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Biognius

(kit para aulas prticas de Biologia Molecular no Ensino


Secundrio)

Manual do utilizador

NDICE
ndice

Introduo

Modo de utilizao do manual

Contedos do kit

Experincia 1
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Introduo
Material necessrio
Material Opcional
Protocolo experimental
Proposta de Experincia

5
5
5
5
5
6
8

Experincia 2 (Conformao de Plasmdeos)


Introduo
Material necessrio
Protocolo experimental
Resultados Esperados

10
10
11
11
11

Experincia 3 (CSI: Fraude canina?)


Introduo
Material Biolgico
Protocolo Experimental
Resultados
Perguntas

13
13
14
14
14
15

Electroforese em gel de agarose


Material Necessrio
Preparao da Electroforese
a)
Preparao das Solues
b)
Preparao do Gel
c)
Aplicao das Amostras
d)
Condies de Electroforese
e)
Colorao do Gel

16
16
16
16
18
19
20
21

Figuras

22

Crditos e Contactos

32

Introduo
O kit Biognius o resultado de uma colaborao longa e
frutuosa entre professores de Biologia do ensino secundrio e
investigadores da rea da biologia molecular de diversas instituies,
no mbito de uma parceria com a Ordem dos Bilogos.
O principal objectivo foi o de fazer chegar aos professores um
conjunto de materiais que lhes permitam realizar aulas prticas
direccionadas para o programa de Biologia do 12 ano, nomeadamente
no captulo da Biotecnologia, que sejam didcticas, motivadoras e que
permitam a participao activa de todos os alunos.
A principal preocupao foi a de fazer chegar esse material a
todas as escolas do pas, permitindo que um docente possa realizar
estas experincias independentemente de existirem ou no
infraestruturas laboratoriais disponveis (laboratrios, bancadas,
equipamento, material descartvel, etc.). Na realidade, para a
realizao de todas as experincias deste kit, um professor necessita
apenas de gua destilada e de um forno microondas ou pequeno fogo
para banho-maria.
Adicionalmente, foi um objectivo deste projecto conceber um kit
que proporcionasse escola uma base de equipamento simples, eficaz
e pouco dispendioso que possa ser utilizado ano aps ano, num
sistema aberto que possa ser utilizado com recargas disponveis de
reagentes ou material biolgico preparado pelos professores.
O presente manual disponibiliza toda a informao para a
realizao das experincias. Para qualquer informao adicional
desejada so disponibilizados contactos que podem funcionar como
uma help desk para os docentes e formadores.
Este material foi testado em Escolas Secundrias de todo o pas
nos ltimos dois anos por professores e alunos de Vinhais a
Almodvar, de Bragana a Faro. A todos os envolvidos, os nossos
agradecimentos. Aos novos utilizadores, os nossos votos de sucesso.

Jos Matos
(coordenador do Projecto)

Modo de utilizao do Manual


O presente kit inclui 3 experincias diferentes:

Experincia 1:
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Parte 2 - Proposta de Experincia: O DNA parte-se?

Experincia 2:
Conformao de plasmdeos

Experincia 3:
CSI: Fraude canina?

Para cada experincia so fornecidos protocolos detalhados que


podem ser fornecidos directamente aos alunos ou adaptados pelo
professor ao calendrio de aulas particular.
Todas as experincias incluem um passo de electroforese em gel
de agarose. A preparao do gel de agarose, solues tampo,
marcadores, colorao do gel, etc. so passos comuns a todas as
experincias, pelo que so apresentados em separado.
Nas figuras so apresentadas diversas fotos ilustrativas dos
vrios processos, que podem auxiliar a compreenso das experincias.
So ainda fornecidas propostas de questionrios para os alunos
que, igualmente, podero ser utilizadas como tal ou adaptadas s
necessidades particulares.

CONTEDOS DO KIT:
1

Tubo com etanol (~20 mL)

Tubo com agarose (~4 g, suficiente para 400 mL, cerca de 16


gis de electroforese)

Tubo tampo TBE 10X (~40 mL, suficiente para 400 mL de


soluo 1X)

Tubo tampo TE (~5 mL, para a 1 experincia)

Saco de pontas de pipeta amarelas

Saco de microtubos tipo eppendorf

Seringa

Pilhas de 9V/(Ou carregador)

Placa de Petri

Tina de electroforese

Pente para a tina

Tabuleiro para a tina

Cabos de ligao (preto e vermelho)

CD (com Manual de Instrues)

Caixa de reagentes contendo:


1 tubo de clulas bacterianas
1 tubo Marcador (transparente, 50 L)
1 tubo DNA plasmdico digerido (verde, 35 L)
1 tubo DNA plasmdico (transparente, 35 L)
1 tubo DNA da me (cor-de-rosa; 35 L)
1 tubo DNA pai possvel 1 (azul, 35 L)
1 tubo DNA pai possvel 2 (amarelo; 35 L)
1 tubo DNA filho (verde; 35 L)
1 tubo corante (30 mg)
1 tubo SDS 10% (em gua; 800 L)
1 tubo tampo de aplicao (50 L)
4

Experincia 1:
Parte 1 - Extraco de DNA genmico
Introduo:
Nesta experincia os alunos tero possibilidade de visualizar
DNA genmico com um grau de pureza substancialmente mais elevado
do que aquele que normalmente fazem nas aulas, vulgarmente a partir
de extractos de cebola, morango ou kiwi. Alm disso, esta experincia
no termina com a visualizao do DNA. Os alunos podero,
posteriormente, analisar, manipular e visualizar o DNA atravs de
electroforese em gel de agarose, utilizando este kit.
Para esta experincia foi utilizada uma estirpe de bactrias E.
coli, (obviamente no patognica), cultivada em meio lquido rico, com
agitao moderada a 37 C. Aps 24 horas a cultura foi centrifugada a
10 000 rpm durante 10 minutos. As clulas recolhidas no fundo do
tubo esto includas no kit (tubo clulas bacterianas). A extraco
poder ser realizada previamente ou durante as aulas com os alunos.
(Nota: a segunda parte desta experincia pode ser tambm realizada
com DNA extrado a partir de qualquer outro material biolgico e/ou
com mtodos de isolamento alternativos, por exemplo o DNA extrado
a partir de morango ou kiwi, pelos mtodos rudimentares
convencionais.)
Material necessrio (enviado no kit):
-

Tubo com Clulas bacterianas (tubo tipo Falcon de cerca de


20 mL)
SDS 10% (sodium dodecil sulphate/dodecil sulfato de sdio, em
gua)
Tampo TE (Tris-EDTA, Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0; EDTA a
1 mM)
Etanol (EtOH)
Material opcional:
-

Placa de Petri (enviada)


Ponta de pipeta amarela (enviada)
Tubos de microcentrfuga tipo Eppendorf (enviado)
Pipeta de Pasteur de vidro (no enviada)
5

Protocolo experimental:
1 - Ressuspender as clulas em 2,5 mL de tampo TE
Pipetar cerca de 2,5 mL de tampo TE para dentro do tubo (pode
utilizar uma pipeta normal do laboratrio ou medir com um copo
de vidro pequeno, ou simplesmente verter metade do volume
fornecido (~5 mL)), fechar o tubo com a tampa e ressuspender
por inverso do tubo na mo vrias vezes (alguns minutos)
suavemente, at a suspenso ficar homognea (No agitar
vigorosamente, o que provoca formao de espuma)
2 - Adicionar 300 L de SDS
Utilizar a seringa e uma ponta amarela. Inverter como no passo
anterior e deixar a incubar durante cerca de 20 minutos
temperatura ambiente, com agitao ocasional do tubo.
3 - Adicionar 5 mL de lcool
Adicionar etanol no dobro do volume do tampo TE (2 x 2,5 mL
= 5 mL), agitar suavemente invertendo o tubo algumas vezes.
Imediatamente se ver o DNA precipitado, de cor branca e
aspecto viscoso.
NOTA: No passo de adicionar o etanol convm que todos
os alunos prestem ateno, porque o surgimento do DNA
precipitado imediato. Se as clulas forem frescas, o DNA
aparece num novelo. De as clulas forem velhas (mais de
1 ms) provavelmente o DNA aparece em flocos brancos
dispersos.
4 - Retirar o DNA precipitado no tubo
O DNA dever ser retirado do tubo com um material estril. Ou
com uma ponta de pipeta amarela (fornecida) ou com uma
pipeta de Pasteur de vidro com a ponta previamente dobrada em
forma de anzol num bico de Bunsen/lamparina (por exemplo).
Alternativamente, o contedo do tubo pode ser vertido para
dentro da placa de Petri (fornecida) e da retirado para um tubo
de microcentrfuga novo.
5 Evaporar o etanol ao ar
6

J no tubo novo, este deve ser mantido aberto para deixar


evaporar o etanol. Quando o DNA estiver seco, ressuspender em
cerca de 100-250 L de tampo TE e agitar suavemente at o
DNA ficar totalmente dissolvido no tampo (a soluo ficar
bastante viscosa, tanto mais viscosa quando maior for a
quantidade de DNA extrado).
Esse DNA pode ser recuperado do tubo e utilizado para um
variado nmero de experincias. Aqui, em seguida, proposta uma
delas.

Parte 2 - Proposta de Experincia: O DNA parte-se?


Introduo
O objectivo desta experincia o de sujeitar o DNA a diferentes
condies de armazenamento e analisar o seu efeito na integridade da
molcula de DNA.
Material necessrio:
-

DNA extrado no passo anterior


Tubos tipo eppendorf
seringa
pontas amarelas
tampo de aplicao

Protocolo experimental:
O DNA recolhido no passo anterior dever ser dividido por vrios
tubos, cada um distribudo a um grupo de alunos, ficando um dos
tubos no laboratrio da escola (por exemplo 5 grupos formados,
dividindo o DNA extrado por 6 tubos, cada um com 30-50 L cada
um).
Cada grupo dever levar o seu tubo de DNA para casa
sujeitando-o a diferentes condies de armazenamento. Por exemplo:
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo
Grupo

1:
2:
3:
4:
5:

Armazenar o DNA no frigorfico a 4 C


Armazenar o DNA no congelador a -20 C
Abrir o tubo e adicionar-lhe umas gotas de saliva
Submeter o DNA a alguns segundos no microondas
Ferver o DNA durante alguns minutos em banhomaria

Alternativas:
-

congelar e descongelar vrias vezes;


macerar um pouco do precipitado de DNA antes de o
colocar em suspenso;
ferver e depois colocar no gelo (versus ferver e no
colocar no gelo.

NO ESQUECER: Deixar uma amostra de DNA no laboratrio, sem


submeter a qualquer processo, para utilizao como controlo negativo.
Na aula seguinte, os alunos devero trazer o seu tubo e
identificar qual o mau-tratamento a que submeteram a amostra.
1-

De todas as amostras (aquelas trazidas de casa e o


controlo) deve ser retirada uma fraco de cerca de 10 L
para um novo tubo e adicionado cerca de 5 L de tampo
de aplicao (lquido azul) para dar densidade e permitir
a sua visualizao, para posterior anlise em electroforese
em gel de agarose

(Ver Protocolo de: Electroforese em gel de agarose)


Resultados esperados: O DNA genmico, quando analisado em
gel de agarose, aparece com um aspecto de cauda de cometa, sendo
a cauda tanto mais comprida e tanto mais baixa quanto maior for o
grau de degradao do DNA. Assim, tratamentos mais violentos para o
DNA iro desnatur-lo e/ou fracturar a sua molcula em fragmentos
mais pequenos, originando uma cauda que corre mais baixo no gel.

Experincia 2:
Conformao de plasmdeos
Introduo:
Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA circular fechado,
que se encontram em clulas de microrganismos (por exemplo
bactrias e leveduras) e que tm capacidade de replicao autnoma
(independente da replicao do DNA cromossmico do organismo). O
seu tamanho varivel, podendo atingir centenas de milhares de
bases (megaplasmdeos). Todavia, os plasmdeos que so utilizados
como vectores de transporte de inseres de DNA estranho (foreign
DNA) para o interior das clulas tm normalmente uma dimenso
muito pequena para facilidade de manipulao (2-5 kpb).
As trs caractersticas principais de um plasmdeo para poder ser
utilizado como vector so:
-

Possuir uma origem de replicao que lhe permita replicar


autonomamente (podem existir centenas de cpias de um
plasmdeo numa clula).
Possuir uma sequncia nica que seja reconhecida por
uma dada enzima de restrio (para que seja possvel
cortar o DNA num nico local, permitindo a linearizao do
DNA circular e posterior insero do DNA estranho)
Possuir um gene de seleco que permita diferenciar as
clulas que incorporaram o plasmdeo daquelas que no o
fizeram (normalmente um gene de resistncia a um
antibitico. Deste modo, aps a transformao, as clulas
so plaqueadas em meio contendo esse antibitico e
apenas aquelas que se desenvolverem em colnias nesse
meio tero incorporado o vector que lhes conferiu
resistncia)

Nesta experincia vamos utilizar, alternativamente, um de dois


plasmdeos muito comuns em Biologia Molecular: pUC18 (ver mapa,
Figuras 2 e 3) com 2686 pb (pares de bases) de comprimento OU
pCR2.1 (ver mapa, Figura 4) com 3900 pares de bases.

10

Material necessrio
-

DNA plasmdico (tubo transparente)


DNA plasmdico digerido (tubo verde)
Marcador (tubo transparente)

Protocolo experimental:
So fornecidos no kit amostras de plasmdeo normal (DNA
plasmdico, tubo branco) e plasmdeo digerido (DNA plasmdico
digerido) tubo verde.
A experincia consiste em calcular o tamanho aproximado do
plasmdeo e analisar a sua conformao atravs de electroforese em
gel de agarose (Ver abaixo: Electroforese em gel de agarose).
Para tal, os alunos tero que
1-

Preparar uma electroforese em gel de agarose (ver


protocolo, pg 16)

2-

Aplicar uma amostra de cada um dos plasmdeos (digerido


e no digerido) em pistas diferentes e uma amostra de
marcador num poo adjacente

3-

Separar os fragmentos por electroforese

4-

Corar o gel

5-

Avaliar o peso molecular do plasmdeo por comparao


com o peso molecular das bandas (conhecidas) do
marcador (ver figuras 5 e 19).

6-

Explicar a existncia de vrias bandas no plasmdeo no


digerido

Resultados esperados:
Marcador:
O marcador constitudo por 3 bandas (ver foto 5) de 3000,
1000 e 500 pares de bases, respectivamente. Em alguns casos ser
ainda visvel uma 4 banda de cerca de 2000 pares de bases.
11

O DNA plasmdico digerido (linearizado) apresentar uma banda


nica situada entre as bandas do marcador de 3000 e de 1000 pb,
revelando que o plasmdeo ter um tamanho prximo dos 2500 (caso
o kit contenha pUC18) OU acima da banda de 3000 pb, revelando que
o plasmdeo ter um tamanho prximo dos 4000 (caso o kit contenha
pCR2.1). Numa verso mais sofisticada podero medir as distncias de
migrao das bandas do marcador, fazer uma representao grfica
em papel semi-logartmico entre os pesos moleculares e a distncia de
migrao, calcular a distncia de migrao do plasmdeo e extrapolar o
seu tamanho de uma forma mais aproximada.
Todavia, o plasmdeo normal (no digerido) apresentar vrias
bandas, nenhuma delas prximo da banda respectiva do plasmdeo
linearizado (2600 pb/4000 pb). Uma(s) estaro mais acima, outra(s)
mais abaixo. Porqu?
A razo tem a ver com o facto de o plasmdeo no digerido no
se comportar no gel de modo igual a um fragmento linearizado. Na
verdade, o plasmdeo (DNA circular fechado) pode tomar vrias
conformaes distintas, desde a sua forma mais relaxada at forma
enrolada ou super-enrolada (supercoiled). (Ver figura 19). Na forma
relaxada ter mais dificuldade de atravessar a malha da agarose, por
isso formar uma banda mais acima do gel (mais prxima do poo).
Na conformao super-enrolada, migrar mais facilmente do que a
forma linearizada, originando banda(s) mais abaixo.

12

Experincia 3:
CSI: Fraude canina?
Introduo:
Esta experincia pretende ser uma introduo rea do DNA
fingerprinting e da utilizao de marcadores genticos em cincias
forenses, atravs dos quais possvel identificar/excluir um potencial
suspeito.
Aproveitando a popularidade das sries televisivas norteamericanas CSI Miami/SCI NY, etc., podem designar este trabalho
como CSI Lisboa, CSI Mogadouro, etc.
Tentando afastar a utilizao de casos (hipotticos) humanos, foi
criada a seguinte situao:
O Sr. Alo comprou um co a um criador de uma raa muito
apreciada. Querendo um animal de grande qualidade, sem olhar a
custos, pediu ao criador que lhe vendesse o melhor co da sua
explorao.
O criador vendeu-lhe um co garantindo que o pai era um co
da sua explorao, campeo nacional em exposies.
Imensamente feliz, o Sr. Alo levou para casa um belo cachorro
que em breve se desenvolveu num co adulto nada parecido com o
seu pai, sem aquele porte altivo nem caractersticas de campeo.
Admitindo a hiptese de ter sido ludibriado, o Sr. Alo voltou
explorao, recolheu amostras de plo da me, do alegado pai,
campeo, mas tambm de um outro macho adulto daquela raa que
partilhava o canil, e que poderia muito bem ser ele o verdadeiro pai,
pois no partilhava as caractersticas de porte e pujana do afamado
co e tinha fortes semelhanas com o animal adquirido.
Tendo assim amostras de plo dos dois putativos pais, da me e
do filho (o seu prprio co), o Sr. Alo pediu a um geneticista
molecular que corresse uma bateria de testes com marcadores
genticos, que permitissem identificar a paternidade do seu animal.
No laboratrio, os tcnicos extraram DNA dos plos de cada um
dos animais (em extraces totalmente separadas, de modo a evitar
13

cruzamento das amostras), e amplificaram, pela tcnica de PCR


(Polymerase Chain Reaction/Reaco da Polimerase em Cadeia) um
fragmento especfico de candeos (e bastante polimrfico) que pode
originar dois alelos diferentes (heterozigotia) ou iguais (homozigotia)
em cada um dos indivduos.
Os produtos dessas amplificaes esto agora nas vossas mos
para poderem analisar por electroforese em gel de agarose (ver
protocolo: Electroforese em gel de agarose) a eventual paternidade
dos indivduos analisados.
Material biolgico:
DNA da me
DNA do pai possvel 1
DNA do pai possvel 2
DNA do filho
Marcador

(tubo
(tubo
(tubo
(tubo
(tubo

cor-de-rosa)
azul)
amarelo)
verde)
transparente)

NOTA: Os DNAs j vm com tampo de aplicao (azul) pelo que s


necessrio aplicar as amostras no gel, a partir dos tubos indicados
acima.
Protocolo experimental:
12-

3
4
5
6

preparar uma electroforese em gel de agarose (ver


protocolo)
aplicar uma amostra (10 L) de cada um dos materiais
biolgicos fornecidos (Me, pai 1, pai 2, filho) em pistas
diferentes e uma amostra de marcador num poo
adjacente (o marcador opcional).
Separar os fragmentos por electroforese
Corar o gel
Registar as bandas.
Analisar os resultados

Resultados:
Para facilidade, diremos que tanto a me como um dos pais
putativos so homozigticos para este marcador, pelo que s
apresentam uma banda. O filho ser heterozigtico, apresentando
duas bandas. Uma vinda da me e outra do pai. Como h certeza
sobre a me, uma das bandas do filho ser automaticamente
14

identificada. O outro alelo (a outra banda) ter que vir do pai. Falta
ento identificar qual dos potenciais pais possui um alelo igual ao do
filho.
Tendo a me dois alelos de 1000 pares de bases (homozigtica),
o filho ter obrigatoriamente esse fragmento. O filho ter outro
fragmento de 600 pb. Como apenas um dos possveis pais possui a
banda de 600 pb, esse pai compatvel com a paternidade. O outro
NO pode ser o verdadeiro pai, uma vez que homozigtico para a
banda a 3000 pb, no tendo o filho nenhuma banda desse tamanho.
O professor seleccionar qual das situaes deseja contemplar:
Ausncia de fraude: o campeo nacional o pai verdadeiro
Presena de fraude: o campeo nacional no o pai verdadeiro
Perguntas:
-

Dos quatro intervenientes, quais so homozigticos e quais so


heterozigticos?

Qual dos dois pais poder ser excludo?

Podemos dizer que o outro co de certeza absoluta o pai?

Em relao ao animal que foi excludo, podemos dizer que, de


certeza absoluta, no ele o pai?

As questes acima destinam-se a contemplar


situao, comum a todos os testes de genotipagem:

seguinte

Se o filho no tem um perfil compatvel com a paternidade,


ento podemos afirmar, com toda a certeza, que aquele possvel pai
NO PODE ser o verdadeiro pai.
Todavia, se o filho tem um perfil compatvel com a paternidade,
apenas essa afirmao que pode ser feita. Ou seja, que este animal
PODE SER pai daquele co, no sendo possvel garantir que o seja,
porque qualquer outro co com aquele perfil compatvel poderia ser o
verdadeiro pai. Apenas em populaes confinadas no espao (por
exemplo peixes num aqurio, bovinos numa vacaria, etc.), sem
hipteses de contacto com o exterior e em que tenham sido
genotipados TODOS os machos em idade de reproduo, apenas nesse
caso se poderia afirmar que aquele pai seria o nico pai possvel.
15

Electroforese em gel de agarose


NOTA: O tabuleiro e o pente da tina de electroforese esto cobertos
por uma pelcula aderente para proteco do plstico (branca com ou
sem letras no caso dos tabuleiros e verde no caso dos pentes). Essa
pelcula DEVE SER REMOVIDA antes da utilizao destes componentes)
Material necessrio:
Para a tina de electroforese:
Tina (com tampa)
Tabuleiro
Pente
Elctrodos (fio vermelho e fio preto)
5 pilhas de 9 V/OU carregador
Fita cola (no fornecida)
Para as solues:
Tampo TBE (10x)
Agarose
gua (no fornecida. Usar gua destilada ou a gua mais pura a
que tiver acesso)
Para as amostras:
Tampo de aplicao
Seringa
Pontas amarelas
DNA das experincias anteriores (1, 2 e 3)
Preparao da electroforese:
a) Preparao das solues
O gel de agarose tem que ser preparado em tampo TBE a 0,5 x. O
tampo fornecido vem concentrado 10 x, portanto ter que ser
diludo 1:20 na gua mais pura que tiverem (gua destilada, gua
bidestilada, gua Mili-Q, etc.). Se no tiverem acesso a gua
qumica e bacteriologicamente pura, pode ser utilizada gua da
torneira, embora com piores resultados.

16

Para um gel necessrio cerca de 40-50 mL de tampo. Para cobrir


o gel de uma tina necessrio cerca de 100 mL, o que significa que
por cada experincia necessitaro no mximo de 150 mL. Mas
podem preparar logo uma maior quantidade (por exemplo,
500 mL). Se a gua tiver boa qualidade e for estril, a soluo pode
manter-se estvel durante longos perodos. O tampo enviado est
concentrado 10 x. Para uma soluo de 0,5 x pode proceder-se
seguinte diluio:
Tampo TBE:
Tampo TBE 10 X
gua destilada estril
Volume final

20 mL
380 mL
400 mL

Agitar para homogeneizar a soluo (por exemplo colocando a


soluo num frasco com rolha hermtica e invertendo o frasco vrias
vezes).
Aps utilizao, o tampo deve ser mantido em frasco rolhado
temperatura ambiente. Se, aps longos perodos sem utilizao, a
soluo ficar contaminada com fungos ou outros microrganismos,
descartar e preparar nova soluo.
Agarose
A soluo de agarose deve ser preparada em tampo TBE 0,5 x
(NOTA: no preparar a agarose no TBE 10X fornecido. Diluir primeiro o
tampo como acima descrito)
Para os trabalhos presentes a agarose deve ser preparada
sempre na concentrao de 1%:
1,0% de agarose (p/v) (1 g de agarose/100 mL de tampo TBE
0,5x)
Preparao da soluo de agarose a 1%
-

Pese 1 g de agarose e dissolva em 100 mL de tampo TBE


0,5X num frasco com rolha hermtica.
Agitar para diluir um pouco.
Colocar no microondas por perodos curtos (15 segundos
de cada vez),
Agitar novamente
17

Repetir a operao (15 s no microondas + agitao at a


soluo ficar TOTALMENTE transparente.

(NOTA: Se existirem ainda gros de agarose no dissolvidos, o gel no


ficar homogneo aps solidificao, prejudicando a separao dos
fragmentos de DNA)
Preparao do corante do gel (Nile Blue):
O corante do gel fornecido em p dentro de um tubo
identificado como corante. Para se preparar a soluo, todo o
contedo do tubo (40 mg) dever ser dissolvido em 200 mL de gua
(a gua mais pura disponvel, de preferncia estril) (concentrao
final: 0,02%, ou seja, 0,02 g/100 mL de gua).
A soluo dever ser agitada at todo o corante estar bem
dissolvido.
A soluo DEVE SER OBRIGATORIAMENTE armazenada no
escuro (utilizar um frasco de vidro escuro, envolver o frasco com papel
de alumnio e guardar num armrio com porta), porque o corante se
degrada na presena de luz.
A soluo corante reutilizvel. Aps corar um gel, a soluo
dever ser novamente colocada no frasco e armazenada at nova
colorao.
b) Preparao do gel:
-

Vedar com fita-cola os dois lados abertos do tabuleiro do


gel (azul) que vem dentro da tina.
Colocar o tabuleiro numa bancada plana (certificar que o
tabuleiro fica totalmente horizontal, nivelado, para que o
gel no fique mais grosso de um lado e mais fino do
outro).
Verter para o tabuleiro cuidadosamente (devagar e sem
deixar formar bolhas) cerca de 40 mL de agarose fundida e
arrefecida at cerca de 45-50 C (quando j conseguir
segurar o frasco da agarose nas mos, sem se queimar).
Colocar imediatamente o pente a cerca de 1 cm de
distncia do fundo do tabuleiro e completamente paralelo
ao fundo do tabuleiro (ver figura 7)*.

18

Aguardar cerca de 30 minutos, at o gel estar totalmente


solidificado.
Remover o pente para cima, perpendicularmente, com
cuidado para no destruir os poos.
Retirar cuidadosamente a fita-cola, mantendo o tabuleiro
na horizontal, e colocar o gel com o tabuleiro dentro da
tina, com os poos para o lado do elctrodo preto.
Verter, cuidadosamente, tampo TBE 0,5x para dentro da
tina at cobrir todo o gel de tampo e o nvel deste atingir
cerca de 1 mm acima do gel. NOTA: todos os poos do gel
devero ficar cheios de tampo

*Os dentes dos pentes devem ficar submersos no gel cerca de 3


mm. Se ao colocar o pente verificar que os dentes ficam de fora ou
levemente em contacto com o gel, verta mais alguns mL de gel para
dentro do tabuleiro
c) Aplicao das amostras:
NOTA: Antes de aplicar as amostras coloque a tina com o gel no
local da bancada onde a electroforese vai decorrer. Aps a aplicao
das amostras a tina no dever ser tocada nem movida.
O volume das amostras a aplicar no deve exceder 10 L por
poo, j com o tampo de aplicao (azul) includo. As amostras
devem ser colocadas sequencialmente nos poos e deve ser anotado
imediatamente, qual a amostra que foi colocada em cada poo. Os
poos devem ser numerados de 1 a 8, num esquema no papel.
Exemplo:
1

1
2
3
4
5
6
7
8

Marcador
DNA congelado (grupo 1)
DNA fervido (grupo 2)
DNA armazenado a 4 C (grupo 3)
DNA incubado com saliva (grupo 4)
DNA sujeito a microondas (grupo 5)

19

Se tiver que aplicar 8 amostras, pode utilizar todos os poos. Se


possuir apenas at 6 amostras para aplicar, dever evitar utilizar os
poos das extremidades (poos 1 e 8) por serem aqueles em que as
amostras migram de forma menos homognea.
Se tiver um nmero menor de amostras (por exemplo na
experincia dos plasmdeos tm apenas 3 amostras) podem deixar um
poo de intervalo entre as amostras, para evitar que uma amostra
verta de um poo para o do lado e contamine as amostras dos poos
adjacentes.
ATENO: aps a colocao das amostras no deve mover a
tina.
d) Condies de electroforese:
Aps preparao do gel e colocao das amostras:
-

Colocar a tampa na tina


Ligar os elctrodos (preto ao plo negativo das pilhas;
vermelho ao plo positivo). No caso do carregador coloque
os fios nos elctrodos de cores correspondentes na tina e
ligue tomada (no importa a posio do carregador na
tomada)
Verificar se h passagem de corrente (nos elctrodos,
devero comear a libertar-se umas pequenas bolhas de
gs, mais do lado dos poos que do lado oposto)
Deixar a electroforese decorrer at frente azul escura do
corante chegar a cerca de 1 cm do final do gel (cerca de 2
horas, dependendo da espessura do gel, do estado das
baterias e da qualidade da gua utilizada)
Desligar os elctrodos
Retirar o gel cuidadosamente e faz-lo deslizar do
tabuleiro da tina para um recipiente adequado,
preferencialmente de vidro. Em alternativa utilizar a tampa
da tina como recipiente de colorao.

Nota: Durante o decorrer da electroforese, normal depositarem-se


cristais de sal ao longo do elctrodo, dentro da tina, formando uma
mucilagem a envolver o elctrodo. Esta mucilagem no interfere na
separao dos fragmentos e pode ser eliminada no final na
electroforese, eliminado o tampo da tina e esfregando o elctrodo
com o dedo ou um esfrego, suavemente, debaixo de gua corrente.
20

e) Colorao do gel
-

Colocar o gel num recipiente adequado aps electroforese.


Preferencialmente, o recipiente dever ser um tabuleiro de
vidro, pouco maior que o gel, mas com uma profundidade
que permita cobrir o gel totalmente com o corante.
Cobrir o gel TOTALMENTE com corante (Nile Blue)
preparado como descrito anteriormente (ver, Preparao
do corante para gel)
Deixar a corar (mnimo 60 minutos) com agitao
ocasional. (Os melhores resultados so obtidos com
colorao durante a noite. Assim, desejavelmente a
electroforese deve ser corrida num dia, o gel deixado
a corar durante a noite e visualizado no dia
seguinte).
Quando se comearem a ver as bandas, pode retirar-se o
gel e fazer o registo. Posteriormente pode prosseguir-se a
colorao por mais algum tempo.
Retirar o corante e vert-lo novamente para o frasco de
armazenamento do corante (o corante reutilizvel. Pode
corar muitos gis).
As bandas so melhor visualizadas colocando o gel sobre
um papel branco ou, de preferncia, sobre uma superfcie
branca iluminada por baixo.

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Figuras
4
1
2

5
6

8
12

13

11

10

Figura 1: Composio do kit (Imagem adaptada da revista National


Geographic (Portugal), N Fevereiro 2008):
1 Pilhas (5 x 9 V = 45 V) para funcionar como fonte de
alimentao
2 Clulas bacterianas para extraco de DNA
3 Tampo TBE/Etanol (ver rtulo)
4 Agarose (em p)
5 CD com informao e protocolos
6 Pontas amarelas para pipeta
7 Placa de Petri (esterilizada por radiao)
8 Tubos tipo Eppendorf
9 Seringa graduada (para usar como pipeta)
10 Caixa com reagentes (corantes, etc.) e material biolgico
(DNAs, etc.)
11 Cabos de ligao entre a tina e a fonte de alimentao
12 Tina de electroforese
13 Tabuleiro para o gel (com pente ao centro)

10

22

Figura 2: Mapa do plasmdeo pUC18*. O plasmdeo (DNA circular


fechado) possui 2686 pares de bases de comprimento. Possui uma
origem de replicao (rep (pMB1)); um gene de resistncia a um
antibitico (ampicilina, bla (ApR)), e um stio de clonagem mltiplo
(MCS, multiple cloning site, ver pormenor da Figura abaixo).

Figura 3: Pormenor do Stio de Clonagem Mltiplo do plasmdeo


pUC18: sequncia que reconhecida por vrias endonucleases (EcoRI,
HindIII, etc.) que s clivam o plasmdeo num stio nico (linearizam).
*Normalmente os plasmdeos so sintetizados aos pares (p.ex.
pUC18/pUC19, o que significa que o MCS, a zona de clonagem que
reconhece vrias enzimas de restrio, pode estar na orientao 2->5
(pUC18) ou na orientao inversa (pUC19).

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Figura 4: Mapa do plasmdeo pCR2.1 com 3900 pares de bases de


comprimento, possuindo a origem de restrio do pUC, genes de
seleco de resistncia a dois antibiticos (ampicilina e canamicina) e
um stio mltiplo de clonagem.

24

3000 pb

1000 pb
500 pb

Figura 5: Ilustrao do marcador fornecido contendo 3 bandas que


variam entre 500 e 3000 pares de bases.

(a)
1

(b)
2

Figura 6: Ilustrao esquemtica (a) e em microscopia electrnica de


varrimento (b) do plasmdeo na sua forma relaxada (1) e superenrolada (supercoiled) (2).

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Figura 7: Tabuleiro selado com fita-cola e com o pente colocado na


posio correcta

Figura 8: Soluo de Agarose (1%) fundida no microondas

Figura 9: Verter a agarose cuidadosamente no tabuleiro (a agarose


foi deixada arrefecer at cerca de 45 C)

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Figura 10: Tabuleiro com a agarose e o pente colocado na posio


correcta

Figura 11: Retirar o pente do gel aps solidificao (com uma das
mos segurar o tabuleiro e com a outra puxar o pente para cima,
perpendicularmente ao gel).

Figura 12: Verter o tampo cuidadosamente para a tina

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Figura 13: Gel totalmente coberto com tampo TBE(A)

(B)

Figura 14: Pipeta com um volume de amostra de 5 L (A) e 10 L (B)

Figura 15: Aplicao da amostra num poo do gel

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Figura 16: Sistema de electroforese montado. Electroforese a


decorrer

Figura 17: Electroforese a decorrer. Visualizao de bolhas de gs a


libertarem-se do elctrodo.

Figura 18: Colorao do gel (aplicao do corante na tampa da tina.


Pode ser feita, preferencialmente, num recipiente (tipo tabuleiro) de
vidro).

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ND

M
L
SE

R
3 kb

L
SE

500 pb

Figura 19: resultado de uma electroforese da Experincia 2, com o


plasmdeo pUC18 (2,6 kpb)
ND = No digerido
D = Digerido
M = Marcador
L Forma linearizada do plasmdeo
SE Forma super-enrolada do plasmdeo
R Forma relaxada do plasmdeo
NOTA: A banda do plasmdeo pUC18 situa-se entre as bandas de 3000
e de 500 pb, indicando um tamanho de cerca de 2700 pb (tamanho
real, 2686 pb). Por este mtodo os alunos podem identificar que se
trata de um plasmdeo pUC18 e no o pCR2.1, no qual a banda do
plasmdeo linearizado se situaria acima da banda de 3000 pb.

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Figura 20: Resultado de uma electroforese da Experincia 3 (Fraude


Canina)
M

P1

P2

Legenda:
M = Me;
P1 = Pai possvel 1;
P2 = Pai possvel 2;
F = Filho
O filho heterozigtico com dois alelos diferentes (1000 pb e
600 pb). Uma das bases vem da me, que homozigtica (1000 pb),
logo o alelo de 600 pares de bases s pode vir do Pai 1, porque o Pai 2
no tem esse alelo.

Figura 21: Aspecto do DNA precipitado (experincia 1)

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CRDITOS
Este trabalho foi financiado pelo Programa Cincia Viva6 e
teve o apoio das seguintes Instituies e colaboradores, sem os quais
no teria sido possvel a sua realizao.
Ordem dos Bilogos Doutor Pedro Loureno
Escola Secundria da Amadora (Amadora) Prof. Maria dos
Prazeres Cardoso Amaral Fragoeiro
Escola Secundria Fernando Lopes Graa (Parede) - Prof Joana
Capucho
Escola Secundria Ibn Mucana (Alcabideche) Prof Ana Maria
Queiroz de Macedo
Escola Secundria Jos Saramago (Mafra) Prof. Pedro Passos e
e Prof. Martinho Rangel
Escola Secundria Padre Alberto Neto (Queluz) Prof Manuela
Moura Lopes
Escola Secundria Stuart de Carvalhais (Massam) Prof Ana
Morais, Prof ngela Neves e Prof. Joo Carlos Ribeiro
INETI (Inst. Nac. Engenharia,
Grupo de Biologia Molecular do
Coordenador: Jos Matos
Investigadores: Fernanda Simes;
(design)
Tcnicos de Investigao: Diogo
Possante.

Tecnologia e Inovao, I.P.)


Departamento de Biotecnologia
Paula S Pereira; Joo Mascarenhas
Mendona, Carla Borges, Mafalda

CONTACTOS:
Para dvidas tcnicas:
Jos Matos
e.mail: jose.matos@inrbi.pt; jose.matos@ordembiologos.pt
Telefone: 217 127 141
Para aquisio de novos kits, seus componentes ou reagentes em
separado:
Bioprincpio: bioprincipio@gmail.com; Telef: 927 577 997 (Dr Sara
Duarte)

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