PAPEL DE LOS ENZIMAS DE MACERACIN EN LA

EXTRACCIN DE TANINOS DE LAS SEMILLAS

Jimnez-Pascual, E.; Busse-Valverde, N.; Gmez-Plaza, E.; Lpez-Roca,
J.M.; Bautista-Ortn, A.B.

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Nutricin y Bromatologa,

Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo,
30071, Murcia.
* encarnag@um.es, tel. 34968367323, fax 34968364147

RESUMEN
Los taninos se encuentran en los hollejos y en las semillas de las uvas
y son importantes en la calidad del vino tinto, ya que participan en las
sensaciones de astringencia y amargor y en la estabilizacin del color. Los
enzimas de maceracin se han utilizado tradicionalmente para mejorar la
extraccin de compuestos fenlicos de los hollejos y no se ha determinado el
papel que pueden jugar en la degradacin de las semillas y extraccin de
sus compuestos fenlicos. En este trabajo se muestra el efecto de distintas
actividades enzimticas puras y un enzima comercial en la liberacin de
taninos de las semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet
Sauvignon.

Los resultados obtenidos muestran que los enzimas de

maceracin parecen favorecer la degradacin de las paredes celulares de

las semillas favoreciendo la salida de los taninos.

PALABRAS CLAVE: taninos, semillas de uva, maceracin, enzimas de

maceracin.

ABSTRACT
Tannins are localized in the grape skins and seeds and are important
for red wine quality since they participate in astringency, bitterness and color
stabilization. The maceration enzymes have been traditionally used to
improve the extraction of phenolic compounds from skins, but their role on
1

the seed degradation and the phenolic compounds release have not been
determined.

This work shows the effect of different pure enzyme activities

and a commercial enzyme in the release of tannins from seeds of Monastrell

and Cabernet Sauvignon grape varieties. The results demonstrate that the
maceration enzymes seem to favour the degradation of seed cell walls,
promoting the diffusion of tannins.

KEYWORDS: tannins, grape seeds, maceration, maceration enzymes

INTRODUCCIN
Los taninos estn localizados en los hollejos y semillas de la uva y su
concentracin y composicin dependen del tejido donde se encuentren
(Bourzeix et al., 1986; Ricardo da Silva et al., 1991). Las semillas contienen
mayor concentracin de taninos que los hollejos y mayor proporcin de
unidades galoiladas (Labarbe et al., 1999; Prieur et al., 1984), mientras que
los hollejos contienen subunidades de epigalocatequina en su estructura
(Labarbe et al., 1999; Souquet et al., 1996) y presentan mayor grado de
polimerizacin que los taninos de las semillas (Cheynier et al., 1997;
Moutounet et al., 1996).
En el hollejo, los taninos se encuentran en las vacuolas como taninos
condensadas, ligados a la membrana proteofosfolipdica e integrados en la
pared celular (Amrani Joutei y Glories 1994). En las semillas, los taninos
ocupan una posicin de defensa del embrin, estando presentes en la
epidermis, la parte media del tegumento externo y la capa interna del
tegumento interno (Cadot et al., 2006). Los flavanoles monomricos estn
concentrados en el tegumento externo, por tanto, estos compuestos
deberan ser particularmente extrados durante el proceso de elaboracin del
vino. Cadot et al. (2006) indicaron que la zona que se encuentra entre la
cutcula y las capas internas lignificadas del tegumento externo son, tal vez,
las ms importantes en cuanto a la concentracin de polifenoles, ya que
ellas contienen la mayor parte de compuestos solubles. La presencia del
tegumento medio, el cual es impermeable y muy duro, podra impedir la
extractabilidad de los compuestos fenlicos del tegumento interno durante el
proceso de elaboracin del vino.
2

Durante el proceso de maceracin, estos compuestos pasan al mostovino. La extraccin de taninos del hollejo, al igual que para los antocianos,
requiere la degradacin de las paredes celulares y estn presentes en el
mosto-vino desde el inicio de la maceracin. Se trata esencialmente de un
proceso de difusin y la extensin del mismo depende de su concentracin,
de la composicin de las paredes celulares y el mtodo de elaboracin
(Ortega-Regules et al., 2006;

Busse-Valverde et al., 2010). En cambio,

parece ser, que los taninos de las semillas solo sern extrados hacia el final
del proceso de maceracin, cuando los lpidos de las semillas sean
eliminados (Glories y Saucier, 2000) por la presencia de altos contenidos de
etanol.
Los taninos son importantes en la calidad del vino tinto, ya que ellos
participan en las sensaciones de astringencia y amargor (Gawel, 1998; Vidal
et al., 2003) y en la estabilizacin del color (Cheynier et al., 2006). Estas
sensaciones dependen del grado medio de polimerizacin de los taninos, es
decir del tamao medio de estos compuestos, y especialmente de la
composicin de los mismos, de tal manera que la astringencia es mayor al
incrementar el grado medio de polimerizacin y el porcentaje de galoilacin
de los taninos (Llaudy et al., 2004). En cambio, la presencia de unidades de
epigalocatequina en los taninos parece disminuir esta percepcin en el vino
(Vidal et al., 2003; Fernndez et al., 2007). Por ello, los taninos de los
hollejos se han considerado mejores organolpticamente que los taninos de
las semillas y la utilizacin de diferentes tcnicas de elaboracin han
buscado ayudar a modular la proporcin de taninos de hollejos y semillas en
los vinos.
Una de estas tcnicas de elaboracin es el uso de enzimas de
maceracin. El efecto de estos enzimas sobre los antocianos y el color de
los vinos tintos ha sido ampliamente estudiado, aunque a veces los
resultados han sido contradictorios (Canal-Llaubres y Pouns, 2002; Pardo
et al., 1999; Revilla y Gonzalez-Sanjose, 2002; Watson et al., 1999; BautistaOrtn et al., 2005). Por el contrario, apenas se ha estudiado su papel en la
extraccin de taninos, aunque algunos autores han encontrado un aumento
de estos compuestos en vinos donde se han utilizado enzimas de
maceracin (Bautista-Ortn et al., 2005, Romero-Cascales et al., 2008; GilMuoz et al., 2009; Ducasse et al., 2010), resultados que se han atribuido a
3

una mayor degradacin de las paredes celulares del hollejo, ya que la accin
de los enzimas sobre la extraccin de polifenoles de las semillas no ha sido
todava demostrada.
El objetivo de este estudio pretende conocer si las actividades
enzimticas normalmente presentes en los enzimas de maceracin
comerciales, as como un producto comercial que integra varias de estas
actividades, actan en la liberacin de los taninos de las semillas de uvas de
las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon.

MATERIALES Y MTODOS
El material vegetal de estudio ha sido semillas de uvas de las
variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon, cultivadas en secano en una
parcela de la D. O. de Jumilla, pertenecientes a la bodega Finca Omblancas.
Las uvas presentaban un grado de maduracin entorno a 15 Be.
0.5 g de semillas de ambas variedades fueron maceradas con 15 mL
de dos soluciones modelo: una acuosa (5 g/L de cido tartrico) y otra
hidroalcohlica (12,5% etanol y 5 g/L cido tartrico), ambas ajustadas a pH
3,6. La extraccin se llev a cabo en un agitador magntico a 700 rpm y a
temperatura ambiente durante 48 horas, todo ello en oscuridad. Transcurrido
el tiempo de extraccin, el sobrenadante fue separado y filtrado usando
filtros de Nylon de 0,2 m. Posteriormente, 4 mL del extracto filtrado fueron
concentrados en un centrivap (Labconco, USA) a 50 C durante 8 horas. El
extracto seco obtenido fue redisuelto en 0,8 mL de metanol.
Tambin se realizaron ensayos con diferentes enzimas, 4 puros y un
enzima comercial, usado normalmente en el proceso de elaboracin de los
vinos tintos, para poder comprobar si este tiene algn efecto en la extraccin
de taninos de las semillas: xilanasa, celulasa, poligalacturonasa y
pectnmetilesterasa (Sigma Aldrich) y Enozym vintage (Agrovin, Alcazar de
San Juan) con actividad poligalacturonasa, pectnliasa, pectnesterasa y glucanasa. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Para poder tener informacin sobre el contenido, porcentaje de
galoilacin y grado medio de polimerizacin de los taninos (GPm) en
semillas de uva se ha utilizado el mtodo de la fluoroglucinolisis propuesto
por Kennedy y Jones (2001). Este mtodo est basado en la ruptura de los
4

enlaces interflavnicos en medio cido y en presencia de un agente

nucleoflico (fluoroglucinol), seguido de un anlisis por cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC) de los productos de reaccin segn el mtodo
propuesto por Busse-Valverde et al. (2010).
El tratamiento estadstico de los datos se ha realizado utilizando el
paquete estadstico Statgraphics 5.0 Plus.

RESULTADOS
Las Tablas 1 y 2 muestran el contenido y composicin de los taninos
en las soluciones control; acuosa (SA) e hidroalcohlica (SH) tras el proceso
de maceracin de las semillas de las variedades Monastrell y Cabernet
Sauvignon y el papel de las diferentes actividades enzimticas. Los
resultados muestran que se obtienen altos contenidos de taninos tras el
proceso macerativo, incluso cuando el medio extractante no contiene etanol,
demostrndose que no es crucial la presencia de etanol en el medio para
que se extraigan los compuestos fenlicos de las semillas, contrariamente a
lo comentado por otros autores (Singleton y Draper, 1964; Llaudy et al.,
2004; Cerpa-Caldern y Kennedy, 2008). De todas formas, se observa que
en presencia de alcohol se consigue extraer mayor cantidad de
proantocianidinas de las semillas, siendo dicho incremento del 43% para
Monastrell y del 80% para Cabernet Sauvignon. El alcohol favorece la
eliminacin de los lpidos que recubren la semilla (Glories y Saucier, 2000),
promoviendo adems, una mayor degradacin de la cutcula y de las
paredes celulares de las clulas donde se encuentran presentes los taninos
y favoreciendo la difusin de los mismos al medio. Gonzlez-Manzano et al.
(2004), en estudios realizados con soluciones modelo, observaron tambin
una ligera extraccin de taninos de bajo grado de polimerizacin de las
semillas en ausencia de alcohol, incrementndose la cantidad liberada
notablemente con el tiempo de contacto y la concentracin de etanol en el
medio. En la misma lnea, De Freitas et al. (2000) tambin encontraron un
incremento importante de los taninos de las semillas en vinos de Cabernet
Sauvignon tras la etapa de maceracin post-fermentativa como resultado de
un mayor contacto de las mismas con el alcohol obtenido durante el proceso
de fermentacin.
5

Los contenidos de taninos obtenidos en este estudio son mucho ms

grandes que los encontrados por Cosme et al. (2009) para vinos de
Cabernet Sauvignon a lo largo de tres vendimias (289-776 mg/L) o por
Romero-Cascales (2008) y Busse-Valverde et al. (2010) para vinos de
Monastrell (489 y 835 mg/L) y de Cabernet S. (757 y 845 mg/L). Es posible
que la continua agitacin aplicada en los diferentes ensayos haga que la
extraccin de estos compuestos sea ms efectiva que bajo las condiciones
de elaboracin en bodega, periodo durante el cual slo una pequea
fraccin de taninos, tanto de las pieles como de las semillas de la uva, es
extrada. Adems, la retencin de taninos, sobre todo de aquellos de mayor
peso molecular en las paredes celulares de la pulpa, pueden causar una
menor presencia de los mismos en el vino (Bindon et al., 2010).
El grado medio de polimerizacin de los taninos (GPm) es mayor en
semillas de Monastrell que en las de Cabernet Sauvignon, incrementndose
en ambos casos con la presencia de alcohol. Este resultado puede ser
debido a que el etanol produzca una mayor extraccin de taninos de las
paredes celulares, lugar donde se encuentran las ms polimerizadas (Geny
et al., 2003). Por el contrario, el estudio de Del Llaudy et al. (2008) con
soluciones modelo, no encontraron diferencias en los valores de GPm de los
taninos extrados de semillas de Cabernet Sauvignon maceradas con
diferente contenido de alcohol, aunque s en la astringencia de los mismos.
Estos autores indicaron que esto poda ser debido a que el GPm no
representa el porcentaje de las diferentes fracciones de diferente tamao
que componen a los taninos y por tanto, con el mismo GPm, la proporcin de
oligmeros puede ser diferente, vindose afectada tanto la astringencia
como el amargor.
En el caso del porcentaje de galoilacin, en solucin acuosa es similar
para Monastrell y Cabernet Sauvignon, pero en presencia de etanol, la
galoilacin de los taninos se incrementa, sobre todo para Cabernet
Sauvignon. Gonzlez-Manzano et al. (2004) tambin encontraron un
incremento en el contenido de derivados galoilados con el aumento del
porcentaje de etanol en el medio. Busse-Valverde et al. (2010) encontraron,
en vinos, valores de galoilacin ms bajos a los encontrados en este estudio,
lo cual puede ser debido a la contribucin de los taninos extrados del

hollejo, que tienen porcentajes de galoilacin ms bajos que los taninos de

semilla.
Tras la aplicacin de enzimas, en el caso de Monastrell y en medio
acuoso (Tabla 2) se observa un aumento importante en la extraccin de
taninos con los diferentes enzimas utilizados, excepto en el caso de los
enzimas xilanasa y pectnmetilesterasa, al mostrar valores de taninos no
significativamente diferentes respecto a la solucin testigo sin enzima. En el
caso de los enzimas puros, la poligalacturonasa consigue triplicar el
contenido de taninos y la celulasa duplicarlo, mientras que el complejo
enzimtico consigue cuadriplicar en el medio los valores de estos
compuestos. La pared celular de las clulas de las semillas est compuesta
por hemicelulosa, celulosa y pectinas, por tanto, es de esperar que la
celulasa y la poligalacturonasa y el complejo enzimtico consigan
incrementar el contenido de taninos en el medio, tras una mayor degradacin
de sta. Estos resultados fueron previamente intuidos en los estudios de
Passos et al. (2009ab), ya que comprobaron que un pretratamiento previo de
las semillas de uvas con ccteles enzimticos a base de celulasa,
hemicelulasa, poligalacturonasa y proteasas incrementaba notablemente la
extraccin de aceite de las semillas, debido a su accin en la destruccin de
la organizacin celular y subcelular de los tejidos de las semillas, tales como
las paredes celulares y el citoplasma (Sineiro et al., 1998).
El grado medio de polimerizacin de los taninos se incrementa
ligeramente con la adicin de enzimas, aunque slo se observan diferencias
significativas

respecto

al

testigo

con

los

enzimas

xilanasa

pectnmetilesterasa. Esto puede ser debido a que estos enzimas acten slo
sobre las paredes celulares de las clulas de las semillas, lugar donde se
encuentran los taninos ms polimerizados (Geny et al., 2003), mientras que
el resto de enzimas tambin pueden llegar hasta zonas ms internas de las
clulas, favoreciendo la salida de taninos menos polimerizados, vindose de
esta manera compensado el tamao de los mismos.
Respecto al porcentaje de galoilacin, este aumenta significativamente
con la presencia de cualquiera de los enzimas, excepto en el caso de
pectnmetilesterasa y xilanasa. El complejo enzimtico y poligalacturonasa
dan lugar a la mayor presencia de taninos galoilados, seguidos de celulasa.
Geny et al. (2003) encontraron que la proporcin de (-)-epicatequina-3-O7

galato era mayor en la fraccin de las paredes celulares que en la fraccin

interna de las clulas de las semillas, por lo que una mayor degradacin de
dichas paredes por parte de estos enzimas podra favorecer una mayor
liberacin de taninos ms galoilados.
Con la presencia de alcohol, los enzimas tambin consiguen una
mayor difusin de taninos al medio. La celulasa, poligalacturonasa y
pectnmetilesterasa (que no tenan efecto en medio acuoso) consiguen
triplicar el contenido de taninos, mientras que con el enzima comercial los
valores son incrementados aproximadamente sobre seis veces. Estos
resultados parecen indicar que la presencia de alcohol facilita an mas la
accin de los enzimas y principalmente de pectnmetilesterasa y Enozym
vintage.
El medio hidroalcohlico es comparable con un vino, y entre los pocos
estudios que hay sobre la influencia de enzimas de maceracin en la
extraccin de taninos (Sun et al., 1998; Romero-Cascales et al., 2008 y GilMuoz et al., 2009) los resultados han mostrado normalmente un incremento
de taninos en el vino, atribuido siempre a la mayor degradacin de las pieles
por parte de hemicelulasas y celulasas presentes en los enzimas de
maceracin, proporcionando vinos con ms cuerpo y estructura (Watson,
2000). Nosotros demostramos en este estudio, que ese incremento de
taninos no es solamente atribuible a los taninos de los hollejos puesto que
tambin se produce la degradacin de las semillas.
El grado medio de polimerizacin de los taninos es menor con el
enzima comercial y la pectnmetilesterasa. Tambin son observadas
diferencias significativas en el caso del porcentaje de galoilacin,
consiguiendo

taninos

ms

galoilados

con

el

enzima

comercial

poligalacturonasa, seguidos de celulasa. Hay que destacar que los taninos

presentes en la solucin testigo sin enzima presentan valores de este
porcentaje similares a aquellos obtenidos en medio acuoso, indicando que el
alcohol no consigue llegar, en el caso de Monastrell, hasta los taninos que se
encuentran en la fraccin interna de las clulas de las semillas.
Para semillas de Cabernet Sauvignon y en solucin acuosa (Tabla 2),
slo

con

celulosa

Enozym

vintage

se

consigue

incrementar

significativamente los valores de taninos en el medio, mientras que en medio

alcohlico, xilanasa y el enzima comercial son los nicos enzimas que no
8

muestran ningn efecto. El grado medio de polimerizacin de los taninos es

mayor con xilanasa y menor con celulasa, poligalacturonasa y el enzima
comercial en medio acuoso y con la presencia de alcohol, solo
poligalacturonasa afecta de forma importante al tamao de estos
compuestos.
En cuanto al porcentaje de galoilacin, en ausencia de alcohol, o bien
no se ve prcticamente afectado, como es el caso de celulasa,
poligalacturonasa

el

enzima

comercial,

bien

disminuye

con

pectnmetilesterasa y xilanasa y en presencia de ste, al igual que ocurre

con el grado medio de polimerizacin, slo incrementa de forma ms
significativa con poligalacturonasa.
El grado medio de polimerizacin y el porcentaje de galoilacin de los
taninos afectan a las caractersticas organolpticas del vino, principalmente
a las sensaciones de astringencia y amargor, y parece que estas
sensaciones son ms potenciadas en presencia de alcohol y con algunos de
los enzimas empleados tanto para Monastrell como para Cabernet
Sauvignon.
El diferente comportamiento observado de los enzimas con semillas
de Cabernet Sauvignon, respecto al obtenido con semillas de Monastrell en
el mismo medio, puede ser indicativo de la existencia de diferencias a nivel
estructural y composicin entre las semillas de ambas variedades. Dichas
diferencias ya fueron encontradas por Ortega-Regules et al. (2008) a nivel
del hollejo.
Estos resultados indican que los taninos de las semillas pueden ser
difundidos al mosto-vino ya desde el inicio de la maceracin en ausencia de
alcohol, aunque su extraccin va a ser ms importante cuando el alcohol est
presente. Los enzimas de maceracin utilizados normalmente en el proceso
de elaboracin de los vinos tintos para incrementar el color tambin pueden
incrementar la extraccin de los taninos de las semillas (y no solo los del
hollejo), estando su efecto ms o menos marcado por el tipo de actividad
presente en los mismos y la variedad de uva. Esto es importante tenerlo en
cuenta, sobre todo cuando la uva llega poco madura a bodega, ya que, en
estas condiciones, el uso de enzimas de maceracin es bastante comn para
favorecer la extraccin de color, pero estos productos enolgicos podran
degradar ms fcilmente las paredes celulares de las clulas de las semillas,
9

al estar menos lignificadas, favoreciendo una mayor salida de taninos al

mosto-vino, incrementando el cuerpo, pero sobre todo las sensaciones de
astringencia y amargor en el vino.

10

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Tabla 1. Concentracin, grado medio de polimerizacin (GPm) y porcentaje de galoilacin

de los taninos en semillas de Monastrell en solucin acuosa e hidroalcohlica tras la adicin
de diferentes enzimas.
Taninos mg/L
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV

GPm
%Galoilacin
Solucin acuosa
1126a
8,9a
9,0a
2402b
9,5ab
10,6b
3345c
9,1a
14,7c
1535ab
10,3c
10,6b
1168a
9,9bc
7,9a
4622d
9,0a
15,4c
Solucin hidroalcohlica
1616a
9,1cd
10,2a
4851c
8,9c
13,1b
4501c
9,2cd
15,4c
2444b
9,3d
10,8a
4603c
7,7a
10,3a
7727d
8,3b
15,7c

Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectnmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras

diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadsticamente
significativas segn el test LSD (P<0,05).

Tabla 2. Concentracin, grado medio de polimerizacin (GPm) y porcentaje de galoilacin

de los taninos en semillas de Cabernet Sauvignon en solucin acuosa e hidroalcohlica tras
la adicin de diferentes enzimas.

Taninos mg/L
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV
Testigo
Celulasa
PG
Xilanasa
PE
EV

GPm

%Galoilacin

Solucin acuosa
2572ab
7,0c
3897d
5,5a
2872bc
5,9ab
2254a
7,8d
3135bcd
6,4bc
3464cd
6,2ab
Solucin hidroalcohlica
4659a
8,6d
5751d
5,4a
5161bc
8,2cd
4525a
8,0bcd
5452cd
7,2b
4883ab
7,4bc

9,2c
9,2c
8,8bc
6,7a
8,1b
9,5c
10,8a
11,0ab
11,4b
11,6c
10,9ab
11,0ab

Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectnmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras

diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadsticamente
significativas segn el test LSD (P<0,05).

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