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Scientia Chromatographica

TROUBLESHOOTING (TS)

Uma viso tcnica para a


compreenso e resoluo de
problemas em sistemas de
cromatografia lquida

lvaro Jos dos Santos Neto


Editor

lvaro Jos dos Santos Neto


Universidade Federal de Alfenas
Departamento de Cincias Exatas
37130-000 Alfenas (MG)
Brasil
lvaro.santosneto@unifal-mg.edu.br

Resumo
Como apresentado na edio de lanamento da Scientia Chromatographica, esse espao tratar do assunto
Troubleshooting em cromatografia o entendimento e a resoluo dos problemas mais comuns apresentados pelos
sistemas e mtodos cromatogrficos de anlise. Nessa edio, uma introduo tcnica e s estratgias de
troubleshooting em sistemas e mtodos cromatogrficos ser
apresentada. Na segunda parte do artigo haver a descrio do sistema
Palavras-chave
de cromatografia lquida de alta eficincia, com uma viso voltada ao
Tcnica de troubleshooting;
entendimento e preveno de problemas comumente encontrados.
cromatografia lquida; CLAE;
manuteno em cromatografia.

Abstract
As presented in the release edition of the Scientia Chromatographica, this column will deal with
Troubleshooting in chromatography addressing the comprehension and resolution of the usual problems depicted
by chromatographic systems and methods of analysis. In this edition, we will present an introduction to the
concepts and strategies of the troubleshooting technique, applied for
chromatographic systems and methods. In the second part, a description
Keywords
of the high performance liquid chromatographic system will be
Troubleshooting technique;
presented, focusing on the understanding and prevention of the most
liquid chromatography; HPLC;
usual problems that a chromatographist is used to deal with.
chromatography maintenance.

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Scientia Chromatographica

Como apresentado na edio de lanamento da


Scientia Chromatographica, esta coluna tratar
daquilo que em ingls chama-se Troubleshooting, ou
seja, de maneira resumida, em portugus, pode-se
compreender esse termo como a identificao e
resoluo de problemas em um sistema ou processo.
Dessa forma, a abordagem de troubleshooting em
cromatografia tem o objetivo de observar, isolar e
corrigir problemas, de maneira direta, simples, racional
e eficiente. Adiante, estratgias para a sistematizao
da identificao e resoluo dos problemas sero
apresentadas, servindo de guia para a abordagem das
falhas que surgirem no decorrer do uso de um sistema
cromatogrfico ou relacionado. Pretende-se abordar as
diversas formas de cromatografia instrumental, por
exemplo, cromatografia lquida, gasosa e com fluido
supercrtico, bem como os assuntos relacionados a ela
(preparo de amostras, tratamento dos dados,
acoplamento com outras tcnicas). A cromatografia
lquida de alta eficincia (HPLC ou CLAE para aqueles
que gostam do termo em portugus) est presente como
ferramenta de anlise nos mais diversos laboratrios e,
dessa forma, ser a primeira a receber a nossa ateno.
Para que o usurio da tcnica torne-se um
profissional (cromatografista) mais capacitado e
prontamente apto para atuar na identificao e
resoluo de problemas, uma compreenso do
funcionamento de cada parte do sistema de
cromatografia imprescindvel. Por essa razo, nesse
primeiro artigo, haver uma discusso relativamente
detalhada dos princpios de funcionamento e operao
de cada parte de um HPLC, bem como sero indicados
os problemas mais comuns que ocorrem em cada parte.
Obviamente, seria praticamente impossvel enderear
cada um dos eventuais problemas que podem ocorrer
em cada parte de um sistema HPLC, da mesma forma,
uma discusso detalhada de cada problema
reconhecido resultaria em um livro sobre resoluo de
problemas em HPLC. Nessa coluna, tentaremos
abordar, ao longo do tempo, os aspectos mais
relevantes que forem considerados pelo editor,
contando com a grande colaborao, sugesto e crtica
dos leitores/colegas cromatografistas. Conforme
necessrio, um pouco da teoria da cromatografia ser
apresentada como subsdio para a compreenso e
resoluo de problemas especficos que estiverem
sendo discutidos. Acreditamos que a compreenso dos
fundamentos bsicos da teoria e tcnica da HPLC so
os requisitos que juntamente com a experincia
adquirida habilitam um cromatografista para atuar com
propriedade, tanto em anlises de rotina quanto nas
reas de pesquisa.

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Quando h um problema?
O que fazer nesse caso?
Antes de adentrar ao assunto da tcnica de
HPLC, gostaria de destacar os fundamentos da tcnica
de Troubleshooting. O primeiro passo para
resolvermos um problema sabermos que estamos
diante de um. Ou seja, precisamos da resposta para a
pergunta Quando h um problema?. Para isso,
precisamos reconhecer o funcionamento normal do
nosso equipamento, de maneira a reconhecer quando
algo de anormal vem a surgir. prtica recomendada
em qualquer laboratrio, mesmo que no exigida pela
rotina, manter um caderno com anotaes sobre o
funcionamento do equipamento. Da mesma forma,
interessante ter um conjunto de condies padro de
uso, sob o qual se obtm determinado resultado. Por
exemplo, com uma determinada coluna e ao utilizar-se
certo
mtodo,
obtm-se
um
reconhecido
cromatograma para a mistura teste, bem como o
registro de certo intervalo de presso para a coluna. Os
sentidos do cromatografista tambm so importantes
ferramentas no reconhecimento de problemas: rudos
ou vibraes anormais podem ser indcios de peas
desgastadas, mal lubrificadas, quebradas, mal
colocadas etc.; vazamentos ou bolhas podem ser
visualmente detectados, bem como as anormalidades
reportadas pelo cromatograma; um eventual
aquecimento ou liberao de odor caracterstico pode
indicar a ocorrncia de queima ou superaquecimento
de placas ou componentes eletrnicos.
Ao reconhecer o problema, O que fazer nesse
caso?, primeiramente, importante saber se ele pode
ser resolvido pelo prprio cromatografista ou se haver a
necessidade de assistncia tcnica especializada. Muitos
procedimentos podem ser realizados pelo prprio
cromatografista e so inclusive listados e descritos nos
manuais de operao e manuteno rotineira dos
equipamentos. Por outro lado, outros procedimentos
fazem parte apenas dos manuais de servio restritos
aos tcnicos especializados e treinados para
manutenes mais avanadas. O cromatografista deve
reconhecer at onde pode atuar e quando chega a hora de
pedir socorro a um profissional habilitado para fazer a
manuteno daquele equipamento.
As sugestes que sero apresentadas nessa
coluna, sero de carter genrico. Apesar de
culturalmente as instrues de uso dificilmente serem
lidas, deve ser entendido que as sugestes apresentadas
aqui no se prestam a substituir os manuais de uso e
manuteno dos equipamentos. Esses manuais contm
informaes especficas e detalhadas para o
equipamento, de uma determinada marca e modelo, em

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particular. Por exemplo, em um procedimento de


manuteno, um manual de boa qualidade traz
diagramas com vista explodida e procedimento passo a
passo para acessar um determinado problema.
Ao efetuar modificaes no hardware do
equipamento, tudo deve ser devidamente anotado e
sistematizado. Por exemplo, ao se suspeitar de mau
funcionamento de uma check valve, a flutuao de
presso dever ser registrada, a vlvula marcada,
trocada e ento a presso aferida e comparada com a
anteriormente registrada. Imagine a dor de cabea
causada por no se marcar uma check valve defeituosa
que foi substituda e posteriormente utiliz-la como
pea de reposio ao se fazer a manuteno
preventiva de outro HPLC. O registro dos
procedimentos de manuteno tem uma vantagem
adicional, pois servem como referncia quando um
problema similar voltar a ocorrer.
Em tempo, importante destacar que, apesar
de algumas pessoas associarem o acrnimo HPLC
com High Problem Liquid Chromatography, um
sistema bem cuidado, com manutenes preventivas
bem executadas e em dia, dificilmente ter problemas
de hardware complicados de serem resolvidos.

reconhecendo-o e resolvendo-o. Algumas vezes, um


laboratrio no tem tempo para tal procedimento,
nesse caso, uma reviso completa da parte sob
suspeio, no sistema, realizada. Se o problema
realmente estiver localizado naquele mdulo ou parte,
provavelmente ser resolvido, porm custa de um
dispndio de recursos maior e sem a compreenso do
que realmente causou o problema. Se a causa do
problema for sistemtica, no se saber como
preveni-la, correndo-se o risco de haver recorrncia,
obrigando a uma nova interveno. Um exemplo
clssico a troca da coluna ou pr-coluna quando se
apresenta um aumento de presso no sistema de LC.
Nem sempre essa a estratgia que surte efeito e no
a maneira mais eficiente de iniciar os testes de
troubleshooting. O isolamento da linha do solvente,
ponto a ponto e sequencial, entre a bomba e o
detector, poderia rapidamente resolver o problema.
Um filtro entupido aps a bomba, ou mesmo uma
vlvula de injeo parcialmente obstruda poderiam
ser a causa do problema, evitando a substituio
desnecessria de uma coluna ou pr-coluna.
2. Confirme a presena do

problema e a sua soluo

Os fundamentos da
Tcnica de Troubleshooting
Dentre os objetivos da tcnica de
troubleshooting, esto includos: a identificao dos
problemas to logo ocorram; a pronta localizao da(s)
causa(s); a soluo rpida do problema. importante,
ainda, que o procedimento seja documentado para que
uma nova ocorrncia seja mais facilmente identificada
e resolvida. Como comentado anteriormente, a
observao cuidadosa do bom funcionamento do
equipamento um excelente termmetro para saber
quando algo de errado surge no sistema ou nos
resultados esperados. Essa tcnica de isolamento e
soluo de problemas baseia-se na sistematizao, de
maneira lgica, da busca pelo problema. As principais
estratgias adotadas seguem a seguir:
1. Uma mudana de cada vez

A abordagem do problema deve ser feita de


maneira lgica e sequencial. Cada alterao ou
substituio de componente ou pea deve ser feita
individualmente para que ento outra possibilidade
seja avaliada. Apesar da realizao de mudanas e
testes individuais soar como uma perda de tempo, essa
a melhor maneira de se isolar o problema,
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Ao deparar com um problema, importante


que este seja confirmado por uma segunda injeo,
antes que mudanas no mtodo ou sistema comecem a
ser feitas na busca pela sua causa. s vezes, um
artefato cromatogrfico causado por uma bolha de ar
espordica pode levar caa pelo problema, quando
ele no mais est presente. Da mesma forma,
importante confirmar se a mudana feita no sistema
ou mtodo, ao se abordar um problema, realmente
efetiva, antes de se partir para um novo teste. Um
exemplo que leva muitos cromatografistas em busca
de problemas no mtodo, preparo de amostras ou
solues de padres o aparecimento de picos
inesperados em corridas cromatogrficas com
gradiente. Algumas vezes, esse(s) pico(s) pode(m) ser
decorrentes de contaminante(s) presentes na gua ou
solventes orgnicos utilizados, e no aparece(m) em
separaes isocrticas. No uso de gradiente, um
contaminante pode ser pr-concentrado no incio da
corrida cromatogrfica, quando a fase mvel no tem
fora suficiente para elu-lo, e ento, ao se iniciar a
rampa do gradiente, ele ser eludo na forma de um
pico cromatogrfico inesperado. Para observar-se que
o problema no diretamente relacionado com o
mtodo aplicado s amostras ou padres, bastaria
teste com uma corrida cromatogrfica em que no se
faz injeo alguma.
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3. Substitua a parte sob suspeio

por outra reconhecidamente boa


Um teste rpido e eficiente de ser feito em
laboratrios com mais de um equipamento (ou com
peas de reposio disponveis) a substituio de
parte ou mdulo por outro que sabidamente apresenta
bom funcionamento. A troca de um detector, em casos
de problemas com a linha de base, por exemplo, uma
boa forma de indicar se o problema reside naquela
parte do sistema. Para essa estratgia, teria inmeros
exemplos pessoais interessantes, que ao longo do
tempo, nessa coluna, sero abordados. Uma extenso
dessa estratgia a devoluo da parte substituda
quando essa mudana no resultar na resoluo do
problema. Digamos que a parte substituda seja uma
check valve ou lmpada do detector. A parte usada
dever ser retornada, para evitar um acmulo de peas
ou partes que ainda no esgotaram a sua vida til.
Excees para esse caso so as partes que apresentam
dano irreparvel quando so substitudas (por
exemplo, alguns selos) ou partes que j se
aproximavam do momento da substituio em
procedimentos de manuteno preventiva.
4. Tenha condies de referncia

Como mencionado anteriormente, tenha


referncias para saber se o desempenho do LC est
adequado. Por exemplo, uma mistura teste conhecida
geralmente adequada para avaliar se uma coluna
est funcionando apropriadamente ou se apresenta
problemas em sua eficincia de separao.
5. Mantenha anotaes

Conforme recomendado anteriormente, as


anotaes dos procedimentos de troubleshooting
funcionam como referncia para problemas que
possam surgir posteriormente. Recomendamos dois
tipos de anotao: anotaes no formato de um
relatrio simplificado de troubleshooting, em que os
testes realizados e suas observaes so indicadas, at
que o problema seja resolvido (sugere-se o esquema:
sintoma, causa e soluo, para esse tipo de anotao);
anotaes temporrias para cada mudana executada.
As anotaes no formato de relatrio servem de
referncia para todos os cromatografistas do
laboratrio/empresa, agilizando os procedimentos
futuros. O objetivo desse ltimo tipo de anotao
manter controle sobre as mudanas que esto sendo
feitas em cada passo do procedimento de verificao

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do problema. Por exemplo, as presses devem ser


anotadas ao se eliminar cada parte da linha
cromatogrfica, entre a bomba e o detector, ao se
buscar a causa de um problema de elevao da presso
no sistema cromatogrfico.
6. Preveja as falhas e atue

antecipadamente na manuteno
Algumas pessoas tm a impresso de que a
manuteno preventiva perda de dinheiro, pois
antecipa a troca de peas que poderiam durar um
tempo a mais. Esse pensamento certamente falho em
laboratrios de rotina/prestao de servios, e muitas
vezes tambm em laboratrios de pesquisa.
Primeiramente, ao se adotar a tcnica de
troubleshooting, as falhas no sistema tornam-se muito
mais previsveis. Alm disso, a prpria rotina de
manuteno sugerida pelo fabricante do equipamento
um indicativo dos pontos que mais merecem
ateno. O esquema de manuteno para o
equipamento pode ser baseado no tempo de uso de um
determinado componente, ou em outro indicativo
qualquer (por exemplo, relao sinal/rudo
apresentado pelo cromatograma de um padro
analtico, reduo na energia da lmpada, elevao do
intervalo de flutuao da presso das bombas etc.). Ao
se estabelecer a manuteno preventiva, ela pode ser
agendada para um perodo mais adequado dentro de
uma faixa de alerta/indicativa de manuteno. Esse
ltimo aspecto o que faz a diferena nos custos
finais desse procedimento. Imagine um projeto em
execuo, o qual envolva a anlise de centenas ou
milhares de amostras. Uma falha no decorrer do
projeto, exigindo a manuteno imediata do sistema,
poderia implicar na perda dos resultados at ento
processados, causando prejuzo muito maior do que
os gastos com a manuteno preventiva que teria
evitado o problema. Em ltima instncia, a
manuteno preventiva tambm evita gastos
adicionais desnecessrios, decorrentes de falhas
secundrias ocasionadas pela falta de manuteno.
Por exemplo, pedaos de um rotor (pea do interior de
uma vlvula injetora) desgastado poderiam ser
arrastados pela fase mvel e causar o entupimento de
uma coluna; ou o vazamento de fase mvel por um
selo desgastado poderia comprometer o sistema
eletrnico de um cromatgrafo. Felizmente, existem
outros meios de prevenir esses problemas, mas a
melhor maneira de se evitar dores de cabea ainda
a manuteno preventiva.

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7. Cuidado com as solues tampo

A. Examine todo o sistema

De to importante e recorrente, resolvemos dar


ateno a um caso concreto nesse ltimo item. O uso de
solues tampo ou contendo eletrlitos (nem sempre a
soluo preparada um tampo revejam o conceito
de tampo antes de reportarem o uso de um em seus
mtodos) muito comum, especialmente em
cromatografia em fase reversa e de troca inica. A
remoo da soluo tampo do sistema, quando fora de
uso, ou na troca por outro mtodo, no deixa de ser um
item preventivo. Algumas dessas solues podem
causar corroso, abraso ou mesmo cristalizao
(levando ao bloqueio das linhas). Outra preocupao o
desenvolvimento de microrganismos devido a solues
tampo em condies fisiolgicas, acarretando
problemas secundrios. A regra nesse caso a remoo
da soluo tampo, do sistema e da coluna, quando fora
de uso. A soluo ideal para esse procedimento deve
conter uma composio similar quela da fase mvel,
substituindo a soluo tampo por gua pura. Deve-se
evitar a lavagem do sistema e coluna, previamente
usados com solues salinas, diretamente com 100% de
solvente orgnico (principalmente se este for
acetonitrila). Um procedimento desse tipo pode levar
precipitao do sal, causando problemas desde a bomba
at o detector. Um ltimo cuidado ao se deixar o sistema
cromatogrfico parado evitar o preenchimento das
tubulaes com gua pura. O emprego de gua nas
tubulaes tambm permite o desenvolvimento de
micro-organismos, os quais requerero um extensivo
procedimento de limpeza e substituies de peas, caso
venha a acontecer. Uma forma simples e segura de
acondicionar o sistema a utilizao de uma mistura
aquoso-alcolica nas tubulaes e linhas do sistema;
uma soluo contendo mais do que 20% de metanol j
adequada para prevenir esse problema.

A primeira etapa ao deparar com um problema


fazer uma varredura rpida de todo o sistema
(hardware e mtodo). Inicie a observao do
reservatrio da fase mvel, seguindo at o descarte do
detector, verificando se h alguma causa bvia que
possa ser identificada visualmente ou que possa ser
inferida devido s caractersticas do mtodo. Procure
por vazamentos, bolhas, trocas nas linhas das fases
mveis, excesso de presso, falta de controle de
temperatura, rack de vials mal posicionado, vials com
volume insuficiente, equvoco na seleo da coluna
etc. Com relao ao mtodo observe o uso equivocado
de um mtodo errado, ou falhas na digitao da
proporo ou vazo da fase mvel, limites ajustados
para as presses (inferior e superior), erro no ajuste do
comprimento de onda do detector ou nas condies de
deteco para outros tipos de detectores. Esse deve ser
um procedimento rpido, porm muitas falhas do
sistema ou do operador so, felizmente, solucionadas
diretamente nessa primeira avaliao.

A lgica da Tcnica de Troubleshooting


na localizao do problema
O uso de procedimentos lgicos na resoluo
de problemas a chave do troubleshooting. Algumas
falhas, como o vazamento de uma conexo, so fceis
de localizar e corrigir. Por outro lado, distores nos
picos cromatogrficos podem ser causadas por
diversas razes, necessitando-se de procedimentos
mais cuidadosos para o isolamento do problema. Para
os problemas que no so de bvia soluo, uma
abordagem sistemtica importante para que se
chegue ao isolamento e correo do real causador do
fato por meio de um caminho mais curto do que a
simples procura aleatria pela causa do problema.
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B. Observe as alteraes que foram

feitas no sistema ou mtodo


Se a falha ou problema no for localizado
seguindo o item anterior, determine as mudanas
realizadas no sistema ou mtodo e que podem ter dado
causa ao fato. Por exemplo, houve algum procedimento
de manuteno, houve a reposio de alguma parte ou
mdulo do sistema, houve mudana no mtodo,
trocou-se a fase mvel, ou injetou-se alguma amostra
incomum? Nesse item a sugesto de manter-se o registro
das alteraes e procedimentos realizados no sistema
muito til. As mudanas realizadas, sob uma anlise
cuidadosa, podem indicar a causa do problema surgido
no sistema. Mesmo que essas mudanas no indiquem a
causa do problema, o seu conhecimento pode ajudar na
posterior investigao do caso.
C. Teste as condies de referncia

Para problemas que causam mudanas no


perfil cromatogrfico, a injeo de uma mistura de
referncia pode solucionar o problema. Dessa forma,
pode-se relacionar o problema com uma caracterstica
da amostra ou do sistema. Se o cromatograma de
referncia est adequado, o problema est
relacionado, de alguma forma, com os procedimentos
dependentes da amostra. Por exemplo, a injeo de
padres diludos em 100% de solvente orgnico, pode
apresentar picos duplos ou com ombros; uma injeo

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de soluo-teste previamente conhecida, e nessas


condies
conhecidas,
resultar
em
um
cromatograma adequado, indicando que a causa dos
picos anmalos esta relacionada amostra, e no com
o sistema cromatogrfico/coluna. Porm, se ambos os
cromatogramas apresentam-se inadequados, algo
relacionado ao sistema cromatogrfico est causando
o problema. Nesse caso, focalize a ateno na
localizao, passo a passo, da causa do problema
Essa discusso apresentada acerca da tcnica
de troubleshooting deve ser usada em conjunto com o
entendimento das fontes/causas de problemas que
podem ocorrer em um sistema ou mtodo
cromatogrfico. A discusso pontual do entendimento
e resoluo desses problemas especficos em
cromatografia ser o tema mais recorrente nessa
coluna, todavia entendemos que o seu emprego, se
baseado nas tcnicas e estratgias apresentadas acima,
tornar o sucesso mais facilmente alcanvel. Em
adio a essa coluna, muitos manuais de
equipamentos apresentam uma descrio dos
problemas mais comuns e suas possveis causas e
solues. Alm disso, alguns catlogos de empresas
especializadas em suprimentos para cromatografia
apresentam listas resumidas de troubleshooting em
suas especialidades. Alguns livros em ingls tambm
apresentam uma discusso mais ampla sobre o
assunto.1,2 Em sntese, siga os seguintes passos:
mantenha anotaes sobre os procedimentos
realizados no sistema cromatogrfico, amostras
injetadas no sistema e na coluna cromatogrfica;
quando estiver em busca da soluo de um problema
no sistema cromatogrfico, faa apenas uma mudana
de cada vez; se a mudana no resolver o problema,
via de regra, retorne configurao original; rotule
(como peas usadas) ou descarte as peas
substitudas, e identifique a posio correta quando
forem removidas temporariamente para algum teste;
quando o problema for corrigido e a causa
identificada, crie uma pequena nota no caderno de
troubleshooting relacionando sintoma, causa e
soluo; requisite peas em substituio s peas do
estoque de manuteno que forem usadas; troque
informaes com seus colegas de laboratrio ou
grupos de discusso, faa buscas nos registros do
caderno de troubleshooting do equipamento e
consulte a literatura, geralmente outras pessoas j
passaram pelos problemas que voc est encontrando
no momento; ao reconhecer um problema, faa uma
varredura em busca da causa, mas no se afaste das
regras de troubleshooting; no se esquea de injetar
solues ou testes anteriores que permitam comparar
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com um cromatograma de referncia (idealmente


registrado nos cadernos de controle referentes ao
equipamento ou coluna); se necessrio, como
estratgia para isolamento do problema, substitua
mdulos ou partes destes, por equivalentes
provenientes de equipamentos que esto em adequado
funcionamento.

Como a compreenso do
funcionamento do sistema de HPLC
pode ajudar na soluo dos problemas?
A soluo de problemas envolvendo
cromatografia mais bem executada quando se
compreende
o
funcionamento
do
sistema
cromatogrfico e os princpios que regem a separao.
Como visto anteriormente, o sistema cromatogrfico, o
cromatograma, ou ambos, indicam quando um
problema surge. Da mesma forma, a soluo do
problema obtida por meio da investigao dos
indcios apresentado pelo sistema ou cromatograma.
Obviamente, um conhecimento sobre o sistema e sobre
a teoria por trs da separao cromatogrfica
imprescindvel. Do contrrio, qualquer mudana feita
no sistema, em busca de soluo para o problema, no
passar de mero procedimento, infundado, de
tentativa e erro, levando perda de tempo e dinheiro.
Nessa parte do artigo, trataremos de fazer uma
apresentao sobre cada parte que geralmente est
presente em um sistema de HPLC, apresentando
informaes necessrias para uma boa compreenso
dos procedimentos de troubleshooting. Uma viso
ainda mais detalhada da instrumentao em HPLC
pode ser obtida na referncia 1 ou em outros livros
especializados.
Para aqueles que no esto familiarizados com
muitas marcas e modelos de cromatgrafos lquidos,
existem basicamente dois tipos de sistemas, quanto ao
arranjo. H sistema modulares, que podem ser
identificados pela presena de mdulos distintos para
as bombas, desgaseificador, injetor, compartimento
para a coluna, detectores etc.; e h sistemas
compactos ou monoblocos. Os primeiros geralmente
apresentam maior versatilidade de configurao e
podem sofrer atualizaes/incrementos mais
facilmente, dependendo da configurao, ocupam um
espao maior que os equipamentos monoblocos e so
caracterizados pelo empilhamento dos mdulos. Os
ltimos costumam ser vendidos para finalidades mais
especficas e tem atualizao (upgrade) relativamente
mais difcil, estes encontram boa aplicao em
laboratrios com rotina bem definida. Em ambos os
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tipos de equipamento os componentes/partes so


praticamente os mesmo, mudando apenas o tipo de
integrao/agrupamento entre eles.
Um
trabalho
envolvendo
separao
cromatogrfica por HPLC comea antes mesmo de
chegar-se frente do equipamento. A escolha de
solventes orgnicos adequados (geralmente descritos
como grau HPLC), de gua ultrapurificada e de
reagentes com alto grau de pureza, imprescindvel,
especialmente nos casos de anlise em gradiente. No
preparo da fase mvel a filtrao de solues obtidas a
partir da solubilizao de solutos slidos (geralmente
solues tampo) necessria para evitar que
materiais particulados sejam introduzidos no sistema
cromatogrfico (membranas de 0,22 ou 0,45 m,
compatveis com a fase mvel, so adequadas a esse
procedimento). Alm disso, caso o cromatgrafo no
possua sistema de desgaseificao integrado, esse
procedimento deve ser executado antes da fase mvel
ser introduzida no sistema.
A asperso de um gs inerte (geralmente hlio)
na fase mvel um dos mtodos mais eficientes para
remoo dos gases dissolvidos na soluo.1 Alguns
equipamentos possuem inclusive um sistema de
asperso de hlio integrado. Mais prticos e
popularizados atualmente so os sistemas online a vcuo
integrados ao cromatgrafo e que se baseiam em
membranas semipermeveis ao gs (Fig. 1). Problemas
relacionados a uma insuficiente desgaseificao so
mais comuns do que se pode imaginar. A tolerncia aos
gases na fase mvel vai depender sobretudo da
sensibilidade da bomba e do detector. O aparecimento
de bolhas mais crtico em misturas orgnico-aquosas
(geralmente acetonitrila-gua ou metanol-gua, em fase
reversa, por exemplo), pois a solubilidade dos gases
nesse tipo de mistura menor do que nas solues
orgnica e aquosa separadas. Com esse tipo de mistura
podem persistir bolhas na fase mvel aps a purga pelos
desgaseificadores online. Em razo do tamanho das
bolhas formadas, algumas delas podem no ser
completamente permeadas pelo desgaseificador a
vcuo. Nesse caso, uma soluo simples a sonicao
da fase mvel por 5 a 10 minutos, antes da introduo no
sistema cromatogrfico. Apesar da sonicao, por si s,
no ser um mtodo de desgaseificao to eficiente
quanto a asperso de hlio ou a aplicao de vcuo, ela
serve para a rpida remoo do excesso de gs
insolubilizado no momento da mistura entre o solvente
aquoso e o orgnico, auxiliando a etapa online posterior.
A filtrao a vcuo dessa mistura, por membrana
filtrante, algumas vezes tambm resolve o problema do
excesso de bolhas de gs.

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Figura 1. Desgaseificador online a vcuo, o solvente entra


no sistema por uma das portas, passa por fina tubulao
composta por membrana semipermevel aos gases e sai do
sistema em direo bomba ou vlvula seletora do
gradiente de baixa presso.

As fases mveis so geralmente acondicionas em


frascos de vidro apropriados (Fig. 2) e colocadas em
compartimento adequado, sobre o cromatgrafo. Caso
no haja compartimento adequado (geralmente suprido
com o cromatgrafo), recomenda-se o emprego de uma
bacia retangular que se adapte sobre o equipamento. A
colocao de frascos diretamente sobre o equipamento
pode levar a acidentes, ocasionando o derramamento de
lquido sobre componentes sensveis do equipamento. Os
frascos devem ser tampados para evitar a entrada de
material particulado e a contaminao, bem como evitar a
evaporao de solventes. Alguns frascos comerciais
possuem tampas com filtros de ar, porm essas tampas
podem ser facilmente adaptadas no laboratrio. Atravs
da tampa deve existir orifcio para a entrada do tubo
coletor da fase mvel, e em caso de sistema de asperso
de hlio, tambm para esse. Na entrada do tubo coletor
comum a utilizao de um filtro de 10 m (geralmente de
ao inoxidvel 316 ou polietileno de altssima densidade),
enquanto na sada do tubo de asperso de hlio usa-se um
filtro de 2 m para a disperso do gs (Fig. 3).

Figura 2. Exemplo de frasco para acondicionamento da


fase mvel.

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Scientia Chromatographica

Figura 3. Exemplos de filtros de admisso de fase mvel.

Na maior parte das bombas, a troca de


solventes pode ser feita por um processo de purga,
comandada por meio de software ou no painel da
prpria bomba cromatogrfica. Esse procedimento
faz com que a fase mvel passe atravs do tubo de
entrada (geralmente um tubo de Teflon
politetrafluoroetileno de 1/8), pelo sistema de
desgaseificao online, se presente, fluindo at a
bomba cromatogrfica e sendo desviado, pela vlvula
de purga, para o descarte. Esse procedimento tambm
pode ser feito manualmente por meio de aspirao
com uma seringa comum, adaptada na sada da
vlvula de purga. Geralmente esse procedimento
necessrio e recomendado quando o tubo de entrada e
a bomba encontram-se sem fase mvel. A no ser que
a bomba seja extremamente robusta, a suco de
grande volume de ar pelo tubo de entrada impede a
bomba de realizar a purga automtica da fase mvel,
requerendo a purga manual. Apesar de esse problema
ser de fcil observao, j foi testemunhada, inmeras
vezes, essa ocorrncia em laboratrios. Geralmente,
esse problema ocorre pela falta de constatao, pelo
operador, de que o tubo de entrada est seco. Nesse
caso, o operador solicita uma purga automtica e no
observa se a fase mvel est fluindo pelo tubo de
entrada at o descarte. Aps esse procedimento de
purga, o operador tenta estabelecer um fluxo de fase
mvel pela coluna, mas constata que no h elevao
da presso (no caso de utilizar fase mvel composta
por apenas um tipo de solvente) ou que h
instabilidade da presso, com repetidas quedas
bruscas, (geralmente no caso de utilizao de fase
mvel binria, ternria ou quaternria). Um
procedimento prtico para constatar o bom
funcionamento das bombas permitir a entrada de um
pequenino segmento de ar atravs do filtro de entrada
no incio da purga e acompanhar o seu caminhar pelo
tubo at ser eliminado pelo desgaseificador ou ser
remetido ao descarte pela vlvula de purga.
Apesar de existirem outros tipos de bomba, as
mais utilizadas atualmente so aquelas baseadas na

90

combinao de dois pistes reciprocantes (em srie


(tandem) ou em paralelo). Em ambas as bombas o
funcionamento do pisto o mesmo. Movido por um
sistema mecnico controlado eletronicamente, o
pisto exerce um movimento cclico de avano e
recuo promovendo o enchimento e esvaziamento da
sua cmara. Para a vedao do espao existente entre
a parede da cmara e o pisto, utiliza-se um selo de
material elastomrico. Esse selo, para melhor
vedao, possui uma mola no seu interior (Fig. 4). A
diferena entre as duas bombas est no tamanho dos
pistes, no caminho feito pelo solvente e no nmero
de check valves. Primeiramente, check valves so
vlvulas de reteno, ou seja, vlvulas que permitem o
fluxo de solventes em apenas um sentido.
Basicamente so vlvulas, ativas ou passivas, com
uma ou mais esferas em seu interior, e que bloqueiam
a passagem da fase mvel quando esta pressionada
no sentido contrrio ao fluxo permitido. Na bomba
com dois pistes reciprocantes em paralelo, para cada
pisto h duas check valves uma de entrada e outra de
sada. Bem como os pistes, as check valves
funcionam alternadamente. Enquanto um pisto
impulsiona a fase mvel da sua cmara para o sistema
cromatogrfico, tendo a check valve de sada aberta e
a de entrada fechada; o outro admite a fase mvel,
proveniente do reservatrio, em sua cmara, tendo a
vlvula de entrada aberta e a de sada fechada. Ao
chegar ao fim dos seus cursos, os pistes e as vlvulas
invertem os seus papis, garantindo um
impulsionamento quase contnuo da fase mvel para o
sistema. A Figura 5 esquematiza esse tipo de bomba.
Nas bombas com pistes em srie h apenas um par de
check valves localizadas na entrada e sada da cmara
do primeiro pisto. Esse primeiro pisto geralmente
tem o dobro do volume do segundo. Na primeira
metade do ciclo, esse primeiro pisto impulsiona a
fase mvel do interior da cmara para o sistema
cromatogrfico, tendo a vlvula de sada aberta e a de
entrada fechada. Todavia, metade do volume da fase
mvel impulsionada, em vez de ser direcionada ao
sistema cromatogrfico, ocupa-se de preencher o
espao de admisso gerado pelo segundo pisto da
srie. Ao fim da primeira metade do ciclo de
funcionamento, a cmara do segundo pisto est
completamente cheia e a do primeiro, vazia; nesse
momento ocorre a inverso dos movimentos e das
check valves. O primeiro, pisto inicia a admisso de
nova fase mvel, proveniente do reservatrio,
enquanto o segundo pisto incumbe-se de
impulsionar a fase mvel contida em sua cmara para
o restante do sistema. A Figura 6 ilustra esse tipo de
bomba.

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Scientia Chromatographica

Figura 4. Exemplos de selo de vedao (vista ampliada) e


pistes de safira, usados em bombas de HPLC.

Figura 5. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pisto em paralelo. Figura cedida como cortesia pelo Dr.
Lincoln F. M. Coutinho3.

Figura 6. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pisto em srie. Figura cedida como cortesia pelo Dr.
Lincoln F. M. Coutinho3.

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Scientia Chromatographica

As bombas de pistes seriais so mais baratas e


robustas do que aquelas de pistes em paralelo, no
entanto, tem inferior qualidade na alimentao do
solvente. Geralmente sob um mesmo regime de vazo, a
pulsao das bombas com pistes em paralelo menor
do que aquela das bombas seriais. Em vazes
convencionais, superiores a 1,0 mL/min, geralmente as
duas bombas apresentam desempenhos bastante
satisfatrios. Para vazes mais baixas, recomenda-se o
emprego de bombas com pistes em paralelo, uma vez
que possuem um inferior limite de trabalho, com menor
nvel de pulsao, esse o caso comum de sistemas
HPLC que alimentam espectrmetros de massas com
interfaces do tipo electrospray. A manuteno e os
problemas mais comuns em uma bomba de HPLC
envolvem os selos e as check valves. Ambos tm uma
vida til e implicam na estabilidade da presso exercida
pela bomba. Enquanto os selos podem apresentar falhas
estruturais e gerar vazamentos, as check valves podem
apresentar dificuldade na abertura e fechamento,
tambm perturbando a presso e vazo da fase mvel.
Os maiores cuidados exigidos por essas partes da bomba
envolvem a limpeza, quanto a materiais particulados
presentes na fase mvel. A cristalizao dos sais de uma
soluo tampo pode levar ao desgaste (ranhuras) do
selo, a travamentos e desgaste da check valve e, em
ltima instncia, a quebra dos pistes e danos em sua
cmara. Algumas bombas apresentam uma segunda
cmara, posterior cmara de admisso da fase mvel, a
qual permite a lavagem do corpo do pisto. Ela de
especial uso quando se faz o emprego contnuo de
solues tampo em altas concentraes. Recomenda-se
a utilizao de soluo aquosa contendo entre 10 e 20 %
de metanol para evitar, por um lado, a cristalizao dos
sais no solvente orgnico, e por outro o crescimento de
microorganismos. O principal sintoma indicativo de
problemas com selos a incapacidade de manter a
presso no interior da bomba. Como isso se d com o
vazamento da fase mvel, dependendo do caso pode-se
observar esse vazamento. Os problemas com selos
costumam ser resolvidos com a sua substituio,
importante escolher o tipo de selo adequado fase
mvel que se utiliza no sistema. No caso das check
valves, tambm h manifestao de instabilidade na
presso. Com um exame detalhado possvel identificar
qual a vlvula problemtica e proceder com o seu
conserto ou substituio. As check valves em caso de
mau funcionamento, algumas vezes, podem ser
recuperadas por meio da lavagem em banho de
ultrassom. Geralmente utiliza-se primeiramente gua
(podendo estar acidificada com cido ntrico), uma
segunda lavagem com gua pura, no caso da lavagem
com cido, e posteriormente um solvente orgnico
92

(metanol ou acetonitrila). Um cuidado adicional a


montagem correta das check valves, evitando-se a sua
inverso ou troca entre as portas de entrada e sada.
Geralmente, na sada da bomba encontra-se mais um
filtro, convm observar se h obstruo dele,
principalmente quando um problema de elevao de
presso ocorrer exclusivamente em uma das bombas do
sistema. Esse tipo de entupimento costuma decorrer da
falta de manuteno do sistema de vedao da vlvula
de purga, o material elastomrico de vedao pode
fragmentar-se e obstruir o primeiro obstculo sua
passagem, no caso, o filtro de sada da bomba. Outras
manutenes requeridas pelas bombas so de mais
longo prazo e podem envolver a substituio de pistes
ou diafragmas, e a limpeza e lubrificao da parte
mecnica do acionamento dos pistes. A substituio de
pistes e diafragmas pode constar dos manuais de
manuteno do usurio, enquanto geralmente a limpeza
e lubrificao das partes mecnicas requerem a abertura
da bomba e costumam ser feitas por tcnico
especializado ou com maiores conhecimentos.
Eventualmente sensores eletrnicos da posio dos
pistes podem falhar e gerar problemas difceis de serem
detectados sob uma primeira inspeo. Nesse caso, a
estratgia de substituio dos componentes funciona
muito bem para o isolamento do problema. Para maiores
detalhes sobre o funcionamento e partes dos diferentes
tipos de bombas, sugerimos uma consulta referncia 3,
a qual pode ser obtida pela web.
Ainda sobre o sistema de bombeamento dos
solventes, alguns realizam separaes baseadas em fase
mvel com composio invarivel, ou seja, separaes
chamadas isocrticas. Enquanto outros utilizam de
gradientes entre diferentes fases mveis, as quais podem
ser binrias, ternrias ou quaternrias. Os sistemas
isocrticos dependem de apenas uma bomba e a mistura
adequada para a fase mvel pode ser feita diretamente
no recipiente de fase mvel. evidente que sistemas
para gradiente podem tambm fazer uma mistura
isocrtica apropriada. Os sistemas para gradiente podem
ser de dois tipos (baixa e alta presso), e seu
entendimento importante para a compreenso de
problemas que podem ocorrer. Nos sistemas de baixa
presso, apenas uma bomba utilizada, porm esta
precedida por uma vlvula seletora de fase mvel
(composta por vlvulas solenoides). A composio final
da fase mvel obtida pela segmentao proporcional
dos diferentes solventes, os quais passam pela bomba e
tem o trmino da homogeneizao realizada por um
misturador. O gradiente controlado pelo sistema
eletrnico, o qual calcula os tempos que cada uma das
vlvulas solenoides ficam abertas, permitindo que a
correta proporo da mistura seja obtida. Os sistemas

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Scientia Chromatographica

com gradiente de alta presso possuem uma bomba para


cada uma das fases mveis misturadas. A proporo
entre os solvente ajustada pela frao da vazo de cada
bomba que constitui a vazo total utilizada. As sadas de
cada uma das bombas confluem para um misturador que
homogeneza a fase mvel que destinada para o
restante do sistema. Os sistemas com gradientes de baixa
presso so mais baratos, uma vez que utilizam apenas
uma bomba e um seletor de solventes, em contraste com
o gradiente de alta presso que precisa de uma bomba
para cada solvente da mistura. Por outro lado, aplicaes
que necessitem de vazes mais baixas e que sejam muito
sensveis a inomogeneidades da fase mvel no
apresentam bons resultados com gradiente de baixa
presso. Sob baixas vazes, causa atrasos no gradiente
(em razo do volume morto do sistema) podendo
inviabilizar a separao e sua repetibilidade, e, alm
disso, a insuficiente homogeneizao causa aumento no
rudo da linha de base do cromatograma. Em sistemas de
baixa presso, uma estimativa do volume morto do
cromatgrafo deve estar bem clara para evitar problemas
de seleo incorreta das condies do gradiente. Muitas
vezes, gradientes com colunas de 2,1 mm de dimetro
interno, sob vazo de aproximadamente 0,2 ml/min,
acopladas a espectrmetros de massas com deteco por
electrospray so incompatveis com sistemas de baixa
presso. Um cuidado adicional com o gradiente de baixa
presso a correta desgaseificao da fase mvel, como
a mistura inicia-se ainda sob baixa presso, eventuais
bolhas de gs podem ser formadas pela menor
solubilidade dos gases na mistura orgnico-aquosa, em
relao aos solventes no misturados. Uma vlvula
seletora de solventes composta por quatro vlvulas
solenoides representada na Figura 7.

Figura 7. Exemplo de vlvula para seleo de solventes em


gradiente de baixa presso.

2009 | v . 1 | n . 2

Aps o sistema de pressurizao da fase


mvel, encontra-se, nos sistemas capazes de elaborar
gradientes, um misturador. Esse misturador costuma
ter um volume de mistura regulvel que deve ser
ajustado de acordo com as caractersticas de uso do
sistema. Um exemplo de ajuste inadequado a
seleo do maior volume de mistura para anlises sob
gradiente em vazes reduzidas. Atrasos superiores a
dez minutos podem ser constatados dependendo da
combinao inadequada que for realizada,
especialmente em sistemas com gradiente de baixa
presso.
A fase mvel, aps deixar a cmara de mistura,
destinada ao sistema de injeo. Convm ressaltar
que toda a linha da fase mvel, aps a bomba, deve ser
resistente s presses utilizadas para a obteno de
adequada vazo pela coluna cromatogrfica. Alm
disso, os dimetros internos desses tubos devem ser
adequados s vazes utilizadas. Tubos com dimetro
interno muito reduzido levam a um desnecessrio
aumento de presso, alm de maiores riscos de
entupimento. Por outro lado, um dimetro interno
relativamente exagerado causa atraso do gradiente e,
se depois do sistema de injeo, alargamento
indesejado dos picos cromatogrficos. Os tubos mais
empregados nos sistemas convencionais so de ao
inoxidvel e tm 1/16 de dimetro externo. Outro
material muito utilizado para as tubulaes de
equipamentos em que se deseja maior inrcia qumica
(geralmente para biomolculas) o polieteretercetona
(PEEK) tambm de 1/16 de dimetro externo.
Alguns sistemas de nano-HPLC e HPLC capilar
apresentam tubulaes mais finas com dimetro
externo de 1/32, geralmente de PEEK revestido
internamente por slica fundida e podem apresentar
dimetros internos de poucos micrmetros. Um
cuidado adicional refere-se aos conectores usado em
HPLC. Nem todas as portas de conexes das
diferentes marcas de cromatgrafos, vlvulas e
colunas apresentam as mesmas caractersticas. A
escolha cuidadosa pode evitar desde o emperramento
de conectores inadequados, at distores
cromatogrficas como picos duplos, com cauda
(tailing) ou com frontes (fronting) em virtude do
excesso de volume morto entre o injetor e a coluna ou
entre a coluna e o detector. Muitos conectores atuais
podem e so suficientemente atarraxados com os
prprios dedos. Em caso do emprego de chaves nas
conexes, recomenda-se que a fora utilizada no seja
em demasia, geralmente de volta aps a conexo ser
atarraxada manualmente j suficiente para evitar
vazamentos. Um vazamento persistente costuma ser
causado por incompatibilidade entre os conectores ou
93

Scientia Chromatographica

conectores danificados. Um excesso de fora pode


causar a quebra de um conector e levar a necessidade
de assistncia tcnica do fabricante.
H diversos sistemas de injeo para HPLC, os
mais encontrados atualmente so as vlvulas manuais
(em sistemas de menor custo) ou os injetores
automticos. No injetor manual, uma vlvula de 6 vias
e 2 posies permite que, com o auxlio de uma
seringa, a ala de amostragem (loop) seja preenchida
(totalmente ou parcialmente) pela amostra. Aps essa
etapa de carregamento da amostra (load), a vlvula
comutada (girada) de maneira a introduzir a ala de
amostragem na linha cromatogrfica, posicionando-a
entre o sistema de bombeamento e a coluna
cromatogrfica. Os maiores cuidados com relao ao
procedimento de injeo manual concernem a uma
adequada limpeza da vlvula, entre as injees, para
evitar que efeitos de memria (carry over) sejam
observados. Como todas peas mveis, os
componentes da vlvula tm uma vida til e devem
sofrer manuteno aps um certo nmero de injees.
Um ltimo cuidado consiste em no esquecer
solues corrosivas ou salinas no interior da vlvula,
uma vez que essas podem danific-la seriamente. Os
sistemas de injeo automtica podem apresentar
diferentes arranjos, cada qual com suas
peculiaridades. Dentre os mais usados, alguns
simplesmente mecanizam as mesmas funes que o
operador executa na injeo manual, preenchendo a
ala por meio do impulsionamento da amostra com
uma seringa; outros preenchem a ala por meio da
suco da amostra at a ala; e um terceiro tipo tem a
agulha de amostragem integrada ala de
amostragem. As velocidades de injeo e demais
caractersticas dependem do tipo de sistema de
injeo empregado pelo amostrador automtico.
Dentre os trs tipos apresentados, o ltimo o mais
moderno e o que geralmente apresenta maiores
velocidades de injeo, bem como reduo do efeito
de memria. Obviamente, costumam ser os mais caros
e com mais componentes para manuteno e fonte de
problemas. Para um troubleshooting mais detalhado
relacionado aos sistemas de injeo, uma melhor
compreenso do funcionamento de cada um se faz
necessria. Infelizmente, nesse momento, um
detalhamento maior estenderia em demasia esta
discusso. Material bem detalhado sobre os diversos
sistemas de injeo pode ser encontrado na web.4
O injetor, como visto anteriormente, o
responsvel pela insero da amostra no sistema
cromatogrfico, permitindo que esta chegue at a
coluna e tenha, idealmente, todos os seus
componentes separados. Entretanto, a amostra, na
94

maioria dos casos, s pode ser injetada depois de ter


sido adequadamente preparada. O adequado
tratamento da amostra envolve o emprego de diversas
tcnicas de preparo de amostras. Esses procedimentos
so bastante especializados e merecem ateno
detalhada desse peridico, podendo ser consultados
na seo Preparo de amostras. Eventualmente,
problemas que tenham relao com o preparo de
amostras sero discutidos nessa coluna. Para o
momento, o mais importante acerca da forma que a
amostra deve encontrar-se para ser introduzida,
refere-se a sua compatibilidade com a fase mvel
empregada no incio da corrida cromatogrfica. Aps
adequadamente tratada, via de regra, a amostra deve
estar solubilizada na fase mvel empregada no incio
da corrida. Como nem sempre isso possvel, alguns
cuidados devem ser tomados, pois muitos problemas
de distoro dos picos cromatogrficos so causados
por erros na introduo da amostra. Primeiramente, a
amostra deve estar completamente solubilizada na
soluo de injeo, devendo ser preferencialmente
filtrada, ou centrifugada, para a remoo de qualquer
material particulado em suspenso. Caso a fase mvel
seja muito diferente da soluo a ser injetada,
importante verificar se a amostra no precipitar ao
ser introduzida no sistema. De preferncia,
especialmente nos casos de grande volume de injeo,
a fora de eluio do solvente da amostra dever ser
menor do que aquele da fase mvel do incio da
corrida. Por exemplo, em injees em fase reversa, a
porcentagem de solvente orgnico da soluo da
amostra no deve superar, em muito, aquela da fase
mvel. Um caso clssico de incompatibilidade a
injeo de solues contendo 100% de acetonitrila ou
metanol, em corridas em fase reversa iniciando com
baixos teores de solvente orgnico na fase mvel.
Todavia, as distores nos picos cromatogrficos so
dependentes do mtodo e dos analitos a serem
separados, e podem estar ausentes em alguns casos.
Aps ser adequadamente introduzida no
sistema cromatogrfico, deseja-se que a amostra
atinja a coluna cromatogrfica com o formato de uma
banda o mais estreita possvel. Esse formato depende,
entre outras, da qualidade da injeo e da
minimizao do volume morto entre o injetor e a
coluna. A coluna cromatogrfica em HPLC, via de
regra, um tubo de ao inoxidvel preenchido com a
fase estacionria adequada. A diversidade de colunas
cromatogrficas incalculvel. H colunas que
variam em escala, desde dimetros de poucos
micrmetros at alguns centmetros, isso em
equipamentos que podemos classificar como HPLC
de bancada. Da surge classificaes que vo desde o

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Scientia Chromatographica

nano-HPLC at o HPLC preparativo. Quanto ao tipo


de material de empacotamento comum o emprego
atual de partculas de slica desde superiores a 10 m
de dimetro em colunas preparativas at sub-2 m
para separaes de altssima eficincia; materiais
polimricos particulados ainda continuam sendo
utilizados; bem como tem sido ampliado o uso de
colunas monolticas a base de slica ou orgnicas,
tanto em escala capilar quanto na convencional.
Muitos problemas encontrados em separaes
cromatogrficas tm causas que, de alguma forma,
relacionam-se com a coluna cromatogrfica. O
perfeito entendimento de seu funcionamento depende
tambm de conceitos tericos que em momento
adequado sero abordados. Para o momento, convm
destacar que a coluna cromatogrfica, exceto no caso
de amostras muito limpas, merece algum tipo de
proteo. Uma das causas mais comuns de perdas
precoces de colunas cromatogrficas, problemas de
eficincia e distoro de picos cromatogrficos
relaciona-se com a obstruo do filtro de entrada,
posicionado justapostamente no incio da coluna.
Esse filtro referido como frit, em ingls, ou
traduzido livremente como frita, em portugus.
Algumas vezes, a sua obstruo pode ser resolvida
com procedimentos de lavagem da coluna, e em
colunas antigas, permitia-se inclusive a sua
substituio; de qualquer maneira, a melhor forma de
evitar-se esse tipo de problema a preveno. muito
divulgada a utilizao de pr-colunas, as quais so
posicionadas precedendo a coluna cromatogrfica
propriamente dita. Apesar de ser a forma de
preveno de problemas mais popularizada, em
muitos casos, o uso de um filtro de linha, em vez da
pr-coluna, surte os mesmos efeitos, ou ainda permite
resultados superiores, em termos de menor
alargamento dos picos. Maiores discusses sobre as
vantagens e desvantagens de filtros de linhas ou
pr-colunas ficam para outro momento, o fato que
ao menos um deles recomendado para prolongar a
vida da coluna. Um filtro de linha obstrudo
facilmente substitudo e tem um preo mdico,
enquanto colunas caras podem ser perdidas se estes
no forem utilizados. Finalmente, as colunas,
idealmente, so mantidas em um forno, para controle
de temperatura. Apesar de variaes na temperatura
implicarem em diferentes tempos de reteno e
seletividades, ao menos em escala convencional, no
vivel a separao por programao de temperatura
(como ocorre na cromatografia em fase gasosa).
Outros dispositivos que podem requerer e apresentar
controle de temperatura so os injetores automticos e
alguns detectores. O resfriamento das amostras

2009 | v . 1 | n . 2

desejado para prolongar a sua conservao no interior


do amostrador automtico, enquanto o controle de
temperatura de detectores, por exemplo, UV/Vis ou
eletroqumico, importante para aumentar a
estabilidade da linha de base do cromatograma.
Sob condies timas, os componentes da
amostra apresentam desiguais taxas de interao com
a fase estacionria da coluna e so eludos com
diferentes tempos de reteno. Para que esses
compostos sejam observados, h a necessidade de um
sistema de deteco, que possibilite o registro na
forma de picos em um cromatograma. Os picos
registrados em um cromatograma fornecem uma ideia
com relao identidade dos compostos separados, e
a rea dos picos relaciona-se com a quantidade de
cada composto. Atualmente, h uma gama muito
grande de detectores que podem ser usados em um
HPLC. O mais popular detector para HPLC o
UV/Vis, o qual pode ser encontrado tambm na forma
mais sofisticada que emprega um arranjo de
fotodiodos (comumente referido como DAD ou PDA,
do ingls, diode array detector ou photodiode array),
para deteco simultnea de todos os comprimentos
de onda em um determinado intervalo do espectro
UV/Vis. Outros detectores que podem ser
encontrados, dependendo da especialidade do
laboratrio, so detectores de fluorescncia, de ndice
de refrao, de espalhamento de luz por evaporao
(evaporative light scattering detector), de dicrosmo
circular, eletroqumico e de condutividade.
Equipamentos mais sofisticados e que constituem
analisadores espectromtricos, em vez de meros
detectores para cromatografia, so os espectrmetros
de massas (MS) e os espectrmetros de ressonncia
magntica nuclear (NMR). Evidentemente, o
primeiro grupo atualmente encontra um grau de
divulgao muito maior do que o segundo, e
equipamentos do tipo LC-MS/MS tm ganhado muito
espao e ateno nos laboratrios. Apesar de custo
muito mais elevado do que o de um HPLC-UV, um
LC-MS/MS, em todos os seus modos de anlise,
expande significativamente as fronteiras de atuao
das tcnicas cromatogrficas. Detalhes sobre os
cuidados e particularidades referentes ao
acoplamento LC-MS fogem ao escopo deste artigo,
mas eventualmente sero retomados em momentos
mais oportunos. De maneira geral, todos os detectores
requerem um certo tempo de estabilizao, esse
tempo pode ir de alguns minutos (detectores UV) at
algumas horas (detectores eletroqumicos). Uma dica
aproveitar o tempo de estabilizao para realizar o
preparo das amostras a serem injetadas. Um detalhe
que evita problemas em alguns detectores, geralmente
95

Scientia Chromatographica

UV/Vis e de fluorescncia, a utilizao de um tubo


de descarte que gere certa presso aps a cela de
deteco. Algumas vezes, o encurtamento do tubo de
descarte, ou a simples eliminao dele para coleta de
fraes imediatamente aps o detector, pode levar ao
surgimento de bolhas que atrapalharo o
cromatograma. A sbita despressurizao aps a
coluna pode levar insolubilizao do gs dissolvido
na amostra e o aparecimento de bolhas, que, em
ltima instncia, podem ficar retidas no detector
causando artefatos no cromatograma. Um ltimo
alerta quanto a esse procedimento a observao da
presso mxima suportada pela cela de deteco, do
contrrio esta pode apresentar vazamentos ou mesmo
ser danificada.
Os sistemas cromatogrficos atuais so
controlados eletronicamente. Apesar de poder-se
executar a grande maioria das funes pelo mdulo ou
interface de controle do equipamento, o meio mais
utilizado o controle via software, instalado em um
computador. Alm do controle do equipamento, o
software comumente apresenta um pacote de
funcionalidades para facilitar o tratamento e a
interpretao dos dados, bem como a gerao de
relatrios e a exportao dos resultados. Dessa forma,
um conhecimento rudimentar da eletrnica e
informtica relacionada ao sistema cromatogrfico
desejado, uma vez que alguns problemas so a
localizados.
Atualmente, os sistemas cromatogrficos
permitem que injees sejam programadas e o sistema
monitorado distncia, tal facilidade permite que
cromatgrafos trabalhem 24 horas processando as
amostras. No caso de deixar o sistema em espera
durante a noite, para que o mesmo mtodo seja
retomado no dia seguinte, recomenda-se deixar uma
pequena vazo de fase mvel fluindo pelo sistema.

96

Algo em torno de 10% da vazo normal j suficiente,


e para maior economia de fase mvel pode operar-se
em modo de reciclagem de fase mvel. O detector e o
restante dos mdulos devem ficar desligados at o dia
seguinte. Quando o sistema for desligar
definitivamente, importante fazer a limpeza de todas
as linhas utilizadas e acondicion-lo com solvente
apropriado, bem como a coluna cromatogrfica.
Concluindo, ao se adquirir experincia na
operao rotineira de um sistema de cromatografia
lquida de alta eficincia, bem como ao se adquirir
conhecimento tcnico e terico a respeito da HPLC,
muitos desses procedimentos e observaes tendem a
tornarem-se intuitivos. O mais importante nas
anlises de rotina, por mais experincia que se tenha,
fazer tudo da mesma maneira e na mesma sequncia,
para que se obtenham resultados comparveis.

Referncias Bibliogrficas
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systems A comprehensive approach to troubleshooting
LC equipment and separation. Totowa, New Jersey:
Humana Press. (1989) 500p.
2. Kromidas, S. Practical problem solving in HPLC.
Weinhein: Wiley-VCH. (2000) 178p.
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Dedicada a Cromatografia Lquida Capilar (cLC).
2008. 219 f. Tese de Doutorado Instituto de Qumica de
So Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2008.
Disponvel em: <http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/
75/75132/tde-05122008-171742/> Acesso em: 27 abr. 2009.
4. CHROMacademy. HPLC Autosamplers. Disponvel
em: <http://www.chromacademy.com/HPLC-Autosamplers/
index.html> Acesso em: 27 abr. 2009.

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