Manual de Laboratorio de Bioquímica Farmacéutica

Manual de prcticas del Laboratorio de Bioqumica farmacutica.
UPIBI-IPN
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
ACADEMIA DE BIOQUMICA
MANUAL DE BIOQUMICA FARMACUTICA
El presente manual fue elaborado por:

Biol. Leonor Patricia Rodrguez Pascual
Q.B.P. Refugia Prez Snchez
QBP Martha Morales Martnez
M. en C. Rodrigo Martnez Ziga
M. en C. Sergio Oliva Maheda
Primera versin
ENERO 2008
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
Manual de prcticas del Laboratorio de Bioqumica farmacutica.UPIBI-IPN
PRLOGO
El presente manual de laboratorio es para la asignatura de Bioqumica Farmacutica, tiene como
objetivo familiarizar al estudiante con las substancias, mtodos y equipo utilizados en la asignatura
de Bioqumica Farmacutica; darle experiencia personal en algunas tcnicas y ponerlo en
contacto con el mtodo cientfico y seguir estimulando su inters por esta rama de la ciencia, para
lograr este objetivo es necesario que el estudiante tenga presente:
a.- Qu debe leer sus experimentos antes de ejecutarlos
b.- Qu debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para
aclarar dudas y comprender el porque de las operaciones que se han de ejecutar
c.- Qu debe hacer cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqu de los
hechos
d.- Qu debe observar minuciosa y crticamente cada uno de los cambios ocurridos
e.- Qu debe anotar sus observaciones y buscar la explicacin cientfica.
Cada una de las prcticas contiene la metodologa necesaria para el desarrollo experimental de la
prctica, as como los antecedentes tericos necesarios para la comprensin de cada uno de los
experimentos y poder reforzar los aspectos tericos del curso.
En el caso de algunos aspectos tericos complejos, stos pueden ser aclarados a travs de la
lectura suplementaria de la bibliografa recomendada al final del presente manual o bien la
sugerida al inicio del curso.
El manual est integrado por prcticas representativas y secuenciales de las unidades del curso
terico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este
manual fueron:
1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental terico.
2) Que fuera lo ms simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3,0 h
3) Que fueran de utilidad para sus cursos posteriores.
Para que un alumno realice el experimento en el laboratorio es necesario tener ciertas
precauciones que se mencionan en el reglamento.
Esta primera edicin del Manual no pretende ser definitiva, sino ser objeto de revisiones y mejoras
sistemticas por parte de los miembros de la Academia de Bioqumica, cada una de las prcticas
fueron probadas por los responsables de su elaboracin y diseo antes de ser puestas en
operacin.
Este Manual no sustituye a la participacin y gua de los profesores en el desarrollo experimental,
ni a la discusin de los resultados obtenidos.
INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIN
I.1.- El laboratorio se evala como sigue:
Trabajo* - laboratorio...............3,5 puntos
Discusin................................ 3,0 puntos
Reporte de la prctica........... 3,5 puntos
En el trabajo se evala
Antecedentes (lectura de la prctica)..0.5 puntos
Limpieza en todos los aspectos0.5 puntos
Organizacin (para trabajar en equipo)..1.0 punto
Habilidad..1.0 punto
Resultados obtenidos y registrados al momento..0.5 puntos
El reporte se evala:
Objetivo y bibliografa.................................
Resultados y anlisis de resultados............
Discusin y glosario........................
Conclusiones...................................
0,5 puntos
1,5 puntos
1,0 puntos
0,5 puntos
I.2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones
prcticas, aprobar el 80% de las prcticas efectuadas, entregar el 80% de los reportes y obtener
un promedio mnimo de seis.
I.3.- La calificacin del trabajo prctico se obtendr promediando las sesiones de las que conste la
prctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificar con cero en la parte
correspondiente.
I.4.- La calificacin final del laboratorio ser el promedio de las calificaciones de todas las prcticas
I.5.- Si un alumno no asiste a una sesin tendr cero en trabajo prctico, si la justifica se mantiene
la calificacin, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
I.6.- Cada profesor elegir un reporte, revisando que todos los alumnos miembros del equipo
hayan elaborado el reporte. Si no es as el alumno que no lo presente tendr cero en el reporte.
I.7.- Los equipos que no laven el material correspondiente de la prctica y/o dejen sucias las
mesas tendrn cero en la prctica.
II.- ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS
II.1.- Para asistir al laboratorio el alumno deber traer:
Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodn, manga larga y blanca.
Instructivo de laboratorio
Bitcora
Una fotografa tamao infantil
II.2.- Por equipo deber traer:

Un rollo de Masking tape
Un metro de franela
Un marcador indeleble
Encendedor o cerillos
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

III.1.- Se impartir una sesin por semana de 3.0 h, cada sesin principiar y terminar a la hora
indicada
III.2.- Se pasar lista cada da al empezar la prctica
III.3.- Se anotarn las faltas y asistencias con todo rigor y por ningn motivo se pondrn
retardos
III.4.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la prctica y sin el
consentimiento del profesor, se considerar que no asisti a la prctica.
III.5.- Las faltas al laboratorio se calificarn con cero.
III.6.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo prctico es
que el alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias. La lista de
asistencia se efectuar a la hora indicada para la prctica, con una tolerancia de 10 minutos. No
habr retardos y se pondr falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata debidamente
abrochada. En caso de llegar tarde ya no se le permitir la entrada a menos que sea discusin con
su correspondiente falta.
III.7.- El reporte se entregar una semana despus de realizada la discusin
III.8.- El alumno utilizar el manual de laboratorio, obligatoriamente en cada sesin, apegndose a
la metodologa a seguir, as como a las instrucciones del profesor.
III.9.- Utilizar como bitcora el manual de laboratorio en cada sesin para anotar todos los datos
obtenidos en el momento de la prctica.
III.10.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio
es un lugar de trabajo.
III.11.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir
bebidas y mascar chicle dentro del laboratorio adems deber lavarse las manos al final de
cada prctica: Recordar que se maneja un tejido(sangre) as como diversas sustancias.
Todo material biolgico residual deber tratarse con el desinfectante que indique le
profesor (benzal o cloro) a fin de evitar riesgos a la salud.
III.12.- Durante el desarrollo de la prctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo
que visiten a los alumnos.
III.13.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deber ser repuesto por la persona o
personas responsables de l.
III.14.- El alumno revisar el material que reciba y reportar cualquier anomala antes de iniciar el
trabajo prctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
III.15.- Despus de terminada la prctica, el material deber ser entregado limpio, a la persona
encargada del almacn del laboratorio y deber limpiar la mesa al iniciar y terminar la prctica.
III.16.- El alumno evitar su permanencia en el laboratorio despus de terminada la prctica.
III.17.- Todo material contaminado con sangre se depositar en el lugar asignado para su
esterilizacin.
III.18.- Esta prohibido el uso de celular durante la prctica, por lo que se le pide al alumno que lo
apague durante el desarrollo, y discusin de la misma.
NOMBRE DEL ALUMNO:__________________________________________

PROFESOR DE TEORA: __________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________
__________________________
__________________________
GRUPO: _______________________________________________________
CICLO ESCOLAR ________________________________________________
NDICE
PRLOGO_________________________________________________________
NDICE____________________________________________________________
Instrucciones generales ______________________________________________
PRCTICA No. 1 Naturaleza qumica de las enzimas y actividad biolgica

PRCTICA No. 2 Transporte de electrones y su inhibicin
PRCTICA No. 3 Determinacin de glucosa y lactato en suspensin de eritrocitos
PRCTICA No. 4 Formacin de liposomas. Determinacin de lipoprotenas y triglicridos en suero
humano.
PRCTICA No. 5 Determinacin de transaminasas, urea y cido rico en suero humano.
PRCTICA No. 6 Determinacin de colesterol en suero humano.
PRCTICA No. 7 Transferencia de material gentico.
PRCTICA No. 8 Determinacin de Gonadotropina Corinica Humana (GCH)

Prctica No 2
DETERMINACIN DE GLUCOSA Y LACTATO EN SUSPENSIN DE ERITROCITOS.
Relacin con Unidad Temtica
II. Catabolismo de carbohidratos
I. OBJETIVOS
El alumno determinar el consumo de glucosa por parte de clulas sanguneas.
El alumno evaluar la produccin de un metabolito de desecho propio del metabolismo anaerobio
de la glucosa.
II. FUNDAMENTOS TERICOS.
La glucosa es la principal fuente de energa para los seres vivos. En el ser humano, su
concentracin debe mantenerse entre 60 y 100 mg/dl, valores por abajo (hipoglucemia) y por
arriba (hiperglicemia) de estos provocan trastornos fisiolgicos. La glucosa para ser aprovechada
por el organismo debe ser introducida al citoplasma celular donde se encuentran las enzimas
responsables de su degradacin, el proceso se llama gliclisis, en el, ocurre una degradacin
incompleta de la glucosa, por lo que se requieren de otros sistemas enzimticos as como de
otros espacios celulares para su degradacin total hasta CO2 y H2O. Durante el proceso de
degradacin de la glucosa se genera energa en forma de ATP, la produccin de ATP ocurre en
las diversas fases del proceso, por lo que si ocurre una degradacin incompleta, la cantidad de
energa generada tambin ser incompleta y desde luego se generarn productos intermediarios
de esa incompleta degradacin.
La degradacin total de la glucosa hasta CO2 y H2O, requiere de la presencia de oxgeno en las
reacciones posteriores a la gliclisis y desde luego los sistemas enzimticos correspondientes,
mismos que estn presentes en la mayora de las clulas del organismo, sin embargo en algunas
clulas como las musculares, pueden reorientar su metabolismo cuando la cantidad de oxgeno
disponible no es suficiente, por lo que llevarn una degradacin incompleta, otras clulas como
los eritrocitos circulantes, carecen de los sistemas enzimticos para la fase oxidativa de la
degradacin de la glucosa y tambin llevan una degradacin a medias, en ambos casos el
producto de este metabolismo incompleto es el cido lctico, o lactato porque realmente se
encuentra ionizado, por lo que su produccin contribuye a la disminucin del pH de la sangre, las
reacciones que llevan a la produccin de cido lctico se conocen como fermentacin lctica.
En los organismos superiores, el lactato no es liberado del cuerpo como desecho dado que an
tiene mucha energa utilizable, por lo que, el lactato producido en msculo o eritrocitos es
liberado a la sangre y ser capturado en el hgado y reconvertido en glucosa, por un proceso
llamado gluconeognesis para su posterior reutilizacin. En otros organismos, propiamente
bacterias, el lactato es liberado a su medio ambiente y comnmente es aprovechado por otros
microorganismos para extraerle la energa que an contiene, lo que es utilizado para la
generacin de diversos productos de inters econmico.
En esta prctica se determinar el consumo de glucosa por parte de las clulas sanguneas a partir
de sangre fresca extrada para tal fin, y se harn tambin las determinaciones de lactato para
determinar la produccin del mismo.
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III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
1. Espectrofotmetro
2. Kit para determinacin de glucosa, por el mtodo de glucosa oxidasa.
3. Kit para determinacin de lactato por mtodo colorimtrico
4. Dos celdas de vidrio para el espectrofotmetro.
5. 9 tubos de ensaye de 6x100
6. 2 pipetas de vidrio de 5ml.
7. 2 pipetas automticas, una de 10 a 100 mcl y una de 100 a 100mcl.
8. Puntas estriles para pipeta automtica de 100 y 1000mcl.
9. Un agitador orbital
10. Cuarto estufa a 37C
11. Frasco de cultivo de 50ml.
12. Heparina en solucin (ProparinMR de Probiomed) de 1000 UI/ml
13. 4 tubos Eppendorf de 1.5ml
14. Microcentrfuga
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Extraer de un integrante del equipo 10 ml de sangre y depositarlo en condiciones de esterilidad,
en un recipiente (tubo de ensayo, frasco de cultivo de 50ml o placa de cultivo 5cm de dimetro)
estril conteniendo 500l de heparina.
2. Homogenizar la sangre con la heparina.
3. Tomar una muestra inicial de 0.5ml y depositarlo en un tubo Eppendorf, el frasco de cultivo
colocarlo en agitacin a 50 rpm en el cuarto de incubacin.
4. Centrifugar la muestra de sangre 30seg a velocidad mxima en microcentrfuga.
5. Separar el plasma en otro tubo limpio.
6. Preparar dos series de 3 tubos como se seala en los cuadros, uno para determinar glucosa y el
otro para determinar lactato.
7. Determinacin de glucosa
Reactivo p/ Glucosa(ml)
Patrn (l) 100mg/dl
Muestra (l)
Blanco
1.0
-
Patrn
1.0
10
-
Muestra
1.0
10
8. Mezclar e incubar 10 minutos a 37C o 30 minutos a temperatura ambiente.

9. Leer la absorbancia (As) del patrn y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentracin de glucosa aplicar la siguiente formula.
As muestra
X 100 = mg/dl de glucosa en la muestra

As Patrn
Factor de conversin: mg/dlglc X 0.0555 = mmol/lglc
28

10. Determinacin de lactato
Reactivo p/ Lactato (ml)
Patrn (l) 100mg/dl
Muestra (l)
Blanco
1.0
-
Patrn
1.0
10
-
Muestra
1.0
10

12. Leer la absorbancia (As) del patrn y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentracin de lactato aplicar la siguiente formula.
As muestra
X 10
As Patrn
= mg/dl de lactato en la muestra
Factor de conversin: mg/dllac X 0.111 = mmol/llac
V. RESULTADOS
Anote sus resultados de As en los cuadros siguientes.
Tiempo
0
X1
X2
X3
As Patrn de glucosa
As Patrn de lactato
As Glucosa
As Lactato
Calcule las concentraciones de lactato y glucosa de acuerdo a las formulas dadas y anote los
resultados en la siguiente tabla.
Tiempo
[Glucosa]
mmol/l
[Lactato]
mmol/l
0
X1
X2
X3
Construya las grficas de decaimiento de glucosa y de produccin de cido lctico en el mismo
eje cartesiano. No olvides anotar el pie de figura.
VI. ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
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Describe la gliclisis y explica porque es una va de degradacin incompleta apyate haciendo un
esquema de la ruta.
Explica como se enlaza la gliclisis con la fermentacin lctica, anota las reacciones. Indica
porque se dice que la gliclisis es una ruta anaerobia.
Di con tus palabras que informacin nos da la grfica.
Incluye la respuesta a estas preguntas en tu discusin Fue consumida realmente la glucosa?,
Qu relacin estequiomtrica se establece entre la glucosa consumida y el lactato generado?
Por qu los eritrocitos no llevan la degradacin de glucosa hasta CO2 y H2O? que les falta?, en
cuanto a la cantidad de energa generada que consecuencias trae esto? Cual es la funcin de los
eritrocitos? Por qu los eritrocitos no requieren tanto ATP como las dems clulas del
organismo?
Describe que le ocurre a lactato que es liberado por los eritrocitos y anota las transformaciones
que le ocurren.
VII. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos a su anlisis y discusin anota las conclusiones que de esto
se desprende.
VIII. BIBLIOGRAFA
Bernard H, John. Todd-Sanford-Davidsohn: Diagnostico y Tratamiento Clnicos por el
Laboratorio. 8 ed. Tomo I Barcelona (Esp): Salvat, 1988. 927p. ISBN: 84-345-2587-9
Devlin. T. M., Bioqumica con aplicaciones clnicas tomo I y II 3. Ed- Revert S.A., Espaa.
1997. 1298 pgs.
Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A. Rodwell, V. W. Bioqumica de Harper 15 edicin.
El Manual Moderno. Mxico. 2001. 1041 pgs.
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PRACTICA No. 3
Transporte de Electrones y su Inhibicin
Unidad Temtica: Catabolismo de Carbohidratos.
I.
OBJETIVOS.
El alumno aislar mitocondrias a partir de riones de rata.

El alumno determinar la hidrlisis de ATP en mitocondrias de riones de rata.
El alumno utilizar inhibidores y aceptores artificiales de electrones que afectan el transporte de
electrones en mitocondrias.
El alumno evaluar el transporte de electrones en mitocondrias y determinar su importancia desde
el punto de vista farmacutico.
II.
FUNDAMENTOS.
El termino respiracin es usado para hacer referencia al proceso en el cual la energa es generada a
travs de molculas nutrimentales, con O2 como el mximo aceptor de electrones, ste trmino es
tambin llamado respiracin celular para distinguirlo del trmino respiracin regular.
Existen tres estados de la oxidacin metablica de compuestos orgnicos:
1. Generacin de un fragmento activado de dos carbonos (el grupo acetilo de la acetil-CoA) del
piruvato (citoplasma), cidos grasos (mitocondria), o aminocidos (citoplasma/mitocondrias).
2. Oxidacin de los carbonos del fragmento de acetilo mediante el ciclo del cido ctrico
(mitocondrias).
3. Transferencia de electrones desde la oxidacin en el paso 2 a travs del sistema de transporte de
electrones para producir ATP de la fosforilacin oxidativa.
Transporte de electrones.
El transporte de electrones es un sistema en el que los electrones generados por la oxidacin son
transferidos. La transferencia de los electrones mediante este sistema genera energa potencial que
es usada para sintetizar ATP en la fosforilacin oxidativa.
El valor de E0 para los acarreadores de electrones en la membrana de la mitocondria se incrementa
en el mismo orden en el que son usados en el transporte electrnico. Dichas reacciones ocurren en el
siguiente orden:
NADH y NADH Deshidrogenasa (Complejo I) La molcula de NADH se genera mediante
numerosas deshidrogenasas en la clula. ste se reoxida a NAD+ por el Complejo I de la
mitrocondria (tambin llamado NADH deshidrogenasa).
Complejo II (Succinato deshidrogenasa) El complejo II no es la forma en la que los electrones
viajan desde el Complejo I. Este es un punto de entrada de los electrones desde FADH2 producido
por la enzima succinato deshidrogenasa en el ciclo del cido ctrico. Estos complejos I y II donan sus
electrones al mismo aceptor coenzima Q.
Coenzima Q (CoQ) - CoQ es una benzoquinona ligada a un nmero de unidades de isopreno. El
tallo de isopreno da a la molcula un character apolar que permite a la CoQ dispersarse rpidamente
a travs de la membrana mitocondrial interna. La CoQ tiene la capacidad de aceptar electrones en
pares y pasarlos uno a la vez mediante un intermediario semiquinona hacia el complejo III.
Complejo III El Complejo III contiene diversas roteinas acarreadoras de electrones. Entre ellas se
encuentran citocromo b, complejos hierro y azufre y citocromo c1. El citocromo b es la primer de las
protenas acarreadoras que contienen un grupo hemo que esta envuelta en el transporte de
electrones.
31

Citocromo c - Esta pequea protena es la nica del sistema de transporte de electrones que no es
un complejo. Esta acepta los electrones del complejo III y los enva al complejo IV.
Complejo IV El Complejo IV es tambin conocido como citocromo oxidasa, porque toma los
electrones del citocromo c. El complejo IV contiene citocromos a y a3. Los citocromos a y a3
evidentemente representan dos grupos hemo A Asociados a la misma cadena polipeptdica. Ellos se
encuentran en diferentes ambientes en el interior de la membrana aunque tienen diferentes
potenciales de membrana idnticos, sus potenciales de reduccin son diferentes. Cada uno de los
hemos esta asociado a un in cobre, localizado cerca al hierro hemo. Los electrones que pasan por
el complejo IV pueden ser bloquedos por el cianuro, azida de sodio y monxido de carbono y el
acarreador artificial de electrones, ferrocianuro, puede aceptar electrones del citocromo a en el
complejo.
Un inhibidor del transporte de electrones crea un punto de cruce o lugar especfico de inhibicin.
Cuando una ruta es bloqueada totalmente, los acarreadores de electrones se encontrarn en un
estado reducido antes del punto de inhibicin y oxidado despus de este. Esto puede monitorearse
fcilmente diferencias de espectro y es de hecho, una de las formas en las cuales la accin de los
acarreadores de electrones en la cadena respiratoria fue establecida.
Los aceptores artificiales de electrones tienen un efecto opuesto a los inhibidores. Esto es,
reestablecen el flujo de electrones en un punto especfico al presentarse un inhibidor. Por ejemplo si
las mitocondrias fueran tratadas con antimicina A (un inhibidor) y azul de metileno (un aceptor
artificial de electrones), el Complejo I sera oxidado respecto a CoQ debido a la liberacin de
electrones del complejo I al azul de metileno. El CoQ permanecera reducido, as mismo la
transferencia de electrones hacia el siguiente acarreador, Complejo III, estara bloqueada.
III.
EQUIPOS Y REACTIVOS.
Parte I.
Materiales, Equipo y Reactivos.
Material:
1 Tijeras de diseccin.
1 Mortero con pistilo.
1 Tubo de centrifuga con camisa.
11 Tubos de ensayo de 16 X 150 mm.
5 Pipetas de 1 mL.
3 Pipetas de 5 mL.
1 Pipeta de Kahn.
1 Propipeta.
1 Vaso de precipitados de 100 mL.
2 Gradillas.
1 Celda espetrofotomtrica.
1 Bao de hielo.
1 Incubadora a 30oC por seccin.
1 Incubadora a 4oC por seccin.
1 Centrifuga por seccin.
1 Espectrofotmetro por seccin.
2 Termmetro de 0o a 100oC.
Material Biolgico.
1 Rata por equipo.
Reactivo.
32

10.0 mL de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, Tris 10mM pH 7.3 frio.
0.5 mL albmina 10 mg/mL
1.0 mL de glicerol.
1.0 mL de KCl 1M.
3.5 mL de regulador Tris 0.1M pH 7.3
0.5 mL de MgCl2 0.1 M
0.5 mL de ATP 60 g/mL.
0.1 mL de azida de sodio 0.1 M
3.5 mL de preparado mitocondrial.
0.1 mL de Polixin ofteno.
0.1 mL de 2,4 Dinitrofenol 0.3 mg/ml.
Parte II
Material.
7 Tubos de ensaye de 16 X 150 mm
1 Gradilla
1 Celda espectrofotomtrica.
1 Bureta de 20 mL
1 Soporte universal
1 Pinzas para bureta.
1 Vaso de precipitados de 100 mL.
7 Pipetas de 1 mL.
2 Pipetas de 2 mL.
1 Incubadora de 37oC por seccin.
1 Espectrofotometro por seccin.
1 Termmetro.
Reactivos.
16.2 mLde regulador de fosfatos 0.3 M, pH 7.4
0.7 mL de DPIP (diclorofenol indofenol)
5.5 mL de succinato de sodio 0.5 M
0.5 mL de malonato de sodio 0.5 M
0.5 mL de KCN 0.1 M
0.2 mL de citocromo c 0.6mM
1.0 mL de preparacin mitocondrial.
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
PARTE I. FOSFORILACIN.
A. PREPARACIN DE LA FRACCIN CON MITOCONDRIAS.
4.1 Obtener los riones de una rata y separar la corteza de ambos.
4.2 Macerar las 3 cortezas en un mortero, utilizando 10 mL. de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1
mM, pH 7.3 fra. Mantener todo en hielo.
4.3 Centrifugar durante 10 min. Cuidar de equilibrar bien los tubos.
4.4 Obtener el sobrenadante y pasarlo a un tubo de ensaye. Mantenerlo a temperatura ambiente.
4.5 Esta preparacin se emplear en el siguiente experimento y despus de utilizar 0.5 mL de albmina
10 mg/mL, 1 mL de glicerol y conservar en congelacin (-4oC).
33

B. ACTIVIDAD DE ATPasa.
4.6 Preparar una serie de tubos como se indica en la siguiente tabla.
Tubo
1
(Testig
o)
2
(Completo)
3
(Azida
de
Sodio)
4
(Mg+2)
5*
(-20oC)
6
2,4
DNF
7
Gramicidi
na
KCl 1M
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
1.1
0.6
0.5
0.7
0.6
0.5
0.5
0.1
0.1
0.1
_____
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
______
________
0.1
_____
_____
_____
______
______
_
________
_____
____
_____
0.1
_______
______
_______
_____
_____
_____
____
0.1
Ver
punto
4.9
0.5
0.5
0.5
0.5* Ver
nota
0.5
0.5
Regulador de
Tris 0.1 M pH 7.3
(mL)
Mg Cl2 0.1 M
(mL)
ATP 60 mg/mL
(mL)
Azida de sodio
(mL)
2, 4 DNF (mL)
Gramicidina
(mL)
Preparacin de
mitocondrias
(mL)
*Nota: Para este tubo primero se incuban las mitocondrias a -20oC en hielo seco, durante 15 min y
despus se adicionan la tubo.
4.7 Incubar a 30oC durante 15 min.
4.8 Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, adicionar a todos los tubos 1.0 mL de TCA al 30
%.
4.9 Al tubo 1, adicionar 0.5 mL de la preparacin de mitocondrias (despus del TCA).
4.10 Centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
4.11 Tomar 0.6 mL de los sobrenadantes y tratarlos como al tubo 4 de la curva tipo pero en lugar de
solucin tipo de fsforo se adiciona sta muestra problema y luego el resto de los reactivos como
marca la tabla.
Atencin: Se debe tener cuidado de No adicionar la solucin tipo de fsforo, pues en su lugar
estamos adicionando los sobrenadantes.
4.12 Determinar la densidad ptica a 660 nm de cada tubo.
C. CURVA TIPO DE FOSFORO.
Tubo
Slucin tipo de fsforo 1mM
(mL)
H2SO4 7.5 N (mL)
1
0.1
0.5
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
____
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
34

Molibdato de amonio
% (mL)
6.6
Agua destilada (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
3.5
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
3.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Agitar
FeSO4 al 10% (ml)
0.4
0.4
4.14. Agitar y leer en el espectrofotmetro a 660 nm. Utilice como blanco el tubo 7.
PARTE II. TRANSPORTE Y ACEPTORES ARTIFICIALES DE ELECTRONES.
A. ACTIVIDAD DE SUCCINICO DESHIDROGENASA Y DE CITOCROMOS.
4.15 Preparar una serie de 5 tubos y adicione los reactivos que se muestran en la siguiente tabla y en
orden estricto.
CUIDADO!
El KCN ES VENENOSO, UTILICE BURETA PARA ADICIONARLO A LOS TUBOS.
1
Testigo
(Sin
sustrato)
Sustancia
Completo +Malonato +Malonato +CN-
6
+CIT
Regulador de
fosfatos 0.3M pH 7.3
(mL)
3.3
2.3
2.1
2.6
1.8
2.1
DPIP 1M (mL)
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Malonato 0.5 M (mL)
____
____
0.2
0.2
____
___
KCN 0.1 M (mL)
____
____
____
____
0.5
___
Cit C 0.6 mM (mL)
____
____
____
____
___
0.2
Succinato 0.5 M (mL)
____
0.5
Incubar los tubos a 37oC durante 5 minutos

4.16 Tomar el tubo 1 (Testigo) y adicionarle 0.1 mL de la fraccin de mitocondrias e inmediatamente
determine la densidad ptica a 660 nm.
4.17 Leer nuevamente la densidad ptica en el mismo espectrofotmetro a los 3 minutos.
4.18 Repetir este procedimiento con cada uno de los otros tubos adicionando en todos los casos 0.1
mL de la fraccin de mitocondrias.
35

V. RESULTADOS, ANLISIS DE RESULTADOS.
5.1 Escriba los datos generados de la curva tipo de fsforo en la tabla 5.1
Tubo
Concentracin de fsforo (moles)
As 600 nm
1
2
3
4
5
6
7
5.2 Construya la curva tipo de fsforo en papel milimtrico, colocando en las ordenadas la densidad
ptica a 660 nm y en las abscisas la concentracin de fsforo en moles.
5.3 Determine la pendiente de la recta y utilcela como coeficiente para el clculo de la concentracin de
fsforo en el experimento de ATPasa. Diga que parmetro permite determinar si la curva tipo es vlida?
5.4 Escribir los resultados del experimento de ATPasa en la tabla siguiente.
Tubo
Condicin
As 660 nm
Concentracin de
Fsforo (moles)
1
2
3
4
5
6
7
5.5. Explique lo ocurri en el tubo 2.
5.6 Cul es el efecto de eliminar el Mg+2 del tubo de reaccin?
5.7 Qu ocurre en el tubo con mitocondrias preenfriadas a 20oC?
5.8 Qu ocurre en el tubo con azida de sodio?
5.9 Qu ocurre en el tubo con gramicidina?
5.10 Qu ocurre en el tubo con 2,4 DNF?
5.11 Cmo afecta la gramicidina el transporte de electrones?
36

5.12 Cmo afecta el 2,4 DNF el transporte de electrones? A qu nivel de la cadena respiratoria acta?
Cul es su uso teraputico?
5.13 Cul es el objetivo de adicionar el TCA?
5.14 Escriba los resultados obtenidos en el experimento 4.3 en la siguiente tabla.
Tubo
Condicin
As 660 nm
1
2
3
4
5
6
5.15 Por qu el tubo 1 disminuye el color, a pesar de que no se adicion el succinato?
5.16 Qu tipo de sustancia es el malonato y a que nivel acta en cadena respiratoria? Explique ya que
nivel acta en cadena respiratoria? Explique como demostr este resultado.
5.17 A qu nivel acta el CN- como inhibidor de la cadena respiratoria? Explicar como demostr lo
anterior.
5.18 Escriba la reaccin de reduccin del DPIP, con frmulas.
5.19 Explique que tipo de sustancia es la gramicidina, y cul es su uso teraputico.
VI. DISCUSIN DE RESULTADOS.
Analice y discuta en base a los resultados obtenidos y a la bibliografa consultada.
VII. GLOSARIO DE TRMINOS TCNICOS.
7.1 POTENCIAL REDOX.
7.2 REDUCCIN.
7.3 OXIDACIN.
7.4 TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.5 FOSFORILACIN OXIDATIVA.
7.6 INHIBIDOR DEL TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.6 DESACOPLANTE.
37

VIII. CONCLUSIONES.
Con los resultados obtenidos, el anlisis, la discusin, los objetivos de la prctica y a la bibliografa
consultada dar las conclusiones de este reporte.
IX. BIBLIOGRAFA
Registre la bibliografa consultada para la elaboracin de ste reporte.
X.
BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
10.1 Lenhinger, A., Principios de Bioqumica, 3. Ed. Omega. Espaa 2001.

10.2 Mathews, V. H. , Bioqumica, 3. Ed. Prentice-hall. Espaa 3003.
10.3 Bohinski, R. C., Bioqumica 2. Ed. Pearson education. Mxico 2000.
10.4 Murray, R. K., Bioqumica Ilustrada Harper, 17. Ed. El manual moderno. Mxico. 2007.
10.5 Clark, J.M., J.M. Experimental Biochemestry, W. H. Freeman, San Francisco, 1964.
38

PRCTICA 4
FORMACIN DE LIPOSOMAS. DETERMINACIN DE LIPOPROTENAS Y TRIGLICRIDOS EN SUERO
HUMANO.
UNIDAD III. Catabolismo de lpidos
Tema: 3.1. Movilizacin y transporte de lpidos (TG y Colesterol)
Tema: 3.1.1 Estructura y funcin de partculas VLDL, LDL, IDL y HDL
1.- OBJETIVOS
Objetivo general.
El alumno formar experimentalmente liposomas y determinar lipoprotenas y triglicridos en suero humano.
Objetivos particulares.
El alumno formar liposomas a partir de fosfolpidos.
El alumno comprobar la capacidad de los liposomas de encapsular sustancias.
El alumno determinar triglicridos y la lipoprotena HDL- colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIN
Los lpidos son compuestos orgnicos, muy heterogneos insolubles en agua, pero solubles en solventes
orgnicos. Los lpidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales estn las siguientes:
1.- Estructural. Forman las membranas celulares (fosfolpidos y esfingolpidos).
2.- Reserva energtica. Triglicridos (TG o TAG).
3.- Transporte. Lipoprotenas.
4.- Compuestos funcionales. Vitaminas (vitamina D), sales biliares y hormonas como: progesterona, testosterona,
estrgenos y corticoides.
5.- Aislante trmico y protector. Tejido adiposo
Los lpidos de la dieta y aquellos que se sintetizan en las clulas son necesarios para los organismos superiores,
donde se utilizan para construir membranas, molculas combustibles o para biosntesis. Los lpidos ms
importantes para el transporte son los triglicridos y el colesterol (colesterol libre y steres del colesterol). Los
lpidos se transportan en la sangre como complejos lipoprotecos, los cuales se componen de protenas especficas
y de combinaciones de triglicridos, colesterol y steres de colesterol, denominadas lipoprotenas o
apolipoprotenas. Los lpidos y las protenas estn asociados como complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoprotenas se clasifican en:
Quilomicrones: son las lipoprotenas menos densas y se componen de 98 a 99% de lpidos, principalmente de
TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa de protenas y lpidos polares. Estos se
ensamblan en el intestino con los lpidos de la dieta y se absorben al torrente sanguneo para ser transportados a
los tejidos perifricos. Ah, una lipoprotena lipasa libera los cidos grasos de los TAG.
Lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL): Son agregados moleculares que se forman en el hgado con los
TAG que ah se sintetizan, su funcin es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos perifricos para ser
almacenados o para utilizarse como fuente de energa. Los cidos grasos se liberan por accin de la lipasa.
Lipoprotenas de baja densidad (LDL): Estas partculas son las principales transportadoras de colesterol en la
sangre, movilizan a los steres de colesterol del hgado donde se sintetizan, hacia los tejidos perifricos. Los
lpidos predominantes son los steres de colesterol que contiene un cido graso poli insaturado (cido linoleico).
Lipoprotenas de alta densidad (HDL): stas son las que tienen mayor contenido de protenas de todas las
lipoprotenas (55% de protena, 45% de lpidos) por lo que son ms densas. Los principales lpidos que
transportan son el colesterol y steres de colesterol, y a diferencia de las LDL, movilizan al colesterol en direccin
contraria, es decir, desde el tejido perifrico hacia el hgado. Durante su recorrido por el torrente sanguneo
39

atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hgado. A las HDL, se les conoce como el colesterol bueno porque
disminuyen los niveles plasmticos de ste.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades fsicas y composicin de las principales lipoprotenas:
Lipoprotena
Quilomicrones
VLDL
LDL
HDL
Densidad
(g/ml)
<0.95
0.95-1.0
1.0-1.063
1.063-1.2
Dimetro
()
800-5000
300-800
180-280
50-120
Composicin (% peso)
Protenas
Colesterol
Fosfolpidos
2
10
25
55
9
20
20
24
4
20
45
17
Triglicridos
TAG
85
50
10
4
Los individuos con altos niveles sricos de colesterol de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor
incidencia a sufrir ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor
concentracin de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
En general se promueve en la poblacin reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el gentico, el de gnero: las mujeres tienden a acumular menos
colesterol y sus niveles de HDL son ms altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades cardiovasculares
que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hbito de fumar, el consumo de alcohol, una
dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrs, que en su conjunto aumentan los niveles de
colesterol y TAG.
Triglicridos: son un grupo de lpidos formados por tres cidos grasos y un glicerol. Son las principales
molculas energticas e ideales como reserva de energa a largo plazo, porque proporcionan ms del doble de
energa por unidad de masa que los carbohidratos. Los triglicridos, como son no polares, se almacenan en forma
anhidra en el tejido adiposo. Para utilizar la energa de los cidos grasos, primero deben ser liberados de los TAG,
y despus ser transportados de los tejidos perifricos a las mitocondrias para su degradacin metablica. El
catabolismo se realiza por -oxidacin, un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA, que entra
posteriormente al ciclo de Krebs. Si la cantidad de molculas disponibles como combustible rebasa las
necesidades fisiolgicas, se inicia la sntesis de cidos grasos, lo cuales se asocian con glicerol y se almacenan en
el tejido adiposo.
Los niveles de triglicridos se elevan por una ingesta alta en grasas saturadas o carbohidratos, tambin por exceso
de peso, consumo de alcohol, la edad (aumentan con la edad), algunos medicamentos como los anticonceptivos,
esteroides, diurticos causan aumento en los niveles de TAG, enfermedades como la diabetes, hipotiroidismo,
enfermedades renales y hepticas se asocian tambin con niveles altos, adems del factor hereditario (trastornos
genticos).
Un nivel elevado de triglicridos se asocia como factor de riesgo de enfermedad cardiaca junto con el colesterol,
adems de ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.
Membranas celulares. La diversidad de lpidos de membrana es extensa, sin embargo tienen en comn una
caracterstica muy importante, los lpidos de membrana son molculas anfipticas. Contienen una parte
hidroffica y otra hidrofbica. La formacin de membranas es una consecuencia de la naturaleza, sus cabezas
polares facilitan el contacto con el agua, mientras que sus colas hidrocarbonadas interaccionan entre si, en lugar
de hacerlo con el agua. Una forma de ordenarse en medio acuoso es formando micelas, estructuras globulares en
la que los grupos de la
cabeza polar estn rodeados de agua y las colas hidrocarbonadas estn secuestradas en el interior e interaccionan
una con otra, otro orden es la bicapa lipdica o liposomas, compuesta por dos capas de lpidos, las colas
hidrocarbonadas de cada capa individual interaccionan entre ellas, formando un interior hidrofbico que acta
como barrera de permeabilidad. Los grupos polares interaccionan con el medio acuoso. La estructura ms
40

favorable para la mayora de los fosfolpidos y glicolpidos en medios acuosos es la bicapa lipdica en vez de la
micela.
Fosfolpido
Micela
Bicapa lipdica
Liposoma
La formacin de bicapas lipdicas a partir de fosfolpidos es un proceso rpido y espontneo de auto ensamblaje,
siendo las interacciones hidrofbicas las principales fuerzas que determinan su formacin, adems de las fuerzas
de Van der Waals que favorecen el empaquetamiento compacto de las colas hidrocarbonadas.
La tendencia de los fosfolpidos a formar membranas, se ha utilizado para crear una importante herramienta
experimental y clnica, los liposomas, que son compartimentos acuosos rodeados por una bicapa lipdica, con un
arreglo similar al de las membranas celulares, pueden emplearse para el estudio de la permeabilidad de la
membrana o para liberar frmacos en las clulas.
Los liposomas pueden prepararse suspendiendo un lpido como la fosfatidilcolina, en un medio acuoso.
Posteriormente, la mezcla se agita por medio de ondas snicas de alta frecuencia, con lo que se consigue una
dispersin de vesculas cerradas de tamao bastante uniforme, las vesculas formadas segn el procedimiento
indicado tiene una forma esfrica, con un dimetro de unos 50 nm
(500 ). Se pueden formar vesculas mayores de 1 m de dimetro, mediante la evaporacin lenta del disolvente
orgnico de una suspensin de fosfolpidos en una mezcla de disolventes. Los liposomas pueden estar formados
por una bicapa lipdica, liposoma unilamelar (LUV) o varias capas concntricas, liposomas multilamelar( MLV)
cuyas capas estn separadas por espacios acuosos. La estructura vesicular de los liposomas y su capacidad de
incorporar sustancias hidroflicas o hidrofbicas, permite aplicarlos en diversos campos de la ciencia y tecnologa.
41

Se estn realizando experimentos para desarrollar el uso de los liposomas, por ejemplo se pueden inyectar en
pacientes liposomas que contengan DNA para tratamiento por terapia gnica, o frmacos, ya que ha demostrado
su potencial como sistema de liberacin de ellos y capacidad para que lleguen a un rgano blanco especfico.
Estos liposomas se fusionan con la membrana plasmtica y pueden introducir sustancias en clulas impermeables
a ellas, el estudio de transporte a travs de membrana, por ejemplo, la permeabilidad a los iones.
Otros sistemas coloidales como los niosomas, transfersomas y nanoesferas, tambin se han utilizado, pero los
liposomas son las formas que presentan mayor posibilidad para contener, transportar y ceder principios activos.
Adems de la capacidad de transportar y ceder principios activos, no son txicos, no son inmunognicos, no son
irritantes, son biodegradables y pueden incorporar una gran variedad de frmacos de naturaleza hidroflica o
hidrofbica.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
3.1 Triglicridos y HDL-colesterol
EQUIPO y MATERIAL
Bao a 25 o 30o C
1 gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
Espectrofotmetro para luz UV
2 celdas espectrofotomtricas
1 porta celdas
1 centrfuga
REACTIVOS
Kit para Triglicridos
Kit para HDL-colesterol (lipoprotena de alta densidad)
3.2 Liposomas
EQUIPO Y MATERIAL
3 tubos de ensaye de 16 x 150
3 pipetas de 2 mL
2 pipetas de 5 mL
1 gradilla metlica
3 portaobjetos
3 cubreobjetos
1 vortex
1 microscopio
Bao de agua a 37o C
Bao de incubacin a 45o C
2 termmetros de 0 a 100o C
REACTIVOS
2,0 mL de dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC o lecitina de soya) al 10 % en cloroformo
4,0 mL de almidn al 1%
3,0 mL de amilasa 10 mg/ mL
2,0 mL de lugol
42

2,0 mL de dodecil sulfato de sodio al 1%
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Primera parte.
A. TRIGLICRIDOS.
FUNDAMENTO. Los triglicridos incubados con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), liberan glicerol y cidos
grasos libres. El glicerol es fosforilado por la accin de la enzima glicerol quinasa (GK) y ATP para producir
glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato
(DAP) y perxido de hidrogeno (H2O2) por la glicerol 3-oxidasa GPO.
Al final, el perxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reaccin
catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloracin roja, cuya intensidad es proporcional a la concentracin
de triglicridos presentes en la muestra:
Reaccin
Lipoprotena lipasa
Triglicridos + H2O Glicerol + cidos grasos libres
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP G3P+ ADP
GPO
G3P + O2 H2O2+ DAP
Peroxidasa
H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol Quinona (Complejo de color rojo)
Los triglicridos son grasas que suministran energa a la clula. Al igual que el colesterol, son transportados a las
clulas del organismo por las lipoprotenas en la sangre.
Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicridos.
Su aumento es relativamente inespecfico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepticas (cirrosis,
hepatitis, obstruccin biliar) o diabetes mellitus, pueden estar asociadas con su elevacin.
MUESTRA
Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el cogulo durante 5 a 35
o
C y centrifugar durante 7 a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100 utilizando una pipeta
pasteur.Se puede utilizar suero o plasma heparinizado o con EDTA. . La muestra es estable 5 das a 2-8C.
REACTIVOS
Nota: Dependiendo del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
R1
Regulador
R2
Enzimas
GOOD pH 7,5
50 mmol/L
p-Clorofenol
2 mmol/L
Lipoprotein lipasa (LPL) Glicerol quinasa (GK) 150000 U/L
Glicerol-3-oxidasa (GPO) Peroxidasa (POD)
500 U/L
4 Aminofenazona (4-AF)
2500 U/L
ATP
440 U/L
43

0,1 mmol/L
0,1 mmol/L
Patrn de Triglicridos 200 mg/dL
PREPARACIN DE REACTIVOS.
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Regulador. Tapar
y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad del reactivo de trabajo: 6 semanas en refrigeracin (2-8C) o una semana a 15-25C.
Estabilidad: todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta,
cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8C, protegidos de la luz y se evita su contaminacin. No usar
reactivos fuera de la fecha indicada.
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 505 (490-550) nm
Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C / 15-25C
2. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en una celda:
Reactivos
RT (mL)
Blanco
1,0
Patrn
1.0
Muestra
1.0
Patrn (L)
--
10
--
Muestra (L)
--
--
10

5. Leer la absorbencia (A) del Patrn y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable durante
30 minutos.
CLCULOS
A (Muestra) (x 200 Conc. Patrn) / A (Patrn) = mg/dL de triglicridos en la muestra
Factor de conversin: mg/dL x 0,0113 = mmol/L.
5.1 RESULTADOS
Equipo Triglicridos (mg/dl) Equipo Triglicridos (mg/dl)
44
CONTROL DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados. S los
valores hallados se encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se recomienda revisar el instrumento, los
reactivos y el calibrador.
VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 40 160 mg/dL
Mujeres: 35 165 mg/dL
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
B) HDL-COLESTEROL (Lipoprotenas de alta densidad)
FUNDAMENTO. Esta tcnica permite la determinacin directa del HDL-colesterol sin necesidad de pretratamiento o centrifugado de la muestra.
El mtodo se basa en las propiedades de un detergente que solubiliza slo la fraccin HDL, el cual se libera
reaccionando con la enzima colesterol esterasa, la colesterol oxidad y los cromgenos.
Las lipoprotenas LDL, VLDL y los quilomicrones son inhibidas debido a la adsorcin del detergente en sus
superficies hacindolas resistentes a la enzima. La intensidad de color formado es proporcional a la concentracin
de HDL presente en la muestra.
MUESTRA. Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el cogulo
durante 5 a 35 o C y centrifugar durante 7 a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100
utilizando una pipeta Pasteur, se puede utilizar plasma pero no con citrato. El HDL-colesterol es estable por 7
das a temperatura ambiente, en este mtodo. No utilizar muestras hemolizadas.
REACTIVOS
GOOD pH 7,0
Colesterol oxidasa
< 1000 U/L
R1
Peroxidasa
< 1300 U/L
DSBmT
< 1 mM
GOOD p H 7,0
Colesterol esterasa
< 1500 U/L
R2
4-aminoantipirina
< 1 mM
Detergente
< 2%
Ascrbico oxidasa
< 3000 U/L
HDL-colesterol/ LDL-c CAL Calibrador. Suero humano liofilizado
PREPARACIN DE REACTIVOS. Los reactivos R1 y R2 estn listos para usarse. El calibrador se reconstituye
con 1 mL de agua destilada, tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver el contenido.
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 600-700 nm
Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C
45

Reactivos
R1 (L)
Blanco
300
Calibrador
300
Muestra
300
Calibrador (L)
--
--
Muestra (L)
--
--

5. Leer la absorbencia (A1) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
6.- Aadir:
Blanco
100
R 2 L
Calibrador
100
Muestra
100
7.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37o C

8.- Leer la absorbencia (A2) frente a blanco de reactivo.
9.- Calcular: A = A2 - A1
CLCULOS
(A) Muestra
x Conc. del calibrador = mg/dl de HDL colesterol en la muestra
(A) Calibrador
Factor de conversin: mg/dL x 0,0259 = mmol/L.
5. 2 RESULTADOS
Equipo HDL-colesterol (mg/dl) Equipo
HDL-colesterol (mg/dl)
Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad (VLDL) se pueden determinar de
acuerdo con la ecuacin de Friedewald:
VLDL-C= triglicridos/5
LDL-C= colesterol total - (HDL C + VLDL C)
Hombres
Mujeres
Riesgo menor
> 50 mg/dL
Riesgo normal 35-50 mg/dL
Riesgo elevado < 35 mg/dL
> 50 mg/dL
45-60 mg/dL
< 45 mg/dL
46

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
Segunda sesin.
C) LIPOSOMAS
Etiquetar 4 tubos de 16 x 150 y adicionarles las sustancias como se indican en el siguiente cuadro y en estricto
orden.
Tubo
Lecitina (m L)
-----
----
Almidn (mL)
AGITAR CON VORTEX DURANTE 5 MINUTOS (evitar la formacin de espuma)

Pasar a el contenido de los tubos a los vasos de pp de 25 ml y
Calentar a bao mara a 45o C hasta obtener un gel viscoso
Tomar una gota y observar al microscopio
amilasa (mL)
1
----
Incubar a 37o C durante 20 minutos

Agua destilada (mL) 2
2
2
Centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante
SDS (mL)
----1
-----Prueba de Lugol
1
( gota)
Observacin
del
color de cada tubo
2
1
1
5.3 RESULTADOS
Hacer esquemas de las observaciones al microscopio de cada tubo
Anota con signo + si la prueba de lugol es positiva, en los tubos probados, en la tabla siguiente.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
47
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.

Con los resultados obtenidos de cada equipo analiza y discute los valores obtenidos en el grupo, la metodologa
utilizada, la importancia de las enzimas en las determinaciones. Incluye las preguntas del cuestionario para que
realices tu discusin.
Parte 1
1.- Explica el fundamento del mtodo de cada una de las determinaciones.
2.- En las determinaciones de TAG y HDL-colesterol, menciona cuales fueron las fuentes de error que pudieron
alterar los valores obtenidos.
3.- Qu ventajas y desventajas hay entre un mtodo enzimtico y uno colorimtrico?
4.- Cul es la importancia de las determinaciones de HDL-colesterol y triglicridos?, explica las implicaciones
clnicas.
5.- Por qu se considera a las LDL y VLDL el colesterol malo y a las HDL el colesterol bueno?
6.- En base a los resultados obtenidos comenta si son valores normales o no y explica porque lo consideras as.
7.- Investiga mnimo 2 sustancias que se utilizan para catabolizar a los TAG del organismo y disminuir su
concentracin sangunea. Explica como actan a nivel molecular.
Parte 2
8.- Explica los resultados obtenidos en cada tubo
9.-Para que se adiciona el SDS y la -amilasa?
10.- De acuerdo a sus datos, es posible considerar a los liposomas como modelo de membrana? Explica
11.- Menciona cmo es posible encapsular en los liposomas sustancias hidroflicas e hidrofbicas.
12.- Indica como podra un frmaco encapsulado alcanzar a las clulas de un rgano especfico
CUESTIONARIO
1.- Disea un mtodo para formar liposomas y demostrar que pueden encapsular sustancias.
7.- CONCLUSIONES. Con el anlisis y discusin de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la
prctica y la investigacin bibliogrfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA.
Cita la bibliografa consultada para hacer tu reporte.
Bibliografia
Davidsohn I., Henry J. B.Todd-Sanford. Diagnstico clnico por el laboratorio.6. Edicin. Salvat editores.
Barcelona. 1979. 1484 pgs.
Devlin. T. M., Bioqumica con aplicaciones clnicas tomo I y II 3. Ed- Revert S.A., Espaa. 1997. 1298 pgs.
Boyer R. Conceptos en Bioqumica.1ra. Edicin. International Thomson Editores. Mxico. 1999. 694 pg
48

PRACTICA No. 5
DETERMINACIN DE TRANSAMINASAS, UREA Y CIDO RICO EN SUERO HUMANO.
UNIDAD IV: Metabolismo de compuestos nitrogenados.
TEMA
4.1 Degradacin de protenas y aminocidos
4.2 Degradacin de nucletidos.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
El alumno analizar el metabolismo de compuestos nitrogenados y su inhibicin, para entender el papel
de los frmacos.
1.2 Objetivos Especficos
1.2.1 El alumno obtendr muestras de sangre humana para la determinacin de transaminasas, urea, y
cido rico en una muestra de suero.
1.2.2 El alumno determinar cuantitativamente la cantidad de transaminasas, urea y cido rico mediante
el empleo de pruebas de diagnstico clnico y los valores obtenidos los comparar con los de
referencia
2. INTRODUCCIN
El metabolismo nitrogenado incluye a las protenas y los aminocidos, as como otros compuestos
derivados de los aminocidos como las bases purnicas y pirimidnicas, grupos hemo, molculas
relacionadas como la hemoglobina, poliaminas, creatina, diversos neurotransmisores y hormonas.
Sin embargo el cido rico es el principal producto de la degradacin de las purinas, la mayor parte de la
formacin de cido rico se lleva a cabo en el hgado Los valores normales de cido rico varan
ampliamente por diversos factores tales como edad, orgenes raciales, sexo, sociales y geogrficos;
adems el mtodo analtico utilizado. Igualmente numerosas enfermedades y alteraciones fisiolgicas
modifican la concentracin de cido rico en la sangre, siendo el aumento ms significativo lo que se
denomina hiperuricemia.
El cido rico y sus sales son el resultado final del metabolismo de las purinas (partes de DNA y RNA).
La mayor parte del cido rico se excreta por el rin, y algo por el sistema intestinal. Cuando aumenta la
destruccin de los tejidos (como en diversos tipos de cncer) el cido rico aparece elevado en sangre, la
consecuencia de la elevacin es la gota.
En este padecimiento existe una sobre produccin de cido rico, y la poca solubilidad del urato sdico
hace que se depositen cristales de ste en las articulaciones y el rin. Es un trastorno del metabolismo
de las purinas (adenina y guanina) y no de las protenas, como a veces se considera.
Las sales sdicas de cido rico tienen una muy escasa solubilidad en medio acuoso, dicha solubilidad
disminuye al disminuir la temperatura y el pH de manera que por encima de concentraciones plasmticas
de 7 mg / dl de cido rico pueden precipitarse en forma de cristales.
Por su similitud estructural con sustratos y productos el alopurinol es un inhibidor competitivo de la
xantina oxidasa, reduciendo la produccin de cido rico, de ah su utilidad en el tratamiento de la gota
donde favorece la acumulacin de la hipoxantina y xantina, que se van eliminando por la orina
Existe una enfermedad hereditaria denominada xanturia que es la falta de xantina oxidasa que impide la
formacin de cido rico, por lo que los productos catablicos consisten fundamentalmente en xantina,
que se depositan en forma de clculos en el tracto urinario.
La urea es el resultado final del metabolismo del nitrgeno de las protenas. Se forma en el hgado a
partir de la destruccin de las protenas. Durante la digestin de las protenas son separadas en
aminocidos, stos contienen nitrgeno que se libera como in amonio, y el resto de la molcula se utiliza
para generar energa en las clulas y tejidos. El amonio se une a pequeas molculas para producir urea,
Rodrguez Pascual P., Prez Snchez R., Morales Martnez Martha, Martnez Ziga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio 49

la cual aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el rin no funciona bien la urea se acumula
en la sangre y se eleva su concentracin.
La aspartato aminotransferasa (AST) es una enzima intracelular que se encuentra en niveles altos en el
msculo del corazn, las clulas del hgado, las clulas del msculo esqueltico y en menor cantidad en
otros tejidos.
Aunque un nivel elevado de AST en suero no es especfico de enfermedad heptica se emplea
principalmente para su diagnstico y seguimiento, junto con otras enzimas como la ALT y ALP. Tambin
se utiliza en el control post-infarto, en pacientes con desordenes del msculo esqueltico, y en otras
afecciones.
La AST cataliza la transferencia reversible de un grupo amino del aspartato al -cetoglutarato con
formacin de glutamato y oxalacetato. El oxalacetato producido es reducido a malato en presencia de
malato deshidrogenada (MDH) y NADH.
La alanina aminotranferasa (ALT) cataliza la transferencia de un grupo amino de la alanina al cetoglutarato con formacin de glutamato y piruvato. El piruvato producido es reducido a lactato en
presencia de lactato deshidrogenasda (LDH) y NADH.
En la determinacin de estas dos enzimas la velocidad de disminucin de la concentracin de NADH en
el medio determinada espectrofotometricamente es proporcional a la c concentracin cataltica de la AST
y ALT en la muestra.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
9 tubos de ensaye 13 X 100 mm
1 gradilla
1 pipetas Pasteur
1 bulbo para pipeta Pasteur
1 jeringa con aguja estril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
1 ligadura
Recipiente para objetos punzocortantes
Pipeta automtica
Puntas para pipeta automtica
1 pizeta con agua destilada
Frasco para muestras de orina
3.2. REACTIVOS
Kit de reactivos para la deteccin cuantitativa de aspartato aminotransferasa AST (GOT) o un juego de
reactivos para la deteccin cuantitativa de alanina aminotransferasa GTP (ALT)
Para la determinacin de aspartato aminotransferasa GOT (AST)
R1
Tampn
R2
Substrato
TRIS pH 7,8
L-Aspartato
NADH
Lactato deshidrogenasa (LDH)
Malato deshidrogenasa (MDH)
-Cetoglutarato
80 mmol/L
200 mmol/L
0,18 mmol/L
800 U/L
600 U/L
12 mmol/L
Kit de reactivos para la deteccin cuantitativa de nitrgeno en urea.

R1
o-Ftalaldehido
4,8 mmol/L

R2
Solucin borato
87 mmol/L
UREA CAL Patrn primario acuoso de Urea 50 mg/dL

Kit de reactivos para la deteccin cuantitativa de cido rico.
R1
Tampn
R2
Enzimas
cido rico cal.
Fosfatos pH 7,4
50 mmol/L
2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS)
4 mmol/L
Uricasa
60 U/L
Peroxidasa (POD)
660 U/L
Ascorbato oxidasa
200 U/L
4 - Aminofenazona (4-AF)
1 mmol/L
Patrn primario acuoso de cido rico 6 mg/dL
3.3. Equipo
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro
3.4 Muestra biolgica
Muestra de suero o plasma heparinizado
Muestra de orina
Urea en orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por
50 (factor de dilucin). Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera asptica 5 ml de sangre siguiendo las instrucciones del profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- En un frasco de toma de muestra de orina limpio y seco depositar aproximadamente 50 ml de orina,
de preferencia la primera de la maana.
c.- Determinacin de transaminasas
1.- Encender el aparato y seleccionar la longitud de onda de:340 nm
2.- Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
3.- Disolver una tableta de R2 (sustrato) en R1 (regulador)
4.- En la celda espectrofotomtrica pipetear lo que se indica en el siguiente cuadro.
RT (mL)
Muestra (L)
1,0
100
5.- Mezclar e incubar por 1 minuto

6.- Leer la absorbancia (As) inicial de la muestra, poner en marcha el cronmetro y leer la absorbancia
cada minuto durante 3 minutos.
7.- Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (A/min).

Datos
Asinicial: ___
As60s____
As 120s:______
As180s:_____
A= As60s Asinicial : ___________

A= A120s As60s : ____________
A= As180s As120s : ___________
Obtener el promedio: __________ y aplicar la siguiente formula.
CLCULOS:
A/min x 1750 = U/L de AST
Unidades: La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 mol de substrato por
minuto, en condiciones estndar. La concentracin se expresa en unidades por litro (U/L).
Valores de referencia orientativos.
Aspartato aminotransferasa
Hombres Hasta 19 U/L 26 U/L 38 U/L
Mujeres Hasta 16 U/L 22 U/L 31 U/L
d.- Determinacin cuantitativa de urea en suero (marca SPINREACT)
1.- Encender el espectrofotmetro y seleccionar la longitud de onda de 510 nm
2.- Cintica: Preparar una serie de tres tubos como se muestra en el siguiente cuadro
Blanco
R 1 (ml)
Patrn (l)
Muestra (l)
Patrn
1,0
1,0
-50
---
Muestra
1,0
-50
3.- Mezclar e incubar por un minuto a 35 C y aadir 1 ml del reactivo (R2) a cada tubo.
4.- Inmediatamente colocar el contenido del tubo a una celda espectrofotometrica y leer la absorbancia a
los 60 y 120 s.
5.- Calcular el incremento de Absorbancias As= As2 As1 .
Datos:
As1 60 s: _______________
As2 120 s: ______________
CLCULOS
(As) muestra
---------------------X 50 (conc. del patrn)= mg/dl de urea en la muestra.
(As) patrn
Urea
Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L)
Orina: de 20 a 35 g/24 horas
e.- Determinacin cuantitativa de cido rico (marca SPINREACT)
1.- Preparar el reactivo de trabajo, disolviendo el contenido de R2 (enzimas) en el frasco de R1
(regulador), el reactivo as preparado es estable por un mes de 2 a 8 C o 10 das a temperatura
ambiente.
2.- Encender el espectrofotmetro y seleccionar la longitud de onda de 520 nm

3.- Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada.
4.- Colocar y etiquetar una serie de tres tubos y adicionar lo que indica la siguiente tabla
RT (ml
Patrn (l)
Muestra (l)
Blanco
1,0
---
Patrn
1,0
25
--
Muestra
1,0
-25
5.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37 C o 10 minutos a temperatura ambiente

6.- Leer la absorbancia (A) del patrn y la muestra, frente al blanco de reactivos. (La reaccin es estable
por 30 min)
CLCULOS:
Recordar que hay que ajustar con agua destilada a cero y luego leer el blanco de reactivos y al valor
obtenido de la muestra, restarle el valor del blanco de reactivos.
As de la muestra ______
_______
As del patrn: _______
Concentracin
del
patrn:
Suero o plasma
(As) muestra
---------------------X 6 (conc. del patrn)= mg/dl de cido rico en la muestra.
(As) patrn
(As) muestra
---------------------X 6 X vol (dl) orina / 24 h = mg/24 h de cido rico en la muestra.
(As) patrn
cido rico
Suero o plasma
Mujeres:
2,5 6,8 mg/dl
Hombres:
3,6 7,7 mg /dl
Orina:
250 750 mg/24 h
ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
Cul es la sensibilidad del mtodo utilizado para cada prueba?, Cmo determinamos la sensibilidad
analtica? Existen para las determinaciones algunas sustancias que pueden interferir con los valores
orientativos de referencia? Por qu en el caso de la urea utilizamos una cintica para la determinacin
de este parmetro?, Por qu decimos que son valores orientativos de referencia?, dado que estos
compuestos nos indican la degradacin de protenas y cidos nucleicos, Qu interpretacin le damos a
un aumento o una d disminucin de los valores?, Cmo te percatarias que los reactivos ya no son
funcionales?
CONCLUSIONES
Anota las conclusiones obtenidas en esta prctica
BIBLIOGRAFA
Devlin, T. M. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Tomo I y II. 5ta. Edicin. Ed. Revert. Espaa. 2000.
1298pags.
Lozano, J.A. Bioqumica y biologa molecular para ciencias del a salud. 2da. Edicin. Ed.McGraw-Hill.|
Espaa.2001. 522 p
PRCTICA 6
DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD V. Anabolismo celular
Tema: 5.4. Metabolismo de colesterol.
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno analizar el anabolismo de lpidos mediante la determinacin de colesterol.
1.2 Objetivo especfico.
El alumno realizar la determinacin experimental de colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIN.
El colesterol es un lpido esteroide presente en las clulas de los tejidos animales, hidrofbico, poco
soluble en medio acuoso, se puede encontrar libre o esterificado con cidos grasos, se une a diversas
protenas formando las lipoprotenas plasmticas para ser transportado. La determinacin de la
concentracin plasmtica de colesterol tiene gran inters clnico, pues est demostrada la relacin entre los
niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y cardiopata isqumica.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en exceso
es potencialmente daino. Su transporte por las lipoprotenas y captura en las clulas est regulado, pero
demasiado colesterol en la sangre lleva a que se acumule, en especial en las arterias a las que puede
obstruir (ateroesclerosis).
Los mamferos pueden obtener el colesterol por dos vas, la exgena y la endgena. La va exgena es por
la ingesta de alimentos de origen animal, como el hgado, lcteos, carnes rojas y yema de huevo. La va
endgena es la biosntesis de colesterol en el organismo, que se realiza en el retculo endoplsmico liso y
cuyo precursor es la acetil-coenzima A. Diariamente el hgado produce alrededor de 800 a 1000 mg de
colesterol, aunado a los cientos de miligramos que ingerimos en la dieta, dara una elevada concentracin
de este, pero la ingesta de colesterol disminuye la sntesis en el organismo.
El colesterol desempea varias funciones bioqumicas importantes, es un componente esencial de las
membranas celulares en animales, donde regula su fluidez y es un precursor de muchas biomolculas
importantes, incluidas las hormonas esteroideas, las sales biliares y la vitamina D. Los problemas de salud
no se deben a un efecto directo de la molcula, sino a una deficiencia fisiolgica en su transporte, debido a
su baja solubilidad y tiene que ser transportado por protenas plasmticas formando lipoprotenas, como
las LDL, VLDL y HDL.
54
El proceso de captacin inicia con la unin de las LDL que contienen colesterol con lugares de unin
especficos en las clulas, conocidos como receptores proteicos de la membrana plasmtica. Las LDL se
invaginan en la membrana plasmtica y se fusionan como parte de ella para formar una vescula
endoctica. Dentro de la clula, la vescula se fusiona con los lisosomas, y las enzimas lisosomales
catalizan la hidrlisis de los steres de cido graso dejando al colesterol libre para la construccin de
membranas. Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles altos de colesterol sanguneo) es un
defecto gentico, donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y desarrollan el sndrome
conocido como hipercolesterolemia familiar. Esta enfermedad ocasiona que los niveles de colesterol
lleguen hasta 700 mg/100 ml, los niveles normales estn entre 150-200 mg/100 ml). El colesterol se
deposita como placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias), muchos de
las personas que padecen esta enfermedad mueren de ataques cardiacos durante su infancia.
En general se promueve en la poblacin reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el gentico y el de gnero: las mujeres tienden a acumular
menos colesterol y sus niveles de HDL son ms altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades
cardiovasculares que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hbito de fumar, el
consumo de alcohol, una dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrs, que en su
conjunto aumentan los niveles de colesterol y TAG.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
Bao a 25 o 30o C
1 gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
EQUIPO
Espectrofotmetro para luz UV
1 porta celdas
1 centrfuga
REACTIVOS
Kit para Colesterol
MUESTRA: Obtener 3 ml de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el
cogulo durante 5 a 35 o C y centrifugar durante 7 a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de
13 x 100 utilizando una pipeta pasteur.Se puede utilizar suero o plasma. La muestra es estable 7 das a 28C y varios meses si se mantiene la muestra congelada (-20C).
A. COLESTEROL. Los primeros mtodos para la determinacin del colesterol se basaban en la formacin
de compuestos coloridos mediante reacciones qumicas del colesterol. No obstante, debido a los lquidos
corrosivos que utilizan, estos mtodos actualmente no se suelen emplear para los anlisis de rutina, a la
fecha se han desarrollado mtodos enzimticos, igualmente especficos, de fcil manejo y de gran
sensibilidad.
55
Fundamento: En estos mtodos enzimticos, la primera reaccin consiste en la hidrlisis de los steres de
colesterol por accin de esterasas bacterianas inespecficas con respecto al cido graso esterificado; a
continuacin se produce la oxidacin del colesterol (el formado en la reaccin anterior y el preexistente, o
colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, producindose H2O 2, el cual con la participacin
de peroxidasa da lugar a la formacin de un compuesto colorido. El esquema de las reacciones acopladas
es el siguiente:
CHE
steres colesterol + H2O Colesterol + cidos grasos CHOD
POD2O
Colesterol + O2 4-Colestenona + H2O2
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona Quinonimina + 4H+ Compuesto colorido
CHE: Colesterol esterasa
CHOD: Colesterol oxidasa
POD2O: Peroxidasa
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de colesterol presente en la muestra
ensayada
El colesterol es una sustancia presente en todas las clulas del organismo. El hgado produce naturalmente
todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La
determinacin del colesterol es uno de las herramientas ms importantes para el diagnstico y
clasificacin de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de
riesgo cardiovascular.
El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio.
Dependiendo del Kit que se tenga en la prctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
REACTIVOS
PIPES pH 6,9
R1
Regulador Fenol
Colesterol esterasa (CHE)
Colesterol oxidasa (CHOD)
R2
Enzimas
Peroxidasa (POD)
4 - Aminofenazona (4-AF)
Patrn de Colesterol
90 mmol/L
26 mmol/L
300 U/L
300 U/L
1250 U/L
0,4 mmol/L
200 mg/dL
PREPARACIN DE REACTIVOS:
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en 1 frasco de R 1 Regulador,
tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad (RT): 4 meses en nevera (2-8C) o 40 das 15-25C. Mantener protegido de la luz
Conservacin y estabilidad. Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8C, protegidos de la luz y se
evita su contaminacin.
Patrn de colesterol. Una vez abierto, es estable 1 mes si se mantienen bien cerrados a 2-8C, protegidos
de la luz y se evita su contaminacin.
56
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 505 nm (500-550)
Cubeta o celda. . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37C /15-25C
Blanco
Patrn
Muestra
Reactivo de trabajo (mL)
1,0
1,0
1,0
Patrn de colesterol (L)
--
10
--
Muestra (L)
--
--
10
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C 10 min. a temperatura ambiente.

5. Leer la absorbancia (A) del Patrn y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable
durante 60 minutos.
CLCULOS
A (Muestra) (x 200 (Conc. Patrn) / Patrn) A = mg/dL de colesterol en la muestra
Factor de conversin: mg/dL x 0,0258= mmol/L.
5.-RESULTADOS
Equipo Colesterol (mg/dl) Equipo
Colesterol (mg/dl)
Evaluacin del riesgo:
Menos de 200 mg/dL Normal
200-239 mg/dL
Moderado
240 o ms
Alto
57
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
Analiza y discute los resultados obtenidos, as como la metodologa utilizada. Discute la importancia del
uso de las enzimas en el diagnstico clnico. Contesta las siguientes preguntas e inclyelas en la discusin.
1.- Cual es la importancia clnica de las determinaciones de colesterol?
2.- Explica 3 enfermedades ocasionadas por la alteracin de los niveles de colesterol y que otros
parmetros hay que tomar en cuenta.
3.- Por qu los valores de colesterol pueden variar de una localidad a otra?
4.- Por qu la ingesta de colesterol, disminuye la sntesis de colesterol en el hgado?
5.- Investiga 2 frmacos que se utilicen para disminuir la concentracin de colesterol en la sangre
6.- Qu enfermedad gentica ocasiona la hipercolesterolemia, y que protena se ve afectada?
7.- CONCLUSIONES. Con el anlisis y discusin de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos
de la prctica y la investigacin bibliogrfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA.
Cita la bibliografa consultada para hacer tu reporte.
Bibliografia
Davidsohn I., Henry J. B.Todd-Sanford. Diagnstico clnico por el laboratorio.6. Edicin. Salvat editores.
Barcelona. 1979. 1484 pgs.
Devlin. T. M., Bioqumica con aplicaciones clnicas tomo I y II 3. Ed- Revert S.A., Espaa. 1997. 1298
pgs.
Boyer R. Conceptos en Bioqumica.1ra. Edicin. International Thomson Editores. Mxico. 1999. 694 pg
58
Practica No 7
TRANSFERENCIA Y EXPRESIN DE MATERIAL GENTICO
Relacin con Unidad Temtica
VI. Aspectos Genticos del Metabolismo
I. OBJETIVOS
El alumno trasferir material gentico a un microorganismo.
El alumno verificara que el material gentico contiene la informacin especfica.
II. FUNDAMENTOS TERICOS.
El DNA (cido desoxirribonucleco) es el almacn de la informacin gentica de los seres
vivos, en el se encuentran codificadas todas la caractersticas que definirn a un ser vivo
como miembro de una determinada especie, as como un organismo con caractersticas
propias individuales.
La expresin de material requiere primero de su amplificacin por el mecanismo de
transcripcin, donde se generan molculas de RNA que llevan la informacin gentica
hacia el sistema donde sta ser decodificada mediante el proceso de traduccin, en el, la
informacin es traslocada a una protena especfica, las diversas protenas generadas por la
transcripcin y traduccin de diversos genes darn origen a los complejos
macromoleculares enzimticos o estructurales que generarn en ltima instancia las
caractersticas propias de cada individuo.
Si bien el pool gentico es propio de cada especie e individuo, en la naturaleza existen
diversos mecanismos que permiten el intercambio de material gentico entre organismos de
modo tal que las caractersticas de un individuo as como de su descendencia pueden
modificarse y ser expresadas como propias. Desde hace varios aos los investigadores han
logrado manipular los diversos mecanismos de transferencia de material gentico para
lograr un fin determinado, intentando incluso la manipulacin gentica en el ser humano
empelando para ello las tcnicas modernas de biologa molecular.
La transduccin, la conjugacin y la transformacin son las vas, mediante las cuales se
puede introducir material gentico exgeno a una clula. La transformacin gentica se
presenta cuando, el DNA desnudo es incorporado a la clula, despus de esto, el DNA
puede o no ser integrado al propio material gentico. El material gentico puede ser un
plsmido que ha sufrido o no la manipulacin por el hombre, por lo que podra contener
genes de resistencia o de importancia industrial o farmacolgica.
La sntesis de protenas puede ser constitutiva o inducida, esto es, la sntesis de protenas es
regulable, la regulacin ocurre a nivel de transcripcin, lo que significa que muchas
protenas solo sern generadas cuando la clula lo requiera, cuando se presente un estmulo
que desencadene su produccin, estmulo que generalmente es una seal del medio
ambiente.
59
En esta prctica se emplear el plsmido pGLO, el cual, contiene el gen para la protena
verde fluorescente, aislada de la medusa Aequorea victoria, (un eucariota), unida al
promotor PBAD de arabinosa, el gen ara C, y el gen para resistencia a ampicilina el cual
acta como gen reportero. ste plsmido se introducir a una clula bacteriana para dotarla
de la capacidad de producir la protena verde fluorescente (GFP) y se inducir su expresin
con el catabolito arabinosa.
III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Plsmido pGLO.
Solucin de transformacin con cloruro de calcio estril.
Caldo Luria
Medio Luria con Ampicilina (50g/ml)
Medio Luria con Ampicilina y Arabinosa (1mg/ml)
Tubos de microensayo de 1.5 ml estriles.
Pipetas automticas de una 1000l y otra de 10l
Puntas estriles
Asa bacteriolgica
Pipetas estriles de 1ml.
Varilla acodada
Bao de hielo
Bao Maria a 42C
Lmpara de luz UV
Incubadora a 37C
IV. DESARROLO EXPERIMENTAL
Todo el trabajo se realizar en condiciones de esterilidad, cerca de un mechero encendido.
1. Marcar dos tubos de microensayo estriles como +pGLO y pGLO (Testigo)
2. Transferir a cada tubo 250l de solucin de transformacin.
3. Colocar los tubos en hielo.
4. Con asa bacteriolgica tomar una colonia de bacterias y sumergirla en la solucin de
transformacin en uno de los tubos, agitando para formar una suspensin bacteriana.
5. Repetir el procedimiento con el otro tubo.
6. Tomar el tubo con la solucin de pGLO y examinarlo bajo luz UV. Anotar las
observaciones.
7. Tomar 1l de sta solucin de plsmido y adicionarlo al tubo con la suspensin
bacteriana. Adicionar tambin 1l al tubo testigo.
8. Incubar los tubos en hielo durante 10minutos.
9. Transferir ambos tubos a un bao mara a 42C durante exactamente 50 segundos.
10. Inmediatamente despus regresarlos al hielo. Para mejores resultados se deben realizar
los cambios de hielo a 42C y de regreso a hielo, lo ms rpido posible.
11. Incubar en hielo durante 2 minutos.
12. Sacar del hielo los tubos y adicionar a cada uno 250l de caldo luria en condiciones
estriles. Mezclar perfectamente.
13. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
60
14. Tomar 0,1ml de cada tubo y colocarlos en las diferentes cajas de petri segn el siguiente
esquema: (Usar una pipeta estril para cada tubo)
Tubo con pGLO
LB + Amp
LB + Amp + Ara
Tubo sin pGLO

LB + Amp
LB
15. En condiciones estriles, realizar extensin con varilla

16. Etiquetar las cajas e incubar a 37C, durante 24 horas.
17. Observar las colonias a luz normal y bajo luz UV. Contar el nmero de colonias en cada
caja y bajo los dos tipos de luz.
V. RESULTADOS
Anote lo que se pide.
Que se observa en el tubo con pGLO al iluminarlo con luz UV?
_____________________________________________________________________
Morfologa colonial
Medio
No de colonias
Color
Forma
Aspecto
Fluorescencia
Tamao
Con pGLO
LB + Amp.
LB+Amp+Ara
Sin pGLO
LB + Amp
LB
Anote la frecuencia de transformacin

________________________________________________.
VI. ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
Incorpora cada uno de los siguientes puntos en tus anlisis y discusin de resultados.
Haz un esquema del DNA y explica como es que la informacin gentica se encuentra
almacenada ah.
Haz un esquema de un plsmido, seala sus partes importantes, explica que es y cual es su
funcin, explica tambin que es un gen reportero y que propiedad confiere el gen. Amp a
los organismos que lo poseen.
Di cual es el papel de la arabinosa en ste sistema.
Di que es la protena verde fluorescente y que caractersticas tiene.
61
Que caractersticas tiene el medio LB.

Explica que informacin se desprende de la tabla, explica porque hay diferente nmero de
colonias en cada cuadro, explica el porque de cada resultado.
En cuanto a la morfologa colonial es igual en los diferentes medios o diferente? di porque.
Di que pasa al iluminar con luz UV las placas y porque sucede eso, que fenmeno ocurri
en la columna dos que no ocurri en la columna uno.
Puedes afirmar, que ocurri incorporacin de material gentico a las bacterias, explica tu
respuesta.
Puedes afirmar con estos experimentos que la informacin gentica se encuentra en el DNA,
explica tu respuesta.
Que te dice el resultado de la frecuencia de transformacin, para que nos sirve ste dato?
En tu campo para que podras ocupar este conocimiento, sobre la transformacin
particularmente en bacterias.
VII. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados, a su anlisis y discusin anota las conclusiones que de esto se
desprende.
VIII. BIBLIOGRAFA
Devlin. T. M., Bioqumica con aplicaciones clnicas tomo I y II 3. Ed- Revert S.A.,
Espaa. 1997. 1298 pgs.
Stryer L. J. Berg, J. Tymoczko Bioqumica. 5 edicin. Ed. Revert, Espaa, 2003. 974
pgs.
Sambrook, J. y col 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor laboratory. CSH. New
York.
62
PRACTICA No. 8
DETERMINACIN DE HORMONA GONADOTROPINA CORINICA HUMANA (HGC)
UNIDAD VII: Integracin y Regulacin del Metabolismo.
TEMA
7.3 Principales Hormonas en humanos.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Explicar la regulacin del metabolismo y el papel de las hormonas en el mismo.
1.2 Objetivos Especficos
1.2.1 El alumno realizar la determinacin cualitativa de la hormona gonadotropina corionica humana en
una muestra biolgica.
1.2.3 El alumno interpretar el resultado como una forma de diagnostico.
2. INTRODUCCIN
A partir del momento en que el vulo es fecundado por un espermatozoide, comienzan a producirse en el
cuerpo de la mujer, una serie de cambios bioqumicos destinados a adaptarse a la nueva situacin, y que
continuarn durante los nueve meses siguientes. Esto es lo que conocemos como un embarazo.
Existen muchas seales asociadas al embarazo, la ms comn es la falta menstrual, pero como no todas
las mujeres tienen periodos regulares es importante observar otras seales como: nuseas, acidez,
fatiga, y micciones frecuentes, aunque para confirmar el embarazo, es necesario detectar la presencia de
una hormona llamada gonadotropina corinica humana (HGC), que es producida por la placenta y se
encuentra presente en la sangre y en la orina de la mujer embarazada, siendo detectable de 7 a 10 das
tras la concepcin.
La hormona gonadotropina corinica humana (HCG) es una hormona glicoproteica que se produce en
condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el embarazo. La HCG,
junto a la hormona folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del
tiroides (TSH), est constituida por una cadena alfa, estructuralmente similar entre ellas, y una cadena
beta especfica que determina su actividad biolgica. Esta hormona estimula la produccin de hormonas
esteroides por el cuerpo lteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del
embrin. El principal uso de la determinacin de la HCG es el diagnstico temprano del embarazo; sin
embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales, embarazos
ectpicos y ovricos.
La HGC constituida por dos subunidades, la subunidad la cual es idntica a las subunidades de
hormonas hipofisiarias como la (LH), (FSH), y (TSH). La subunidad es la que proporciona su funcin
biolgica especfica y la que detecta especficamente a la hora de hacer la prueba, por lo tanto cuando se
determina la HCG lo que realmente se mide es la subunidad de la HGC.
La determinacin de HCG se realizaba tradicionalmente por ensayo inmunoisotpico (RIA) con el uso de
anticuerpos policlonales, mtodo altamente sensible pero que presenta un marcado efecto de reacciones
cruzadas en relacin con las dems hormonas glicoproteicas, lo cual hace poco precisos los resultados.
De ah que recurrir a la tecnologa de produccin de hibridomas es una ventaja en este sentido, ya que
permite disponer de poblaciones homogneas de anticuerpos que por su especificidad y suministro
ilimitado permiten desarrollar metodologas alternativas.
En el mercado existen muchos reactivos comerciales entre los que podemos encontrar los
inmunoensayos por cromatografa de flujo lateral. El mtodo emplea una combinacin nica de
conjugado anticuerpo monoclonal-colorante y anticuerpos policlonales en fase slida para identificar
selectivamente HCG presente en la muestra, con un elevado grado de sensibilidad. En menos de 5
minutos, pueden detectarse niveles de HCG tan bajos como 10 mIU/ml.
64
Cuando se aplica una cantidad suficiente de muestra en la porcin absorbente, sta migra por capilaridad
a travs de la tira. El conjugado anticuerpo-colorante se une a la HCG formando un complejo anticuerpoantgeno. Este complejo se une al anticuerpo anti-HCG de la zona de reaccin positiva produciendo una
banda coloreada rosa cuando la concentracin de HCG es mayor de 10 mIU/ml. En ausencia de HCG, no
se observa banda alguna en la zona de reaccin positiva. La mezcla de reaccin continua la migracin a
travs de la tira hasta la zona control. El conjugado libre an, se une a los reactivos de la zona control
formando una banda coloreada rosa, demostrando el correcto funcionamiento de la prueba.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
2 tubos de ensaye 13 X 100 mm
1 gradilla
1 pipetas Pasteur
1 bulbo para pipeta Pasteur
1 jeringa con aguja estril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
1 ligadura
Recipiente para objetos punzocortantes
3.2. Reactivos
1 kit comercial para la deteccin de HGC
3.3. Equipo
Centrfuga clnica
3.4 Muestra biolgica
Muestra de suero
Muestra de orina
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera asptica 5 ml de sangre, con el procedimeitno que indique el profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- Etiquetar un frasco, el cual debe estar limpio y seco
2.- Solicitar a la persona a la cual se le har la determinacin la muestra de orina, de preferencia la
primera orina de la maana.
3.- Si el anlisis no se realiza inmediatamente la muestra se puede refrigerar de 2 a 8 C, hasta por 24
horas.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.- Una vez colocada la muestra en el tubo correspondiente ya sea de suero u orina.
2.- Introducir verticalmente la tira HCG en la muestra durante 5 segundos para las muestra de orina o 10
segundos para las muestras de suero.
65
3.- Leer en ambos casos el resultado a los 3-5 minutos y comparar con el resultado que viene en el
inserto de la prueba.
Precaucin: No sobrepasar la marca roja y no interpretar el resultado despus de transcurrir 10 minutos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1.- La prueba solo sirve como diagnostico in vitro como un estudio preliminar cualitativo.
2.- No realizar la prueba en embarazos muy temprano, pues a bajas concentraciones el resultado puede
ser negativo.
RESULTADOS
Negativo: Si slo aparece una banda coloreada transversal en la zona blanca superior (banda control)
Positivo: Adems de la banda transversal roja (control) aparece una segunda banda transversal roja en
la zona blanca central de la tira
No vlido: Si no aparece ninguna banda coloreada visible se recomienda repetir la prueba con una
nueva placa u obtener una muestra fresca.
ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
Cul es la sensibilidad de este mtodo?, Dado que existe una fraccin similar en varias hormonas Cul
es la importancia de elegir una fraccin especfica en la determinacin de esta prueba?, Con que
hormonas puede ocasionar reacciones cruzadas y cuando se llevara a cabo? Existen algunas
sustancias que interfieran en el mtodo?, Esta hormona solo es secretada en las mujeres?, Cul es la
funcin de la HGC?
CONCLUSIONES
Anota las conclusiones obtenidas en esta prctica
BIBLIOGRAFA
Devlin, T. M. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Tomo I y II. 5ta. Edicin. Ed. Revert. Espaa. 2000.
1298 pags.
Lozano, J.A. Bioqumica y biologa molecular para ciencias del a salud. 2da. Edicin. Ed.McGraw-Hill.|
Espaa.2001. 522 pags.
66

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MANUAL DE BIOQUMICA FARMACUTICA

El presente manual fue elaborado por:

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II.1.- Para asistir al laboratorio el alumno deber traer:

Una fotografa tamao infantil

II.2.- Por equipo deber traer:

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

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NOMBRE DEL ALUMNO:__________________________________________

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PRCTICA No. 1 Naturaleza qumica de las enzimas y actividad biolgica

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8. Mezclar e incubar 10 minutos a 37C o 30 minutos a temperatura ambiente.

X 100 = mg/dl de glucosa en la muestra

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11. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o 10 minutos a temperatura ambiente.

= mg/dl de lactato en la muestra

Factor de conversin: mg/dllac X 0.111 = mmol/llac

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El alumno aislar mitocondrias a partir de riones de rata.

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Agua destilada (mL)

Completo +Malonato +Malonato +CN-

Malonato 0.5 M (mL)

KCN 0.1 M (mL)

Cit C 0.6 mM (mL)

Succinato 0.5 M (mL)

Incubar los tubos a 37oC durante 5 minutos

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Concentracin de fsforo (moles)

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10.1 Lenhinger, A., Principios de Bioqumica, 3. Ed. Omega. Espaa 2001.

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4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o 10 minutos a temperatura ambiente.

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4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C o 10 minutos a temperatura ambiente.

7.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37o C

x Conc. del calibrador = mg/dl de HDL colesterol en la muestra

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AGITAR CON VORTEX DURANTE 5 MINUTOS (evitar la formacin de espuma)

Incubar a 37o C durante 20 minutos

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6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.

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Kit de reactivos para la deteccin cuantitativa de nitrgeno en urea.

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