En el presente artculo se estudi la relevancia de la actividad enzimtica de las

polimerasas como un requisito indispensable para la vida. Dado que la capacidad

de replicar el genoma es un trabajo simple y universal, gracias a estas enzimas se
copian las secuencias de DNA y se fabrican secuencias iguales de DNA.
Se plante la hiptesis sobre el mecanismo de la DNA polimerasa, en el cual
interactan dos iones metlicos que catalizan la reaccin de la fosforil-transferasa
que promueve la secuenciacin del DNA.
Por medio de cristalografa, tcnicas bioqumicas y estudios genticos de
polimerasas de polinucletidos, se logr demostrar que estos iones metlicos son
de dos unido por tres carboxilatos contenidos en un dominio que no es homlogo
a otras polimerasas. Los iones metlicos A y B estabilizan tanto la estructura,
como la carga pentacovalente del estado de transicin que se produce durante el
curso de esta reaccin. Finalmente, ion de metal B se une y se propuso para
facilitar la dejando de la b- y g-fosfatos. Mecanismos qumicamente similares de
reacciones de transferencia de fosforilo de iones catalizada de dos metales son
utilizados por muchas enzimas, incluyendo ribozimas.
Se concluy que todas las polimerasas de polinucletidos pueden utilizar el mismo
mecanismo de dos iones metlicos de iones para catalizar las reacciones de la
Polimerasa Fosforil Transferasa. La fidelidad de los resultados de la sntesis de
ADN de una combinacin de interacciones Watson-Crick "forzadas" en el sitio
activo de la polimerasa y el sitio activo de la 39-exonucleasa. Los dominios del
pulgar y el dedo son estructuralmente diferentes en la totalidad de las familias de
polimerasa para las cuales estructuras cristalinas representativas son ahora
conocidos, aunque de forma anlogas posicionadas estructuras secundarias
funcionan de modo similar.

Posiblemente la actividad enzimtica apareci temprano en la evolucin fue la

de las polimerasas de polinucletidos, la capacidad de replicar el genoma
siendo con precisin un requisito previo para la evolucin s mismo. Por lo
tanto, se podra anticipar que el mecanismo por el que todo polimerasas

trabajo sera a la vez simple y universal. Adems, estos escribas enzimticos

deben fielmente copiar el secuencias del genoma en hija cido nucleico o la
informacin contenida dentro se perdera; por tanto, algn mecanismo de
asegurar la fidelidad se requiere. Por ltimo, todas las clases de polimerasas de
polinucletidos deben ser capaces de trasladar a lo largo la plantilla se copia
como sntesis de los ingresos. El cristal estructuras de numerosas ADN
polimerasas de diferentes familias sugieren que todos ellos utilizan un idntico
dos metalioncatalyzed-mecanismo de la polimerasa, pero difieren ampliamente
en muchas de sus caractersticas estructurales.
De las comparaciones de secuencias de aminocidos (1), as como el cristal
analiza estructura (2), las ADN polimerasas pueden dividirse en por lo menos
cinco familias diferentes, y el cristal representante estructuras son conocidas
por las enzimas en cuatro de estas familias. Tal vez el mejor estudiado de estas
familias es la ADN polimerasaI (pol I) 1 o una familia de la polimerasa, que
incluye el Fragmentos de Klenow de Escherichia coli y un ADN Bacillus
polimerasa I, ADN polimerasa de Thermus aquaticus, y la T7 ARN y ADN
polimerasas, cuyas estructuras de cristal son conocido (3-11). La segunda
familia de ADN polimerasas dependientes de ADN es una ADN polimerasa (pol
a) o ADN polimerasa de la familia B.
Todas las polimerasas de ADN y la replicacin eucariotas polimerasas de fagos
T4 y RB69 pertenecen a esta familia, y una estructura de cristal de la
polimerasa RB69 muestra algunos similitudes con las enzimas de la familia pol
I y numerosas diferencias (12). Transcriptasas inversa (RT), ARN dependiente
de ARN polimerasas, y la telomerasa parecen mostrar algunos comunes
similitudes estructurales, mientras que la estructura de la ADN polimerasa b
muestra ninguna relacin estructural con cualquiera de estos anterior familias
(13, 14). Sobre la base de la secuencia de aminocidos comparaciones, pero no
hay estructuras cristalinas, parece que la bacterianas ADN polimerasa III
enzimas tambin forman una familia que no est relacionado con las
polimerasas de estructura conocida (1).
Independiente de sus estructuras de dominio que se detallan todas las
polimerasas, cuyas estructuras son conocidas actualmente parecen compartir
una caracterstica arquitectnica global comn. Tienen una forma que puede
compararse con la de una mano derecha y han sido descrito como un conjunto
de dominios de dedos "" pulgar "," palma "y" (15). La funcin del dominio de
palma parece ser catlisis de la reaccin de transferencia de fosforilo mientras
que la de el dominio de los dedos incluye interacciones importantes con el
trifosfato de nuclesido entrante, as como la base de la plantilla a la que se
empareja. El pulgar por otro lado puede desempear una papel en el
posicionamiento del dplex de ADN y en procesividad y translocacin. Aunque
el dominio de palma parece ser homloga entre la pol I, pol una, y las familias
de RT, los dedos y dominios pulgar son diferentes en los cuatro de estas
familias para que las estructuras se conocen hasta la fecha (16).
Aqu las similitudes y diferencias funcionales y estructurales entre las
polimerasas de estructura conocida se exploran. De particular inters son el

papel de la edicin en la fidelidad de copia, el mecanismo enzimtico comn de

polimerasas, y las maneras en las que la funcin de las diferentes estructuras
de dominio en la reaccin de la polimerasa en formas anlogas.
Las diferencias estructurales entre las polimerasas
Aunque los dominios palma de la pol I, pol una, y las familias RT son
homlogos, los dedos y el pulgar dominios son completamente diferente en las
estructuras de todas las familias (16). En la estructura de la ADN polimerasa de
RB69 cinco dominios estn dispuestos alrededor de un agujero central (12). En
esta enzima el dominio dedos consiste en gran parte en dos muy larga espiral
de la bobina anti-paralelo a-hlices que se extienden ms de 20 a cabo la
"vuelta". El dominio general es visto a estar interactuando directamente con el
dominio exonucleasa y proporcionar algunos de los sitio de unin para la
exonucleasa de una sola hebra sustrato. Despus de orientar los dominios
palma de la RB69 y enzimas fragmento Klenow de forma idntica, se hace
evidente que sus dominios exonucleasa se encuentran en completamente
diferente coloca en relacin con el sitio activo de la polimerasa. Aunque en el
Orientacin "estndar" el dominio exonucleasa puede describirse como siendo
sureste del sitio activo de la polimerasa en el fragmento Klenow, el dominio
correspondiente de la RB69 polimerasa se encuentra noroeste del sitio activo
de la polimerasa. Esta diferencia en ubicacin del dominio de edicin puede
estar en parte relacionado con el hecho de que la enzima RB69, como que a
partir del fago T4, tiene una exonucleasa actividad que es 103 veces ms
grande que la de la Klenow fragmento (17, 18).
Una comparacin detallada de las estructuras de cuatro familias de
polimerasas muestra que los dedos y los pulgares son diferente en todos los
cuatro familias para las que se conocen las estructuras. Aunque las estructuras
del pulgar dominios no son homlogas, que hacen exhibir caractersticas
anlogas que consisten en gran parte paralelo o antiparalelo a-hlices y en
cada caso al menos una a-hlice parece estar haciendo interacciones
importantes en todo el surco menor del primertemplate producto. En el caso de
la familia pol I, bucles en la parte superior del pulgar tambin que las
interacciones importantes y conservadas con la columna vertebral del ADN (6,
8).
Aunque los dedos dominios de las cuatro familias tampoco son homloga, hay
algunas analogas estructurales sorprendentes entre las familias como con los
pulgares. En tres de los cuatro ADN polimerasa familias con estructuras
conocidas, la pol I, pol y una pol b familias, una a-hlice en el dominio de dedos
se coloca en el extremo romo del cebador-plantilla; que contiene cadenas
laterales que son conservada dentro de las familias (el motivo B) y proporciona
importantes orientar las interacciones con el entrante desoxinuclesido
trifosfato. En el caso de la familia de la transcriptasa inversa, sin embargo,
parece que algunas de estas funciones se han tomado ms de un b-cinta antiparalelo, que se encuentra en una posicin similar, como se ve en una reciente
complejo ternario con el cebador-molde y desoxinuclesido trifosfato (27).

El quizs sorprendente diversidad de las estructuras de la polimerasa que se

encuentra en estas familias una conduce a preguntarse por qu las estructuras
de ADN polimerasas llegar a ser tan diverso cuando las estructuras de enzimas
ms metablicos, tales como gliceraldehdo-3- fosfato deshidrogenasa, son casi
idnticos a partir de microbio hombre. Una posibilidad es que los RT, pol I y pol
b familias adiciones posteriores evolutivos a todas las polimerasas de
replicacin celular, que podra llegar a ser divergente en relacin con la pol un
polimerasas de la familia; Sin embargo, las comparaciones de secuencias no lo
hacen actualmente mostrar esa relacin entre la pol eucariota A y los
procariotas pol III ADN polimerasas. Una alternativa la especulacin podra
imaginar que una ADN polimerasa ribozima originario en el "mundo ARN"
puede haber persistido ms all de la divergencia de los eucariotas y
procariotas y fue reemplazado dominio por dominio diferente.
Fidelidad del Genoma Copiado Los mayores conocimientos sobre los
mecanismos por los cuales las polimerasas lograr la fiel copia de la plantilla
provienen de estudios estructurales y bioqumicos de la familia pol I de
polimerasas (2, 20). Fidelity surge tanto de las restricciones impuestas a el
apareamiento de bases en el sitio activo de la polimerasa as como la edicin
de pares de bases no coincidentes en un sitio activo 39-exonucleasa. La
estructura cristalina del fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I primero
demostr que esta enzima se divide en dos dominios, uno de que cataliza la
reaccin de la polimerasa y la segunda de que tiene un sitio activo de ms de
30 de distancia de la polimerasa sitio activo y cataliza la reaccin 39-59exonucleasa (3). La estructura co-cristalina del fragmento de Klenow con
dplex ADN que contiene un 39 tetranucleotide voladizo muestra que el 39 de
fin de cadena sencilla se une a la exonucleasa activo lugar (4). Estudios
estructurales, mutagnicos y bioqumicos Extensas de sustratos de una sola
hebra unidas a la exonucleasa activo sitio dio lugar a la propuesta de un
mecanismo de ion de metal de dos de la transferencia de fosforilo (20, 21, 23).
Cuando el ADN dplex est unido a la homloga de ADN de T. aquaticus
polimerasa, que hace no contiene un sitio activo exonucleasa funcionamiento,
el extremo 39 del cebador de la cadena se encuentra para estar en el sitio
activo de la polimerasa adyacente a los residuos de carboxilato altamente
conservadas que se sabe que importante para la reaccin de la polimerasa (6).
Asimismo, en el
complejo ternario entre T7 ADN polimerasa, cebador-molde ADN, y dNTP, el
extremo 39 se encuentra en la polimerasa activo sitio. Aunque la porcin
dplex de sustratos se encuentra en la misma posicin aproximada adyacente
al pulgar si el cebador plantilla se une a la enzima en el modo de polimerasa o
en modo de exonucleasa, los extremos 39 estn ubicados en sitios activos que
estn separados por ms de 30 .
El mecanismo mediante el cual el dominio exonucleasa ejerce su Se propone la
funcin de edicin (Fig. 2) para involucrar a un concurso entre estos dos sitios
activos para el extremo 39 de la imprimacin cadena y un rpido vaivn de la
terminal de imprimacin entre ellos (2, 4, 21). El sitio activo 39-exonucleasa

ata el singlestranded ADN polimerasa mientras que el sitio activo se une

dplex ADN con la relacin de aproximadamente 1 a 10 para correctamente
Watson-Crick DNA dplex de bases apareadas (18). Pares de bases
coincidentes desestabilizan el dplex de ADN y de ese modo mejorar la unin
de la 39 ADN al sitio activo exonucleasa de cadena sencilla. Por otra parte,
polimerizacin se estanc despus de la incorporacin de los no coincidentes
pares de bases presumiblemente debido a misorientation de el grupo 39hidroxilo de la terminal de imprimacin sobre la que la siguiente nucletido es
que se aade. Una vez ms, este estancamiento de la reaccin de
polimerizacin sirve para mejorar la probabilidad de escisin por la actividad
exonucleasa. El papel adicional que las obras de dominio de la polimerasa en la
fidelidad se considera a continuacin.
Mecanismo de la Polimerasa
Estudios estructurales, as como la comparacin de secuencias entre
polimerasas sugieren fuertemente la hiptesis de que la fosforilo reaccin de
transferencia de todas las polimerasas es catalizada por una twometal
mecanismo de iones (Fig. 3), propuesto originalmente (22, 24) por analoga al
bien estudiado mecanismo de iones de dos de metal en el Reaccin 39exonucleasa (20-23). La primera observacin de una polimerasa complejo con
dos ADN-primer plantilla y dNTPzMg21 obligado que directamente al sitio
activo de la polimerasa mostr la base estructural de un mecanismo de ion de
metal era de dos un complejo con pol rata b (19). Estos iones metlicos son de
dos unido por tres carboxilatos contenidos en un dominio que no es homloga
a otras polimerasas (14). Una estructura de mayor resolucin (2,1 ) de pol
humana b complejo con un sustrato de ADN con huecos y didesoxi-CTP
muestra el detalle preciso de la interaccin de dos hexacoordinado, iones
MG21 parcialmente hidratadas interactuar con los tres fosfatos (25). En los
dominios homlogos "palma" de la pol I y las familias RT estos iones metlicos
de dos (normalmente iones de magnesio) se observan para unirse a la enzima
a travs de dos restos de carboxilato completamente conservados pero slo en
el complejo de cebador-molde con el dNTP (8). Estos iones metlicos estn
separados por poco menos de 4 en el ternario complejo de ADN polimerasa
de T7 complejado con cebador-molde ADN y dNTP (8). Un ion metlico
interacta con el 39- hidroxilo de la cadena de cebador y que se propone (24)
para bajar el pKa del hidroxilo, facilitando su ataque a la a-fosfato del dNTP
entrante. Los iones metlicos A y B tambin se propusieron estabilizar tanto la
estructura y la carga de la pentacovalent estado de transicin que se produce
durante el curso de esta reaccin. Finalmente, ion de metal B se une y se
propuso para facilitar la dejando de la b- y g-fosfatos. Mecanismos
qumicamente similares de reacciones de transferencia de fosforilo de iones
catalizada de dos metales son utilizados por muchas enzimas, incluyendo
ribozimas (26).
Aunque las comparaciones de secuencias de aminocidos haban sugerido que
eran tres altamente conservada que contiene carboxilato residuos en los sitios
activos de todas las clases de polimerasas, la comparacin de las estructuras

cristalinas de fragmento de Klenow, el VIH-1 RT, RB69 pol una polimerasa, y la

ARN polimerasa de T7 (12) muestra que slo dos residuos de cido asprtico
son estructuralmente conservada entre estas cuatro enzimas. Adems, el
cristal estructura del ADN polimerasa de T7 complejado con un primertemplate
y un desoxinuclesido trifosfato (8) muestra que los iones metlicos divalentes
dos estn unidos por un solo cido asprtico residuo que emana de secuencia
conservada motivo A y uno residuo de aspartato que emana de secuencia
conservada motivo C (residuos Asp-705 y Asp-882 de fragmento de Klenow).
Adems, comparacin de las pol ay pol I estructuras muestra que anterior
alineamientos de secuencias del motivo C, lo que posicion a la Asp primera de
una secuencia de DXD en la primera de una secuencia de Asp DE (1), necesita
ser modificado de modo que, ms bien, el segundo Asp de la pol una secuencia
DXD familia superpone en la primera Asp de la Familia RT secuencia o la
secuencia DE DD familia pol I (1).
A pesar de los dedos dominios de la pol b, RT, pol I, pol y un ADN polimerasas
todos tienen diferentes orgenes evolutivos, comparten algunas caractersticas
funcionales similares. La unin de dNTP a la pol b, ADN polimerasas RT, y T7
complejado con los resultados de ADN cebador-molde en una rotacin
importante de el dominio dedos cuando se compara con el correspondiente
complejos binarios con polimerasa ADN o dNTP (8, 19, 27). La orientacin de la
dNTP en las difiere complejos binarios considerablemente de su orientacin en
el complejo ternario. Solamente en presencia de la siguiente dNTP correcta es
un complejo ternario formado en la cual los dedos giran y el nucletido
entrante hace un par de bases con la plantilla. En esos complejos ternarios en
la que los dedos no giran, el dNTP se une como en el complejo binario dNTP.
Todas las estructuras juntos (8, 19, 25, 27) estn en consonancia con la
propuesta de principios que dNTP primero se une a un complejo de cebadormolde con la polimerasa en una no plantilla dependiente de la moda, pero
despus de una tasa limitada conformacional cambiar (rotacin dedo?) de
unin dNTP es apretado especfica secuencia molde (28). La propuesta ha sido
ms hecho que slo con la correcta emparejamiento de bases Watson-Crick
entre plantilla y dNTP hace los dedos rotation esencial para la catlisis ocurrir
(25). Es decir, la fidelidad para la incorporacin de la de nucletidos correcta
en la etapa de polimerizacin se ve reforzada por este cambio catalticamente
esencial, inducida ajuste conformacional, que detecta la presencia de un par de
bases correcta. Adems, los cuatro dedos no homlogas conocidas dominios
presentar residuos similares a la dNTP entrante para el mismas razones
funcionales. Arg-72 en el VIH-1 RT y Lys-522 en T7 ADN Pol interactuar con un
oxgeno sin puente de la A-fosfato de una manera que ayude a estabilizar el
negativo adicional cargo del estado de transicin pentacovalent. Por otra parte,
residuos bsicos anlogos de los dedos dominios interactan con el g-fosfato
de dNTP.
Conclusiones

De la extensa cristalogrfica, bioqumica, y gentica estudios de polimerasas

de polinucletidos hay varios conclusiones generales que se pueden extraer de
esta clase de enzimas.
En primer lugar, todas las polimerasas de polinucletidos pueden utilizar el
mismo y dos de metal mecanismo de iones para catalizar la fosforilo
polimerasa transferir reacciones (24). Es quizs de inters sealar que un
mecanismo de este tipo, que implica slo las propiedades de dos
correctamente posicionado iones metlicos divalentes, fcilmente podra ser
utilizado por una enzima hecha de ARN y por lo tanto podra funcionar en una
todo mundo de ARN. En segundo lugar, la fidelidad de los resultados de la
sntesis de ADN de una combinacin de interacciones Watson-Crick "forzadas"
en el sitio activo de la polimerasa (8, 19, 25) y la edicin competitiva a el sitio
activo 39-exonucleasa (4, 6, 21). Nucletidos mal incorporados retardar an
ms la sntesis, desestabilizar el ADN dplex y mejorar la unin al sitio activo
exonucleasa. En tercer lugar, aunque los dominios de palma catalticamente
importantes se observa que son homlogas en el pol I, RT, y pol a las familias,
la palma b familia pol dominio es decididamente no relacionado (14); Del
mismo modo, los dominios catalticos a partir de la ADN polimerasa III y el ARN
multisubunit familias polimerasa son propensos a ser diferente segn se juzga
a partir de amino comparaciones de secuencias de cido. En cuarto lugar, el
pulgar y el dedo dominios son estructuralmente diferentes en la totalidad de la
polimerasa familias para las cuales estructuras cristalinas representativos son
ahora conocido, aunque de forma anloga posicionado estructuras secundarias
funcionan de modo similar.