UNIVERSIDADEFEDERALDORIOGRANDEDOSUL

INSTITUTODEBIOCINCIAS
PROGRAMADEPSGRADUAOEMGENTICAE
BIOLOGIAMOLECULAR

Anlise funcional de genes que codificam protenas WRKY, responsivos ao ataque

do fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, agente causador da ferrugem asitica em
soja [Glycine max (L.) Merrill]

Marina Borges Osorio

Porto Alegre, Maro de 2010.

UNIVERSIDADEFEDERALDORIOGRANDEDOSUL
INSTITUTODEBIOCINCIAS
PROGRAMADEPSGRADUAOEMGENTICAE
BIOLOGIAMOLECULAR

Anlise funcional de genes que codificam protenas WRKY, responsivos ao ataque

do fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, agente causador da ferrugem asitica em
soja [Glycine max (L.) Merrill]

Marina Borges Osorio

Dissertao submetida ao Programa de Ps-Graduao em

Gentica e Biologia Molecular da UFRGS como requisito
parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias.
Orientadora: Dra. Mrcia Margis-Pinheiro
Co-orientadora: Dra. Maria Helena Bodanese-Zanettini

Porto Alegre, Maro de 2010.

INSTITUIOEFONTESFINANCIADORAS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular
Vegetal do Departamento de Gentica da UFRGS e recebeu apoio financeiro do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), assim como dos projetos
GENOSOJA e BIOTECSUR.

AGRADECIMENTOS
s minhas queridas orientadoras, Mrcia e Maria Helena: pela acolhida no
Laboratrio de Gentica Vegetal da UFRGS, por terem me disponibilizado as melhores
condies possveis para a realizao deste trabalho e principalmente, por servirem
(sempre) como grandes exemplos, tamanha a competncia e a dedicao com as quais
exercem sua profisso.
Bea: por no incio, ter facilitado enormemente minha adaptao ao novo
laboratrio; e ao longo do mestrado, por ter sido como uma terceira orientadora, sempre
prestativa e paciente, me dando dicas e sugerindo caminhos a seguir...
Aos colegas, professores e funcionrios dos diversos ncleos que formam o
Laboratrio de Gentica Vegetal, assim como do Laboratrio de Genomas e Populaes de
Plantas (CBIOT), pela amizade e pela ajuda prestada ao longo destes dois anos...em
especial ao Joo, por ter se mostrado sempre prestativo e atendido com boa vontade,
sempre que uma ajudinha lhe era requisitada (e no foram poucas...).
minha famlia e aos meus amigos pelotenses, que me deram o incentivo e o apoio
fundamentais para meu sucesso nesta etapa...
Finalmente, a Deus, por ter me provido de pacincia descomunal, sem a qual a
escrita desta dissertao no seria possvel.
Muito obrigada!

RESUMO
A soja [Glycine max (L.) Merrill] uma espcie da famlia Fabaceae que possui grande
importncia econmica mundial. A ferrugem asitica (ASR), causada pelo fungo Phakopsora
pachyrhizi Sydow, tornou-se nos ltimos anos uma das maiores ameaas s lavouras de soja ao
redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados resistncia ASR foram identificados.
Entretanto, at o momento, nenhuma cultivar com resistncia efetiva ao ataque pelo patgeno foi
obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistncia quebrada por ao menos um
isolado do fungo. A identificao de diversas fontes de resistncia que possibilitem a construo de
um arsenal contra a ASR no germoplasma comercial de soja, alm do entendimento ao nvel
molecular dos mecanismos de defesa desta espcie contra P. pachyrhizi, podem contribuir
significativamente no combate ao patgeno. Os fatores de transcrio WRKY so membros de uma
superfamlia com ampla distribuio no Reino Vegetal; embora suas funes regulatrias ainda no
estejam bem definidas, inmeros estudos realizados ao longo dos ltimos anos tm reunido
evidncias de seu envolvimento nas respostas a ataques por patgenos. Estas requerem uma ampla
reprogramao transcricional na clula vegetal, na qual fatores de transcrio WRKY parecem
desempenhar um papel crucial no ajuste-fino da expresso de genes de defesa. O objetivo deste
trabalho caracterizar a funo de dois genes da famlia WRKY em soja, envolvidos nas respostas
ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, atravs de estratgias de gentica reversa e estudos de
expresso gnica. As seqncias genmicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e
identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpresso e
silenciamento em soja foram construdos e os processos de transformao gentica desta espcie
foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado bombardeamento/Agrobacterium,
nos quais embries somticos foram utilizados como tecido alvo. Alm disso, a anlise do perfil de
expresso desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condies de
estresse salino e em resposta infeco por P. pachyrhizi.

ABSTRACT
Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In
the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has
become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant
genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety
presenting effectiveness towards the pathogens attack, since the resistance ruled by every single
one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The
identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in
commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybeans defense mechanisms
against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the
pathogens eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide
distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been
several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogens
attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant
cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense
related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics
strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were
isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides,
vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species
was

genetically

transformed

by

particle

bombardment

or

by

an

integrated

bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target

tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and
GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in
response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

LISTADEABREVIATURAS
aa: aminocido
ASR: ferrugem asitica (Asian Soybean Rust)
At: Arabidopsis thaliana
CaMV: vrus mosaico da couve-flor (Cauliflower mosaic virus)
CC-NB-LRR: Coiled-Coil Nucleotide Binding Leucine-Rich Repeats
cDNA: DNA complementar
CTAB: brometo de cetiltrimetilamnio
DNA: cido desoxirribonucleico
D.O.: densidade ptica
dpi: dias aps a inoculao
ESTs: etiquetas de seqncias expressas (Expressed Sequence Tags)
ET: etileno
GFP: protena fluorescente verde (Green Fluorescent Protein)
Gm: Glycine max
hpi: horas aps a inoculao
hpt: higromicina fosfotransferase
HR: resposta de hipersensibilidade (Hypersensitive response)
IPTG: Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside
JA: cido jasmnico
kb: quilobases
LB: meio de cultura Luria Broth
LRR-RLK: Leucine-Rich Repeats Receptor-like Kinase
LRR-RLP: Leucine-Rich Repeats Receptor-like Protein
MAPK: Mithogen-activated Protein Kinase
Mb: megabases
MKK7: Mithogen-activated Protein Kinase Kinase 7
MS: meio de cultura Murashinge e Skoog
Myr: milhes de anos atrs (Million years ago)
7

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NPR1: Nonexpressor of PR genes 1
P35S: promotor 35S do CaMV
pb: pares de base
PCD: morte celular programada (Programmed Cell Death)
PCR: Reao em Cadeia da Polimerase
pH: potencial hidrogeninico
PIG: Particle Inflow Gun
ProlD: rooting loci promoter de Agrobacterium rhizogenes
PRs: Pathogenesis-Related proteins
pv: patovar
RT-qPCR: PCR em Tempo Real quantitativo
RLK: Receptor-like Kinase
RNA: cido ribonucleico
RNAi: RNA de interferncia
ROS: espcies reativas de oxignio
rpm: rotaes por minuto
SA: cido saliclico
SAR: resistncia sistmica adquirida (Systemic Acquired Resistance)
T35S: terminador 35S do CaMV
T-DNA: DNA de transferncia de Agrobacterium tumefaciens
TIR-NB-LRR: Toll/Interleukin1 Receptor Nucleotide Binding Leucine-Rich
Repeats
TTSS: Sistema de Secreo Tipo III (Type III Secretion System)
UTR: regio no-traduzida
UV: radiao ultravioleta
WT : planta selvagem (Wild-type)
X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside

SUMRIO
1. INTRODUO .................................................................................................... 14
1.1.

Estresses ambientais que afetam a cultura da soja e os mecanismos de

resposta da planta ............................................................................................................. 16

1.2.

A genmica funcional como ferramenta para o melhoramento de plantas .... 23

1.3.

A superfamlia de fatores de transcrio WRKY ........................................... 24

1.4.

Transformao gentica da soja e estudos funcionais .................................... 29

2. OBJETIVOS......................................................................................................... 32
2.1.

Objetivo geral ................................................................................................. 32

2.2.

Objetivos especficos ...................................................................................... 32

3. METODOLOGIA ................................................................................................ 33
3.1.

Material........................................................................................................... 33

3.2.

Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes de interesse ....................... 33

3.3.

Obteno de vetores para a transformao de soja ......................................... 34

3.3.1.

Construo de superexpresso .................................................................... 35

3.3.2.

Construo de silenciamento ...................................................................... 36

3.4.

Transformao de Escherichia coli ................................................................ 38

3.5.

Transformao de Agrobacterium tumefaciens .............................................. 39

9

3.6.

Extrao de DNA............................................................................................ 40

3.7.

Extrao de RNA total.................................................................................... 40

3.8.

Sntese de cDNA ............................................................................................ 40

3.9.

Reao em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................... 41

3.10.

PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR) ............................................. 42

3.11.

Anlises da expresso gnica ao longo do desenvolvimento e em resposta a

estresses............. ............................................................................................................... 44
3.11.1.

Diferentes rgos e fases do desenvolvimento ....................................... 44

3.11.2.

Infeco por P. pachyrhizi ...................................................................... 45

3.11.3.

Estresse salino ......................................................................................... 46

3.12.

Anlises estatsticas .................................................................................... 46

3.13.

Transformao gentica de soja .................................................................. 46

3.13.1.

Induo de embriognese somtica e obteno de tecido embriognico

proliferativo............. ......................................................................................................... 47
3.13.2.

Transformao por biobalstica (bombardeamento de partculas) .......... 47

3.13.3.

Transformao

via

sistema

integrado

bombardeamento

Agrobacterium ................................................................................................................ 48
3.13.4.

Seleo de transformantes, regenerao e aclimatao das plantas

obtidas............................................................................................................................... 48

10

3.13.5.

Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da

expresso do gene reprter ............................................................................................... 51

4. RESULTADOS .................................................................................................... 52
4.1.

Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes para estudo........................ 52

4.2.

Anlises da expresso gnica ......................................................................... 57

4.2.1.

Diferentes rgos e fases do desenvolvimento ........................................... 57

4.2.2.

Infeco por P. pachyrhizi .......................................................................... 59

4.2.3.

Estresse salino ............................................................................................. 61

4.3.

Obteno de vetores para a transformao de soja ......................................... 63

4.3.1.

Construo do vetor binrio de superexpresso.......................................... 63

4.3.2.

Construo dos vetores de silenciamento ................................................... 64

4.4.
4.4.1.

Obteno de plantas transgnicas ................................................................... 67

Transformao de Agrobacterium tumefaciens com as construes de

superexpresso e silenciamento ........................................................................................ 67

4.4.2.

Transformao de embries somticos de soja via sistema integrado

bombardeamento / Agrobacterium................................................................................ 68
4.5.
4.5.1.

Anlise dos tecidos geneticamente modificados e das plantas transgnicas .. 71

Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da expresso

do gene reprter ................................................................................................................ 71

11

4.5.2.

Confirmao da integrao do transgene por PCR ..................................... 73

4.5.3.

Clculo do nmero de cpias do transgene atravs de RT-qPCR .............. 73

5. DISCUSSO......................................................................................................... 75
5.1.

Anlises in silico e isolamento dos genes em estudo ..................................... 75

5.2.

Anlises da expresso gnica ......................................................................... 77

5.2.1.

Genes-referncia ......................................................................................... 77

5.2.2.

Expresso em diferentes rgos, fases do desenvolvimento e em resposta ao

estresse salino ................................................................................................................... 78

5.2.3.

Infeco por P. pachyrhizi .......................................................................... 79

5.2.4.

Estrutura, expresso e funo gnica .......................................................... 80

5.3.

Obteno e anlises de plantas transgnicas para o estudo funcional de

GmWRKY20 e GmWRKY46 ............................................................................................. 84

5.3.1.

Expresso GFP ............................................................................................ 84

5.3.2.

Estimativa do nmero de cpias do transgene ............................................ 88

5.3.3.

Revelao do fentipo................................................................................. 90

6. CONCLUSES .................................................................................................... 93
7. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 94
8. REFERNCIAS ................................................................................................... 95

12

ANEXO 1: Seqncias genmicas e codificantes de GmWRKY20 e GmWRKY46 e

alinhamento dos primers utilizados nas construes RNAi e para as anlises de expresso
por RT-qPCR. ..................................................................................................................... 102
ANEXO 2: Clculo do nmero de cpias do transgene atravs da quantificao relativa
pela anlise da curva padro. .............................................................................................. 107

13

1. INTRODUO
Leguminosas

so

plantas

pertencentes

famlia

Fabaceae

que,

com

aproximadamente 20.000 espcies, a terceira maior famlia entre as plantas superiores.

Dentre as leguminosas, a soja [Glycine max (L.) Merrill] a espcie de maior importncia
econmica mundial. Segundo dados da FAO, a produo mundial de soja em 2008
ultrapassou 230 milhes de toneladas. Neste contexto, o Brasil aparece como o segundo
maior produtor atrs apenas dos Estados Unidos tendo produzido, em 2008, quase 60
milhes de toneladas de gros. A relevncia desta espcie na agricultura decorrente de sua
capacidade de fixao de nitrognio atmosfrico atravs da simbiose com microrganismos;
do seu alto teor protico e lipdico, sendo utilizada h milnios na alimentao humana e
animal; e mais recentemente, da possibilidade de utilizao do leo de soja para a produo
de biocombustveis, sendo esta utilidade de particular interesse do governo brasileiro
(http://www.biodiesel.gov.br/).
Devido a sua grande importncia, a comunidade cientfica internacional
recomendou sua utilizao como planta modelo entre as leguminosas para estudos
genticos e moleculares, na conferncia Cross-Legume Advances through Genomics
(CATG), realizada em 2004, nos Estados Unidos (Gepts et al. 2005). Desde ento,
diversos esforos ao redor do mundo tm sido realizados visando a obteno e a integrao
do maior volume de dados possveis sobre o genoma da soja. A comear pelo
seqenciamento do genoma da cultivar Williams 82, financiado pelo Departamento de
Energia dos Estados Unidos e realizado entre os anos de 2006 e 2008 atravs de shotgun
sequencing (http://www.jgi.doe.gov/CSP/). Alm disso, em 2007 foi criado o
International Soybean Genome Consortium (ISGC) formado por pesquisadores da China,
Japo, Coria do Sul, Estados Unidos e Brasil. O Consrcio Nacional para Estudos do
Genoma da Soja se integra ao ISGC atravs do projeto GENOSOJA, coordenado pelo
pesquisador Ricardo Vilela Abdelnoor e financiado pelo CNPq.
O projeto GENOSOJA propos o desenvolvimento de um consrcio entre diversos
grupos de pesquisa do pas para a caracterizao do genoma da soja, tendo por objetivo a
14

integrao de informaes sobre a estrutura fsica do genoma e a expresso de genes e as

protenas codificadas por eles, dando nfase s situaes de estresses biticos e abiticos
que comprometem a produtividade da cultura no Brasil e no mundo. Entre os estresses
alvos de estudo esto: a ocorrncia de secas; doenas, como a ferrugem asitica; e pragas,
como o ataque de diferentes espcies de nematides. Ferramentas de bioinformtica tornam
possvel a integrao das informaes geradas nos diferentes nveis do projeto estrutural,
transcricional, protico e funcional auxiliando na compreenso da funo e dos
mecanismos de controle da expresso de genes presentes na soja e envolvidos em processos
de desenvolvimento e/ou defesa contra estresses ambientais.
Alm do GENOSOJA, o Brasil tambm faz parte do projeto BIOTECSUR (Projeto
de Cooperao Bi-Regional entre a Unio Europia & MERCOSUL, Referncia EU
127119) que tem por objetivo a caracterizao de genes e tecnologias derivadas de sua
anlise funcional, que possam agregar valor ao cultivo da soja frente aos estresses
ambientais atravs da formao de uma rede de trabalho entre quatro pases do
MERCOSUL (Argentina, Brasil, Paraguai e Uruguai), representando um marco de
sustentabilidade ambiental, social e econmica nestes pases.
Recentemente, os primeiros resultados obtidos da anlise do seqenciamento do
genoma da soja foram publicados (Schmutz et al. 2010). Compreendendo 950 Mb, o
genoma da soja o maior genoma vegetal seqenciado por shotgun at hoje. Em termos
comparativos, duas vezes e meia maior que o genoma do arroz (389 Mb) e seis vezes
maior que o genoma de Arabidopsis thaliana (157 Mb), espcie-modelo entre as
dicotiledneas. Dividido entre 20 cromossomos, 43% de suas seqncias se encontram em
regies eucromticas, pouco repetitivas e com alta taxa de recombinao; entretanto 21,6%
dos genes preditos com alta confiabilidade (high confidence genes) so encontrados nas
regies prximas aos centrmeros, ricas em seqncias repetitivas e transposons. O genoma
da soja parece ter sofrido dois grandes eventos de duplicao (h 59 e 13 Myr) resultando
em uma conformao atual com quase 75% dos genes presentes em mltiplas cpias, que
vm sendo extraordinariamente mantidas ao longo do tempo. Ressalta-se ainda, que dos
15

46.430 loci preditos como codificantes de protenas, 12,2% foram identificados como sendo
fatores de transcrio (em Arabidopsis este nmero de apenas 7%). A distribuio geral
destes entre as famlias de fatores de transcrio conhecidas similar entre os genomas de
soja e Arabidopsis, entretanto algumas famlias so mais esparsas e outras mais abundantes
no genoma da soja, indicando que as vias regulatrias nesta espcie podem diferir daquelas
descritas para Arabidopsis. Como referido anteriormente, a composio dos leos
produzidos em sementes de soja de grande importncia para sua utilizao na indstria de
biocombustveis. Desta forma, chama-se ateno para a anlise comparativa de genes que
governam as vias de biossntese e de acmulo de lipdeos. O nmero de genes envolvidos
nas diversas etapas destas vias aparenta ser bem maior em soja, sugerindo que estas sejam
reguladas de maneira bem mais complexa nesta espcie, quando comparada a Arabidopsis.
1.1. Estresses ambientais que afetam a cultura da soja e os mecanismos de resposta
da planta
Os estresses ambientais so os grandes responsveis por limitar um maior
rendimento das culturas de soja. Estes podem ser de dois tipos: estresses abiticos
(causados por alta salinidade e seca, principalmente) ou estresses biticos (causados por
pragas e doenas). Aproximadamente 40 doenas (bacterianas, fngicas, causadas por vrus
ou nematides) que afetam as lavouras de soja j foram identificadas no Brasil; dentre elas,
pode-se destacar o crestamento bacteriano da soja (Pseudomonas savastanoi pv. glycinea),
o mosaico comum da soja (Vrus do Mosaico Comum da Soja, VMCS), o nematide de
cisto da soja (Heterodera glycines), a antracnose (Colletotrichum dematium var. truncata),
a podrido de carvo (Macrophomina phaseolina) e a ferrugem asitica (Phakopsora
pachyrhizi). A expanso da cultura para novas reas, aliada a prticas inadequadas de
manejo e monocultura so os principais responsveis pelo aumento de ocorrncias e pela
diversificao das doenas que afetam a soja (EMBRAPA Soja 2005).
A ferrugem asitica (ASR, Asian Soybean Rust) uma doena causada pelo
fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow e foi identificada pela primeira vez no Japo, h mais
de um sculo [Hennings VP (1903) A few new Japanese Uredinaceae. Hedwigia 42:10716

108, citado em Hartman, Miles & Frederick, 2005]. Entretanto, foi apenas a partir de 2001
que a doena comeou a receber ateno por parte de agricultores e pesquisadores. Nesse
ano foi descrito o primeiro caso de ASR em lavouras de soja do Paraguai, e alguns meses
depois, no Brasil (Yorinori et al. 2005). Aps sua disperso pela Amrica do Sul, ao final
de 2004, a ASR chegou s lavouras dos Estados Unidos (Miles et al. 2006). Desde ento,
devido sua alta severidade (perdas de at 80% na produo), se tornou uma das maiores
ameaas s lavouras de soja ao redor do mundo. Estimativas apontam que a doena tenha
causado perdas econmicas de mais de 2,2 bilhes de dlares na safra 2006/2007 no Brasil
(Calvo et al., 2008). Alm disso, a USDAs Risk Management Agency (RMA), j h
alguns anos pe em alerta os agricultores norte-americanos sobre o risco de contaminao
de suas lavouras e recomenda prticas preventivas e de controle de uma possvel epidemia
(http://www.rma.usda.gov/news/2006/04/soybeanrust.html).

desenvolvimento

da

infeco resulta na desfolhao prematura e reduo drstica no rendimento dos gros.

Atualmente, por no haver disponibilidade de cultivares comerciais com resistncia
gentica durvel, a principal forma de controle atravs do uso de fungicidas. Estes, alm
de aumentarem substancialmente os custos da produo e serem uma fonte constante de
contaminao ambiental, geralmente acabam sendo ineficientes, devido agressividade do
fungo e dificuldade de deteco do mesmo nos estgios iniciais da infeco (Calvo et al.,
2008; Silva et al., 2008).
O ciclo infeccioso de um fitopatgeno inicia-se pela sua penetrao no tecido
vegetal. As plantas dispem de uma imunidade pr-invasiva, na qual lanam mo de um
conjunto de barreiras fsicas pr-existentes (cutcula, tricomas e parede celular) ou
induzidas (deposio de calose, fechamento dos estmatos); alm de barreiras qumicas
(liberao de quitinases, glucanases e compostos antimicrobianos) a fim de prevenir a
invaso de microrganismos. Ao sobrepor estas barreiras, o patgeno ento exposto aos
mecanismos de defesa da imunidade ps-invasiva, a qual pode ser ativada por PAMPs
(Pathogen-associated Molecular Patterns) sendo neste caso denominada PTI (PAMPtriggered Immunity) ou ainda, ser ativada por efetores e denominada ETI (Effectortriggered Immunity)(Ghre et al. 2008). A PTI geralmente est associada imunidade
17

no-hospedeira e imunidade basal, que so respostas imediatas ao contato com o

patgeno. J a ETI est associada ao desenvolvimento de uma resposta de
hipersensibilidade (HR) e resistncia sistmica adquirida (SAR), sendo estas respostas de
longa durao.
Juntas, a PTI e a ETI fazem parte do modelo atualmente conhecido como o Dogma
Central da fitopatologia (Figura 1). Este importante modelo descreve um processo de coevoluo popularmente denominado queda-de-brao evolucionria (evolutionary armsrace), resumido a seguir. Alm das barreiras fsicas e qumicas pr-existentes, as plantas
possuem a capacidade de detectar componentes genricos conservados dos microrganismos
(MAMPs, Microbe-associated Molecular Patterns; ou PAMPs) desencadeando a PTI. Por
sua vez, alguns microrganismos desenvolvem fatores de virulncia (efetores) capazes de
suprimir parte da resposta geral de defesa de seu hospedeiro. Estes acabaram por
desenvolver genes de resistncia (R genes) especficos, cujo produto detecta de forma
direta ou indireta os fatores de virulncia do patgeno, desencadeando a ETI. Finalmente,
atravs da eliminao ou da modificao de seus efetores, o patgeno pode mais uma vez
escapar deteco pela planta (Bent et al. 2007).

18

Figura 1. Modelo evolutivo da interao planta-patgeno. O modelo apresentado utiliza a

interao planta-bactria como exemplo geral de interao planta-patgeno: (a) O reconhecimento de PAMPs
(como a flagelina bacteriana) por receptores extracelulares RLKs prontamente ativa a imunidade basal, a qual
inclui a sinalizao por cascatas de MAPKs e a reprogramao transcricional mediada por fatores de
transcrio WRKY. (b) Bactrias patognicas utilizam o TTSS para secretar mltiplas protenas efetoras que
suprimem as respostas da imunidade basal do hospedeiro, permitindo a multiplicao do patgeno no
apoplasto vegetal. (c) Protenas de resistncia vegetais (produtos de genes R, como protenas TIR-NB-LRR)
reconhecem a atividade de efetores e restabelecem a resistncia da planta, desenvolvendo forte ETI. (d) O

19

patgeno evita a defesa mediada por genes R modificando ou eliminando os efetores que ativam esta defesa.
Este estado lembra o apresentado em (b), exceto que neste caso o patgeno teve que perder ou alterar uma
protena efetora, ou ainda desenvolver uma nova. (Retirado de Bent & Mackey, 2007).

As estruturas ou molculas conservadas pertencentes aos microrganismos que

servem como alvo do reconhecimento de receptores eucariticos so chamadas, de maneira
geral, de elicitores. Freqentemente refere-se a estes atravs das siglas PAMPs ou MAMPs,
previamente descritas. Flagelinas bacterianas, lipopolissacardeos, quitinas fngicas ou
heptaglucosdeos de oomicetos so exemplos de MAMPs detectados pelas clulas vegetais;
como estes esto geralmente envolvidos em processos biolgicos bsicos do
microrganismo, sua evoluo adaptativa a fim de evitar o reconhecimento pela planta um
processo muito lento. PRRs (Pattern Recognition Receptors) so os receptores presentes
na membrana plasmtica vegetal que estimulam cascatas de transduo de sinal ao
reconhecerem MAMPs, induzindo respostas de defesa no ncleo. Dois tipos de PRRs so
os mais conhecidos, LRR-RLKs ou LRR-RLPs e as respostas de defesa desencadeadas por
estes geralmente envolvem: o fluxo de ons de Ca2+, a formao de espcies reativas de
oxignio (ROS) e de xido ntrico (NO) e a ativao de cascatas de transduo de sinal at
o ncleo (envolvendo MAPKs e fatores de transcrio WRKY); resultando na deposio de
calose, no fechamento dos estmatos e na sntese de compostos antimicrobianos (PRs), por
exemplo. Os efetores liberados por patgenos, visando suprimir a PTI, so molculas
relacionadas sua virulncia que esto fortemente sujeitos evoluo adaptativa, por no
desempenharem uma funo fisiolgica essencial nestes organismos. Se bem sucedidos,
promovem a ocorrncia de uma interao denominada compatvel entre o patgeno e a
planta, resultando no desenvolvimento do processo infeccioso. So tambm conhecidos
como genes de avirulncia (Avr genes), pois uma vez reconhecidos por receptores do
hospedeiro nas interaes incompatveis, sua funo de virulncia ofuscada por uma
funo dominante de avirulncia e a infeco evitada. Estes efetores geralmente so
secretados no apoplasto ou no citoplasma vegetal, atravs do sistema de secreo tipo trs
(TTSS) em bactrias, ou por exocitose, no caso de fungos e oomicetos. Por fim, a ETI
desencadeada na clula vegetal quando o produto de genes R protenas receptoras de
20

membrana (do tipo LRR-RLKs ou LRR-RLPs), ou ainda intracelulares (CC-NB-LRR ou

TIR-NB-LRR) reconhece estas molculas efetoras ou o produto de sua ao. As respostas
de defesa decorrentes deste reconhecimento incluem, como referido anteriormente para a
PTI, a gerao de uma exploso oxidativa na clula, o fluxo de ons atravs da membrana
plasmtica e a expresso de genes de defesa no ncleo, ativados atravs de cascatas de
transduo de sinal. Diferentemente da PTI, na ETI geralmente ocorre o desenvolvimento
de uma HR, podendo esta eventualmente resultar em morte celular programada (PCD).
Estas e outras evidncias apontam atualmente para a ETI como sendo uma reativao da
PTI, de maneira acelerada e potencializada (Bent & Mackey, 2007; Hckelhoven, 2007;
Ghre & Robatzek, 2008).
O ciclo tpico da infeco por P. pachyrhizi comea pela germinao dos
uredinisporos, entre 1 e 2 horas aps a inoculao (hpi) sob condies adequadas: escuro,
alta umidade e temperatura permissiva, entre 15C e 25C (Tsukahara et al. 2008). Duas
horas aps a germinao formado o apressrio. Dentro deste formado um cone, a partir
do qual, 7 hpi uma hifa de penetrao atravessa a epiderme do tecido vegetal. Quando esta
atinge o espao intercelular abaixo da epiderme, um septo formado produzindo hifas
primrias (entre 15 e 20 hpi). Os haustrios, rgos especializados posicionados entre a
parede celular e a membrana plasmtica vegetal, pelos quais o fungo obtm nutrientes e
secreta protenas efetoras, so formados de 24 a 48 hpi. Neste mesmo perodo o fungo
segue colonizando o mesfilo esponjoso, atravs da formao de hifas secundrias e
haustrios adicionais. Novos uredinisporos so formados de 7 a 9 dias aps a inoculao
(dpi), sendo disseminados por at quatro semanas (van De Mortel et al. 2007).
At hoje, cinco genes dominantes relacionados resistncia ASR, Resistance to
Phakopsora pachyrhizi genes, foram identificados em soja: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e
Rpp5, sendo que cada um desses genes condiciona resistncia a um grupo limitado de
isolados de P. pachyrhizi. Trs reaes em resposta ao patgeno so possveis (Figura 2). A
reao imune (governada por Rpp1) na qual a planta no apresenta sintomas visveis; a
reao de hipersensibilidade (HR, governada por Rpp2 a Rpp5) que possui como
21

caracterstica a formao de leses avermelhadas (reddish-brown lesions, RB)

decorrentes de morte celular programada e que resultam na limitao da esporulao e do
crescimento do fungo; e a reao suscetvel, caracterizada por leses marrons (tanlesions, TAN) decorrentes da esporulao total das pstulas de P. pachyrhizi. Como j
mencionado, at o momento a utilizao de nenhuma destas fontes monognicas gerou
resistncia durvel em cultivares comerciais de soja, uma vez que todos os loci avaliados
tiveram sua resistncia quebrada por ao menos um isolado (Miles, Hartman, & Fredrick,
2005; Silva et al., 2008; Meyer et al., 2009). Alm do mais, a baixa variabilidade gentica
apresentada entre as cultivares de soja existentes, tanto no Brasil quanto nos Estados
Unidos, um fator agravante na busca por novas fontes de resistncia. Em 2006, Miles,
Frederick & Hartman testaram todo o banco de germoplasma dos Estados Unidos contra
cinco isolados de P. pachyrhizi e nveis de tolerncia (ao menos parcial) foram encontrados
em menos de 5 % da coleo disponvel. A identificao de diversas fontes de resistncia
que possibilitem a construo de um arsenal contra a ASR no germoplasma comercial de
soja, alm do entendimento ao nvel molecular dos mecanismos de defesa da soja contra
este fungo, podem contribuir enormemente no combate ao patgeno.

22

Figura 2. Reaes da soja em resposta ASR. (A) reao imune, sem sintomas visveis; (B) reao
de hipersensibilidade, com leses avermelhadas (RB); e (C) reao suscetvel, com leses marrons (TAN)
(Modificado de Miles, Frederick, & Hartman, 2006).

1.2. A genmica funcional como ferramenta para o melhoramento de plantas

A genmica funcional aparece como uma importante ferramenta biotecnolgica
para se incrementar as bases genticas utilizadas nos programas de melhoramento. A
utilizao combinada de tcnicas de gentica reversa, como a superexpresso de genes de
interesse ou o silenciamento gnico por RNAi, aliada a anlises de high throughput,
como o microarranjo e o MPSS (massively parallel signature sequencing), tm feito da
genmica funcional uma pea chave na era ps-genmica, de forma a possibilitar a
identificao de genes e rotas metablicas relacionadas aos mais variados processos
biolgicos, como o desenvolvimento de rgos,

ciclo celular e resposta a estresses

ambientais, alm de elementos-chave na regulao destas rotas (Waterhouse & Helliwell,

2003; Gutterson & Zhang, 2004).
Recentemente, trs grupos independentes demonstraram atravs de tcnicas de
genmica funcional high throughput a modulao da expresso de vrios genes de soja
em resposta ao ataque do fungo P. pachyrhizi (Panthee et al., 2007; van De Mortel et al.,
23

2007; Choi et al., 2008; Panthee et al., 2009). O primeiro perfil do transcriptoma desta
interao foi um microarranjo realizado por Panthee et al. em 2007, onde foram analisadas
plantas jovens (estgio V2), 72 hpi com o patgeno. Em 2009, o mesmo grupo apresentou
outra anlise, desta vez comparando o perfil de expresso em duas fases distintas do
desenvolvimento da soja (estgios V4 e R1), 72 hpi. O foco destes estudos foi demonstrar
que a expresso diferencial de genes em resposta infeco depende do estgio de
desenvolvimento. Em 2008, Choi et al. obtiveram o perfil do transcriptoma atravs de
construo de bibliotecas de SSH (suppressive subtraction hybridization) seguida de
microarranjo, comparando a reao suscetvel com a imune (governada pelo gene Rpp1) 1,
6, 12, 24 e 48 hpi. Neste trabalho foi ressaltada a importncia, tanto de genes responsveis
pelo balano oxidativo (lipoxigenases e peroxidases); quanto de membros de diversas
famlias de fatores de transcrio, sugerindo um complexo padro de regulao na clula
vegetal para que a infeco seja evitada. J no trabalho realizado por van De Mortel et al.,
em 2007, a reao suscetvel foi comparada reao de hipersensibilidade (governada pelo
gene Rpp2), sendo as anlises realizadas 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120 e 168 hpi.
Atravs de microarranjo pde-se observar um grande nmero de genes diferencialmente
expressos, ressaltando em especial a expresso diferencial de 46 fatores de transcrio
pertencentes famlia WRKY, indicando que estes ocupam papel-chave na resposta da soja
infeco pelo fungo causador da ferrugem asitica.
1.3. A superfamlia de fatores de transcrio WRKY
Os fatores de transcrio WRKY so membros de uma superfamlia com ampla
distribuio no Reino Vegetal, o que pode refletir sua importncia na histria evolutiva
destes organismos (Eulgem et al., 2000). Membros desta famlia j foram identificados em
diversos txons vegetais: desde brifitas (Physcomitrella patens 38 membros) e
gimnospermas (Pinus monticola 83 membros); at angiospermas monocotiledneas
(Oryza sativa 105 membros) e dicotiledneas (Arabidopsis thaliana 74 membros,
Populus trichocarpa 100 membros) (Ulker & Somssich, 2004; Liu & Ekramoddoullah,
2009). O aparente sucesso desta superfamlia no Reino Vegetal parece ser decorrente dos
24

sucessivos eventos de duplicao gnica sofridos pelos genomas das plantas, sendo que um
grande nmero de genes WRKY duplicados foi mantido ao longo da evoluo, tanto em
espcies selvagens quanto nas cultivadas (Petitot, Lecouls, & Fernandez, 2008; Tao et al.
2009). Apesar disso, membros desta famlia foram recentemente identificados em espcies
de outros reinos, tais como Giardia lamblia (protista), Dictyostelium discoideum
(mixomicota) e Chlamydomonas reinhardtii (alga unicelular); sugerindo que possuam
origem anterior ao surgimento das plantas, tendo sido perdidos em algum momento ao
longo da evoluo de fungos e animais grupos nos quais no h registros de sua presena
(lker et al. 2004).
A principal caracterstica compartilhada pelos membros desta famlia seu domnio
de ligao ao DNA, denominado domnio WRKY: tipicamente composto por 60
aminocidos, dentre estes a seqncia conservada WRKYGQK (triptofano arginina
lisina tirosina glicina glutamina lisina) na sua poro N-terminal, alm de um
motivo zinc-finger-like na sua poro C-terminal (Eulgem et al., 2000). O domnio
WRKY possui como alvo principal de ligao, cis-elementos do tipo W-boxes
(C/TTGACT/C), apesar de stios alternativos terem sido identificados recentemente, o que
reflete a grande variao apresentada entre os aminocidos adjacentes ao motivo
conservado WRKYGQK (Pandey et al. 2009). Baseado no nmero de domnios WRKY e
nas caractersticas apresentadas por seus motivos zinc-finger-like, Eulgem et al., em
2000, dividiram os fatores de transcrio WRKY em trs subgrupos (Figura 3): protenas
do grupo I apresentam dois domnios WRKY e potenciais ligantes a zinco seguindo o
padro C2-H2 (CX45CX2223HX1H) em seus motivos zinc-finger-like; no grupo II
o padro C2-H2 permanece, mas estas protenas possuem apenas um domnio WRKY; j no
grupo III, o padro C2-HC (CX7CX23HX1C) observado e protenas deste grupo
tambm apresentam apenas um domnio WRKY.

25

Figura 3. Representao esquemtica dos domnios estruturais das protenas WRKY de salsa
(Pc), batata doce (Ib), Arabidopsis (At), tabaco (Nt), pepino (Cs) e aveia selvagem (Af). Elas so
divididas em trs grupos de acordo com o nmero e o tipo de domnio WRKY que contm. Domnios
WRKY esto representados em preto, provveis sinais bsicos de localizao nuclear em azul e zperes de
leucina em rosa. Regies ricas em serina-treonina esto em amarelo, regies ricas em glutamina em roxo,
regies ricas em prolina em verde e regies acdicas em vermelho (Retirado de Eugelm et al., 2000).

26

Embora as funes regulatrias destes genes ainda no estejam bem definidas,

inmeros estudos realizados ao longo dos ltimos anos tm demonstrado evidncias de sua
participao nos processos de senescncia, desenvolvimento de tricomas e metabolismo,
alm da resposta a estresses abiticos (seca, frio, irradiao por luz UV) e principalmente,
em resposta aos mais diversos tipos de estresses biticos (Berri et al., 2009; (Pandey et al.
2009).
Respostas a ataques por patgenos requerem uma ampla reprogramao
transcricional e estudos sugerem que a maioria dos patgenos desencadeia uma rede de
sinalizao interconectada na clula vegetal envolvendo o balano entre os hormnios
cido saliclico (SA) e cido jasmnico (JA). Esta rede intrincada compreende ainda, a ao
de ativadores e repressores transcricionais que realizam o ajuste fino da expresso de genes
de defesa. Grandes famlias de fatores de transcrio so responsveis por esta modulao;
em particular, a presena de cis-elementos do tipo W-boxes na regio promotora de genes
co-regulados em respostas de defesa, indica que fatores de transcrio WRKY
desempenham um papel amplo e crucial na resposta imune das plantas (Figura 4)(Kalde et
al., 2003; Eulgem & Somssich, 2007; Berri et al., 2009; Pandey & Somssich, 2009). Alm
do mais, a presena destes cis-elementos em suas prprias regies promotoras indicam a
existncia de um sistema de auto-regulao/regulao cruzada entre WRKYs atravs de
mecanismos de feedback especficos (Pandey & Somssich, 2009). Por fim, estudos
recentes (Navarro et al., 2008; Zhang, et al. 2008; Kuang, Padmanabhan, & Li, 2009)
demonstraram que pequenos RNAs endgenos de plantas esto amplamente envolvidos na
regulao ps-transcricional de genes envolvidos nas respostas a patgenos, apontando
ainda, para a existncia de um interatoma entre WRKYs e pequenos RNAs (Figura 5),
uma vez que WRKYs so alvos preditos de diversos miRNAs, assim como estes tambm
apresentam W-boxes em sua regio promotora.

27

Figura 4. Modelo hipottico da rede de interao entre WRKYs (de A. thaliana) envolvidos nas
respostas ao ataque por patgenos. A sinalizao de defesa celular pode ser desencadeada pelo
reconhecimento de PAMPs por receptores de membrana e subseqente ativao de cascatas de fosforilaes
envolvendo MAPKs (PTI), ou atravs da deteco de produtos de efetores do patgeno na clula vegetal por
protenas R (ETI). Em ambos os casos, rpidas alteraes da expresso gnica subseqentes so mediadas
pela ao de diversos fatores de transcrio, como WRKYs. A ETI pode ser desencadeada pela ativao de
protenas R (R inativa R ativa) mediada por efetores e subseqente inibio de WRKYs supressores da
defesa. A sinalizao por SA ativada pelo patgeno libera NPR1 de complexos oligomricos, resultando no
acmulo de monmeros de NPR1 no ncleo e sua associao com fatores de transcrio TGA em stios
promotores, sendo que conjunto de genes WRKY depende da ao de NPR1, tanto de forma positiva quanto
negativa (Modificado de Eulgem & Somssich, 2007).

28

Figura 5. Modelo do interatoma WRKYs - pequenos RNAs durante a reprogramao das

respostas de defesa vegetal. Durante o ataque do patgeno, loci geradores de pequenos RNAs podem estar
sob o controle de fatores de transcrio WRKY; ao mesmo tempo, a abundncia de WRKYs pode ser
regulada por pequenos RNAs. RdRs, RNA polimerases direcionadas RNAs (Modificado de Pandey &
Somssich, 2009).

1.4. Transformao gentica da soja e estudos funcionais

A importncia econmica da soja, aliada sua baixa variabilidade gentica e
incompatibilidade sexual desta espcie em cruzamentos interespecficos e intergenricos
(Hu et al. 1995) tm feito da transformao gentica de soja, no s uma importante
alternativa s prticas de melhoramento convencional; mas tambm, servido como
ferramenta a estas prticas, de forma a possibilitar o incremento das bases genticas
utilizadas nos programas de melhoramento. Hoje em dia, a transformao gentica vegetal
(tanto de forma estvel quanto transiente), pr-requisito para a realizao de estudos
moleculares, genticos, bioqumicos e fisiolgicos (Somers et al. 2003) que sejam
realizados, por exemplo, a partir da superexpresso, do silenciamento ou da localizao
sub-celular dos genes em estudo. Entretanto, a existncia de um sistema eficiente de
transformao essencial para que estes sejam bem sucedidos.

29

Dessa forma, diversos trabalhos tm sido desenvolvidos principalmente em

Arabidopsis thaliana que alm de ser uma espcie de fcil transformao (mtodo floral
dip; Clough & Bent, 1999) e rpido desenvolvimento, possui genoma de tamanho
reduzido que acaba por facilitar as anlises moleculares subseqentes. Mais
especificamente, no estudo de genes envolvidos nos mecanismos de interao entre planta /
patgeno pode-se citar diversos trabalhos bem sucedidos realizados atravs de tcnicas de
superexpresso e silenciamento. Navarro et al., em 2006, demonstraram pela primeira vez
o envolvimento de um microRNA endgeno de plantas (miR393 de Arabidopsis) na via de
defesa antibacteriana ativada por PAMPs (flg22 de Pseudomonas syringae pv. tomato
DC3000). Quando induzido, o microRNA em questo atuaria inibindo a expresso de genes
relacionados sinalizao de auxinas na clula vegetal. Esta via parece funcionar de forma
antagnica via de defesa contra patgenos biotrficos, mediada pelo cido saliclico, e sua
inibio resultou na restrio do crescimento bacteriano. Da mesma forma, Zhang et al., em
2007 demonstraram que a MKK7 de Arabidopsis est envolvida na regulao negativa do
transporte polar de auxinas na clula. Alm disso, a superexpresso de MKK7 aumentou a
resistncia

aos

patgenos

Pseudomonas

syringae

pv.

maculicola

ES4326

Hyaloperonospora parasitica Noco2 e seu silenciamento resultou no comprometimento,

tanto da resistncia basal quanto da resistncia sistmica adquirida (SAR) desta espcie
(Zhang et al. 2007). Alm disso, o papel regulatrio dos prprios fatores de transcrio
WRKY tem sido desvelado atravs de estudos funcionais utilizando plantas
superexpressando, silenciadas ou mutantes para um ou mais genes WRKY. Em 2006, Xu
et al. demonstraram haver uma interao fsica (formao de homo- e heterocomplexos) e
funcional (redundante ou antagnica) entre AtWRKY18, AtWRKY40 e AtWRKY60 na
resposta de Arabidopsis a diferentes patgenos. No mesmo ano, Wang, Amornsiripanitch &
Dong demonstraram que 8 fatores de transcrio WRKY estavam entre os alvos diretos de
NPR1 que um co-fator transcricional da via mediada por SA no desenvolvimento da
SAR e que estes atuam tanto de forma positiva quanto negativa na regulao da SAR.

30

A existncia de um sistema eficiente de transformao fundamental para a

realizao de estudos funcionais em uma espcie. No caso da soja, cujos processos de
transformao gentica se mostram bem mais complexos, no existem muitos relatos de
estudos funcionais que se utilizem da transformao desta espcie. Em nosso laboratrio o
protocolo de transformao de soja via bombardeamento foi estabelecido por Droste,
Pasquali & Bodanese-Zanettini em 2002. Alm disto, foi desenvolvido um sistema de
transformao de soja que combina a tcnica de bombardeamento de partculas
transformao via A. tumefaciens (Droste et al., 2000). Em ambos os sistemas, embries
somticos secundrios so utilizados como tecido-alvo, sendo este bastante promissor como
ferramenta para a realizao de estudos funcionais nesta espcie.
At o presente momento, diversas pesquisas em sistemas heterlogos de
transformao (como o caso de Arabidopsis) vm gerando informaes relacionadas
funcionalidade de genes de soja. Dentre elas pode-se citar o trabalho realizado por Zhou et
al. em 2008, relacionando a funo de GmWRKY13, GmWRKY21 e GmWRKY54
tolerncia a estresses abiticos atravs de sua superexpresso em Arabidopsis; ou o trabalho
de Zhang et al., publicado no mesmo ano, que demonstrou que a superexpresso de
GmWRKY57 em tabaco conferiu tolerncia seca nas plantas transgnicas desta espcie.
Como exceo, pode-se citar o trabalho desenvolvido por Mazarei et al. em 2007, no qual
a participao de EREBPs (Ethylene-responsive Element-binding Proteins) nas vias de
regulao mediadas por ET e JA foi demonstrada a partir da expresso destes fatores de
transcrio em soja transformada geneticamente. At o momento, nenhum trabalho
envolvendo o estudo funcional de fatores de transcrio WRKY de soja atravs da
transformao gentica desta espcie foi publicado.

31

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O presente trabalho pretende caracterizar e determinar a funo de genes que
codificam protenas WRKY em soja, relacionados com os processos de resposta ao ataque
do fungo P. pachyrhizi, agente causador da ferrugem asitica, atravs de estratgias de
gentica reversa e estudos de expresso gnica.
2.2. Objetivos especficos
1.

Isolar as seqncias genmicas e codificantes dos genes selecionados;

2.

Determinar o padro de expresso desses genes em plantas de soja, atravs de

PCR em tempo real (RT-qPCR);

3.

Construir vetores de transformao vegetal contendo os genes clonados, tanto

para superexpresso quanto para o silenciamento (via RNAi) da expresso dos
mesmos;

4.

Obter linhagens transgnicas de soja com as construes descritas no item c;

5.

Caracterizar

em

nvel

molecular,

atravs

de

PCR

RT-qPCR,

as linhagens de soja estavelmente transformadas.

32

3. METODOLOGIA
3.1. Material
As cultivares IAS 5, BRSMG 68 (Vencedora), e MGBR 46 (Conquista) de soja
[Glycine max (L.) Merrill] foram utilizadas para a obteno de DNA, RNA e nos
experimentos de transformao gentica. Para a multiplicao dos vetores de clonagem e de
transformao de plantas foram utilizadas as cepas de Escherichia coli X-L1 Blue
(Stratagene) e Top10 (Invitrogen). A cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi
utilizada no co-cultivo com a soja no processo de transformao gentica vegetal.
3.2. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes de interesse
A seleo dos genes de estudo, envolvidos na resposta da soja infeco pelo fungo
P. pachyrhizi, ocorreu a partir de anlise de microarranjo realizada por van De Mortel et al.
em 2007, na qual genes codificando 46 fatores de transcrio da famlia WRKY
apresentaram nveis alterados de expresso aps a inoculao de folhas de soja com o
referido patgeno. A seleo foi realizada com base nos seguintes critrios:
1. Apresentar perfil de expresso diferencial ao longo do perodo analisado;
2. Apresentar perfil de expresso diferencial entre a cultivar suscetvel (Embrapa-48)
e a linhagem resistente (PI970230) utilizadas no estudo;
3. Apresentar perfil de expresso diferencial entre si.
Alm desses, a disponibilidade destas seqncias (ao menos parciais) no Genbank
tambm foi fator determinante para a seleo dos genes em estudo. Isto porque, no
momento de sua seleo (incio de 2008), os resultados obtidos no sequenciamento do
genoma da soja ainda estavam sendo montados (esta montagem s foi finalizada no incio
de 2009), de forma que as informaes obtidas no banco de dados onde este foi depositado
(Phytozome - http://www.phytozome.org/soybean) se mostravam ainda incompletas.

33

Atravs dos cdigos de acesso obtidos no microarranjo (Gene Chip Soybean

Genome Array, Affimetrix) foi realizada a anlise in silico dos genes selecionados. Suas
ESTs

seqncias

codificantes

parciais

foram

obtidas

no

NCBI

GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) e suas seqncias genmicas foram obtidas no

Phytozome. Estas ltimas eram verificadas medida que atualizaes no banco de dados
eram realizadas.
O isolamento das seqncias genmica e codificante dos genes selecionados foi
realizado atravs do desenho de oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficos para
cada gene, seguido de clonagem em vetor pGEM-TEasy (Promega) seguindo o protocolo
fornecido pelo fabricante. Os vetores obtidos da clonagem dos fragmentos isolados em
pGEM-TEasy foram inseridos em Escherichia coli XL-1Blue por choque trmico, como
descrito no item 3.4. A fim de obter grande quantidade de cada produto clonado, colnias
recombinantes foram cultivadas em meio LB lquido contendo 50 g.ml-1 de ampicilina e
submetidas extrao de plasmdeo (Wizard Plus SV Minipreps, Promega), de acordo
com o manual do fabricante. Os plasmdeos purificados foram enviados para
seqenciamento, para a confirmao da identidade gnica.
3.3. Obteno de vetores para a transformao de soja
Construes utilizando vetores de expresso em planta foram obtidas visando a
superexpresso e o silenciamento dos genes em estudo. Estas foram obtidas atravs da
tecnologia Gateway de clonagem (Invitrogen), baseada na utilizao de stios de
recombinao homloga que garantem a insero bem sucedida de fragmentos de DNA no
vetor de interesse, sem a necessidade de utilizao de enzimas de restrio. Primeiramente,
o fragmento de DNA isolado foi amplificado com um primer direto especfico, para que
houvesse a adio da seqncia de nucleotdeos CACC em sua extremidade 5,
possibilitando a ligao adequada do fragmento de interesse ao vetor de entrada (pENTR
Directional TOPO, Invitrogen), uma vez que este possui uma extremidade GTGG
proeminente. Esta ligao gerou uma construo que, a seguir, foi utilizada para efetivar a
transferncia do fragmento de interesse para o vetor de destino (neste caso os vetores de
34

expresso em plantas) atravs de uma recombinao LR utilizando a enzima LR

clonase II (Invitrogen) de acordo com as especificaes do fabricante. As construes
obtidas contendo os fragmentos de interesse, tanto no vetor de entrada quanto nos vetores
de destino, foram mantidas em E. coli Top 10 transformada por choque trmico, como
descrito no item 3.4.
3.3.1. Construo de superexpresso
O vetor de destino utilizado para a superexpresso foi o pH7WG2D,1 (Karimi, Inz
& Depicker, 2002 - http://www.psb.ugent.be/gateway/) (Figura 6). Este um vetor binrio
no qual o fragmento de interesse inserido entre o promotor e o terminador do 35S do
CaMV (o promotor P35S altamente ativo na maioria das clulas vegetais); genes de
resistncia estreptomicina e espectinomicina permitem a seleo em bactria e a
seleo em planta se deve presena do gene hpt (higromicina fosfotransferase) que
confere resistncia higromicina. Este plasmdeo possui ainda, um gene reprter que
codifica uma Green Fluorescent Protein (gfp), cuja expresso controlada pelo promotor
rolD.

35

Figura 6. Vetor de superexpresso pH7WG2D,1 (http://www.psb.ugent.be/gateway/). Neste

vetor, o gene de interesse inserido entre os stios attR1 e attR2 atravs de recombinao homloga,
sendo sua expresso em planta controlada pelo promotor 35S de CaMV (em amarelo). Os genes de
resistncia a antibiticos esto representados em rosa: estreptomicina (Sm) e espectinomicina (Sp)
possibilitam a seleo de bactrias recombinantes, enquanto a seleo em planta obtida pela resistncia
higromicina (Hyg). O gene reprter gfp (em verde) expresso sob o controle do promotor rolD (em
amarelo). RB e LB (em cinza) representam as bordas direita (right border) e esquerda (left border) do
T-DNA (Modificado de Karimi, Inz & Depicker, 2002).

3.3.2. Construo de silenciamento

Para o silenciamento por RNAi, o vetor de destino utilizado foi o
pH7GWIWG2(II),0 (Karimi, Inz & Depicker, 2002 - http://www.psb.ugent.be/gateway/)
(Figura 7). Neste vetor binrio, o fragmento de interesse inserido duas vezes, de forma
direta e inversa, havendo uma seqncia de ntron (de Arabidopsis) entre as duas inseres,
36

permitindo assim a formao de um hairpin RNA que resulte na ativao do

silenciamento ps-transcricional de seqncias homlogas. A seleo em bactria feita
devido presena de genes de resistncia estreptomicina e espectinomicina e a seleo
em planta obtida pela resistncia higromicina (hpt). Alm disso, o plasmdeo possui um
gene que confere resistncia ao cloranfenicol (CmR) no meio da seqncia de ntron,
permitindo a seleo apropriada deste.

Figura 7. Vetor de silenciamento pH7GWIWG2(II),0 (http://www.psb.ugent.be/gateway/).

Neste vetor, o fragmento de interesse inserido duas vezes, de forma direta e reversa, entre os stios attR1
e attR2 e expresso em planta sob controle do promotor 35S de CaMV (em amarelo). Para que ocorra a
formao apropriada do hairpin, uma seqncia de ntron (em azul) est situada entre os fragmentos
clonados. Os genes de resistncia a antibiticos esto representados em rosa: a seleo do ntron
realizada atravs da resistncia ao cloranfenicol (Cm) em bactria, estreptomicina (Sm) e espectinomicina
(Sp) so utilizadas na seleo de colnias recombinantes e a seleo em planta obtida pela resistncia

37

higromicina (Hyg). RB e LB (em cinza) representam as bordas direita (right border) e esquerda (left
border) do T-DNA (Modificado de Karimi, Inz & Depicker, 2002).

3.4. Transformao de Escherichia coli

Clulas termo-competentes de E.coli foram preparadas conforme protocolo descrito
a seguir: colnias isoladas foram cultivadas em 3 ml de meio LB lquido, na presena do
antibitico adequado para a seleo de cada cepa 10 g.ml-1 de tetraciclina para X-L1
Blue e 20 g.ml

-1

de estreptomicina para Top10 sob agitao constante de 225 rpm, a

37C por 16 h. Uma pr-cultura foi feita (500 l em 20 ml de meio lquido com
antibitico), por 2 h e 30 min a 37C, sob agitao (225 rpm); sendo esta transferida para
tubos de centrfuga estreis e centrifugada (5.000 rpm por 10 min). Aps o descarte do
sobrenadante, adicionou-se ao precipitado 5 ml de CaCl2 0,1 M, seguido de
homogeneizao (vrtex). As clulas foram mantidas no gelo por 20 min, sendo ento
repetidas a centrifugao (5.000 rpm por 10 min) e o descarte do sobrenadante. Em
seguida, adicionou-se mais uma vez CaCl2 0,1 M (agora 0,5 ml) seguido da ressuspenso
do precipitado no gelo. Este foi mantido no gelo at o momento da transformao, realizada
por choque trmico, como descrito a seguir: a 100 l do precipitado bacteriano foram
adicionados 300 g do produto de cada ligao; a mistura foi mantida no gelo por 30 min,
sendo ento incubada a 42C por 2 min e levada mais uma vez ao gelo, onde foi mantida
por 2 min. A seguir, adicionou-se 400 l de meio LB lquido ao produto da transformao,
sendo este incubado a 37C por 40 min. Aps esse perodo, as clulas bacterianas foram
cultivadas em meio LB slido acrescido dos antibiticos de seleo adequados para cada
caso: para o vetor

pGEM-TEasy, adicionou-se

ao meio de cultivo 50 g.ml-1 de

ampicilina alm de 24 l de X-Gal (40 mg.ml-1) e 10 l de IPTG (1M)1. Colnias de E.

O Vetor pGEM-TEasy possui mecanismo de seleo de recombinantes atravs do operon lac: a

seqncia codificante do gene lacZ est inserida no stio mltiplo de clonagem, resultando na produo da
enzima -galactosidase (colnias azuis). A insero bem sucedida do fragmento de interesse nesta regio
resulta na interrupo do gene lacZ; neste caso a enzima no produzida e as colnias bacterianas
recombinantes so brancas.

38

coli Top10 recombinantes foram selecionadas pela adio de 50 g.ml-1 de canamicina para
o vetor de entrada (pENTR Directional TOPO); 20 g.ml -1 de estreptomicina e 75 g.ml 1

de espectinomicina para o vetor de superexpresso (pH7WG2D,1) e 20 g.ml

-1

de

estreptomicina, 75 g.ml -1 de espectinomicina e 100 g.ml -1 de cloranfenicol para o vetor

de silenciamento [pH7GWIWG2(II),0].

3.5. Transformao de Agrobacterium tumefaciens

Clulas eletro-competentes de A. tumefaciens LBA4404 foram preparadas conforme
o protocolo descrito a seguir: colnias isoladas foram cultivadas em 5 ml de meio LB
lquido com rifampicina (50 g.ml -1) sob agitao constante de 225 rpm, a 28C por 48 h.
Pr-culturas desta foram feitas (500 l em 100 ml de meio lquido com rifampicina), com
tempos diferentes. Aps 16h, a densidade ptica (D.O.) destas culturas foi medida em
espectrofotmetro, sendo utilizada a cultura que apresentasse D.O.600nm 0,5. A cultura
escolhida foi ento colocada em frascos GSA (30 ml de cultura por frasco de 40 ml) e
centrifugada a 5.000 rpm por 15 min a 4C. Descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi
ressuspenso em 150 ml de gua milli-Q a 4C. Este procedimento foi repetido trs vezes,
sendo o precipitado ressuspenso sucessivamente em 100 ml de gua milli-Q a 4C, 20 ml
de glicerol 10% estril e 2 ml de glicerol 10% estril. As clulas foram divididas em
alquotas de 100 l e armazenadas em nitrognio lquido at o momento da transformao.
Esta foi realizada por eletroporao, onde aproximadamente 200 g do DNA recombinado
foram homogeneizados a 100 l de bactria competente, sendo a mistura submetida a uma
diferena de potencial de 500 volts em eletroporador (BioRad Gene Pulser II).
Imediatamente aps o choque, foram adicionados 400 l de LB lquido s clulas
eletroporadas, sendo a suspenso cultivada por 1 h a 28C sem agitao, seguida de 2 h a
28C sob agitao constante de 225 rpm. A suspenso foi ento plaqueada em meio slido
contendo rifampicina (50 g.ml

-1

) estreptomicina (20 g.ml

-1

) e espectinomicina (75

g.ml -1). O processo foi repetido para cada construo obtida.

39

3.6. Extrao de DNA

A extrao de DNA genmico de folhas de soja foi realizada utilizando-se o tampo
CTAB, conforme protocolo descrito por Doyle & Doyle em 1987, com algumas
modificaes. Aps desidratao com slica-gel (por 48 h, no mnimo), colocou-se
aproximadamente 100 mg de cada amostra foliar em um tubo de micro-centrfuga, sendo
este mergulhado diretamente no nitrognio lquido e a amostra macerada com pistilo. A
separao dos cidos nuclicos de protenas foi realizada em duas etapas: primeiramente
adicionando-se fenol / clorofrmio (1:1) e em seguida clorofrmio / lcool isoamlico
(24:1). Na etapa de precipitao com isopropanol, adicionou-se meio volume de acetato de
amnio 7,5 M para a purificao do DNA precipitado. O DNA extrado foi solubilizado em
50 l de gua milli-Q estril e as amostras foram quantificadas atravs do sistema Qubit
(Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, Invitrogen).
3.7. Extrao de RNA total
O material vegetal foi coletado e imediatamente congelado em nitrognio lquido,
sendo armazenado a -80C at o momento da extrao de RNA total. Esta foi realizada com
o reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. Aps a extrao, a
fim de eliminar contaminantes de DNA genmico, todas as amostras foram tratadas com
DNAse (Promega), sendo ento quantificadas atravs do sistema Qubit (Quant-iT
RNA Assay Kit, Invitrogen).
3.8. Sntese de cDNA
A sntese de cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit de
transcrio reversa M-MLV (Promega), de acordo com as instrues do fabricante. Para
cada reao, utilizou-se 10 l de amostra de RNA tratado com DNAse. Aps a sntese, o
volume final obtido de cada amostra (50 l) foi diludo dez vezes (soluo estoque) em
gua milli-Q estril. Para uso nas reaes de RT-qPCR, a soluo estoque foi novamente
diluda 10 vezes (diluio de 1:100).
40

3.9. Reao em cadeia da polimerase (PCR)

As reaes de amplificao dos DNAs genmicos, plasmidiais e cDNAs foram
geralmente realizadas utilizando-se: 1 l de MgCl2 50 mM, 2,5 l de tampo 10x, 0,5 l de
dNTPS 10 mM, 1 l de cada primer (direto e reverso) 10 mM, 0,25 l de Taq DNA
Polimerase (5 U/ l), 17,75 l de gua milli-Q estril e 1 l de DNA. As condies
utilizadas para a polimerizao foram: desnaturao inicial a 94C por 5 min, 35 ciclos de
desnaturao a 94C por 1 minuto, anelamento a 59C por 1 minuto, extenso a 72C por 1
minuto e extenso final a 72C por 5 min. As amplificaes foram submetidas
eletroforese e os fragmentos foram visualizados em gel de agarose (de 0,8 a 1,5%) corados
com GelRed (Biotium, Inc) ou brometo de etdio. Uma lista com os primers utilizados
nas reaes de PCR encontra-se na Tabela 1.

41

Tabela 1. Lista dos primers utilizados nas reaes de PCR

3.10.

PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR)

As reaes de RT-qPCR foram realizadas em aparelho StepOne Plus Real Time

PCR System (Applied Biosystems), conforme as seguintes condies: uma etapa de
42

desnaturao inicial de 5 min a 94oC, seguida por 45 ciclos de 10 s a 94oC, 15 s a 60oC e 15

s a 72oC. Aps a amplificao, as amostras foram mantidas por 2 min a 40oC para
reanelamento e, ento, aquecidas de 55 at 99oC com uma taxa de incremento de 0.1oC/s
para aquisio de dados e obteno da curva de desnaturao. As reaes foram feitas em
um volume final de 20 l, sendo os mesmos compostos de 2 l de tampo PCR 10x
(Invitrogen), 1,2 l de MgCl2 50 mM, 0,4 l de dNTPs 5 mM, 0,4 l de cada par de
primers 5 M, 4,95 l de gua ultra pura, 1,0 l de SYBR Green (1:100.000, Molecular
Probes Inc.) e 0,05 l de Platinum Taq DNA polimerase (5 U/l, Invitrogen). A este mix,
adicionou-se: 10 l de cDNA (diluio 1:100) nas anlises de expresso gnica; ou 10 l de
DNA genmico em diluies seriadas (1:100, 1:1.000 e 1: 10.000), para a estimativa do
nmero de cpias do transgene. A temperatura de anelamento de todos os primers foi
ajustada para 60C. Uma lista com os primers utilizados nas reaes de RT-qPCR
encontra-se na Tabela 2.
Tabela 2. Lista dos primers utilizados nas reaes de RT-qPCR

Nas anlises de expresso gnica, os resultados foram expressos atravs de uma

quantificao relativa a dois genes utilizados como controles endgenos da reao F-box
43

protein family e metalloprotease (Libault et al. 2008) atravs da metodologia 2-Ct

descrita por Livak & Schmittgen em 2001.
A estimativa do nmero de cpias do transgene por RT-qPCR foi realizada atravs
da Quantificao relativa pela anlise da curva padro (Shou et al., 2004). Nesta tcnica,
a diluio seriada das amostras possibilita a obteno de curvas-padro relativas, onde os
valores de Ct entre o gene alvo e um controle endgeno so comparados. Este controle
endgeno um gene cujo nmero de cpias no genoma em estudo pr-estabelecido,
sendo utilizado para a normalizao da reao os valores obtidos nas diluies para o
gene-alvo so divididos pelos valores obtidos para o controle endgeno (quantidade
relativa ao gene endgeno,1). Alm disso, necessria a utilizao de um calibrador,
ou seja, uma planta onde o nmero de cpias do gene-alvo conhecido. Os valores
normalizados obtidos nas amostras analisadas so divididos pelos valores normalizados
obtidos nas amostras do calibrador (nmero de cpias, 2) (Bubner & Baldwin, 2004;
Shou et al., 2004). O controle endgeno utilizado foi o gene da lectina Le1 (Schmidt et al.
2001) e plantas de soja WT foram utilizadas como calibradores.
3.11. Anlises da expresso gnica ao longo do desenvolvimento e em resposta a
estresses
3.11.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento
Plantas de soja da cultivar MGBR 46 (Conquista) foram semeadas em casa de
vegetao e as amostras coletadas como especificado na Tabela 3, sendo imediatamente
congeladas em nitrognio lquido e armazenadas a -80C at o momento da extrao de
RNA. De um grupo de plantas jovens, foram coletadas amostras de raiz e folha, 14 dias
aps a semeadura destas. De outro grupo, trs meses aps a semeadura foram coletadas
amostras de flor e de folha. No ms seguinte foram coletadas deste mesmo grupo de
plantas maduras amostras de caule, alm das amostras de vagem e semente. Para cada
tipo de amostra analisada, foram utilizadas quatro replicatas biolgicas (quatro vasos),
sendo cada uma destas composta por um pool de quatro plantas diferentes.
44

Tabela 3. rgos utilizados nas anlises de expresso gnica e as respectivas fases do

desenvolvimento nas quais estes foram coletados.

3.11.2. Infeco por P. pachyrhizi

O experimento de infeco por P. pachyrhizi foi realizado em abril de 2009, na
sede da Embrapa Soja (Londrina, PR). Plantas de soja da cultivar Embrapa 48
(gentipo suscetvel) e da linhagem PI 561356 (gentipo resistente) foram semeadas em
casa de vegetao seis vasos com cada gentipo, trs plantas por vaso. Trs semanas
aps o incio do cultivo, realizou-se a inoculao com o patgeno: uredinisporos foram
coletados e ressuspensos em gua contendo gotas de Tween-20, para uma concentrao
final de 2,6 x 104 esporos. ml-1. A soluo foi borrifada nas folhas de metade das plantas
de cada gentipo, sendo a outra metade utilizada como controle (mock-inoculated). A
inoculao ocorreu aps as 18h ( noite a umidade maior, facilitando o processo de
45

infeco pelo fungo) e as plantas inoculadas permaneceram por doze horas cobertas por
plstico. Triflios foram coletados 1, 12, 24, 48, 96 e 192 hpi, sendo imediatamente
congelados em nitrognio lquido e armazenados a -80C at o momento da extrao de
RNA.
3.11.3. Estresse salino
Aps duas semanas de cultivo em cmara de crescimento (em copos plsticos
contendo vermiculita), plantas de soja foram tratadas com soluo salina (150 mM de
NaCl), duas horas aps o incio do fotoperodo. Amostras de quatro copos, com duas
plantas cada, foram utilizadas como controle (mock) e a mesma quantidade foi tratada.
Amostras de razes e folhas foram coletadas 6 h aps o tratamento, sendo imediatamente
submetidas extrao de RNA.
3.12.

Anlises estatsticas

Os resultados obtidos nos experimentos de quantificao da expresso gnica (item

3.11) foram avaliados quanto a sua significncia estatstica atravs das seguintes anlises:
one-way ANOVA seguida do teste de Tukey HSD (p < 0,05) (SAS/STAT Software v.8)
nas anlises de expresso em diversos rgos e fases do desenvolvimento; e teste - T de
Student (p < 0,05) (Microsoft Office Excel 2007) nas anlises de expresso na infeco
por P. pachyrhizi e em condies de estresse salino.
3.13.

Transformao gentica de soja

Uma lista com os meios de cultivo vegetal utilizados nas etapas descritas a seguir
apresentada na Tabela 4. Os conjuntos embriognicos submetidos a cada experimento de
transformao realizado so descritos na Tabela 5.

46

3.13.1. Induo de embriognese somtica e obteno de tecido embriognico

proliferativo
Vagens imaturas de soja foram colhidas de plantas cultivadas no campo e
esterilizadas pela imerso em etanol 70% (1 minuto), seguida da imerso em soluo de
hipoclorito de sdio 4% contendo gotas de Tween-20 (15 min) e de trs lavagens
subseqentes, com gua destilada autoclavada. Para a induo de embriognese somtica,
sementes (3-5mm) foram excisadas das vagens esterilizadas. As metades dos cotildones
removidos foram utilizadas como explantes e colocadas em meio de induo D40. Aps 30
dias, os explantes embriognicos foram transferidos para meio de proliferao semi-slido
D20. Aps 14 dias, os conjuntos de embries secundrios foram removidos dos cotildones
e transferidos para meio fresco. Sub-culturas destes para meio D20 fresco foram realizadas
a cada 14 dias. A cultura in vitro foi mantida em cmara de crescimento a 26+1C de
temperatura, com fotoperodo de 16 h e intensidade luminosa de 20 mol m-2s-1.
3.13.2. Transformao por biobalstica (bombardeamento de partculas)
Este processo de transformao foi realizado atravs de um acelerador de partculas
de baixa presso (PIG Finer et al., 1992), segundo protocolo descrito por Finer &
McMullen em 1991. Previamente ao bombardeio, placas de Petri com conjuntos de
embries globulares (15 conjuntos por placa) foram abertas em capela de fluxo laminar
(por 15 min) para que estes fossem parcialmente desidratados, reduzindo assim a presso de
turgor do material vegetal (Vain et al. 1993). s partculas de tungstnio diludas em gua
estril (100 mg.ml-1), adicionou-se 2 l do DNA-alvo (250 g.l-1). A esta mistura, foram
adicionados 25 l de CaCl2 2,5 M e 10 l de espermidina 0,1 M. Aps homogeneizao e
incubao no gelo (5 min), 45 l do sobrenadante foi descartado, sendo 2 l do precipitado
utilizado em cada disparo.

47

3.13.3. Transformao

via

sistema

integrado

bombardeamento

Agrobacterium
Linhagens de A. tumefaciens recombinante foram preparadas de acordo com
procedimento descrito por Droste et al., em 2000: colnias isoladas foram cultivadas por 48
h em meio LB lquido contendo rifampicina (50 mg.l-1), canamicina (50 mg.l-1) e
acetoseringona (100 M), a 28C sob agitao continua. Aps centrifugao, as clulas
foram ressuspensas em meio lquido D10 com 100 M de acetoseringona (D.O.

600nm

final

de 0,3).
A seguir, realizou-se o protocolo de bombardeamento, como descrito no item
3.13.2. Neste caso, as partculas foram preparadas livres de DNA; servindo apenas para
causar micro-ferimentos nas clulas vegetais bombardeadas, facilitando a subseqente
infeco por A. tumefaciens. Aps serem bombardeados, os conjuntos de embries foram
incubados com a suspenso bacteriana durante 20 min, sendo a seguir, secos em papel filtro
estril (para a retirada do excesso de bactria) e co-cultivados por 48 h em meio D20 com
acetoseringona (100 M). Ao co-cultivo sucedeu-se a lavagem dos embries em gua
destilada autoclavada, seguida de secagem em papel filtro estril e transferncia para meio
D20 contendo 250 mg.l-1 de cefotaxima e 250 mg.l-1 de vancomicina (Wiebke et al., 2006).
Estes antibiticos foram adicionados aos meios de cultivo subseqentes, inclusive durante o
perodo de seleo por higromicina, at que o tratamento completasse 49 dias, garantindo a
eliminao total da bactria utilizada na transformao.
3.13.4. Seleo de transformantes, regenerao e aclimatao das plantas
obtidas
Aps serem submetidos a qualquer um dos processos de transformao gentica
referidos acima, os conjuntos embriognicos de soja foram submetidos seleo de
transformantes atravs do cultivo vegetal em doses crescentes de higromicina. Esta
seleo teve incio 10 dias aps a realizao de cada experimento de transformao,
quando se adicionou 12,5 mg.l-1 de higromicina ao meio de proliferao de embries
48

(D20). Aps 21 dias, a dose de higromicina foi aumentada para 25 mg.l-1. Aps trs
meses de seleo, ao total, conjuntos de embries resistentes higromicina (que
permaneceram verdes) foram destacados dos embries no resistentes e proliferados em
meio D20 por trs meses, para que os eventos de transformao obtidos fossem
multiplicados. A seguir, os conjuntos proliferados foram transferidos para meio MSM6
(acrescido de 1% de carvo ativado) para iniciarem seu processo de histodiferenciao e
maturao, onde permaneceram por 30 dias. Por mais 30 dias, os embries
permaneceram em meio MSM6 (sem carvo ativado) para que os processos de
histodiferenciao e maturao fossem completados.

Embries maduros obtidos

passaram por um processo de dessecao (Buchheim et al. 1989), permanecendo em

placas sem meio de cultura por 6 h; sendo logo em seguida transferidos para meio MSO
para a converso em plntulas (em placas de Petri) e subseqente regenerao (em
frascos). Plntulas regeneradas e enraizadas foram aclimatadas; primeiramente em copos
plsticos contendo vermiculita e cobertos com filme plstico, sendo expostas de forma
gradual s condies ambientais; e aps 10 dias (no mnimo), transferidas para vasos
com solo orgnico, sendo mantidas em cmara de crescimento com temperatura mdia
de 27+1C, fotoperodo de 16 h e intensidade luminosa de aproximadamente 60 mol m2 -1

s .

49

Tabela 4. Composio dos meios de cultivo vegetal utilizados na cultura de embries somticos e na
transformao gentica de soja.

Bailey, Boerma & Parrott, 1993

Wright et al., 1991

Droste, Pasquali & Bodanese-Zanettini, 2000

Finer & McMullen, 1991

* Murashige & Skoog, 1962
** Gamborg, Miller & Ojima, 1968

50

Tabela 5. Conjuntos embriognicos submetidos aos experimentos de transformao realizados.

3.13.5. Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da

expresso do gene reprter
Como previamente mencionado, o gene gfp est presente entre as bordas do T-DNA
do vetor de superexpresso utilizado (pH7WG2D,1). Este utilizado como gene reprter,
uma vez que o monitoramento da integrao do T-DNA ao genoma vegetal pode ser feito
atravs da visualizao da expresso de gfp sob luz azul. Esta foi realizada em microscpio
de fluorescncia Olympus (filtro BP; comprimentos de onde de excitao e emisso de
488 e 505-530 m, respectivamente), com cmera fotogrfica acoplada. As imagens foram
obtidas atravs do software QCapture Pro 6 (QImaging).

51

4. RESULTADOS
4.1. Seleo, anlise in silico e isolamento dos genes para estudo
Em 2007, van De Mortel et al. detectaram, atravs de anlise de microarranjo, a
expresso diferencial de 46 genes que codificam protenas WRKY em resposta infeco
por ASR. Alguns destes foram pr-selecionados para estudo, de acordo com seu perfil de
expresso. Entretanto, em alguns casos a etiqueta obtida atravs do cdigo do
microarranjo era insuficiente para a subseqente identificao in silico do gene, de forma
que apenas dois genes, os quais possuam uma poro considervel de sua regio
codificante disponvel no GenBank foram escolhidos para o presente estudo. Atravs de
seus

respectivos

cdigos do

chip

de

microarranjo

[GmaAffx.51816.1.S1_at

Gma.1256.1.S1_at, Gene Chip Soybean Genome Array (Affimetrix)], as seqncias das

ESTs referentes a estes genes (BE804769 e BI967912) foram obtidas no GenBank. A busca
por sua identidade gnica no GenBank (ferramenta blastn), resultou em duas seqncias
parciais codificantes (EU019582.1 e EU019564.1) para ambas as ESTs, respectivamente
anotadas como GmWRKY46 e GmWRKY20. Curiosamente, quando estes dois fragmentos
so alinhados, eles se complementam de forma parcial, aparentemente representando as
extremidades amino- e carboxi-terminal da mesma protena (Figura 8) e sua seqncia
traduzida possui todas as caractersticas estruturais comuns aos membros da famlia dos
fatores de transcrio WRKY. Alm disso, ao se realizar uma busca por suas respectivas
seqncias genmicas no Phytozome, ambas as ESTs apresentaram alta similaridade com
duas regies distintas do genoma (Figura 9): scaffold_78 e scaffold_92, que foram
identificadas respectivamente como Glyma05g36970 e Glyma08g02580, aps o trmino da
organizao dos dados do genoma. Estes resultados indicavam que, apesar do resultado
obtido no GenBank, as ESTs e seus respectivos perfis de expresso se referem a dois genes
distintos, com alto grau de identidade.

52

Figura 8. Alinhamento das seqncias traduzidas das ESTs obtidas no GenBank, anotadas
respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Asteriscos (*) indicam resduos idnticos, dois
pontos (:) indicam resduos conservados e pontos (.) indicam resduos semi-conservados. O programa
ClustalW v1.81 (http://align.genome.jp/) foi utilizado para o alinhamento.

53

Figura 9. Resultado das buscas realizadas no Phytozome (www.phytozome.org/soybean). As

seqncias genmicas correspondentes s ESTs obtidas no GenBank para GmWRKY20 (A) e GmWRKY46
(B) foram buscadas no Phytozome (ferramenta blast genome). Nota-se que para ambas as ESTs
utilizadas, as mesmas duas regies do genoma (Gm05 e Gm08) apresentaram correspondncia, sendo que
cada uma destas regies apresentou maior ou menor grau de identidade com uma das duas seqncias.

Na tentativa de resolver esta contradio e confirmar a presena de dois genes

codificando protenas muito similares, primers foram desenhados visando o isolamento
tanto da seqncia genmica quanto da codificante dos genes em questo. Os fragmentos
obtidos foram clonados em vetor pGEM-TEasy (Promega) e enviados para
seqenciamento (dados no mostrados). O alinhamento das seqncias completas de
54

aminocidos de GmWRKY20 e GmWRKY46, obtidas a partir de suas seqncias de

nucleotdeos codificantes, pode ser visualizado na Figura 10. Nela esto ressaltados os
resduos de aminocidos conservados presentes em cada gene. Sua anlise possibilitou a
classificao de ambos os genes no grupo III da superfamlia de fatores de transcrio
WRKY (Eulgem et al., 2000). A Figura 11 uma representao grfica da estrutura de
xons e ntros de ambos os genes, ressaltando a presena uma pequena insero/deleo de
12 nucleotdeos situada na primeira juno xon/ntron, sendo esta a maior diferena
estrutural apresentada entre as duas seqncias. Um resumo com os dados obtidos sobre os
genes em estudo apresentado na Tabela 6.

Figura 10. Alinhamento dos aminocidos deduzidos a partir seqncias codificantes completas
clonadas de GmWRKY20 e GmWRKY46 e identificao dos resduos conservados entre WRKYs
grupo III. Asteriscos (*) indicam resduos idnticos, dois pontos (:) indicam resduos conservados e
pontos (.) indicam resduos semi-conservados. O programa ClustalW v1.81 (http://align.genome.jp/) foi
utilizado para o alinhamento. A identificao dos resduos de aminocidos conservados entre os fatores de

55

transcrio WRKY (em rosa) e do padro C2-HC nos provveis stios de ligao a zinco (em verde),
permitiu a classificao desses genes no grupo III da superfamlia (de acordo com Eulgem et al., 2000).

Figura 11. Representao grfica comparativa da estrutura de xons e ntrons de GmWRKY20

e GmWRKY46. Os xons esto representados por blocos coloridos e os ntrons por linhas cinza. A
diferena de tonalidade entre o primeiro xon de cada gene (verde claro / verde escuro) representa a
diferena de tamanho apresentada por eles: esta causada por uma insero / deleo de 12 nucleotdeos
(linhas pontilhadas verticais) ao final do primeiro xon, resultando na principal diferena estrutural
existente entre os genes em estudo. Pb, pares de base.
Tabela 6. Nomenclatura, caractersticas estruturais, classificao, localizao no genoma e
cdigos de acesso dos genes selecionados para estudo.

de acordo com Eulgem et al., 2000.

56

4.2. Anlises da expresso gnica

4.2.1. Diferentes rgos e fases do desenvolvimento
O nvel de expresso de transcritos de GmWRKY20 e GmWRKY46 foi medido em
diferentes rgos e fases do desenvolvimento de plantas de soja (Figura 12). Nas condies
em que o experimento foi realizado, a expresso de ambos os genes no foi detectada em
nenhuma das amostras de flor nem de semente utilizadas. Na maioria dos rgos
analisados, os nveis de expresso entre GmWRKY20 e GmWRKY46 no diferiram
estatisticamente, exceto na vagem. A expresso de GmWRKY20 foi significativamente
maior no caule de plantas maduras, sendo a folha dessas plantas o rgo que apresentou
menor expresso. De forma semelhante, o maior nvel de expresso de GmWRKY46 foi
encontrado no caule de plantas maduras. Entretanto, o nvel de expresso apresentado em
razes de plantas jovens tambm foi significativamente maior, se comparado aos outros
rgos analisados.

57

Figura 12. Expresso relativa de GmWRKY20 e GmWRKY46 em diferentes rgos. No

grfico apresentada uma anlise comparativa entre os nveis de expresso obtidos nos diversos rgos
utilizados. Os valores foram normalizados em relao ao nvel de expresso obtido para GmWRKY46 no
caule (atribudo arbitrariamente como 1). Letras minsculas diferentes indicam diferena significativa na
expresso de GmWRKY20 e letras maisculas diferentes indicam diferena significativa na expresso de
GmWRKY46 (ANOVA / Tukey, p < 0,05). Com exceo da vagem, a comparao dos nveis de expresso
entre os genes para cada rgo analisado no apresentou diferena significativa (teste-T de Student, p <
0,05). Os genes F-box protein e metalloprotease foram utilizados como controles endgenos da
reao.

58

4.2.2. Infeco por P. pachyrhizi

O perfil de expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46 obtido aps a inoculao de
plantas de soja com P. pachyrhizi mostrado na Figura 13. Os resultados obtidos indicam
que estes genes so modulados em resposta inoculao com o patgeno (comparando-se
com a situao controle) e que a modulao da expresso dos mesmos ocorre de forma
diferencial entre o gentipo resistente (PI561356) e o gentipo suscetvel (Embrapa-48), ao
longo do perodo analisado.

59

Figura 13. Expresso relativa de GmWRKY20 (A) e GmWRKY46 (B) em resposta infeco por
P. pachyrhizi. Nos grficos so apresentados os nveis de expresso obtidos em folhas de plantas
inoculadas com o patgeno, quando comparados a plantas controle (mock-inoculated). Diferenas
significativas (teste-T de Student, p < 0,05) so representadas por asteriscos (*). Entre as plantas
inoculadas, ao longo do perodo analisado, pode-se observar uma modulao diferencial da expresso
destes genes nas plantas portando o gentipo resistente (PI 561356), se comparadas s portadoras do

60

gentipo suscetvel (Embrapa-48). Os genes F-box protein e metalloprotease foram utilizados como
controles endgenos da reao.

4.2.3. Estresse salino

Os resultados obtidos nas anlises de expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46 em
resposta ao estresse salino (Figura 14) sugerem que estes genes possam ser induzidos na
presena de 150 mM de NaCl (comparando-se com a situao controle), e que esta induo
ocorre tanto em folhas quanto em razes. Contudo, devido alta variao nos nveis de
expresso apresentada pelas amostras, os resultados obtidos no foram estatisticamente
significantes.

61

Figura 14. Expresso relativa de GmWRKY20 (A) e GmWRKY46 (B) em resposta ao estresse
salino. Nos grficos so apresentados os nveis de expresso obtidos em razes e folhas de soja, 6 h aps
serem submetidas ao estresse salino (150 mM de NaCl), comparados s plantas controle (mock).
Devido ao grande desvio apresentado pelas amostras, a induo visualizada nos grficos no
estatisticamente significativa (teste-T de Student, p > 0,05).

62

4.3. Obteno de vetores para a transformao de soja

Tendo em vista a superexpresso e o silenciamento de plantas de soja, os
fragmentos de DNA previamente isolados e clonados no vetor pGEM-TEasy (Promega)
foram transferidos para vetores de expresso em planta.
4.3.1. Construo do vetor binrio de superexpresso
Devido alta similaridade entre as seqncias de aminocidos de ambos os genes
em estudo, apenas a seqncia codificante completa de GmWRKY20, contendo 1.080 pb,
foi utilizada para a superexpresso. Atravs da tecnologia Gateway (Invitrogen), esta foi
primeiramente clonada no vetor de entrada pENTR Directional TOPO, sendo a seguir
recombinada no vetor de destino pH7WG2D,1 (Figura 15). O produto da recombinao foi
inserido em E. coli Top 10 por choque trmico e selecionado pela adio de estreptomicina
e espectinomicina ao meio de cultura bacteriano. Uma nica colnia resistente seleo foi
obtida. Esta foi submetida PCR, sendo a transformao confirmada pela amplificao do
fragmento referente a GmWRKY20 (1.080 pb) e do fragmento referente ao gene hpt (~400
pb) (Figura 16).

Figura 15. Representao grfica da construo para a superexpresso de GmWRKY20. Na

figura est representada apenas a regio do T-DNA do vetor pH7WG2D,1, aps a recombinao com a
seqncia codificante completa de GmWRKY20. As setas horizontais (em cinza) indicam os primers (F,
forward e R, reverse) utilizados para a confirmao da recombinao e para as subseqentes anlises
moleculares em A. tumefaciens e nas plantas transformadas. RB, borda direita do T-DNA (right border);
LB, borda esquerda do T-DNA (left border); EgfpER, protena GFP contendo sinal de direcionamento
do retculo endoplasmtico (enhanced green fluorescent protein linked to endoplasmatic reticulum
targeting signal); hpt, higromicina fosfotransferase.

63

1.080 pb

~ 400 pb

Figura 16. Confirmao da transformao de E. coli com a construo pH7WG2D,1 +

GmWRKY20. Uma colnia isolada de E. coli, resistente seleo pelos antibiticos estreptomicina e
espectinomicina, foi submetidas PCR e os produtos desta reao foram analisados em gel de agarose
0,8%, aps eletroforese. M, marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder (Promega); 1, amplificao
com os primers GmWRKY20 (1.080 pb); 2, amplificao com os primers Hpt1 (~400pb).

4.3.2. Construo dos vetores de silenciamento

Dois fragmentos foram utilizados para as construes de silenciamento por RNAi:
um maior, possuindo 490 pb e outro menor, com 249 pb. Ambos possuem seqncias
homlogas exclusivas a GmWRKY20 e GmWRKY46 (Anexo 1), de forma a impedir o
silenciamento de outros membros da famlia. Entretanto, o silenciamento de cada um dos
genes em separado no deve ocorrer, devido alta similaridade entre suas regies
codificantes. Estes foram primeiramente clonados no vetor de entrada pENTR Directional
TOPO, para em seguida serem recombinados no vetor de destino pH7GWIWG2(II),0
(Figura 17). Os produtos destas recombinaes tambm foram inseridos em E. coli Top 10
por choque trmico e selecionados pela adio de estreptomicina, espectinomicina e
cloranfenicol ao meio de cultura bacteriano. Colnias resistentes seleo foram
submetidas PCR e as transformaes foram confirmadas pela amplificao dos
fragmentos RNAi1 (490 pb), hpt (~400 pb) (Figura 18) e RNAi2 (dados no mostrados). A
insero dos fragmentos de forma correta no vetor de destino foi confirmada de duas
maneiras:
64

1. Pela utilizao combinada (ver Figura 17) dos seguintes primers na reao de
PCR: RNAi1(2) F x ntron F, RNAi1(2) F x ntron R, ocorrendo amplificao
dessas bandas; alm de RNAi1(2) R x ntron F e RNAi1(2) R x ntron R, as quais
no geraram amplificao, como esperado (resultados no mostrados);
2. Alm disso, realizou-se extrao de plasmdeos (Miniprep) seguida pela
clivagem com enzimas de restrio (HindIII e XbaI) dos vetores obtidos (Figura
19): como esperado, na clivagem do plasmdeo selvagem [pH7GWIWG2(II),0]
foram liberadas bandas de tamanho aproximado de 9.000 pb, 3.400 pb e 1.900
pb. J a clivagem do plasmdeo recombinante [pH7GWIWG2(II),0 + RNAi1]
gerou fragmentos de aproximadamente 9.000 pb, 2.400 pb e 900 pb, como
esperado. Uma colnia falso-positiva (resistente seleo pelos antibiticos,
mas que teve resultado negativo na PCR) tambm foi utilizada, para que seu
padro de clivagem fosse comparado.

Figura 17. Representao grfica da construo para o silenciamento de GmWRKY20 e

GmWRKY46. Na figura est representada apenas a regio do T-DNA do vetor pH7GWIWG2(II),0. Dois
fragmentos de regies comuns a GmWRKY20 e GmWRKY46 foram clonados, gerando duas construes
(RNAi1 e RNAi2), as quais so teis para produzir o silenciamento simultneo de ambos os genes. Os
locais de insero de ambos os fragmentos (de forma direta e inversa) esto representados em rosa. As
setas horizontais (em cinza) indicam os primers utilizados para a confirmao da recombinao e das
transformaes subseqentes (de A. tumefaciens e tambm de planta). As setas verticais (em azul) indicam
os stios de restrio presentes na seqncia e as respectivas enzimas utilizadas para as clivagens descritas
no texto. RB, borda direita do T-DNA (right border); LB, borda esquerda do T-DNA (left border);
CmR, gene de resistncia ao cloranfenicol; hpt, higromicina fosfotransferase.

65

490 pb

~ 400 pb

Figura 18. Confirmao da transformao de E. coli com a construo pH7GWIWG2(II),0 +

RNAi1. Colnias isoladas de E. coli, resistentes seleo pelos antibiticos estreptomicina,
espectinomicina e cloranfenicol, foram submetidas PCR e os produtos da reao foram analisados em
gel de agarose 1%, aps eletroforese. M, marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder (Promega); 1-3,
amplificao com os primers Hpt1 (~400 pb), onde 1 o controle positivo (amplificao de DNA
plasmidial), 2 e 3 so colnias (positiva e falso-positiva, respectivamente); 4-6, amplificao com os
primers RNAi1 (490 pb), onde 4 o controle positivo (amplificao de DNA plasmidial), 5 e 6 so
colnias (positiva e falso-positiva, respectivamente).
M

9.000 pb
2.400 pb

900 pb

Figura 19. Confirmao da transformao e da insero adequada do fragmento RNAi1 no

vetor de silenciamento pH7GWIWG2(II),0. Aps a PCR, os plasmdeos das colnias isoladas foram

66

extrados por Miniprep, clivados com as enzimas HindIII e XbaI ( por 3 h cada) e submetidos a
eletroforese em gel de agarose 1,5%. A confirmao da recombinao de forma adequada foi realizada
pela anlise do tamanho das bandas liberadas aps a clivagem. M, marcador de peso molecular 1 kb DNA
Ladder (Promega); 1, 3 e 5, plasmdeos no-clivados (1, selvagem; 3, falso-positivo e 5, positivo); 2,4 e 6,
plasmdeos clivados (2, selvagem; 4, falso-positivo e 6, positivo).

4.4. Obteno de plantas transgnicas

4.4.1. Transformao de Agrobacterium tumefaciens com as construes de
superexpresso e silenciamento
Clulas competentes da cepa desarmada LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens
foram

transformadas

com

as

construes

obtidas

por

eletroporao. Colnias

recombinantes foram selecionadas pela adio de rifampicina, estreptomicina e

espectinomicina ao meio de cultura e submetidas PCR para a confirmao da
transformao: nas colnias contendo os vetores recombinantes foram amplificadas bandas
referentes a GmWRKY20 (1.080 pb) e htp (~400 pb) na construo de superexpresso
(Figura 20); e nas construes de silenciamento, a htp (~400 pb) e a seus respectivos
fragmentos RNAi (RNAi 1 dados no mostrados; ou RNAi 2 Figura 21).
M

1.080 pb

~ 400 pb

Figura 20. Confirmao da transformao de A. tumefaciens com a construo pH7WG2D,1 +

GmWRKY20. Colnias isoladas de A. tumefaciens, resistentes seleo pelos antibiticos rifampicina,
estreptomicina e espectinomicina foram submetidas PCR e analisadas em gel de agarose 0,8 %, aps
eletroforese. M, marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder (Promega); 1-4, amplificao com os
primers GmWRKY20 (1.080 pb); 4-6, amplificao com os primers Hpt1 (~ 400 pb).

67

~ 400 pb
249 pb

Figura 21. Confirmao da transformao de A. tumefaciens com a construo

pH7GWIWG2(II),0 + RNAi2.

Colnias isoladas de A. tumefaciens, resistentes seleo pelos

antibiticos rifampicina, estreptomicina e espectinomicina foram submetidas PCR e analisadas em gel de

agarose 1%, aps eletroforese. M, marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder (Promega); 1-3,
amplificao com os primers RNAi2 (249 pb); 4-6, amplificao com os primers Hpt1 (~400pb).

4.4.2. Transformao de embries somticos de soja via sistema integrado

bombardeamento / Agrobacterium
A transformao gentica de soja foi realizada como descrito por Droste, Pasquali &
Bodanese-Zanettini, em 2000. Conjuntos de embries somticos secundrios em fase
proliferativa (9 a 12 meses) sofreram bombardeamento por partculas de tungstnio livres
de DNA em acelerador de partculas de baixa presso (PIG; Finer et al., 1992); sendo a
seguir, co-cultivados com suspenses de A. tumefaciens portando as trs construes
obtidas (um co-cultivo separado para cada construo). A eliminao da bactria aps o cocultivo foi realizada como descrito por Wiebke et al., em 2006, adicionando-se doses
adequadas de cefotaxima e vancomicina ao meio de cultivo. Alm disso, para a construo
de silenciamento pH7GWIWG2(II),0 + RNAi1, tambm foi realizado experimento de
transformao atravs do bombardeamento de partculas de tungstnio carregadas com o
68

vetor recombinante. A seleo de embries transformados foi realizada atravs da adio de

doses crescentes de higromicina ao meio de cultivo. Conjuntos embriognicos resistentes
higromicina (Tabela 7) passaram pelo processo previamente descrito (item 3.13.4) at a
obteno de plntulas regeneradas, sendo estas posteriormente transferidas para a
vermiculita e finalmente para o solo onde foram aclimatadas e mantidas em cmara de
crescimento, visando realizao das anlises moleculares subseqentes. As diversas
etapas transcorridas aps a transformao dos embries somticos de soja podem ser
visualizadas na Figura 22. Entre as plantas aclimatadas, 46 (representando ao menos 14
linhagens diferentes) foram transformadas via bombardeamento / A. tumefaciens com a
construo de superexpresso, e 19 (representando ao menos 11 linhagens) foram
transformadas via bombardeamento com a construo RNAi1. Plntulas portando as
construes RNAi1 e RNAi2 , transformadas via bombardeamento / A. tumefaciens,
ainda esto em fase de regenerao.
Tabela 7. Conjuntos embriognicos resistentes seleo por higromicina.

69

Figura 22. Etapas transcorridas aps a transformao dos embries somticos de soja. A
seleo dos transformantes teve incio 10 dias aps cada experimento de transformao, com a adio de
12,5 mg.l-1 de higromicina ao meio de cultivo vegetal. (A) Pontos de necrose (embries no-resistentes) j
podem ser observados algumas semanas aps o incio da seleo. (B) Passados 21 dias, os conjuntos
embriognicos foram transferidos para meio com dose aumentada de higromicina (25 mg.l-1),

70

permanecendo neste at que o perodo de seleo completasse 3 meses. (C) Conjuntos de embries
resistentes higromicina (pontos verdes) foram ento destacados do tecido necrosado e proliferados por
trs meses, visando multiplicao dos eventos de transformao obtidos. (D) Os conjuntos
embriognicos proliferados foram ento submetidos aos processos de histodiferenciao e maturao,
sendo transferidos para meio de cultivo contendo 6% de sacarose e 1% de carvo ativado por 30 dias; (E)
por mais 30 dias, os embries permaneceram em meio contendo 6% de sacarose, at que estivessem
totalmente maduros. (F) Estes foram ento submetidos dessecao, na qual permaneceram por 6 h em
placas sem meio de cultivo, sendo logo em seguida transferidos para meio de converso em plntulas. (G)
Ao surgimento das primeiras razes e folhas nas plntulas obtidas, estas foram transferidas para frascos
individuais contendo meio de cultivo adequado para sua regenerao. (H e I) Depois de regeneradas, as
plntulas obtidas seguiram para aclimatao, primeiramente em copos contendo vermiculita e cobertos
com plstico (H), sendo ento finalmente transferidas para solo orgnico (I), permitindo o completo
desenvolvimento das plantas obtidas.

4.5. Anlise dos tecidos geneticamente modificados e das plantas transgnicas

4.5.1. Monitoramento da integrao do transgene atravs da anlise da
expresso do gene reprter
A integrao do transgene ao genoma vegetal pde ser monitorada atravs da
visualizao da expresso GFP em microscopia de fluorescncia, sob luz azul.
Na etapa de seleo por higromicina, um ms aps a transformao, alguns
embries j apresentavam a expresso GFP (Figura 23). Infelizmente, nas etapas seguintes
(proliferao e histodiferenciao), sua visualizao se tornou dificultada pelo excesso de
clorofila que caracterstico aos embries nestas fases. A seguir, na etapa de maturao, a
expresso GFP pde ser mais uma vez observada; entretanto esta foi dificultada pelo alto
nvel de fluorescncia basal apresentado por embries selvagens (WT), aliado ao acmulo
de clorofila presente em algumas regies dos embries analisados. Desta maneira, evitou-se
prosseguir com a anlise em rgos e tecidos clorofilados. Esta foi retomada medida que
as plntulas foram aclimatadas, quando foi possvel observar nveis diversos de sua
expresso em razes principalmente nas extremidades e em tricomas foliares
principalmente em folhas com menor acmulo de clorofila. Entretanto, medida que a
71

anlise foi sendo realizada nos tecidos de plantas mais maduras, a dificuldade de
visualizao da expresso GFP foi aumentada (dados no mostrados).

Figura 23. Monitoramento da integrao do transgene pela anlise da expresso GFP. (A) No
perodo de seleo por higromicina, um ms aps o processo de transformao gentica, j era possvel
identificar a expresso do gene reprter em alguns embries resistentes (setas), apesar da grande
fluorescncia basal apresentada pelo tecido utilizado. (B e C) A expresso GFP s pde ser observada de
novo ao final do estgio de maturao dos embries, devido ao alto acmulo de clorofila nas etapas
anteriores; mesmo assim, a alta fluorescncia basal apresentada pelo tecido no transformado (B), mais
uma vez dificultou a comparao deste com o tecido transformado (C). Finalmente, aps a aclimatao
das plntulas obtidas, a expresso GFP pde ser visualizada com mais clareza em rgos aclorofilados.
Em D, pode-se observar a diferena de fluorescncia apresentada entre uma raiz transformada e outra
selvagem; j em E e F pode-se comparar o nvel de fluorescncia dos tricomas foliares de planta selvagem
(E) e transformada (F). A visualizao dos tecidos foi realizada em microscpio de fluorescncia sob
aumento de 40 vezes.

72

4.5.2. Confirmao da integrao do transgene por PCR

As anlises moleculares visando a confirmao da integrao do transgene nas
diversas plantas obtidas esto em andamento. Como as seqncias-alvo dos genes em
estudo se tratam de fragmentos endgenos, pertencentes ao genoma da soja, sua
amplificao no indicativa do sucesso dos experimentos de transformao realizados.
Dessa forma, a confirmao deve ser realizada pela amplificao de outros fragmentos
presentes no T-DNA, como o marcador de seleo (hpt), o promotor 35S ou o ntron
responsvel pela formao do hairpin (no caso das construes de silenciamento).
Entretanto, os primers que haviam sido previamente utilizados para a confirmao das
transformaes em bactria no apresentaram resultados satisfatrios quando utilizados nas
amostras vegetais, resultando na amplificao de diversos fragmentos inespecficos. Assim,
devido a estas dificuldades iniciais, alteraes esto sendo feitas visando obteno de
maior especificidade nas reaes de PCR, alm de maior pureza no processo de extrao de
DNA.
4.5.3. Clculo do nmero de cpias do transgene atravs de RT-qPCR
A partir dos resultados obtidos no monitoramento da expresso do gene-reprter
(gfp) nas plantas decorrentes da transformao para a superexpresso de GmWRKY20, a
estimativa do nmero de cpias do transgene foi realizada atravs de RT-qPCR, pelo
mtodo de quantificao relativa pela anlise da curva padro (Shou et al., 2004; Anexo
2). A expresso nmero de cpias, neste caso se refere ao nmero de alelos que so
detectados para cada gene no genoma diplide. O gene Le1 (lectina 4 cpias) foi utilizado
para eliminar os efeitos decorrentes da variao na quantidade de material apresentado
inicialmente entre as amostras testadas. Plantas no-transformadas (WT) foram utilizadas
para a calibrao da reao. Como esperado que seja encontrada uma cpia endgena de
GmWRKY20 no genoma da soja (2 alelos), no clculo atribuiu-se aos calibradores o valor
de 2 cpias. At o momento, foram analisadas apenas as linhagens 4.15, 6.9, 7.4 e 9.9 (nas
quais uma nica insero do transgene foi identificada), alm da linhagem 9.12, onde duas
73

inseres foram detectadas. Os dados obtidos at o momento esto apresentados na Tabela

8.
Tabela 8. Estimativa do nmero de cpias do transgene.

74

5. DISCUSSO
5.1. Anlises in silico e isolamento dos genes em estudo
Em 2003, um grupo de pesquisa pertencente ao Institute of Genetics and
Developmental Biology da Chinese Academy of Sciences (Tian et al. 2004) construiu
uma biblioteca de ESTs de soja em resposta ao cido saliclico. Atravs da anlise dos
clones desta biblioteca, juntamente com a anlise de ESTs de soja previamente depositadas
no GenBank, o grupo realizou a montagem em contigs (UniGene) destas seqncias e a
anotao

funcional

dos

dados

obtidos

de

acordo

com

Gene

Ontology

(http://www.geneontology.org), visando sua comparao com os genomas de A.thaliana e

Medicago truncatula. Mais tarde, em 2007, procurando por genes envolvidos nas respostas
da soja a estresses abiticos, o mesmo grupo realizou um screening (in silico) nos
contigs formados, utilizando como sonda motivos conservados de fatores de transcrio
WRKY. Como resultado, 64 genes WRKY de soja foram identificados e sua anotao foi
depositada no NCBI (Tian, Zhang & Chen, 2007 artigo no-publicado; Zhou et al. 2008).
Primers foram desenhados visando a obteno das seqncias codificantes (totais, ou em
muitos casos, parciais) dos genes identificados e utilizando-se apenas as regies contendo
os motivos conservados previamente utilizados como sondas uma anlise filogentica
(Neighbour-Joining) desses genes foi realizada. Alm disso, seus nveis de expresso em
diversos rgos da planta e diversas situaes de estresses abiticos foram analisados por
RT-PCR.
As seqncias codificantes parciais de GmWRKY20 e GmWRKY46 foram
depositadas no GenBank atravs dos trabalhos citados acima. Como primeiro passo para a
caracterizao funcional destes genes, que o objetivo maior do presente trabalho,
tornaram-se necessrias tanto a obteno de suas seqncias codificantes completas, quanto
a anlise in silico destas e de suas respectivas seqncias genmicas. Esta anlise estrutural
permitiu que se chegasse s seguintes concluses:

75

1.

As seqncias parciais depositadas no GenBank foram anotadas de forma

incorreta em 2007, uma vez que representam (com alguns erros de
seqenciamento), as pores amino- e carboxi-terminal da mesma protena;

2.

Este erro decorrente da montagem incorreta dos contigs referentes a

esses genes, realizada em 2003, uma vez que ESTs de ambos foram
agrupadas no mesmo contig (GmWRKY46); o qual provavelmente ocorreu
devido alta similaridade apresentada entre GmWRKY20 e GmWRKY46;

3.

Assim, o grupo da Chinese Academy of Sciences desenhou primers para

apenas um dos genes (GmWRKY20), conseqentemente as duas seqncias
codificantes parciais obtidas representam as pores 5 e 3 deste;

4.

Estas seqncias foram utilizadas tanto para as anlises filogenticas quanto

para anlises iniciais de expresso gnica realizadas pelo grupo, de forma
que os resultados obtidos nessas anlises devem ser, no mnimo, reavaliados.

No presente trabalho, os genes selecionados para estudo foram isolados de forma

bem sucedida. Suas seqncias codificantes completas foram obtidas (Figura 10), o que
possibilitou a identificao das principais diferenas estruturais entre GmWRKY20 e
GmWRKY46 (Figura 11); alm da classificao destes no grupo III da superfamlia (Tabela
6).
Alm disso, os dados estruturais obtidos sobre os genes em estudo indicam que
estes tenham sido alvo de um evento de duplicao recente, pois apesar de estarem situados
em cromossomos diferentes, suas seqncias codificantes possuem alto grau de identidade.
De acordo com anlises recentemente publicadas, obtidas a partir do seqenciamento do
genoma da soja (Schmutz et al. 2010), foi inferido que este do tipo paleopoliplide, tendo
sofrido dois grandes eventos de duplicao: estima-se que o primeiro evento tenha ocorrido
h 59 Myr, estando relacionado origem da linhagem Papilionoideae; j a segunda
duplicao, denominada Glycine-especfica, ocorreu h provavelmente 13 Myr. Ressaltase ainda, que a reteno de blocos homlogos nesta espcie excepcionalmente alta,
76

podendo envolver no apenas dois, mas vrios cromossomos. Alm do mais, eventos de
duplicao gnica so inerentes prpria histria evolutiva dos fatores de transcrio
WRKY e em especial, sua expanso de forma gradual dentro do Reino Vegetal: um maior
nmero de membros encontrado entre as Fanergamas, provavelmente refletindo a maior
adaptabilidade destas ao ambiente (Zhang et al. 2005).
5.2. Anlises da expresso gnica
5.2.1. Genes-referncia
A quantificao da expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46 em diversas situaes
foi realizada por RT-qPCR. Este tipo de anlise requer a normalizao dos valores obtidos
contra genes-referncia que so utilizados como controles internos da reao, partindo-se
do pressuposto de que a expresso destes no varia ao longo do experimento analisado.
Devido a sua funo em processos celulares bsicos, genes como actina, tubulina e fator de
elongao 1- (eF1-) so geralmente escolhidos como genes-referncia, muitas vezes sem
ter seu nvel de expresso previamente avaliados nas condies analisadas, o que acaba por
interferir na clareza e na preciso dos resultados obtidos para os genes em estudo.
Em 2008, Libault et al. buscaram por genes que pudessem ser utilizados como
referncia em anlises de expresso gnica de soja em resposta a condies de estresse
bitico: primeiramente atravs de busca por genes com expresso constitutiva em anlises
de microarranjo disponveis; seguida da quantificao (RT-qPCR) dos nveis de expresso
do conjunto de genes pr-selecionados em novos experimentos envolvendo estresse bitico.
Os

dados

obtidos

foram

avaliados

no

geNorm

(http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/), que um software desenvolvido para

indicar os genes mais adequados a serem utilizados como referncia em cada experimento,
atravs do clculo da variao mdia entre pares (M) de um gene em relao aos outros
(maior valor M representa menor estabilidade); alm de gerar um ranqueamento da
estabilidade de expresso dos genes testados e calcular o nmero necessrio de genes a
serem utilizados em cada experimento, para uma normalizao acurada da expresso
77

gnica. Como resultado deste trabalho, quatro novos genes referncia foram indicados para
a normalizao das anlises de expresso gnica em soja: ATP-binding cassette (ABC)
transporter, F-box protein Family, metalloprotease e CDPK-related protein kinase
(Libault et al. 2008). Os trs ltimos foram escolhidos para serem testados nas anlises de
expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46, juntamente com os genes ciclofilina (CYP2),
actina (ACT II) e fator de elongao eucaritico 1- (ELF1A) (Jian et al. 2008). Seus
nveis de expresso foram medidos nas condies experimentais realizadas e os valores
obtidos foram analisados no GeNorm. A utilizao de dois genes-referncia foi indicada,
sendo F-box protein Family e metalloprotease os genes que apresentaram maior
estabilidade de expresso nessas condies (dados no mostrados).
5.2.2. Expresso em diferentes rgos, fases do desenvolvimento e em resposta
ao estresse salino
Como j mencionado, Zhou et al. publicaram em 2008, um artigo com anlises
referentes aos 64 genes WRKY de soja identificados a partir de uma biblioteca de ESTs.
Entre as anlises realizadas, inclui-se a quantificao da expresso dos genes WRKY
identificados atravs de RT-PCR (no-quantitativo) em caules, cotildones, folhas e
razes de plantas de soja com duas semanas de idade; alm de plantas da mesma idade
submetidas a estresse salino (200 mM de NaCl), estresse por seca e por frio (4C). Os
resultados obtidos demonstraram expresso relativamente baixa de GmWRKY20 e
GmWRKY46 (quando comparados aos outros WRKYs) em todos os rgos analisados,
havendo leve diferena entre o padro de expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46 o que
deve refletir a inacurcia da tcnica utilizada, uma vez que os primers desenhados para a
deteco de ambos os genes so referentes a duas regies distintas de GmWRKY20 apenas.
Em nossas anlises, tanto o padro quanto o nvel de expresso entre ambos os genes se
mostrou similar, sendo que o maior nvel de expresso encontrado foi no caule de plantas
maduras. Mais amostras devem ser analisadas (como amostras de caule de plantas jovens,
por exemplo) para que um perfil de expresso mais amplo destes genes seja obtido,
possibilitando relacion-lo aos processos biolgicos nos quais podem estar envolvidos.
78

Alm disso, na anlise de estresse salino realizada por Zhou et al. em 2008,
nenhuma mudana significativa foi observada para os genes em questo. No presente
trabalho, condies similares foram utilizadas no experimento (150 mM de NaCl, plantas
com duas semanas de idade) e o resultado obtido sugere que no h induo significativa de
ambos os genes na referida condies. Entretanto, tanto nas amostras de raiz como de
folhas utilizadas, pode-se observar uma tendncia de maior expresso destes genes nas
plantas tratadas com NaCl. Desta forma, novos experimentos nestas condies devem ser
realizados visando minimizar as variaos nos nveis de expresso apresentadas entre as
replicatas biolgicas, permitindo assim, determinar se as diferenas obtidas entre plantas
tratadas e no-tratadas so de fato significativas.
5.2.3. Infeco por P. pachyrhizi
Os dados obtidos no microarranjo realizado por van De Mortel et al. em 2007,
permitiram aos autores inferir que um padro bifsico de expresso apresentado por
grande parte dos genes envolvidos na defesa contra o patgeno causador da ferrugem
asitica. Nossos resultados confirmam este perfil bifsico de expresso para os genes
GmWRKY20 e GmWRKY46 no gentipo resistente (Rpp2, PI561356) em resposta
infeco por P. pachyrhizi; apesar de este no refletir o perfil exato obtido para cada um
dos dois genes no microarranjo. Essas diferenas apresentadas podem ser decorrentes das
diferenas de sensibilidade entre as tcnicas utilizadas em geral RT-qPCR possui maior
acurcia para medir a expresso gnica individual, enquanto que o microarranjo, como
ferramenta de anlise em larga escala, extremamente til para retratar mudanas globais
no transcriptoma.
Em teoria, o perfil bifsico apresentado no microarranjo seria decorrente da
formao de dois picos de respostas de defesa aps a inoculao com o patgeno: o
primeiro seria reflexo da ativao de mecanismos basais de defesa da planta, ocorrendo em
geral, tanto no gentipo resistente quanto no suscetvel, at 24 hpi. Aps este perodo, entre
24 e 48 hpi (que corresponde ao perodo de desenvolvimento de hifas secundrias e
formao de haustrios), a maioria dos genes volta a nveis basais de expresso,
79

possivelmente como resultado da liberao pelo patgeno de molculas efetoras. No

gentipo resistente, foi observado um segundo pico de expresso de genes de defesa em 72
hpi, o qual s ocorreu no gentipo suscetvel de 1 a 2 dias depois. Essa segunda induo
pode ser decorrente da ativao de genes R, resultando na expresso de protenas R
responsveis pelo reconhecimento dos efetores liberados pelo patgeno (Avr, interao
incompatvel) e conseqente inativao dos mesmos, o que resulta na restrio do
crescimento do patgeno e na preveno do desenvolvimento da infeco.
Em 2008, Choi et al., aps anlise de microarranjo comparando as respostas obtidas
na reao imune (governada pelo gene Rpp1) em relao reao suscetvel, tambm
observaram a induo inicial (de 6 a 12 hpi) de fatores de transcrio WRKY, seguida pela
sua represso (de 24 a 48 hpi), corroborando com os resultados aqui apresentados. Alm
disso, estes autores complementam a hiptese inferida por van De Mortel et al., 2007,
sugerindo que a resistncia ferrugem mais uma questo de tempo e intensidade de
ativao de vias da imunidade inata, do que o resultado da induo de alguns poucos genes
especficos. Desta forma, a imunidade ativada por efetores (ETI) seria uma re-ativao da
imunidade ativada por PAMPs (PTI), apenas de uma maneira acelerada e potencializada.
Neste contexto, a reprogramao transcricional mediada por fatores de transcrio da
famlia WRKY retratada tanto nas anlises de microarranjo citadas, quanto neste trabalho
se mostra crucial na modulao dos mecanismos de defesa contra P. pachyrhizi.
5.2.4. Estrutura, expresso e funo gnica
Como a regulao da expresso de um gene em condies diversas decorrente do
reconhecimento de motivos conservados (cis-elementos) presentes em sua regio
promotora, e de sua conseqente interao com outros genes atravs destes cis-elementos,
um alto grau de homologia entre as seqncias codificantes de dois genes no
necessariamente quer dizer que estes possuam o mesmo perfil de expresso, ou participem
das mesmas vias regulatrias. fato que funes redundantes entre fatores de transcrio
WRKY so comumente encontradas: atravs de tcnicas de genmica funcional, diversos
grupos de pesquisa relatam a co-regulao destes e a contribuio de vrios genes WRKY
80

na composio de um fentipo. Por outro lado, genes WRKY altamente homlogos j

foram descritos como possuindo funes diversas em determinada via regulatria, como
reportado por Tao et al., em 2009. Este grupo demonstrou que o par allico de genes
WRKY de arroz (Oryza sativa) OsWRKY45-1 e OsWRKY45-2, cujas seqncias proticas
diferem em apenas 10 aminocidos, possuem papis distintos nos mecanismos de
resistncia a patgenos: tanto a superexpresso de OsWRKY45-1, quanto o silenciamento de
OsWRKY45-2 resultaram em maior susceptibilidade de plantas de arroz a Xanthomonas
oryzae, e de forma inversa, o silenciamento de OsWRKY45-1 e a superexpresso de
OsWRKY45- 2 resultaram na resistncia contra este patgeno. Alm disso, diferenas no
balano de fitormnios envolvidos nestas respostas tambm foram observadas, levando os
autores anlise da regio promotora destes alelos a fim de obterem respostas sobre sua
modulao diferencial.
Mesmo que uma anlise aprofundada dos motivos que compem a regio
regulatria de GmWRKY20 e GmWRKY46 ainda no tenha sido realizada, os resultados
obtidos nas diversas anlises de expresso gnica realizadas demonstraram que, ao menos
nas condies testadas, ambos os genes apresentam perfis de expresso extremamente
similares. A partir destes resultados, pode-se pressupor que os genes em estudo estejam
provavelmente sob ao de forte presso seletiva, uma vez que eventos de duplicao
gnica geralmente levam a processos de perda de funo da cpia extra; formao de
pseudogenes; silenciamento epigentico ou ainda sub-funcionalizao entre os
homlogos, com conseqente formao de genes parlogos. A reteno de dois genes
WRKY altamente homlogos foi descrita por Petitot et al., em 2008: CaWRKY1a e
CaWRKY1b foram isolados de uma biblioteca de ESTs construda na resposta do caf
(Coffea arabica) ao fungo Hemileia vastatrix, patgeno responsvel pela ferrugem da folha
nesta espcie. Os nveis de expresso destes genes foram quantificados (RT-qPCR) em
diversas situaes, como em folhas senescentes, no tratamento com SA e em resposta ao
fungo H. vastatrix, alm do nematdeo Meloidogyne exguos; sendo que ambos os genes
apresentaram perfis de expresso similares em todos os experimentos realizados. Uma
explicao para a recorrente reteno da redundncia funcional entre genes WRKY que
81

esta sirva para proteger o organismo de efeitos deletrios eventualmente causados pela
mutao ou deleo gnica (Zhang et al. 2005).
Utilizando-se a ferramenta GOST GreenPhyl Orthologs Search Tool
(http://greenphyl.cirad.fr/cgi-bin/gost.cgi), foi possvel identificar os genes AtWRKY53 e
AtWRKY30 como sendo os provveis ortlogos em A. thaliana dos genes de soja em
estudo. Nesta espcie, foi demonstrado que AtWRKY53 mas no AtWRKY30
rapidamente induzido aps o tratamento de plantas com SA (Kalde et al., 2003); nesta via,
relacionada defesa contra patgenos biotrficos, AtWRKY53 alvo direto de NPR1 e atua
ativando genes de defesa no ncleo, no desenvolvimento da SAR (Figura 24) (Wang et al.
2006); o gene tambm induzido em plantas inoculadas com Blumeria graminis (patgeno
de gramneas), estando aparentemente envolvido na resistncia no-hospedeira. Alm do
mais, em experimentos com o patgeno Ralstonia solanacearum foi demonstrado que
AtWRKY53 tambm est envolvido em processos relacionados senescncia e sinalizao
mediada por ABA, havendo aparente sobreposio entre os genes envolvidos nestas vias
(Hu et al. 2008). J AtWRKY70 outro membro do grupo III alm de atuar como ativador
da defesa sinalizada por SA (possuindo funo redundante a AtWRKY53 na induo da
SAR), tambm previne o acmulo excessivo da molcula-sinal nesta via, de maneira a agir
na regulao entre as vias mediadas por SA (biotrficos) e JA (necrotrficos) (Wang,
Amornsiripanitch & Dong, 2006). Em contraste, tambm fazem parte do grupo III em A.
thaliana, os fatores de transcrio AtWRKY38 e AtWRKY62, que possuem papel na
represso da defesa basal mediada por SA em resposta a P. syringae: estes tambm so
alvos de NPR1, mas atuam como ativadores transcricionais de genes repressores da defesa.
Por outro lado, o reconhecimento do patgeno pela planta pode induzir a ao de HDA19,
uma histona-desacetilase que resulta na formao de um complexo de co-represso,
tornando regies eucromticas inacessveis a estes fatores de transcrio, conseqentemente
permitindo a ativao de genes de defesa contra o patgeno em questo (Kim et al., 2008).

82

Figura 24. Representao esquemtica da regulao da SAR por fatores de transcrio WRKY
induzidos por NPR1, em A. thaliana. O acmulo de SA ativa o transporte de NPR1 para o ncleo,
resultando na induo de diversos genes WRKY: quando os nveis de SA esto baixos, WRKY58 funciona
na preveno da ativao espria da SAR; j quando estes esto altos, a sinalizao atravs de fatores de
transcrio WRKY ativadores (como WRKY18, 53, 54 e 70) sobrepe o efeito repressor de WRKY58,
ativando a transcrio de genes-alvo. Alm disso, WRKY70 e WRKY54 tambm atuam na preveno do
acmulo excessivo de SA na clula (Modificado de Wang, Amornsiripanitch & Dong, 2006)

Recentemente, Yang et al. (2009) isolaram 46 fatores de transcrio WRKY de

canola (Brassica napus), uma espcie economicamente importante e com filogenia prxima
A. thaliana ambas pertencem famlia Brassicaceae cuja seqncia completa do
genoma ainda no est disponvel ao pblico. Os genes isolados foram anotados de acordo
com seus ortlogos na espcie-modelo e tiveram seus nveis de expresso analisados na
infeco com os patgenos Sclerotinia sclerotiorum e Alternaria brassicae, e em diversos
tratamentos com fitormnios. Curiosamente, os genes BnWRKY53 e BnWRKY70 tiveram
83

seu nvel de expresso aumentados em resposta a ambos os patgenos necrotrficos, alm

de BnWRKY53 ser fortemente reprimido no tratamento com ABA; pelos trabalhos j
realizados com seus respectivos ortlogos em A. thaliana, um perfil oposto seria esperado
para estes.
5.3. Obteno e anlises de plantas transgnicas para o estudo funcional de
GmWRKY20 e GmWRKY46
Partindo-se do pressuposto de que a superexpresso de ambos os genes em estudo,
sob o controle do mesmo promotor constitutivo, resultaria no desenvolvimento do mesmo
fentipo em plantas de soja (devido a sua alta similaridade de seqncia), apenas
GmWRKY20 foi utilizado nos processos de transformao visando a superexpresso desse
gene em soja. J nas construes de silenciamento utilizadas, os fragmentos clonados de
GmWRKY20 possuem alto nvel de identidade com a GmWRKY46, desta forma esperado
que os nveis de expresso de ambos os genes sejam reduzidos nas plantas obtidas para
estas construes, o que pode ser muito til para revelar funes gnicas redundantes.
Ressalta-se ainda que a principal diferena entre as construes RNAi1 e RNAi2 que o
fragmento clonado da primeira construo composto, alm da seqncia codificante, por
parte de um ntron; assim esperado que esta construo gere um silenciamento mais
inespecfico entre genes WRKY do que a segunda, possivelmente sendo capaz de diminuir
a expresso de GmWRKY12, que possui similaridade de seqncia com GmWRKY20 e
GmWRKY46.
5.3.1. Expresso GFP
Em 1994, Chalfie et al. demonstraram pela primeira vez, que uma protena
fluorescente verde (GFP) derivada de Aequorea victoria (popularmente conhecida como
gua-viva) ao ser expressa tanto em clulas procariticas quanto eucariticas capaz
de emitir forte fluorescncia quando excitada por luz azul ou UV. Desde ento, esta
descoberta tm sido amplamente utilizada como ferramenta para vrios tipos de anlises,
inclusive como uma poderosa ferramenta de monitoramento da expresso gnica (gene 84

reprter) sendo extremamente vantajosa em relao a outras tcnicas disponveis para

este fim por no ser invasiva e no requerer a utilizao de substratos ou co-fatores
exgenos. Mais recentemente, a descoberta rendeu aos autores o Prmio Nobel de Qumica
em 2008.
Dois tipos de filtros podem ser utilizados para a visualizao da expresso GFP: um
deles o long pass filter, que permite a passagem de comprimentos de onda maiores do
que 500 m, incluindo as fluorescncias verde, vermelha e amarela. Na tentativa de
eliminar a passagem destas outras fluorescncias (vermelha e amarela) o narrow-band pass
filter (525 + 25 m) utilizado; entretanto, o resultado geralmente observado um efeito
aditivo destas fluorescncia verde, de forma a dificultar a discriminao entre a
fluorescncia verde basal e a expresso GFP.
Neste trabalho, o vetor binrio de superexpresso utilizado possui alm do cassete
de expresso do gene de interesse um cassete de expresso da GFP, cuja finalidade
acompanhar o desenvolvimento das plantas transformadas, distinguindo-as das plantas no
trasnformadas. Para a visualizao da fluorencncia o long pass filter foi utilizado, sendo
o espectro de emisso analisado de 505 a 530 m. Em decorrncia disso, ressalta-se a
grande dificuldade na deteco da expresso GFP nos tecidos de soja analisados, uma vez
que os pigmentos fotossintticos presentes na clula vegetal refletem essas fluorescncias
interferentes. Chama-se especial ateno clorofila, que em altos nveis resulta na
visualizao de forte fluorescncia vermelha. A dificuldade de visualizao da expresso
GFP por interferncia da clorofila j foi reportada em algumas espcies, como no arroz (O.
sativa), na leguminosa M. truncatula e em A. thaliana (apesar de nesta, ocorrer em menor
grau) (Zhou et al., 2005); sendo mais recentemente, reportada em soja (Wu et al., 2008).
Neste ltimo, os autores propem o tratamento de embries somticos de soja com o
herbicida Isoxaflutole (IFT; 5-cyclo-propyl-1,2-isoxazol-4-yl -trifluoro-2-mesyl ptolyl ketone), que resulta na disrrupo da via de sntese de carotenides e na inibio do
desenvolvimento

cloroplastdico;

tornando

os

tecidos

vegetais

esbranquiados

(bleaching effect). Alm de eficiente em seu objetivo de facilitar a visualizao da

85

expresso GFP em tecidos com altos nveis de clorofila, este processo se mostrou
reversvel: duas semanas aps o final do tratamento, embries somticos re-cultivados em
meio D20 j apresentavam colorao verde e no tiveram seu desenvolvimento
comprometido. Apesar de no ter sido utilizada no presente trabalho, atualmente esta
prtica vem sendo testada em nosso laboratrio (onde tambm se mostrou eficiente) e
provavelmente ser adotada nos prximos experimentos nos quais o monitoramento da
expresso GFP requerido.
Outro fator importante que parece ter interferido nas anlises descritas (item 4.5.1),
foi a virtual perda de expresso GFP em tecidos mais maduros de plantas cuja expresso j
havia sido visualizada em etapas anteriores do desenvolvimento. O mesmo problema foi
relatado por Zhou et al., em 2005, ao analisar plantas de O. sativa, M. truncatula e A.
thaliana. Neste trabalho os autores demonstram que o aumento gradual da dificuldade de
deteco ao longo do desenvolvimento das plantas est tambm relacionado presena de
clorofila (neste caso de forma quantitativa) j que foi observado que o aumento nos nveis
de clorofila acompanhado pela diminuio relativa da protena GFP (em relao
composio protica total da planta). Assim, os autores justificaram que o menor efeito
observado em A. thaliana ocorre porque, nesta espcie, os nveis de clorofila so levemente
diminudos ao longo do desenvolvimento; alm da proporo da protena GFP permanecer
relativamente constante ao longo deste, diferentemente do que foi observado em O. sativa e
M. truncatula. Duas estratgias para a reduo dos nveis de clorofila visando facilitar a
visualizao de GFP foram utilizadas: a estiolao de folhas (durante 6 dias) e o
tratamento com etanol 95% (por no mximo 8 h). Ressalta-se ainda que, nessas anlises,
assim como foi observado nos tecidos de soja analisados no presente trabalho, nveis basais
(mas detectveis) de fluorescncia foram encontrados em tecidos selvagens (notransformados) de arroz, sendo denominados autofluorescncia, que o terceiro fator
contribuinte para a dificuldade de deteco da expresso GFP nos diversos tecidos de soja
aqui analisados.

86

O quarto fator envolvido nas variaes observadas nos nveis de expresso GFP o
prprio promotor responsvel pela regulao de sua expresso no cassete transferido para a
planta: no vetor pH7WG2D,1, o promotor rolD est fusionado seqncia codificante de
EgfpER (enhanced green fluorescent protein linked to endoplasmatic reticulum targeting
signal). Esta seqncia promotora (rolD, rooting loci gene) proveniente do plasmdeo
Ri (root-inducing) de Agrobacterium rizhogenes e sua capacidade de promover forte
expresso, tanto em raiz como em partes areas de plantas transgnicas, j foi reportada em
diversos trabalhos atravs de sua fuso a genes marcadores, como o uidA que codifica a
enzima -glucuronidase (GUS) (Elmayan & Tepfer, 1995; Kamo & Blowers, 1999). Mais
recentemente, em experimento de transformao transiente de soja via A. rizhogenes
(hairy-root transformation), forte expresso GFP sob controle desse promotor foi
demonstrada nos primrdios radiculares formados (Klink et al. 2008). Entretanto, em 2008,
Wally, Jayaraj & Punja, ao comparar os nveis de expresso de GUS sob controle de
diversos promotores em plantas transgnicas de cenoura (Daucus carota), observaram que
a utilizao do promotor rolD, assim como de mas2 (mannopine synthase, de A.
tumefaciens), resultou em nveis baixos de expresso GUS, em relao aos outros
promotores testados: 35S de CaMV, duplo 35S (2x35S) e ubiquitina de A. thaliana
(UBQ3). Alm disso, os autores demonstraram ainda, que a expresso governada por rolD
apresentou variaes, tanto de forma espacial (os nveis obtidos em razes foram muito
mais altos que em folhas, onde a expresso pde ser apenas observada nos feixes
vasculares) quanto temporal (razes de plantas maduras tambm apresentaram nveis muito
baixos de expresso, se comparados ao tecido jovem). Este ltimo padro de expresso
tambm parece ter ocorrido em nossas anlises, uma vez que a expresso GFP fortemente
observada em razes de plantas transformadas tambm foi reduzida, medida que estas
plantas tornaram-se maduras.
Alm disso, com relao expresso GFP visualizada nos tricomas foliares, esta
provavelmente decorrente da falta de pigmentos apresentada por esses rgos (fator j
discutido anteriormente), uma vez que um padro de expresso tricoma-especfico no
parece ser caracterstico do promotor rolD; apesar de j ter sido relatado em alguns
87

trabalhos que utilizaram a seqncia codificante de gfp fusionada a seqncias diversas,

como ferramenta na busca por ESTs ou cis-elementos envolvidos especificamente no
desenvolvimento de tricomas e na resposta contra patgenos (Wu & Liu, 2005; Souza,
2006).
Por fim, vale lembrar que a superexpresso do gene de interesse (GmWRKY20) nas
plantas transformadas obtidas neste trabalho governada pelo promotor 35S, no possuindo
desta forma, nenhuma relao com o padro de expresso obtido para o gene-reprter
analisado, sob regulao do promotor rolD.
5.3.2. Estimativa do nmero de cpias do transgene
Por muitos anos, a deteco do nmero de cpias do transgene inseridas no genoma
de um organismo geneticamente modificado era realizada exclusivamente atravs de
tcnicas baseadas em hibridizao, como o Southern blot. A demanda por grandes
quantidades de DNA para que a anlise de uma nica planta pudesse ser processada, aliada
demora (em mdia trs dias) na obteno do resultado e falta de sensibilidade resultante
de eventuais hibridizaes inespecficas esto entre os fatores responsveis pela busca de
tcnicas novas e aprimoradas para a quantificao do DNA-alvo. Tcnicas baseadas em
PCR tm sido utilizadas; dentre elas, mtodos de anlise desenvolvidos a partir de PCR em
tempo real quantitativo (RT-qPCR) esto entre os mais promissores. Entre as principais
vantagens destes, citam-se fatores como a rapidez da tcnica, as facilidades de automao e
de escalonamento das anlises (diversas amostras podem ser processadas em apenas uma
placa); sem contar a alta sensibilidade e especificidade alcanadas pelo RT-qPCR poucos
nanogramas de DNA so necessrios para o processamento de uma amostra, a deteco do
gene-alvo acurada mesmo na anlise de genes pertencentes a grandes famlias homlogas
e possvel distinguir diferenas pequenas na quantidade do gene-alvo (como uma cpia
do transgene ou diferenas entre homo- e heterozigotos, por exemplo) (Schmidt & Parrott,
2001; Bubner & Baldwin, 2004; Koyama, et al., 2008).

88

O mtodo utilizado em nossas anlises se baseia na Quantificao relativa pela

anlise da curva padro (Shou et al., 2004). Este foi escolhido por sua praticidade, j que a
simples comparao entre as curvas padro relativas obtidas para o gene-alvo e para o
controle endgeno (cujo nmero de cpias conhecido) so suficientes para se determinar
quantas cpias do gene-alvo so detectadas na amostra utilizada (Bubner et al. 2004). Se
por um lado no necessria a quantificao absoluta da quantidade fsica do transgene
(atravs de diluies seriadas do plasmdeo e quantificao exata da concentrao e do peso
molecular referentes a cada cpia); a escolha do calibrador (ou ao menos a determinao
precisa do nmero de cpias do gene-alvo presentes neste) fator crucial, especialmente
quando a quantificao feita levando-se em conta o nmero de cpias endgenas do gene
em estudo, como o nosso caso: a simples presuno do nmero de cpias apresentados
pela planta utilizada como calibrador, sem que este valor seja de fato comprovado, pode
resultar na inconsistncia dos dados obtidos. Alm do mais, os dados obtidos at o
momento para o nmero de inseres de GmWRKY20 so apenas uma estimativa, pois
partem do pressuposto de que cada linhagem homozigota (possui dois alelos) para o gene
endgeno e cada cpia extra detectada tratada como uma insero do transgene. Uma
idia interessante talvez seja a deteco do nmero de inseres atravs da amplificao de
um fragmento do cassete que no faa parte da regio codificante de GmWRKY20, ou seja,
que no esteja presente de forma endgena no genoma da soja. Esta idia certamente ser
adotada como um complemento para a deteco do nmero de inseres do transgene nas
plantas obtidas.
Sob essa perspectiva, pode-se concluir que a quantificao atravs de RT-qPCR
muito til como estimativa do nmero de cpias do transgene, ainda mais quando diferentes
genes endgenos e diferentes fragmentos do cassete de expresso so utilizados, garantindo
alto grau de preciso dos resultados obtidos. Ainda assim, os resultados obtidos podem ser
complementados atravs da realizao de Southern blot e anlises de segregao.

89

5.3.3. Revelao do fentipo

Quando se tm por objetivo elucidar a funo de fatores de transcrio WRKY em
determinada via regulatria, atravs da utilizao de tcnicas que envolvam sua
superexpresso e seu silenciamento gnico, ou ainda pela utilizao de mutantes que
apresentem perda de funo, duas caractersticas inerentes aos membros desta superfamlia
devem ser levadas em considerao na hora de se avaliar o fentipo obtido: a interao
estrutural (formao de homo- ou heterocomplexos) e funcional (papis redundantes ou
antagnicos) entre os fatores de transcrio WRKY.
Um estudo bem sucedido demonstrando esta interao foi realizado por Xu et al.,
em 2006: AtWRKY18, 40 e 60 so induzidos por patgenos e codificam trs protenas
estruturalmente similares. A interao fsica (estrutural) entre AtWRKY18, 40 e 60 foi
demonstrada atravs de ensaios de duplo hbrido (two-hybrid system) e de coimunoprecipitao e provavelmente est relacionada obteno de especificidade e
seletividade necessrias para a ligao in vivo destes fatores de transcrio a seqnciasalvo envolvidas em vias distintas. Linhagens de A. thaliana apresentando expresso
constitutiva, silenciamento ou perda de funo de um destes genes (ou de combinaes
entre eles), foram avaliadas em resposta aos patgenos P. syringae e Botrytis cinerea,
responsveis pela ativao de vias distintas de sinalizao na clula vegetal, sendo o
primeiro considerado hemibiotrfico (envolvido na via mediada por SA) e o ltimo
necrotrfico (envolvido na via mediada por JA e ET). Nos ensaios com P. syringae, apesar
de mutantes simples no terem apresentado diferena significativa de fentipo, o nocaute
dos trs genes de forma combinada resultou em reduzido crescimento bacteriano
(comparando-se a plantas WT), revelando assim sua redundncia funcional nesta via. De
forma intrigante, a superexpresso de AtWRKY18 tambm resultou em maior resistncia ao
patgeno; ao contrrio, a co-expresso deste com AtWRKY40 ou AtWRKY60 levou maior
suscetibilidade a P. syringae. Este resultado foi obtido possivelmente em decorrncia de
efeitos pleiotrpicos gerados pela superexpresso de AtWRKY18 levando a ativao ou
represso de genes que no so geralmente regulados por este. A expresso combinada com
90

AtWRKY40 ou AtWRKY60 pode ter aumentado a especificidade de ligao de AtWRKY18 a

DNAs-alvos e conseqentemente reduzido seus efeitos inespecficos na expresso gnica;
desta forma foi possvel desvendar a real funo destes como reguladores negativos da via
mediada por SA.
Os resultados obtidos pelos autores nos ensaios com B. cinerea foram ainda mais
intrigantes: tanto mutantes quanto linhagens superexpressando estes genes (de forma
combinada) resultaram em maior suscetibilidade ao patgeno necrotrfico, indicando que o
papel de genes WRKY nas vias de sinalizao contra este tipo de patgeno seja mais
complexo. Aparentemente, a resistncia a B. cinerea associada a determinados nveis de
expresso dos trs genes; dessa maneira, apesar de os mecanismos de sinalizao ativados
na perda de funo de AtWRKY18, 40 e 60 e na sua superexpresso serem distintos, estes
convergiram para o aumento da morte celular e conseqente promoo da virulncia do
patgeno necrotrfico.
A partir deste e de outros exemplos encontrados na literatura, e levando-se em
considerao os resultados obtidos nas anlises de expresso de GmWRKY20 e
GmWRKY46; possvel que a superexpresso de GmWRKY20 apenas, apesar de til para a
indicao de seu modo de ao na infeco com P. pachyrhizi, no seja suficiente no
sentido de revelar sua real funo nesta situao, sendo provavelmente necessria a anlise
conjunta com genes que apresentem potencial redundncia funcional a este (como pode ser
o caso de GmWRKY46). Se bem sucedidas, as linhagens obtidas com as construes RNAi
podem ser teis para este fim, uma vez que devem possibilitar o estudo dos efeitos gerados
pelo silenciamento de ambos (e possivelmente de um terceiro gene WRKY, como j
mencionado) em diversas situaes, nas quais provavelmente a falta de um deles apenas
no resultaria em alteraes observveis de fentipo.
Com relao a alteraes morfolgicas apresentadas por plantas apresentando nveis
alterados de expresso de genes WRKY, estas no so de ocorrncia comum, salvo
excees (Wang, Amornsiripanitch & Dong, 2006), apesar desses genes estarem
envolvidos em diversos processos biolgicos, alm das respostas a estresses. Algumas
91

variaes morfolgicas foram encontradas entre as linhagens de superexpresso obtidas

neste trabalho (dados no mostrados); contudo, uma vez que as alteraes no so
recorrentes entre as diferentes linhagens, essas parecem ser decorrentes ou da variao
somaclonal freqentemente observada em plntulas regeneradas a partir da cultura de
tecidos (Kaeppler et al. 2000) ou de efeito posicional (Matzke et al. 1998), uma vez que o
local de insero do transgene no genoma pode afetar a expresso de algum outro gene
responsvel por alguma alterao morfolgica. Ressalta-se ainda, que superexpresso e o
silenciamento dos genes em estudo nas plantas obtidas ainda no foram confirmados, sendo
este mais um motivo pelo qual no possvel inferir que alguma variao morfolgica
obtida seja decorrente da alterao nos nveis de expresso de GmWRKY20 e GmWRKY46.

92

6. CONCLUSES
Os dados obtidos neste trabalho nos permitiram chegar s seguintes concluses:
1.

Os genes GmWRKY20 e GmWRKY46 codificam duas protenas distintas, mas

com alta similaridade estrutural, sendo provavelmente decorrentes de um evento
recente de duplicao gnica;

2.

Devido a suas caractersticas estruturais, ambos pertencem ao grupo III da

superfamlia de fatores de transcrio WRKY;

3.

O perfil de expresso desses dois genes d indcios de que eles estejam

envolvidos na complexa rede de sinalizao da soja em resposta ao ataque por
patgenos, inclusive durante a infeco pela ferrugem asitica, alm de
participarem em outras vias de sinalizao na resposta desta espcie contra
estresses abiticos;

4.

A similaridade estrutural, aliada ao perfil de expresso obtido nas situaes

avaliadas, indicam que GmWRKY20 e GmWRKY46 possuam redundncia
funcional.

93

7. PERSPECTIVAS
1.

Repeties dos experimentos utilizados nas anlises de expresso devem ser

realizadas, com a adio de um maior nmero de indivduos nestas anlises;

2.

Novas anlises de expresso devem ser realizadas, tanto de forma especfica,

nos processos de resposta a patgenos; quanto de forma mais ampla, nas vias de
sinalizao contra estresses abiticos e em outros processos fisiolgicos da
planta (como a senescncia), para que um padro de expresso mais amplo de
GmWRKY20 e GmWRKY46 seja obtido;

3.

Anlises moleculares que possibilitem a confirmao das plantas transgnicas

obtidas devem ser feitas, assim como anlises que confirmem que os genes em
estudo possuam expresso modificada (superexpresso ou silenciamento) nestas;

4.

Plantas de soja superexpressando GmWRKY20 e silenciadas para GmWRKY20 e

GmWRKY46 podero ser utilizadas em estudos funcionais e submetidas a
ensaios biolgicos com patgenos;

5.

Anlise minuciosa da regio regulatria de ambos os genes deve ser feita, alm
da realizao de experimentos que permitam a identificao dos possveis alvos
dos fatores de transcrio em estudo, como ensaios de pull-down ou
experimentos de microarranjo envolvendo plantas que estejam superexpressando
GmWRKY20, por exemplo.
Combinadas, estas anlises certamente sero teis para se desvendar os papis

destes dois fatores de transcrio nas complexas vias de sinalizao celular, especialmente
nos mecanismos moleculares de defesa da soja contra patgenos. Alm disso, a
caracterizao funcional destes genes na infeco por P. pachyrhizi poder servir para o
incremento dos programas de melhoramento gentico de leguminosas, podendo
eventualmente contribuir para a construo de um arsenal de fontes de resistncia contra
a ferrugem asitica no germoplasma comercial da soja.

94

8. REFERNCIAS
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101

ANEXO1:
Seqncias genmicas e codificantes de GmWRKY20 e GmWRKY46 e alinhamento
dos primers utilizados nas construes RNAi e para as anlises de expresso por
RT-qPCR.

102

Alinhamento das seqncias genmicas:

GmWRKY20
GmWRKY46

ATGGAGAGTGACTTGAGCTGGGAGCGGAACACACTCATCAATGAGCTAATTCAGGGGATG
ATGGAGAGTGACTTGAGCTGGGAGCAGAACACGCTCATAAATGAGCTAATTCAGGGGATG
************************* ****** ***** *********************

GmWRKY20
GmWRKY46

GAGGTAGCAAGGAAGTTGAAGGCTGACTTGAAGTTGCCGTATTCAGTTGACACAAGAGAT
GAGGTAGCAAGGAAGTTGAAGGCAGACTTGAGGATGCCGTATTCAGTTGACTCAAGAGAT
*********************** ******* * ***************** ********

GmWRKY20
GmWRKY46

CTGCTTCTGCAGAGGATATTATCTTCTTACGAAAAGGCTCTACTGATTCTAAGATGCAGC
TTGCTTGTGCAGAGGATATTATCTTCTTATGAAAAGGCTCTACTGATTCTAAGATGCAAT
***** ********************** ****************************

GmWRKY20
GmWRKY46

AATGCATCAACTTCCGAGTTGCAGGGCATGAATCAAGCAACACCAACTTTGCTACCCGAG
GCATCATCAACTTCCGAGTTGCAGGCCATGAGTCAAGCAACACCAACTTTGCTACCCGAG
********************* ***** ****************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TCCCCATTATCTGTCCATGGAAGTCCTCTGCGCGAGGACGTTCATGGGGCCATCAAGGAT
TCCCCATTATCTGTCCATGGAAGTCCTCTGCGCGAGGACGTTGATGGGACCATCAAGGAT
****************************************** ***** ***********

GmWRKY20
GmWRKY46

CACCA------------TAATTCAAAGAAAAGGTGAATATTACTGAACAGACTTGGTAGC
CACCAAGAAGTTAAACATGATTCAAAGAAAAGGTGAATTTTACTATACAGACTTGGTAGC
*****
* ******************* ***** **************

GmWRKY20
GmWRKY46

TGTTTCCTGGCACATAAACATCAGCTATGTCTGGTAACTGGTTATACTATAGCTCCTAAC
AGTTTTCTGCCACATAAAGATCAGCTATGTTTGGTT----------CTACGGCTCCTAAC
**** *** ******** *********** ****
*** *********

GmWRKY20
GmWRKY46

TTGTATTTGTGTTTCTTTTTTAATTGCTTTCAGAAAGATAACGCCCAAATGGATGGATCG
T---ATTTGTGTTTCTTTTT-AATTGCTTTCAGAAAGGCAACGCCCAAATGGATGGATCA
*
**************** **************** ********************

GmWRKY20
GmWRKY46

TGTAAGAGTGAGCTGTGAGAGTGGTCTTGAAGGACCACATGAAGATGGTTACAACTGGAG
TGTAAGAGTGAGCTGTGAAAGTGGTCTTGAAGGACCACATGAAGATAGCTACAACTGGAG
****************** *************************** * ***********

GmWRKY20
GmWRKY46

AAAATATGGTCAGAAAGACATCCTTGGAGCCAAATATCCCAGGTGAGAGAACTTCCCTCG
AAAATATGGTCAGAAAGACATCCTTGGAGCCAAATATCCCAGGTGAGAGAACTTTCCTCT
****************************************************** ****

GmWRKY20
GmWRKY46

GTCCTGCTTTA-AAAAGAATTACAAGTTTT-CTTAAGGATAAAATTGCCTTCACCTTGGC
ATCCTGCTTTAGAAAAGAATCACAAGTTTTTCTTAAGGATAAAATTGCCTTCACCTTGGC
********** ******** ********* *****************************

GmWRKY20
GmWRKY46

CAGCTTCTAATTAACGACTCATTGTGACAATTTGCAGAAGTTACTATAGGTGCACCTTCC
CAGCTTCTAATAAACAACTCATTGTGACAATT-GCAGAAGTTACTATAGGTGCACCTTCC
*********** *** **************** ***************************

GmWRKY20
GmWRKY46

GCAGCACTCAGGGCTGTTGGGCAACAAAGCAAGTGCAGAGATCAGATGAAGATCCCACAA
GCAACACTCAGGGCTGTTGGGCAACAAAGCAAGTGCAGAGATCAGATGAAGATCCCACAG
*** *******************************************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TGTTTGACATAACTTACAGAGGAAATCATACCTGTTCTCAGGGAAACAATGCCGTTCTGC
TATTTGACATAACTTACAGAGGCAAGCATACCTGTTCTCAGGGAAACAATGCCGTTCTGC
* ******************** ** **********************************

103

GmWRKY20
GmWRKY46

CACCCAAGTCACCAGAAAAACATGAGAAACCAGCACACAGTCATAACATTGACATTCACC
CACCTAAGTCACCAGAAAAACAAGAAAAACCAACACACAGTCATAACATTGATATTCACC
**** ***************** ** ****** ******************* *******

GmWRKY20
GmWRKY46

ATGCACAGGCATCACAAGAAAGCCTTGCAAAGTTCAGAAGTATCTTGTCTGTCAACACAG
GTGCACAGGCATCTCAAGAAAGCCTTACAAAGTTCAGAAACATCTTGTCTGTCAACACAG
************ ************ ************ *******************

GmWRKY20
GmWRKY46

ATAATCTGGACAATGGAGATATGGCATATGCTTTCACTTTCCCTTCCACTTCATTTGGAT
ATAATCTGAACAATGGAGATATGGCATATCCTTTCACTTTCCCTTCAACTTCATTTGGAT
******** ******************** **************** *************

GmWRKY20
GmWRKY46

GCATGAAACAAGACAACCACAGCTTGATTCCTTTGGCCCTGGAGAATGACTCCTTCTTAA
GCATGAAACAAGACAACCACAGCTTGATTCCTTGGGCCCTGGAGAACGAGTCCTTCTTAA
********************************* ************ ** **********

GmWRKY20
GmWRKY46

GCGACCTATACCAAACACACCTGTTATCCCCAACAACACCAGAATCAAATTATTTCCCAT
GCGACCTATACCAAACACACCTTTTATCCACAACAATACCAGAATCAAACTATTTCCCAT
********************** ****** ****** ************ **********

GmWRKY20
GmWRKY46

CTCCAACTTTCCAGATGAATGAGTTTGATGGGATCTACAACAGGTCACATTCGAAATCCG
CTCCAACTTTCCAGATGAATGTGTTTGATGGGATCTACAGCAAGCCACATTCGGAATCCG
********************* ***************** ** * ******** ******

GmWRKY20
GmWRKY46

ATATCAATGAGATCATTTCCACCAACACATCAGCAACCAATTCTCCAATTCCTGATTTCA
ATATCAATGAGATCATTTCCACCAACACATCAGCAACCAATTCTCCAATTCCTGATTTCA
************************************************************

GmWRKY20
GmWRKY46

ATTTCTCACTTGATCCGGTGGAAATTGATCCAAATTTCCCTTTCAATACCCCAGGATTTT
ATTTCTCACTTGATCCAGTGGAAATTGACCCAAATTTCCCTTTCAATACCCCAGGACTTT
**************** *********** *************************** ***

GmWRKY20
GmWRKY46

TGTGCTGA
TCTCCTGA
* * ****

Obs.: Os primers utilizados nas construes de silenciamento esto marcados em cores, segundo a
legenda abaixo. As seqncias homlogas entre os dois genes, alvos das construes RNAi
utilizadas esto sublinhadas.
Legenda:
RNAi1 For
RNAi2 For
RNAi1/2 Rev

104

Alinhamento das seqncias codificantes:

GmWRKY20
GmWRKY46

ATGGAGAGTGACTTGAGCTGGGAGCGGAACACACTCATCAATGAGCTAATTCAGGGGATG
ATGGAGAGTGACTTGAGCTGGGAGCAGAACACGCTCATAAATGAGCTAATTCAGGGGATG
************************* ****** ***** *********************

GmWRKY20
GmWRKY46

GAGGTAGCAAGGAAGTTGAAGGCTGACTTGAAGTTGCCGTATTCAGTTGACACAAGAGAT
GAGGTAGCAAGGAAGTTGAAGGCAGACTTGAGGATGCCGTATTCAGTTGACTCAAGAGAT
*********************** ******* * ***************** ********

GmWRKY20
GmWRKY46

CTGCTTCTGCAGAGGATATTATCTTCTTACGAAAAGGCTCTACTGATTCTAAGATGCAGC
TTGCTTGTGCAGAGGATATTATCTTCTTATGAAAAGGCTCTACTGATTCTAAGATGCAAT
***** ********************** ****************************

GmWRKY20
GmWRKY46

AATGCATCAACTTCCGAGTTGCAGGGCATGAATCAAGCAACACCAACTTTGCTACCCGAG
GCATCATCAACTTCCGAGTTGCAGGCCATGAGTCAAGCAACACCAACTTTGCTACCCGAG
********************* ***** ****************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TCCCCATTATCTGTCCATGGAAGTCCTCTGCGCGAGGACGTTCATGGGGCCATCAAGGAT
TCCCCATTATCTGTCCATGGAAGTCCTCTGCGCGAGGACGTTGATGGGACCATCAAGGAT
****************************************** ***** ***********

GmWRKY20
GmWRKY46

CACCA------------TAATTCAAAGAAAAGAGAGATAACGCCCAAATGGATGGATCGT
CACCAAGAAGTTAAACATGATTCAAAGAAAAGAAAGGCAACGCCCAAATGGATGGATCAT
*****
* ************** ** ******************** *

GmWRKY20
GmWRKY46

GTAAGAGTGAGCTGTGAGAGTGGTCTTGAAGGACCACATGAAGATGGTTACAACTGGAGA
GTAAGAGTGAGCTGTGAAAGTGGTCTTGAAGGACCACATGAAGATAGCTACAACTGGAGA
***************** *************************** * ************

GmWRKY20
GmWRKY46

AAATATGGTCAGAAAGACATCCTTGGAGCCAAATATCCCAGAAGTTACTATAGGTGCACC
AAATATGGTCAGAAAGACATCCTTGGAGCCAAATATCCCAGAAGTTACTATAGGTGCACC
************************************************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TTCCGCAGCACTCAGGGCTGTTGGGCAACAAAGCAAGTGCAGAGATCAGATGAAGATCCC
TTCCGCAACACTCAGGGCTGTTGGGCAACAAAGCAAGTGCAGAGATCAGATGAAGATCCC
******* ****************************************************

GmWRKY20
GmWRKY46

ACAATGTTTGACATAACTTACAGAGGAAATCATACCTGTTCTCAGGGAAACAATGCCGTT
ACAGTATTTGACATAACTTACAGAGGCAAGCATACCTGTTCTCAGGGAAACAATGCCGTT
*** * ******************** ** ******************************

GmWRKY20
GmWRKY46

CTGCCACCCAAGTCACCAGAAAAACATGAGAAACCAGCACACAGTCATAACATTGACATT
CTGCCACCTAAGTCACCAGAAAAACAAGAAAAACCAACACACAGTCATAACATTGATATT
******** ***************** ** ****** ******************* ***

GmWRKY20
GmWRKY46

CACCATGCACAGGCATCACAAGAAAGCCTTGCAAAGTTCAGAAGTATCTTGTCTGTCAAC
CACCGTGCACAGGCATCTCAAGAAAGCCTTACAAAGTTCAGAAACATCTTGTCTGTCAAC
**** ************ ************ ************ ***************

GmWRKY20
GmWRKY46

ACAGATAATCTGGACAATGGAGATATGGCATATGCTTTCACTTTCCCTTCCACTTCATTT
ACAGATAATCTGAACAATGGAGATATGGCATATCCTTTCACTTTCCCTTCAACTTCATTT
************ ******************** **************** *********

105

GmWRKY20
GmWRKY46

GGATGCATGAAACAAGACAACCACAGCTTGATTCCTTTGGCCCTGGAGAATGACTCCTTC
GGATGCATGAAACAAGACAACCACAGCTTGATTCCTTGGGCCCTGGAGAACGAGTCCTTC
************************************* ************ ** ******

GmWRKY20
GmWRKY46

TTAAGCGACCTATACCAAACACACCTGTTATCCCCAACAACACCAGAATCAAATTATTTC
TTAAGCGACCTATACCAAACACACCTTTTATCCACAACAATACCAGAATCAAACTATTTC
************************** ****** ****** ************ ******

GmWRKY20
GmWRKY46

CCATCTCCAACTTTCCAGATGAATGAGTTTGATGGGATCTACAACAGGTCACATTCGAAA
CCATCTCCAACTTTCCAGATGAATGTGTTTGATGGGATCTACAGCAAGCCACATTCGGAA
************************* ***************** ** * ******** **

GmWRKY20
GmWRKY46

TCCGATATCAATGAGATCATTTCCACCAACACATCAGCAACCAATTCTCCAATTCCTGAT
TCCGATATCAATGAGATCATTTCCACCAACACATCAGCAACCAATTCTCCAATTCCTGAT
************************************************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TTCAATTTCTCACTTGATCCGGTGGAAATTGATCCAAATTTCCCTTTCAATACCCCAGGA
TTCAATTTCTCACTTGATCCAGTGGAAATTGACCCAAATTTCCCTTTCAATACCCCAGGA
******************** *********** ***************************

GmWRKY20
GmWRKY46

TTTTTGTGCTGA
CTTTTCTCCTGA
**** * ****

Obs.: Os primers utilizados nas reaes de RT-qPCR esto marcados em cores, segundo a
legenda abaixo. Os fragmentos amplificados para cada gene esto sublinhados.
Legenda:
GmWRKY46 RT For
GmWRKY46 RT Rev
GmWRKY20 RT For
GmWRKY20 RT Rev

106

ANEXO2:
Clculo do nmero de cpias do transgene atravs da quantificao relativa pela
anlise da curva padro.

107

A seguir so descritos os passos realizados para o clculo do nmero de cpias do

transgene2:
1.

As amostras de DNA de plantas transgnicas, assim como de plantas WT, foram

diludas 100, 1.000 e 10.000 vezes e submetidas RT-qPCR para a
quantificao, tanto do gene endgeno (Le1) quanto do gene-alvo GmWRKY20;

2.

Os valores de Ct obtidos para ambos os genes foram comparados e, a partir

destes, uma curva padro relativa para cada amostra de DNA foi obtida (Figura
25);

3.

Foi feita uma mdia dos valores plotados na curva padro para GmWRKY20 (em
azul), aps estes serem multiplicados pelos respectivos valores de diluio. Esta
foi utilizada para o clculo do nmero de cpias: primeiramente, as diferenas
de quantidade de input entre as amostras (WT e transgnica) foram
normalizadas pela multiplicao do valor obtido na planta transgnica pelo
fator de correo, o qual foi obtido pela relao entre o nmero de cpias de
Le1 inferidos na planta transgnica e na planta WT (Tabela 9);

4.

Uma segunda correo (regra de trs simples) foi feita para minimizar as
diferenas de eficincia apresentadas entre os primers utilizados (Tabela 9);

5.

Os dados corrigidos obtidos foram ento comparados (Tabela 9): a amostra de

uma planta WT foi utilizada para a calibrao; o nmero de cpias foi
determinado dividindo-se o valor obtido para a planta transgnica pelo valor
obtido para o calibrador, sendo o resultado multiplicado por dois (presumindo-se
que duas cpias do gene endgeno so esperadas no genoma diplide; Tabela 8
Resultados).

Os dados aqui apresentados servem apenas para a exemplificao da tcnica utilizada, sendo

referentes a uma linhagem WT e uma linhagem transgnica (IAS5 GmWRKY20 4.15) apenas.

108

Figura 25. Curvas padro relativas, geradas a partir dos valores de Ct e das quantidades de
DNA obtidas para o gene endgeno Le1 (em vermelho) e para o gene-alvo GmWRKY20 (em azul).
(A) planta WT; (B) planta transgnica. O software StepOne Plus Real Time PCR System (Applied
Biosystems) foi utilizado.

109

Tabela 9. Clculos realizados para a determinao do nmero de cpias do transgene.

110