios tipos, denomina-se cultura
mista.
H vrias tcnicas de inoculao de
microrganismos. Algumas so utilizadas para
exames qualitativos e outras, para estudos
quantitativos.
OBJETIVOS
- Realizar inoculao em meios de cultura
lquidos, slidos em placa e inclinados (semislidos), verificando a presena ou ausncia de
crescimento bacteriano;
- Realizar semeadura em profundidade;
- Realizar semeadura em superfcie.
MATERIAIS
Tubos de soluo salina estril (9,9mL) ;

Suspenses bacterianas (Escherichia coli)

Staphylococcus aureus e mista);
Tubos de meio lquido tioglicolato;
Tubos com Agar nutriente inclinado;
Tubos com Agar semi-slido (SIM);
Placas de EMB ou McConkey.

PROCEDIMENTO
Prtica
A) Tcnica de semeadura em meio lquidotubos de meio lquido tioglicolato;
Flambar a ala de inoculao ao rubro e,
a seguir, deix-la esfriar perto da chama
do bico de Bunsen;
Tomar o tubo a ser inoculado e identificlo;
Tomar o tubo com a cultura bacteriana
com a mo esquerda e agit-lo
levemente;
Retirar o tampo de algodo com o dedo
mnimo da mo direita e flambar a boca
do tubo;
Introduzir a ala at tocar o meio e retirla aps coletar uma gota da suspenso;
Flambar novamente a boca do tubo e
recolocar o tampo de algodo;
Tomar o tubo com o meio esterilizado com
a mo esquerda, retirar o tampo de
algodo com o dedo mnimo da mo
direita e flambar a boca do tubo;
Introduzir
a
ala
carregada
de
microrganismo no interior do tubo,
levando-a, delicadamente, ao interior do
meio lquido;
Retirar a ala, flambar novamente a boca
do tubo e recolocar o tampo de algodo;
Colocar o tubo na estante, flambar a ala
e recoloc-la na estante.
B) Tcnica de semeadura em meio slido
inclinado (esgotamento): tubos com gar
nutriente inclinado
Flambar a agulha de platina ao rubro e a
seguir, deix-la esfriar perto da chama do
bico de Bunsen;
Tomar o tubo a ser inoculado e identificlo;
Tomar o tubo com a cultura bacteriana
com a mo esquerda e agit-lo
levemente;
Retirar o tampo de algodo com o dedo
mnimo da mo direita e flambar a boca
do tubo;
Introduzir a agulha at tocar o meio e
retir-la aps coletar uma gota da
suspenso;
Flambar novamente a boca do tubo e
recolocar o tampo de algodo;
Tomar o tubo com o meio esterilizado com

a mo esquerda, retirar o tampo de

algodo com o dedo mnimo da mo
direita e flambar a boca do tubo;
Introduzir a agulha carregada de
microrganismo no interior do tubo,
levando-a, delicadamente, ao interior do
meio inclinado, fazendo estrias na
superfcie do Agar com a agulha;
Retirar a agulha, flambar novamente a
boca do tubo e recolocar o tampo de
algodo;
Colocar o tubo na estante, flambar a ala
e recoloc-la na estante.

C) Tcnica de semeadura em meio semislido em tubo (repicagem profunda)MEIO SIM

Flambar a agulha de platina ao rubro e, a
seguir, deix-la esfriar perto da chama do
bico de Bunsen;
Tomar o tubo com a cultura bacteriana
com a mo esquerda e agit-lo
levemente;
Retirar o tampo de algodo com o dedo
mnimo da mo direita e flambar a boca
do tubo;
Introduzir a agulha at tocar o meio e
retir-la, aps coletar uma gota da
suspenso;
Flambar novamente a boca do tubo e
recolocar o tampo de algodo;
Tomar o tubo com o meio esterilizado com
a mo esquerda, retirar o tampo de
algodo com o dedo mnimo da mo
direita e flambar a boca do tubo;
Introduzir a agulha carregada de
microrganismo no interior do tubo,
levando-a, delicadamente, ao interior do
meio semi-slido;
Inocular a cultura de bactrias em meio
semi-slido, utilizando a agulha de platina.
A inoculao dever ter a profundidade de
dois teros do meio semi-slido ao qual se
aplicar uma, e apenas uma picada;
Retirar a agulha, flambar novamente a
boca do tubo e recolocar o tampo de
algodo;
Colocar o tubo na estante, flambar a ala
e recoloc-la na estante.
D) Tcnica de semeadura em meio slido em
placa (esgotamento) usar cultura mista
em McConkey
A tcnica de esgotamento em placa
consiste em depositar sobre um ponto da
superfcie do meio uma parte do material e,
depois, espalh-la de maneira a se obter
quantidades progressivamente menores do
material. O objetivo obter colnias isoladas.
O sucesso da semeadura est em:

- No haver um grande nmero de estrias;

- No perfurar o meio;
- Pegar uma pequena quantidade de
material para semear.

Prtica
E) Tcnica de semeadura em placa Pour
Plate
A tcnica Pour Plate pode ser realizada com
o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo
qualitativo), ou de se fazer a contagem de
colnias em placa (estudo quantitativo). A seguir,
ser visto o procedimento para a realizao do
estudo quantitativo, determinando o nmero de
UFC (unidades formadoras de colnia) por
mililitro.
Agitar a cultura da bactria e transferir
0,1mL para 9,9mL de lquido de diluio
(1:100);
Agitar esse tubo e transferir 0,1mL para
outro tubo com 9,9mL (1:10.000);
A
seguir,
realizar
nova
diluio,
transferindo 0,1mL do ltimo tubo para
outro com 9,9mL de lquido de diluio
(1:1.000.000);
Aps realizar as diluies, fazer o
plaqueamento ao se agitar e retirar 1mL
de cada diluio, transferindo-os para
placas estreis;
Em seguida, colocar de 15 a 20mL de
Agar fundido em cada uma delas;
Submeter as placas a suaves movimentos

rotatrios (em forma de oito), visando

perfeita mistura da cultura com o Agar;
Esperar solidificar;
Inverter as placas e incubar a 37C por
48horas.

F) Tcnica de semeadura em placa Spread

Plate
Aproveitar
a mesma
diluio
da
semeadura em placa Pour Plate;
Fazer o plaqueamento ao agitar, e retirar
0,1mL de cada diluio, transferindo-os
para a placa com o Agar j solidificado;
Com a ala de Drigalski esterilizada,
espalhar os inculos para as superfcies
dos meios de cultura, comeando do mais
diludo para o menos diludo;
Incubar a 37C por 48horas.

EXERCCIOS DE FIXAO
1. Quais so as formas de crescimento
bacteriano? Explique-as.
2. O que se entende por colnia de
microrganismo?
3. Como pode ser obtida uma cultura pura
de bactria?
4. Explique a diferena entre as tcnicas de
semeadura em Pour Plate e em Spread
Plate.
5. Como se calcula o nmero de UFC/ml de
microrganismos inoculados na tcnica de
Pour Plate?
6. Como se calcula o nmero de UFC/ml de
microrganismos inoculados na tcnica em
Spread Plate?

REFERNCIAS
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologiaroteiros de aulas prticas. So Paulo: Tecmedd,
2008.