Ananda Brito de Assis

Anlise sobre a microbiota cutnea de anfbios em

fragmentos de Floresta Atlntica e sua eficcia contra
agentes patognicos

Analysis on the bacterial microflora on the amphibian skin of Atlantic

Forest fragments and its effectiveness against pathogens

So Paulo
2011

Ananda Brito de Assis

Anlise sobre a microbiota cutnea de anfbios em

fragmentos de Floresta Atlntica e sua eficcia contra
agentes patognicos

Analysis on the bacterial microflora on the amphibian skin of Atlantic

Forest fragments and its effectiveness against pathogens

Dissertao apresentada ao Instituto de

Biocincias da Universidade de So Paulo,
para a obteno de Ttulo de Mestre em
Cincias, na rea de Fisiologia Geral.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Arturo Navas
Iannini
Co-orientadora: Prof a. Dra. Cristine Chaves
Barreto

Verso corrigida.
Original encontra-se disponvel
no Instituto de Biocincias.

So Paulo

Assis, Ananda B.
Anlise sobre a microbiota cutnea de anfbios
em fragmentos de Floresta Atlntica e sua eficcia
contra agentes patognicos
103 pginas
Dissertao (Mestrado) Instituto de Biocincias da
Universidade de So Paulo. Departamento de
Fisiologia.
1. Anura 2. Microbiota cutnea 3. Ambiente
I. Universidade de So Paulo. Instituto de Biocincias.
Departamento de Fisiologia Geral.

Comisso Julgadora:

________________________

_______________________

Prof(a). Dr(a).

Prof(a). Dr(a).

______________________
Prof. Dr.
Orientador

 minha famlia,
meu sustentculo.

A mais profunda emoo que podemos experimentar inspirada pelo

senso do mistrio. Essa a emoo fundamental que inspira a
verdadeira arte e a verdadeira cincia.
Albert Einstein 1879-1955

Agradecimentos

O trabalho aqui apresentado no poderia ter sido realizado sem a

contribuio de diversas pessoas, que tiveram participao, direta ou indireta, do meu
aprendizado e construo desta pesquisa. Sou grata ao meu orientador Carlos Arturo
Navas Iannini e minha co-orientadora Cristine Chaves Barreto por terem acreditado e
me acompanhado nesta pesquisa, desde o incio at a elaborao deste manuscrito.
Agradeo ao Instituto de Biocincias pela infra-estrutura e Fundao
de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo, pela bolsa de mestrado concedida e
financiamento.
Sou imensamente grata aos colegas do Laboratrio de Ecologia
Microbiana do Instituto Oceanogrfico, que tem os cuidados da professora Vivian
Helena Pellizari, especialmente Carol, Priscila e Dani, por estarem sempre dispostas
a tirar minhas eternas dvidas relacionadas aos procedimentos em Microbiologia.
Ainda neste laboratrio, devo um agradecimento especial Rosa, pela iniciao
nesses procedimentos, disposio e estmulo.
Agradeo aos amigos do laboratrio de Biologia Molecular, da
Universidade Catlica de Braslia, especialmente Flvia por ter sido grande
companheira nos estudos de comunidades microbianas, que no foram includos neste
trabalho, mas que serviram de preparo para as etapas seguintes deste estudo. Esses
procedimentos foram realizados no Laboratrio de Fisiologia de Tripanossomatdeos
e sou grata professora Lucile Floeter-Winter, por ter cedido o espao e pelas
orientaes nas metodologias utilizadas. Sou imensamente grata ao Ricardo Zampieri,
pelo aprendizado, ajuda e pacincia durante os procedimentos. Assim como aos
demais colegas sempre to prestativos: Marcos, Fernanda e Ermeson.

Sou grata aos amigos do laboratrio do qual fao parte: Fisiologia

Ecolgica e Evolutiva, por fazerem parte da minha formao como cientista, durante
as estimulantes discusses, especialmente ao Pedro Ribeiro, pelas sugestes para o
manuscrito e Lye pelas aventuras no campo. Sou tambm grata pela amizade e
predisposio em ajudar uns aos outros, caractersticas marcantes dessas pessoas.
Agradeo Roseli por estar sempre disposta a nos auxiliar nas eternas
burocracias acadmicas e Gisele, por fazer das burocracias acadmicas e
administrativas problemas simples e dissolveis. Um agradecimento especial ao Be,
pelo imensurvel companheirismo e amizade durante e depois dos trabalhos de
campo e Telma pelo auxlio na manuteno das cepas e auxlio nos procedimentos
no laboratrio.
Por fim, tenho tambm grande gratido a pessoas que no contriburam
diretamente nesta pesquisa ou aprendizado cientfico e acadmico, mas indiretamente,
pelo simples e complexo fato de fazerem parte de minha vida: minha enorme famlia,
especialmente meu pai Fernando, me Marina e meus irmos Alden e Mayan. Sem
faltar minha tia Rosenilda, que to parceira em minha estadia em So Paulo e o
Marcus, por todo companheirismo e carinho.

Sumrio
Introduo Geral...........................................................................................................01
Captulo 1. Anlise sobre a densidade de microbiota cutnea de quatro
espcies de anfbios: Proceratophrys boiei (Anura, Cicloramphidae), Dendropsophus
minutus, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta (Anura, Hylidae), em
paisagens contnuas e fragmentadas de Floresta Atlntica.............................................06
Resumo...............................................................................................................07
1. Introduo......................................................................................................08
2. Objetivos .......................................................................................................13
3. Materiais e Mtodos......................................................................................13
3.1 Espcies estudadas........................................13
3.2 reas de estudo.................................................................................14
3.3 Temperatura e umidade.....................................................................17
3.4 Microbiologia em campo..................................17
4. Resultados
4.1 Coleta dos espcimes........................................................................21
4.2 Densidade de colnias bacterianas ...................................................22
4.3. Anlises de temperatura e umidade..........................29
5. Discusso........................................................................................................30
6. Concluso.......................................................................................................34

Captulo 2. Caracterizao da microbiota cutnea de quatro espcies de

anuros em diferentes fragmentos de Floresta Atlntica: Riqueza e
potencial antimicrobiano...............................................................................................36
Resumo...............................................................................................................37
1. Introduo......................................................................................................38
2. Materiais e Mtodos......................................................................................42
2.1Isolamento dos morfotipos de colnias bacterianas...........................42
2.2 Inibio de crescimento bacteriano.......................................43
3. Resultados..............................................45
3.1. Morfotipos........................................45
3.2. Densidade de morfotipos..............................46

3.3. Ensaio de poder inibitrio de patgenos...........................................48

4. Discusso........................................................................................................50
4.1 Riqueza microbiana............................................................................50
4.2 Efeito inibitrio..................................................................................51
5. Concluso........................................................................................................52

Captulo 3. Identificao de morfotipos de colnias bacterianas isoladas

de comunidades microbianas residentes da pele de quatro anuros da
Floresta Atlntica.............................................................................................................54
Resumo................................................................................................................55
1. Introduo......................................................................................................56
2. Materiais e Mtodos......................................................................................58
2.1 Identificao dos isolados......................................58
2.2 Clonagem.......................................................59
2.3.Determinao

da

seqncia

de

nucleotdeo

anlise

filogentica...........................................................................................................61
3. Resultados...............................................62
4. Discusso.........................................................................................................63
Anexo 1................................................................................................................72
Anexo 2................................................................................................................78

Discusso Geral e Concluses.......................................................................................83

Resumo (GERAL) ......................................................................................................85
Abstract .........................................................................................................................87
Referncias Bibliogrficas............................................................................................87

Introduo Geral

Declnios de populaes de anfbios

Nas ltimas dcadas diversas populaes de anfbios tm sofrido declnio e
extino local, ou total em alguns casos. (Heyer et al., 1988; Echegaray & Hernando, 2004;
Eterovick et al., 2005; Lips, et al., 2005; La Marca et al., 2005; Carey & Alexander, 2003;
Keisecker et al., 2001; Funk & Mills, 2003; Carey et al., 1999; Rollins-Smith et al., 2002;
Alexander & Eischeid, 2001; Lips et al., 2006; Mendelson III et al., 2006; Pouds et al.,
2006). Nesse perodo, pelo menos 43% das espcies de anfbios tem sofrido declnio, 32.5%
esto globalmente ameaadas, 34 foram extintas e 88 esto passveis ou possivelmente esto
extintas (Lips et al. 2006). No Brasil, 20 espcies de anfbios anuros parecem estar sofrendo
declnio em suas populaes, sendo que duas destas espcies ocorrem no Bioma Cerrado e
todas as demais na Floresta Atlntica (Eterovick et al., 2005). Muitos casos de declnio
populacional em anfbios esto relacionados s ocorrncias de novos patgenos (Carey et al.,
1999; Schumacher, 2006). Por isso, o termo Emerging Infectious Diseases (EIDs), antes
usado apenas para se referir a doenas humanas deflagradas em larga escala geogrfica,
agora aplicado tambm vida selvagem, fazendo aluso srie de epidemias constatadas
no meio natural nestes ltimos anos (Daszak et al., 2001).
O fungo quitrdio Batrachochytrium dendrobatidis indicado como o principal
agente envolvido nos casos de declnios de populaes de anfbios em diversas partes do
mundo e j foi detectado em algumas comunidades de anfbios no Brasil. As primeiras
menes desse fungo em populaes de anfbios na Floresta Atlntica datam de 1981 e,
segundo Carnaval et al. (2006), estariam relacionados aos primeiros registros de declnios
populacionais em territrio brasileiro.

O cenrio ambiental
As populaes selvagens de anfbios podem estar mais susceptveis aos patgenos
se modificaes em variveis fsicas do ambiente est relacionada com eventos de doenas.
Um exemplo bem estudado a diminuio nos valores mdios de parmetros do sistema
imune, tais como clulas de defesa, quando animais so expostos a pesticidas. Neste caso, os
indivduos se tornam mais vulnerveis s infeces por patgenos presentes naturalmente no
ambiente e a sobrevivncia de toda uma populao pode ser comprometida (Christin et al.,
2004; Raffel et al. 2006; Vos et al., 1989).
Mudanas ambientais de origem antropognica nas reas naturais podem
contribuir para o estabelecimento de um cenrio propcio disseminao de doenas em
grande escala. Destacam-se as mudanas climticas, aumento da incidncia de radiao
ultravioleta (UV-B), introduo de espcies exticas e competidoras, contaminao por
agentes txicos e fragmentao das reas de mata que causam perda de hbitat e isolamento
de populaes (Keisecker et al., 2001; Blaustein & Kiesecker, 2002; Echegaray & Hernando,
2004).

Nesse contexto, os anfbios compem um grupo considerado particularmente

vulnervel a diversos tipos de impacto ambiental. Por isso, diversas variveis biticas e
abiticas tm sido estudadas no contexto dos declnios populacionais desse grupo e alguns
autores consideram a fragmentao de habitat como a principal causa de declnios
populacionais de anfbios, tpicos de ambientes florestais (Saunders et al. 1991; Joly et al.,
2003).
As primeiras barreiras de proteo contra patgenos
Os anfbios possuem um sofisticado sistema imune e uma pele que atua com
barreira inicial contra predadores e microorganismos patognicos (Zasloff 2002). Alm de
secretar molculas componentes de venenos, molculas bioativas com ao antimicrobiana,

essa superfcie continuamente umidificada por muco que pode ter um papel na
termorregulao (Lillywhite, 1974). Em algumas espcies h tambm secreo de ceras
liberadas por glndulas para prevenir a dessecao (Fontana et al., 2006).
Estudos sobre a microbiota cutnea de anfbios apontam para um papel funcional
de proteo contra patgenos. A primeira meno sobre microbiota cutnea na literatura data
de 1986, no trabalho de Bettin & Greven, com a espcie Salamandra salamandra. Aps isso
Austin (2000) tambm constatou a presena de uma comunidade microbiana residente sobre
a pele da salamandra Plethodon ventralis. Nesse trabalho foi sugerido que antibiticos
produzidos pelas bactrias componentes dessas comunidades poderiam prevenir a infeco
fngica dos ovos chocados pelas fmeas (Austin, 2000). Assim, essas comunidades
consistem de populaes de microorganismos que so capazes de se multiplicar na pele e que
podem inibir o crescimento de outros microorganismos seja pela produo de substncias ou
pela competio. Dessa forma, a compreenso da interao entre a microbiota cutnea e os
agentes patognicos, alm dos fatores que ditam variaes na sua composio, importante
no sentido de entendermos a contribuio dessas comunidades para a resistncia ou
susceptibilidade dos anfbios s doenas infecciosas.
Contextualizando o trabalho
Os microrganismos so vulnerveis s alteraes no substrato onde vivem, tais
como temperatura, pH, disponibilidade de gua, nutrientes, entre outros (Madingan et al.,
2004). Portanto, os microorganismos presentes na epiderme dos anuros, por sua vez exposta
s alteraes fsicas, qumicas e biticas tpicas dos remanescentes de Floresta Atlntica,
podem ter a estrutura de suas comunidades alteradas. Alm disso, possvel que
caractersticas da histria natural, por exemplo, o microhabitat ocupado por uma espcie de

anfbio tambm contribua para a determinao dos perfis das comunidades microbianas da
pele.
Pela breve discusso realizada at o momento, podemos sugerir que 1) os anuros
possuem uma microbiota residente na pele, 2) tal comunidade microbiana desempenha um
papel importante contra a ao de patgenos, 3) essa comunidade pode ser afetada por
variveis associadas ao microhabitat e histria natural de cada espcie e 4) tais consideraes
devem ser muito importantes no contexto de anuros de ambientes florestais fragmentados.
A presente pesquisa esteve focada em trs frentes de trabalho simultneas, que
resultou na produo de trs captulos independentes. O primeiro trata sobre as densidades de
bactrias cutneas de quatro espcies de anuros: Proceratophrys boiei, Aplastodiscus
leucopygius, Phyllomedusa distincta e Dendropsophus minutus, em dois contextos de
paisagem: reas contnua e fragmentada. Dessa forma, anlises foram feitas sob as
perspectivas da paisagem, espcie e localidade onde os animais foram coletados, sendo a
discusso focada nesses aspectos e naqueles relacionados histria natural dessas espcies.
O captulo dois est focado na caracterizao morfolgica das entidades das comunidades
amostradas na primeira parte do trabalho, que compe o captulo um, e nos experimentos
realizados in vitro para a verificao do potencial de ao inibitria dessas entidades isoladas
contra alguns patgenos conhecidos. No terceiro captulo constam as identificaes, por
mtodos moleculares, de parte das entidades bacterianas isoladas. Neste h tambm uma
abordagem comparativa com txons de bactrias isoladas de outras espcies de anfbios, a
partir de dados disponibilizados na literatura.

Captulo 1
Anlise sobre a densidade de microbiota cutnea de quatro espcies de
anfbios: Proceratophrys boiei (Anura, Cicloramphidae), Dendropsophus
minutus, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta (Anura, Hylidae),
em paisagens contnuas e fragmentadas de Floresta Atlntica

Resumo

O potencial de bactrias isoladas das comunidades microbianas da pele de

anfbios, contra patgenos importantes como o fungo Batrachochytrium dendrobatidis tem
sido verificado em estudos anteriores. Nesse aspecto, indispensvel o entendimento da
estrutura e funo dessas comunidades para as espcies de anfbios, que tm experimentado
eventos de declnio e extino de populaes, principalmente devido destruio de habitat e
ocorrncia de epidemias no meio natural. So desconhecidos os fatores que modulam a
estrutura dessas microbiotas cutneas, porm, o ambiente se perfila como componente
fundamental na determinao dos perfis dessas comunidades. A densidade um dos
componentes principais dos ecossistemas microbianos e pode ser um bom norteador nesse
momento inicial de pesquisa, onde buscamos entender de que maneira o ambiente modula as
microbiotas cutneas dos anfbios. O objetivo geral dessa pesquisa foi a identificao dos
padres de densidade microbiana cutnea de quatro espcies de anfbios, tanto sob a
perspectiva das espcies quanto da paisagem onde os indivduos esto inseridos. Foram
coletados indivduos em reas contnuas e fragmentadas de Floresta Atlntica e nossos
resultados mostraram que existem diferenas entre as espcies e entre as paisagens. Sendo
P.boiei a espcie com a maior densidade microbiana, assim como os remanescentes de
floresta, em contraposio s reas contnuas.

1. Introduo
A presena de comunidades microbianas sobre a pele dos anfbios j foi
constatada em trabalhos anteriores, assim como a caracterizao de algumas bactrias como
potentes inibidores do crescimento de patgenos importantes para esses animais (Harris et
al., 2006; Woodhams et al., 2007; Lauer et al., 2007; Lauer et al., 2008; Culp et al., 2007;
Brucker et al., 2008; Lam et al., 2009). possvel, portanto, que a microbiota cutnea desses
animais atue como um componente fundamental de primeira proteo contra patgenos no
meio natural. Apesar disso, no tm sido estudados os fatores que modulam os perfis dessas
comunidades microbianas.
A partir de estudos prvios, no publicados, realizados por mtodo Denaturing
Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) observamos que o perfil das comunidades microbianas
presentes sobre a pele de anfbios sobrepunha parcialmente aquele das comunidades
microbianas dos microhabitats ocupados pelos animais (Assis et al., no publicado). Culp et
al., 2007 tambm detectaram a presena de entidades microbianas tpicas de ambientes,
como componentes das microbiotas cutneas de trs espcies de anfbios. Dessa forma,
podemos apontar o ambiente como um componente importante na colonizao e composio
das comunidades que se estabelecem sobre a pele dos anfbios.
Os microrganismos podem ser fortemente afetados por mudanas nas condies
de algumas variveis qumicas e fsicas, principalmente temperatura, disponibilidade de
gua, pH e oxignio, alm de outros tais como presso e radiao (Pelczar et al., 1981;
Madigan et al., 2004; Madigan et al., 2009). Mesmo a pele dos animais no um substrato
constante, e pode variar conforme as condies ambientais, por exemplo, durante a
termorregulao ou secreo de ceras para diminuir a perda de gua e venenos para defesa

(Daly, 1995). Assim, os perfis dessas comunidades microbianas poderiam ser influenciados
pela condio do hospedeiro e o ambiente onde este se encontra.

1.1 Fragmentao da paisagem e microbiota ambiental

O processo de fragmentao definido por Franklin et al., 2002 como um
conjunto de mecanismos que levam descontinuidade a distribuio espacial dos recursos e
condies presentes em uma rea em uma dada escala que afeta a ocupao, reproduo e
sobrevivncia em espcies particulares e, segundo Saunders e colaboradores, em 1991,
altera as condies microclimticas dentro e fora das reas remanescentes, por meio de
alteraes nos valores mdios e varincias de diversos parmetros fsicos. Esse processo de
perda de hbitat est entre as maiores ameaas s populaes de anfbios (Cushman, 2006).
Uma das variveis que poderia afetar a microbiota cutnea dos anfbios em
remanescentes de floresta seria o aumento na incidncia de radiao solar que alcana o solo
dentro da mata. Esta por si s j muda a composio microbiana nesse substrato, assim como
mudanas no regime termal local, com dias mais quentes e noites mais frias do que seria em
reas de floresta contnua (Saunders et al. 1991). O aumento da temperatura no solo afeta a
ciclagem de nutrientes deste, o que afeta as suas comunidades microbianas (Plante & Parton,
2007). Uma maior incidncia de vento resulta em reduo da umidade relativa e alterao
nas caractersticas da superfcie do solo devido ao aumento no folhio pela maior queda de
partes de vegetao. Gradientes drsticos dos nveis de nutrientes no solo so tambm
formados, principalmente na rea da borda da mata (Saunders et al. 1991). O fluxo de gua
atingido pelo movimento de sais, nutrientes e pesticidas advindos das clareiras adjacentes e
pode oferecer impactos significantes nos sistemas hdricos da rea (Saunders et al. 1991).
Uma vez que, parte da microbiota cutnea de alguns anfbios composta de bactrias de

10

ambiente (Culp et al. 2007), esta deve ser afetada por conseqncia das alteraes acima
mencionadas.

1.2 Alteraes na pele dos anuros, um substrato para a microbiota residente

A pele dos anfbios um rgo de grande importncia para as trocas gasosas,
processo durante o qual a secreo de muco e a evapotranspirao atuam como mecanismos
auxiliares (Lillywhite, 1974). Tambm um rgo de defesa, feita por meio da secreo de
venenos e molculas antimicrobianas, que so parte do sistema imune inato (Rollins-Smith et
al., 2005). possvel ento perceber que a pele desses animais no um substrato constante,
no qual devem ocorrer mudanas de temperatura, pH e umidade. Isso nos faz pensar que a
comunidade microbiana residente deve ser tolerante, ou mesmo adaptada a essas alteraes
naturais. A pele pode inclusive servir de substrato nutritivo, dada presena de carboidratos
no muco, por exemplo, ou mesmo seletivo, devido aos peptdeos antimicrobianos (Brizzi et
al., 2002; Rollins-Smith et al., 2005).
Mudanas nas caractersticas da pele dos anfbios tambm podem ser
conseqncia das condies s quais os animais so expostos (Pelczar et al., 1981; Madigan
et al., 2004), como aqueles cenrios de impactos ambientais. Por exemplo, alguns dos
peptdeos secretados pelas glndulas da derme so seqestrados da dieta (Daly et al., 1995),
por isso, alteraes no tipo e disponibilidade de presas podem acarretar mudanas no perfil
molecular das secrees (Daly et al., 1997). Alm disso, a exposio a txicos e o aumento
da radiao ultravioleta, que so alterados nos remanescentes (Saunders et al. 1991), podem
tambm acarretar impactos sobre a microbiota cutnea dos anfbios. Cabe ainda ressaltar a
importncia da temperatura, pois esta se configura como uma varivel indispensvel de se
considerar ao falarmos sobre comunidades microbianas que habitam a superfcie corprea de

11

animais ectotrmicos. Esses microrganismos, de fato, devem ser afetados pelos padres
termais corpreos obtidos durante os eventos de termorregulao, nos quais as temperaturas
corporais so determinadas pela interao com o microhabitat (Navas, 1996).

1.3 Relevncia da densidade microbiana

A densidade microbiana um fator importante na relao da comunidade residente
com o seu hospedeiro e com eventuais patgenos com potencial para infeccion-lo. Alm
disso, a densidade populacional de microrganismos sobre ou no interior de um organismo
muitas vezes determinante na deflagrao de uma doena infecciosa (Madigan et al., 2009).
Em termos da microbiota cutnea de anfbios, uma alta densidade microbiana
residente, sobretudo das espcies bacterianas produtoras de antibiticos, poderia prevenir a
infeco por patgenos atravs da pele. Lam et al., 2009 explicou a persistncia de uma
populao de Rana mucosa pela alta proporo de indivduos hospedando bactrias com
potencial contra o fungo quitrdio (Bd), apesar da ocorrncia desta na populao. Em alguns
casos, a densidade populacional um fator determinante na biossntese de compostos
antimicrobianos. A produo da violacena, um importante antibitico produzido pela
bactria Chromobacterium violaceum, por exemplo, densidade dependente sendo
controlada por processo de comunicao microbiana que onde h sinalizao para
alteraes na expresso gnica, de acordo com a densidade populacional (quorum sensing).
Esse composto tambm produzido por uma espcie de bactria simbionte em espcies de
salamandras e especula-se sobre a produo densidade dependente quando da infeco por
Bd (Brucker et al., 2008).

12

1.4 Contexto da pesquisa

A microbiota cutnea de anfbios poderia ser afetada por mudanas ambientais s
quais esses animais se expem. Um cenrio onde alguns parmetros ambientais so, de
forma constatada, alterados, aquele dos remanescentes de Floresta Atlntica, produtos do
processo de fragmentao de habitats. Nesse cenrio, possvel que as alteraes no
macroambiente se estendam aos microhabitats ocupados pelos anfbios. Nessas condies, a
microbiota residente na pele desses animais pode ser afetada de forma direta pelos fatores
ambientais, ou indireta, pelas mudanas fisiolgicas s quais os animais ficam sujeitos, uma
vez expostos s variaes biticas e abiticas tpicas desses remanescentes. Temperatura e
umidade so duas variveis abiticas importantes no crescimento bacteriano e
estabelecimento de comunidades sobre os substratos. Assim, poderiam afetar a comunidade
microbiana residente da pele dos anfbios tanto em condies naturais, como quando estes
esto sujeitos a regimes de temperatura diferenciados, por exemplo, estando em paisagens
fragmentadas. Um papel importante das condies macro e microambientais sobre a
microbiota cutnea de anuros seria corroborado por nossa hiptese inicial: ao comparar as
comunidades microbianas cutneas de indivduos representando espcies de anuros em
paisagens contnuas de Floresta Atlntica e aqueles em paisagens fragmentadas desse mesmo
bioma, e, alm disso, ao comparar indivduos ocupantes de microhabitats distintitos, existem
diferencias, mesmo que a magnitude e direo das mesmas no poderiam ser previstas com a
informao disponvel. provvel que hajam diferenas entre paisagens contnuas e
fragmentadas relacionadas s variveis temperatura e umidade relativa.

13

Objetivos
Para testar as hipteses propostas determinamos como objetivo deste trabalho:
1.Estimar a densidade total de microbiota cutnea em populaes de anuros
provenientes de paisagens fragmentadas e contnuas de Floresta Atlntica.
2. Estimar a densidade bacteriana total em populaes de anuros de diferentes
espcies e microhabitats ocupados.
3. Caracterizar as reas de estudo sobre as variveis temperatura e umidade, em
busca de relaes entre esses fatores abiticos e os padres de densidade microbiana cutnea
total encontrados.

3. Materiais e Mtodos
3.1 Espcies estudadas
Quatro espcies de anfbios anuros adultos foram utilizadas neste trabalho:
Proceratophrys boiei, famlia Cicloramphidae, Dendropsophus minutus, famlia Hylidae,
Aplastodiscus leucopygius, famlia Hylidae e Phyllomedusa distincta, famlia Hylidae. As
espcies representam microhabitats: Phyllomedusa distincta e Aplastpdiscus leucopygius
como representantes do microhabitat vegetao (Bertoluci, 2005; Heyer, et al., 1990);
Proceratophrys boiei que ocupa a serrapilheira do interior das matas (Zina et al., 2007) e
Dendropsophus minutos mais relacionado a corpos de gua e ambientes abertos (Pombal &
Haddad, 2005), ocupando o extrato arbreo quando no est no stio reprodutivo (Gomes,
comunicao pessoal, 14 de maro de 2011). Destas espcies, P.disticta consta na Red List
como espcie no ameaada, mas com populaes em declnio, as demais possuem
populaes estveis (IUCN, 2010).

14

3.2 reas de estudo

Consideramos paisagens contnuas as florestas com grandes extenses de matas
primrias que esto dentro das Unidades de Conservao e paisagens fragmentadas os
remanescentes descontnuos de florestas. Foram determinadas duas grandes regies para este
estudo (Figura 1).
A primeira regio compreende fragmentos de Floresta Atlntica situados no
municpio de So Lus do Paraitinga, estado de So Paulo, entre a Serra da Mantiqueira e a
Serra do Mar (2313S, 4520 W). Paisagisticamente, caracterizada, pela cobertura de
matrizes de pastagens, cerca de 50,8% sendo que os 11% de Floresta est distribuda na
forma de pequenos e dispersos fragmentos (Becker, 2007). A paisagem contnua uma rea
de floresta com 60% de mata primitiva, com 17 mil hectares (Projeto de preservao da Mata
Atlntica, 2007) localizados Ncleo Santa Virgnia (317' a 2324' S, 4503 a 4511' W), do
Parque Estadual da Serra do Mar, situado, em grande parte, no municpio acima citado, alm
de Cunha e Ubatuba (Figura 2).

Figura 1. Imagens de satlite das regies de coleta. Regio 1 Fragmentos de

Floresta Atlntica no municpio So Lus do Paraitinga e Ncleo Santa Virgnia,
Parque Estadual da Serra do Mar Regio 2 Fragmentos nos municpios de
Ribeiro Grande e Capo Bonito e Fazenda Paraso, floresta contnua com o Parque
Estadual Intervales.

15

Na segunda regio esto os fragmentos situados no municpio de Ribeiro Grande

(2405S, 4821W) e Capo Bonito (2400S, 4820W). Os entornos desses fragmentos
so normalmente circundados por matrizes de monoculturas, a principal atividade econmica
da regio. Como paisagem contnua, o Parque Estadual Intervales (2412S e 2432, e
4803e 4832W), situado nos municpios de Guapiara, Ribeiro Grande, Sete Barras,
Eldorado e Iporanga, Estado de So Paulo (Campos, 1994). Sendo os espcimes coletados
dentro da propriedade particular Fazenda Paraso Eco Lodge (2414S, 4822W), cuja rea
de floresta primria, conservada e contnua com aquela do Parque (Figura 2).

16

Figura 2. Imagens de satlite das regies de coleta. A. rea 1 Fragmentos de Floresta

Atlntica no municpio So Lus do Paraitinga; B. rea 2 - Ncleo Santa Virgnia,
Parque Estadual da Serra do Mar; C. rea 3 - Fragmentos no municpio de Ribeiro
Grande; D. rea 4 - Fazenda Paraso, floresta contnua com o Parque Estadual
Intervales.

17

3.3 Temperatura e umidade

Foram utilizados registradores automticos de dados Ibbuton (Sistema de
Monitoramento de Temperatura Kooltrak) para obteno de registros de temperatura e
umidade. Os aparelhos foram distribudos a partir da borda, a cada 25m at 100m no interior
da mata, incluindo os corpos de gua que se encontravam no interior ou na borda das matas.
Para cada transecto um nico aparelho para medio de umidade relativa foi colocado.
Totalizando 5 aparelhos Ibbutons para cada mata durante um perodo de pelo menos 10 dias.
Foram primeiramente colocados na fazenda Paraso (mata contnua com o Parque Estadual
de Intervales) e trs fragmentos adjacentes, no municpio de Ribeiro Grande, onde o foram
coletados os animais. Posteriormente, no Parque Estadual Serra do Mar - Ncleo de Santa
Virgnia e um fragmento em So Lus do Paraitinga. As duas etapas foram feitas durante o
vero, mas em meses diferentes. Nas reas abertas onde ocorria a espcie Dendropsophus.
Minutus foram colocados aparelhos a 1 e 3 m dos corpos de gua onde foram coletados os
animais. Para comparar os parmetros mdia, mxima, mnima e amplitude de temperatura e
T

umidade relativa, nos fragmentos e reas contnuas, foi utilizado o Test T, para amostras
independentes.

3.4 Microbiologia em campo

Algumas tcnicas clssicas em Microbiologia foram adaptadas realidade do
campo, para que houvesse a possibilidade de preservao, ao mximo possvel, das
caractersticas da microbiota cutnea nas amostras obtidas dos animais coleados.

18

3.4.1 Coletas dos animais

Todos os animais foram coletados por busca ativa, utilizando luvas previamente
desinfetadas por lcool a 70%. Para cada indivduo, uma luva foi usada e em seguida
descartada. Aps a captura, os animais foram colocados em sacos tipo ziplock, um indivduo
por saco.

3.4.2 Coleta de microbiota

A microbiota cutnea foi coletada logo aps a captura dos animais, ainda em
campo, nas estalaes dos alojamentos onde era preparada a logstica para os procedimentos
em microbiologia. Os animais foram levados para o alojamento, onde um espao foi
previamente destinado para os trabalhos em microbiologia.
Os animais foram retirados do saco plstico sendo a manipulao realizada com
luvas, previamente desinfetadas com etanol 70%. A seguir, os animais foram lavados com
dois banhos de gua destilada autoclavada em garrafas previamente esterilizadas em
autoclave. Conforme descrito por Lauer et al, 2008 esse procedimento remove a microbiota
transiente preservando a microbiota residente. A microbiota da pele foi ento amostrada com
o auxlio de um cotonete estril, passando o mesmo em toda a extenso do dorso e ventre,
bem como a cabea e a regio gular do animal. Essas reas de amostragem foram
determinadas aps verificarmos que foram mais representativas, quando comparadas a
esquadros de 1 e 2 cm2 , em termos de densidade e de riqueza de colnias, sendo esta ltima
P

utilizada em estudo posterior (Captulo2).

O cotonete impregnado com a comunidade microbiana foi depositado em um tubo
contendo 1 mL de soluo fisiolgica (NaCl 0,9%) agitando-se durante 1min com o auxlio
de vrtex. Dessa maneira, espera-se que a maior parte das clulas presas no cotonete passe

19

para a soluo, alm de garantir a sua homogeneizao. A partir dessa primeira amostra que
corresponde comunidade total foram feitas diluies seriadas. Com o auxlio de uma pipeta
estril, 100 L da primeira amostra transferida para outro tubo contendo 900 L de soluo
fisiolgica estril, correspondendo diluio 10 -1 e em seguida o procedimento repetido
P

para a diluio 10 -.
P

Essa diluio foi escolhida para o cultivo em placa depois de

experimentos pilotos, onde se verificou que essa foi a diluio que permitiu o crescimento de
30 a 300 colnias por placa para a maioria das espcies de anuros testada.
Foram inoculados 100 L da diluio 10 - em placas de Petri plsticas estreis de
P

90x15mm, contendo meio de cultivo R2A gar (DIFCO). Escolhemos o R2A gar porque,
em geral, este o meio de cultivo utilizado nos estudos sobre microbiota cutnea de anfbios,
o que permitiu uma comparao posterior dos nossos resultados com aqueles de outros
grupos de pesquisa (Veja captulo 3, tabela 2). Alm disso, disso, outros meio de cultivo
foram testados e o R2A gar apresentou maior efecincia para a obsevao da riqueza de
morfotipos (Captulo 2).
Todo o contedo inoculado na placa foi espalhado com ala de Drigalski plstica e
estril, at que o lquido fosse absorvido pelo meio, seguindo o mtodo de espalhamento em
placa, descrito em Madigan et al., 2009. Para cada amostra so feitas duas repeties,
obtendo-se assim, triplicatas. Esse procedimento foi realizado em proximidade a uma chama
de gs. Foram executados controles com placas de Petri abertas sobre a bancada durante as
etapas de coleta e plaqueamento da comunidade microbiana da seguinte forma: duas placas
de Petri, contendo o mesmo meio de cultivo, foram deixadas abertas a 10 e 40 cm da chama.
Para essas ltimas, ao final do tempo de crescimento das outras placas, no foi esperado
crescimento bacteriano.

20

As placas foram incubadas por 48hs a temperatura ambiente, conforme realizado

para cultivo de bactrias de amostras de solo. A incubao foi feita em campo, para que as
temperaturas fossem aquelas da localidade onde foram coletadas as amostras. Alguns j
foram detectados nas primeiras 24hs e outros foram visualizados aps o terceiro dia. Assim,
o nmero de colnias foi determinado aps 48hs e 72 horas de crescimento. Aps a coleta
da microbiota os animais foram soltos. Apenas dois animais de cada espcie e de cada rea
de coelta foram preservados em lcool a 70% para verificao da taxonomia e criao de
uma pequena coleo de referncia.
Por fim, cabe ressaltar que, pelos mtodos utilizados, todos os resultados obtidos
neste trabalho (todos os captulos) so relacionados poro cultivvel, em meio R2A gar,
da microbiota cutnea das espcies anuros estudadas.

3.4.3 Estimativa da densidade bacteriana.

Para a contagem das colnias, foi utilizado o mtodo padro contagem de placa
heterotrfica (CPH), utilizado comumente para estimar o nmero de bactrias heterotrficas
vivas, coletadas em corpos de gua. Uma colnia que surge a partir da proliferao de uma
nica clula bacteriana denominada unidade formadora de colnia ou UFC (Madigan et
al., 2004) e essa nomenclatura utilizada no decorrer deste trabalho.
A contagem foi feita considerando todas as unidades visualizadas com o auxlio de
lupa sobre um contador de colnias da marca (Quimis). Para se estimar a quantidade de
UFC por amostra a seguinte frmula foi utilizada:
Fator de diluio x UFC
0,1

21

Sendo o fator de diluio igual a 100, UFC, a quantidade de unidades formadoras

de colnias contadas na placa e o denominador corrige o volume para mL (Eaton et al.,
1995).

As mdias de cada triplicata de placas foram consideradas. Para se estudar a

dependncia da densidade bacteriana residente sobre a pele dos anuros Dendropsophus

minutus, Proceratophrys boiei, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta, foram
utilizados testes de Kruskal-Wallis, dependentes da espcie, paisagem, localidade e
microhabitat, seguidos de testes de Mann-Whitney para comparaes pareadas.

4. Resultados
4.1 Coleta dos espcimes
Um total de 187 indivduos adultos foi coletado. Destes, 52 foram da espcie
Proceratophrys boiei, famlia Cicloramphidae; 73 indivduos de Dendropsophus minutus,
famlia Hylidae;

28 indivduos de Aplastodiscus leucopygius, famlia Hylidae;

e 34

indivduos de Phyllomedusa distincta, famlia Hylidae.

Em relao s localidades, para P. boiei foram 5 indivduos coletados no Parque
Estadual Serra do Mar Ncleo de Santa Virgnia;18 no municpio de So Lus do
Paraitinga, 17 na fazenda Paraso Parque Estadual de Intervales e 12 no municpio de
Ribeiro Grande. Houve 31 indivduos de D. minutus capturados Parque Estadual Serra do
Mar Ncleo de Santa Virgnia; 9 no municpio de So Lus do Paraitinga, 17 na fazenda
Paraso Parque Estadual de Intervales e 16 no municpio de Ribeiro Grande. Foram
coletados 16 indivduos de P. distincta espcimes na fazenda Paraso Parque Estadual de
Intervales e 18 no municpio de Ribeiro Grande. Finalmente, foram capturados 14
indivduos de A. leucopygius no Parque Estadual Serra do Mar Ncleo de Santa Virgnia;
14 no municpio de So Lus do Paraitinga (Tabela 1).

22

Tabela 1. Total de indivduos coletados por espcie e

localidade.
Espcie

Microhabitat

NSV SLP INT RG

Dendropsophus minutus

rea aberta

31

17

16

Proceratophrys boiei

Folhio

18

17

12

Aplastodiscus leucopygius

rvores

14

14

Phyllomedusa distincta

rvores

16

18

Abreviaes: NSV, Ncleo de Santa Virgnia; SLP, So Lus do Paraitinga; INT,

Intervales - Fazenda Paraso; RG, Ribeiro Grande

4.2 Densidade de colnias bacterianas

Previamente s anlises de densidade total, foi detectado que as espcies de anuros
estudadas possuem tamanhos diferenciados. Por exemplo, a mdia de comprimento rostrocloacal em A. leucopygius 39,8 mm, P. boiei 52,75 mm, P. distincta 56,14 mm e D.
minutus 39,87 mm (Figura 2). Julgamos que essas diferenas nas dimenses corpreas das
espcies poderiam atuar como um vis nos resultados finais de densidade microbiana. Por
isso, foram feitas medies de massa e comprimento rostro-cloacal e uma funo dessas duas
medidas serviu para obter uma varivel proporcional s reas corpreas amostradas dos
indivduos. Para avaliar a importncia do tamanho dos espcimes, e, por conseqncia, a rea
corprea amostrada, nas mdias de densidade de microbiota cutnea desses indivduos, foi
utilizada estatstica F e teste de correlao com esses fatores morfomtricos, onde se
verificou que o tamanho corpreo dos animais no um bom preditor das mdias de
densidade microbiana (r 2 0,26; F crtico 2,26; F 1,3). Neste trabalho, o termo densidade
P

refere-se ao nmero total de unidades formadoras de colnias para cada espcime de anfbio
amostrado.

23

0,5 cm

0,5 cm

0,5 cm

0,5 cm

Figura 2. Espcies de anuros estudadas, com escala de tamanho corpreo.

A. Proceratophrys boiei; B. Aplastodiscus leucopygius; C. Dendropsophus
minutus; D. Phyllomedusa distincta.

24

A densidade bacteriana na pele dos indivduos testados variou de 0 a 1.278.000

UFC/mL, sendo observada diferenas entre as espcies de anuros analisadas (p= 9,49 -21)

Milhares

(Figura 3).
480
440
400

UFC Mdio

360
320
280
240
200
160
120
80
40
0
A. leucopygius

D. m inutus

P. boiei

P.distincta

Espcie

Figura 3. Mdia e desvio padro das densidades de UFC/ml amostradas

em quatro espcies de anuros.
T

Com o auxlio do teste de Mann-Whitney, foram feitas anlises pareadas de

espcies para verificar diferenas na densidade de UFC/mL sobre a pele dos indivduos,
entre espcies, com nvel de significncia p= < 0,05. Vimos que, com exceo do par D.
minutus e A. leucopygius, os demais pares de espcies so diferentes entre si (Tabela 2).

Tabela
2.
Comparao
de
mdias
de
entre pares de espcies, utilizando teste de Mann-Whitney.

UFC/mL

P-valor (5%)

A. leucopygius

D. minutus

P. boiei

P. distincta

A. leucopygius

0,172

4,85 -10

9,74 -5

-17

2,36 -8

D. minutus
P. boiei
P. distincta

1,37
-

1,95 -5
P

25

A anlise de densidade de UFC/mL em duas paisagens: fragmento e rea contnua

de Floresta Atlntica mostrou que, ao considerarmos a microbiota cutnea amostradas em
todas as espcies de anuros estudadas, h diferenas entre os dois grupos (p= 8,64 -3 ) (Figura
P

UFC Mdio

Milhares

4).
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
CONT

FRAG

Paisagem

Figura 4. Mdia e desvio padro das densidades de UFC/ml amostradas

em quatro espcies de anuros nas paisagens contnuas e fragmentos.

Ao ser feita uma anlise por espcie nas duas paisagens: fragmento e rea

contnua foi verificado que apenas P. boiei (p= 1,39 -2 ) apresenta diferena na densidade de
P

UFC. Nesta espcie, os indivduos coletados nos fragmentos apresentam uma densidade
superior de UFC/mL quando comparados queles presentes nas reas contnuas. As demais
espcies: A. leucopygius (p= 1,89 -1 ), D. minutus (p= 9,95-1); P. distincta (p= 8,14 -2) no
P

mostraram diferenas entre os dois grupos(Figura 5).

Milhares

300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

UFC Mdio

UFC Mdio

Milhares

26

CONT

300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

CONT

FRAG

C
Milhares

UFC Mdio

UFC Mdio

Milhares

Paisagem
300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
CONT

FRAG

Paisagem

FRAG

Paisagem

300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

CONT

FRAG

Paisagem

Figura 5. Mdias e desvio padro de densidade de UFC/ mL de quatro espcies de anuros: A.

A. leucopygius; B. D. minutus; C. P. boiei; D. P. distincta, em duas paisagens: Contnua
(CONT) e Fragmento (FRAG).

A anlise considerando as quatro reas de coleta individuais, ou seja, no mais

agrupadas em paisagens (fragmento e rea contnua), mostrou que h diferenas entre elas
(p= 2,36 -6). Sendo a maior mdia encontrada em So Lus do Paraitinga (DP=252.842),
P

seguido do Parque Estadual de Intervales (DP=120.721), Ribeiro Grande (DP=130.14) e

Parque Estadual Serra do Mar Ncleo de Santa Virgnia (DP= 43.754) (Figura 6).

UFC Mdio

Milhares

27

340
320
300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
INT

NSV

RG

SLP

Localidade

Figura 6. Mdia e desvio padro da densidade de UFC/ml nas localidades: Intervales (INT);
Ncleo de Santa Virgnia (NSV); Ribeiro grande (RG) e So Lus do Paraitinga (SLP).

Foram feitas anlises entre pares de localidade para cada espcie, onde foi
observado que o maior nmero de pares com diferena significativa entre si corresponde
queles que consistem de uma rea contnua e outra fragmentada: em Proceratophrys boiei:
Intervales Ribeiro Grande (INT RG) e Intervales So Lus do Paraitinga (INT SLP);
Dendropsophus minutus: Ncleo de Santa Virgnia Ribeiro Grande (NSV RG) e
Intervales So Lus do Paraitinga (INT SLP) e em Phyllomedusa distincta: Intervales
Ribeiro Grande (INT RG). Esses resultados devem determinar a diferena entre rea
contnua e fragmento observada nas anlises anteriores, onde a densidade das comunidades
amostradas de anfbios em fragmentos foi significativamente maior que daquelas amostras de
anfbios em reas contnuas (Tabela 3).

28

Tabela 3: Comparao de mdias de UFC/mL entre pares de

localidades para cada espcie, cujo resultado mostrado pelo teste
Kruskal-Wallis (K-W).
reas
NSV - INT
NSV - RG
NSV - SLP
INT - RG
INT - SLP
RG - SLP

Mdias
114266 - 17704
114266 - 201805
114266 - 287824
117704 - 201805
117704 - 287824
201805 - 287824

Desvio
137456 - 90359
90359 - 61335
90359 - 322813
137456 - 61335
137456 - 322813
61335 - 322813

K-W
6,67-1
9,17-2
1,8-1
2,39-2
1,46-2
7,99-1

D. minutus

NSV - INT
NSV - RG
NSV - SLP
INT - RG
INT - SLP
RG - SLP

389 - 3908
389 - 9437
3889 - 13381
39080 - 9437
39080 - 13381
9437 - 13381

9243,8 - 91979
9243,8 - 14394
9243,8 - 32833
91979 - 14394
91979 - 32833
14394 - 32833

3,19-3
2,97-3
2,94-1
3,87-1
2,42-2
1,09-1

P. distincta

INT - RG

117571 - 73903

123527 - 160404

2,75-2

NSV - SLP

12166 - 26333

20806 -6463

8,54-1

P. boiei

A. leucopygius

Abreviaes: NSV, Ncleo de Santa Virgnia (rea contnua); SLP, So Lus do

Paraitinga (fragmento); INT, Intervales (rea contnua); RG, Ribeiro Grande
(fragmento); K-W, Kruskal-Wallis.

A anlise de comparao dos microhabitats mostrou que existem diferenas entre

Milhares

os eles (Figura 7).

480
440
400
360
UFC Mdio

320
280
240
200
160
120
80
40
0
rvore

rea aberta

Folhio

Esp ci e

Figura 7. Mdia e desvio padro da densidade de UFC/ml da microbiota cutnea de

anfbios, representantes de trs microhabitats distintos.

29

As anlises dos pares de microhabitats mostraram que h diferenas significativas

entre os pares dos trs microhabitats estudados (Tabela 4).
Tabela 4. Comparao de mdias de UFC/mL entre
pares de microhabitats, utilizando teste de MannWhitney
P-valor (5%)

rvore

rea aberta

Folhio

rvore

0,00

4,85 -10

1,06 -15

rea aberta

Folhio

4.3 Anlises de temperatura e umidade

Durante a obteno dos dados de temperatura, perdemos algumas informaes

devido ao mau funcionamento dos equipamentos. Tal fato nos privou da incluso dos dados
de reas abertas e alguns pontos do interior das matas, no entanto, julgamos que os registros
obtidos foram suficientes para constatar os padres de temperatura e umidade dos
fragmentos e reas contnuas.
Para temperatura, houve diferena significativa entre as mdias de temperaturas,
sendo a paisagem fragmentada mais quente que a paisagem contnua. No foram observadas
diferenas significativas para os demais parmetros de temperatura (Figura 8).

Temperatura - C

40
35
30
25
20
15
10
5
0
Mdia

Mxima
Contnuo

Mnima

Amplitude

Fragmento

Figura 8. Mdias dos parmetros mdia, mxima, mnima e amplitude de

temperatura em reas contnuas e fragmentos.

30

Os parmetros de umidade relativa no apresentaram diferenas significativas entre as

paisagens (Figura 9).

Temperatura - C

40
35
30
25
20
15
10
5
0
Mdia

Varincia

Mxima
Contnuo

Mnima

Amplitude

Fragmento

Figura 9. Mdias e desvios padro dos parmetros mdia, mxima, mnima e

amplitude de umidade relativa em reas contnuas e fragmentos.

5. Discusso
Apesar da impossibilidade de fazer comparaes com estudos anteriores, dado ao
carter pioneiro da problemtica proposta nesta pesquisa, as anlises de densidade
microbiana permitiram identificar alguns padres de comunidades cutneas das espcies de
anuros estudadas.
Diferena de densidade microbiana entre espcies de anuros O primeiro
padro que pode ser identificado so as diferenas entre as espcies havendo em P. boiei
uma densidade muito superior de bactrias, seguido das densidades de P. distincta, A.
leucopygius e, por ltimo, D. minutus. Essa diferena entre espcies pode ser explicada por
dois fatores principais: a morfo-fisiologia da pele e a histria natural das espcies.
Em relao do primeiro fator, sabemos que h diferenas interespecficas
relacionadas s secrees cutneas das glndulas drminas dos anfbios, referentes s

31

molculas componentes (Conlon et al., 2004, Conlon et al., 2007). Algumas dessas
molculas so bioativas produzindo efeito antimicrobiano contra espcies de bactrias e
fungos (Rollins-Smith et al., 2002). Alm disso, P. distincta, A. leucopygius e D.minutus,
possuem a superfcie da pele constantemente umidificada por secrees mucosas, e cera no
caso de P. distincta, que podem limitar a densidade microbiana. Concomitantemente, a
morfologia da pele tambm pode explicar a maior densidade observada em P. boiei, uma vez
que esta a espcie com maior rugosidade de pele das espcies de anuros estudadas, o que
pode facilitar a instalao e permanncia de uma densidade superior de bactrias. Por outro
lado, a menor densidade microbiana em D. minutus pode ser explicada pela lisa textura dessa
superfcie da pele dessa espcie.
O segundo fator, histria natural das espcies, tambm pode ser um modulador da
diversidade e densidade bacteriana residente na pele dos anfbios. Por exemplo, os
indivduos da espcie P. boiei so bastante ativos, se deslocando por longas distncias, o que
pode ser percebido atravs dos encontros com indivduos em trilhas distantes dos corpos de
gua, onde eles so achados durante o perodo reprodutivo (Zina et al., 2007). Esses hbitos
devem permitir que o animal entre em contato com um amplo mosaico de comunidades
microbioanas que ocorrem dentro da mata, quando comparado com as demais espcies de
anuros. P. distincta uma espcie de hbito arborcola, passando a maior parte da vida sobre
rvores (Bertoluci, 2005). A.leucopygius encontrada noite principalmente sobre rvores e
tambm vocalizando sobre vegetaes associadas a corpos de gua, como taboais e charcos
temporrios (Heyer, et al., 1990). D. minutos, espcie que tanto vocaliza nas margens quanto
nada ativamente em corpos de gua lnticos (Pombal & Haddad, 2005), nesse estudo foi
principalmente encontrada em reas abertas e apresentou os menores valores de densidade
microbiana cutnea, nos chamando ateno o fato de que para algumas amostras, nenhuma

32

colnia foi detectada na placa, o que no aconteceu para as demais espcies. As freqentes
lavagens durante as incurses e nado ativo nos corpos de gua podem contribuir para uma
menor densidade bacteriana amostrada nessa espcie.
razovel ainda propor que algumas espcies de anfbios lancem mo de uma
microbiota cutnea com alta densidade e outras tenham como principal barreira de proteo
uma maior complexidade e efeito em termos de molculas bioativas secretadas na pele e,
que, portanto, determinam uma densidade inferior de bactrias residentes.
Diferena de densidade microbiana na pele de anuros em duas paisagens
Apesar de haver uma tendncia que indica uma maior densidade de microbiota cutnea em
anuros de paisagens fragmentadas (tabela 3), o resultado mais expressivo dessa realidade
referente espcie P. boiei. Esse resultado pode estar associado ao fato de que o substrato
solo, principal superfcie de contato dessa espcie, experimenta grandes flutuaes nas
caractersticas de microbiotas, principalmente em remanescentes de floresta. Sendo afetado
tanto pela lixiviao de compostos e microrganismos da matriz, quanto pelas prprias
variveis abiticas e biticas alteradas no interior da mata (Saunders et al., 1991). As demais
espcies no indicaram a existncia de um forte efeito da paisagem sobre a densidade
microbiana total, mostrando que existem diferenas interespecficas.
Embora possamos fazer menes quanto aos componentes que modulam os perfis
das comunidades microbianas da pele dos anfbios, as conseqncias de tais perfis
estabelecidos, ou de alteraes desses por causas antropognicas, so de difcil previso
devido ao fato de ainda no entendermos qual o significado das densidades total ou relativa
de microbiota cutnea para as espcies estudadas. possvel que existam processos
densidade dependentes, como foi identificado para a bactria Chromobacterium violaceum,
isolada da espcie de salamandra Plethodon cinereus, onde a produo de antibitico pela

33

bactria residente dependente da densidade de Batrachochytrium dendrobatidis, que causa

infeces cutneas (Brucker et al., 2008). Estudos que investiguem a densidade, biomassa e
atividade, principais parmetros ecolgicos da estrutura e funo dos ecossistemas
microbianos (Atlas & Bartha, 1993), iro elucidar o significado da densidade dessas
comunidades para os anfbios e os ambientes. Assim como o significado dos ambientes e dos
anfbios para as microbiotas cutneas.
Uma relao direta do microhabitat com os perfis de densidade microbiana
encontrados poderia ser verificada por meio de estudos da densidade microbiana dos
microhabitats ocupados. Isso porque o solo, a vegetao e a gua variam em estrutura fsica,
composio de nutrientes, temperatura e potencial de gua, o que influencia os tipos de
microrganismos presentes (Madigan et al., 2004). Esses estudos adicionais relacionados aos
microhabitats devem considerar a co-varivel filogenia, que deve ter influenciado fortemente
os resultados observados na anlise de microhabitat.
Alm das caractersticas sugeridas como determinantes dos padres observados,
tais como caractersticas inerentes pele e tipo de hbitat ocupado, poderia existir um vis
metodolgico em nossos resultados: o meio de cultivo utilizado. Este apesar de ser utilizado
nos estudos de diversidade microbiana e em todos aqueles de microbiota cutnea de anfbios,
poderia como qualquer meio de cultivo, selecionar algumas entidades microbianas e no
outras (Atlas & Bartha, 1993). Estudos futuros de contagem de clulas por microscopia de
fluorescncia traro resultados mais acurados da densidade microbiana residente da pele dos
anfbios.
Apesar de no terem sido detectadas diferenas entre as paisagens contnuas e
fragmentadas, para a maioria dos parmetros de temperatura estudados, a diferena
significativa entre as mdias de temperatura podem ter influncia nos padres de densidade

34

observados, dada a influncia da temperatura no crescimento e fisiologia bacterianos. Assim,

mdias superiores de temperatura nos fragmentos estudados podem ter um efeito nas
densidades da microbiota cutnea observada. Amostragens que incluam outras estaes do
ano, alm do vero, podero elucidar melhor os padres de umidade relativa e tempetatura
existentes nessas reas. Alm disso, outras variveis que podem ser importantes ou melhores
preditores dos perfis dessas comunidades microbianas, tais como pH, disponibilidade hdrica
nos substratos e incidncia de radiao, ou ainda, a interao entre diversas variveis
ambientais.

6. Concluso
A comunidade microbiana residente da pele de anfbios configura-se como uma
interessante interface entre o animal e o ambiente, onde inmeros processos biolgicos
podem ser abordados. O presente estudo trouxe uma perspectiva inovadora onde foi
ressaltada a existncia de padres de densidades microbianas sobre a pele desses animais.
Tais padres apontam para a influncia dos fatores: espcie, histria natual e paisagem, na
determinao da densidade bacteriana cutnea. O microhabitat pode tambm ser um
componente determinante dos padres observados, sendo o solo o microhabitat que
proporciona uma maior densidade microbiana.
A diferena entre as mdias de temperatura nas paisagens estudadas o nosso
primeiro indicativo de que h diferena relacionada aos fatores abiticos nessas paisagens e,
sendo a temperatura um fator muito importante para o crescimento de microrganismos,
muito provvel que esta tenha efeito sobre a densidade bacteriana cutnea. Alm da
temperatura e umidade relativa, outras variveis ambientais devem estar includas em futuras
anlises dos padres de microbiota cutnea de anfbios para avaliar mais profundamente a

35

importncia das variveis abiticas e contexto ambiental para a determinao dos perfis
dessas comunidades. Anlises de densidade microbianas devero incluir estimativas feitas
atravs de contagem de clula por microscopia de fluorescncia, para que o vis do meio de
cultivo seja eliminado. Estudos adicionais incluindo os componentes biomassa e atividade,
juntamente com a densidade microbiana podero elucidar o significado das diferenas
encontradas entre espcies e entre paisagens, principalmente, atravs do entendimento da
estrutura e funo dessas comunidades.
O estudo trouxe um marco que aponta para a necessidade de novas pesquisas, pois
fica demonstrado que, em alguns casos, a paisagem pode influenciar notoriamente a
comunidade microbiana residente na pele dos anfbios. esperado que existam
conseqncias ecologicamente relevantes nessas diferenas e estudos adicionais podero
contribuir para a elucidao de processos ecolgicos, fisiolgicos e evolutivos, nessa
interface.

36

Captulo 2
Caracterizao da microbiota cutnea de quatro espcies de anuros em
diferentes

fragmentos

antimicrobiano.

de

Floresta

Atlntica:

Riqueza

potencial

37

Resumo

Diversas pesquisas tm demonstrado o potencial de bactrias, componentes das

comunidades microbianas da pele dos anfbios, contra importantes patgenos, como o fungo
Batrachochytrium dendrobatidis. O que serve como um indicativo de que a microbiota atua
como um componente de proteo desses animais. Apesar de ainda conhecermos pouco, esse
aspecto da histria natural dos anfbios muito relevante no contexto atual de impactos
ambientais e doenas infecciosas no meio ambiente. A riqueza de morfotipos de colnias
bacterianas uma medida rpida e pode ser considerada como um indicativo da diversidade
microbiana cultivvel das comunidades. Esse estudo teve como objetivo geral uma anlise
sobre o potencial antimicrobiano de colnias bacterianas isoladas das comunidades cutneas
de anfbios de quatro espcies de anfbios: Proceratophrys boiei, Dendropsophus minutus,
Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta, bem como uma anlise comparativa da
riqueza de comunidades microbianas presentes em anuros coletados em fragmento e rea
contnua de Floresta Atlntica. Todas as espcies apresentaram morfotipos de colnias
bacterianas com potencial antimicrobiano, nos testes cross-streak. P. boiei apresentou a maior
riqueza e nmero de morfotipos com atividade antimicrobiana. As diferenas podem ser
determinadas por dois componentes principais: modo de vida e caractersticas da pele. O
entendimento dos fatores ambientais que modulam as diferenas acerca da riqueza e
diversidade de bactrias com potencial antimicrobiano pode auxiliar na determinao de
estratgias conservacionistas, atravs da predio de quais ou o que torna as espcies de
anfbios mais vulnerveis, com base nos perfis das comunidades microbianas da pele.

38

1. Introduo
O termo microbiota residente no contexto desse trabalho definido como a
comunidade de microrganismos viventes na epiderme dos anfbios. Essa comunidade pode
atuar como primeira barreira protetora, impedindo a infeco por outros microrganismos que
possam invadir o corpo desses animais atravs da pele (Austin, 2000; Harris et al. 2006;
Woodhams, 2007; Lauer et al. 2007; Ashcroft, 2008; Brucker et al., 2008; Lauer et al., 2008;
Lam, et al. 2009; Harris et al., 2009). Apesar de ainda conhecermos pouco, esse aspecto da
histria natural dos anfbios muito relevante no contexto atual de impactos ambientais e
doenas infecciosas no meio ambiente. Isso porque diversas entidades microbianas, que so
apontadas na literatura como causadoras de epidemias em populaes de anfbios,
aparentemente atacam a partir de contato com a epiderme. Dessa forma, a comunidade
microbiana residente na pele desses animais poderia ter um significado funcional no contexto
de uma primeira barreira protetora.
Em 2006, Harris e colaboradores isolaram e identificaram alguns gneros de
espcies de bactrias presentes na pele de duas espcies de salamandras (Amphibia, Caudata)
e com aparente ao inibidora do crescimento de fungos, inclusive Bd. Lauer et al., 2007 em
estudo de caracterizao da microbiota residente de salamandras da espcie Plethodon
cinereus, revela uma ampla distribuio de bactrias sobre a pele, como tambm bactrias
com propriedades antifngicas. Tambm em 2007, Woodhams e colaboradores estudaram
duas populaes de Rana mucosa expostas ao fungo, estando uma delas em declnio e a outra
persistindo apesar da ocorrncia do patgeno. Nesse estudo foi constatado que a variao na
suscetibilidade ao Bd no estava associada s alteraes na composio dos peptdeos da
secreo mucosa, mas acontecia em associao a diferenas na microbiota cutnea residente.
A proporo e a freqncia de rs hospedando pelo menos uma espcie de bactria com ao

39

inibitria de crescimento de Bd foi significativamente maior naquela populao resistente ao

fungo.
Lauer et al., 2008 isolaram bactrias da pele de trs populaes de salamandras e
realizaram ensaios destas contra dois diferentes tipos de fungo: Mariannea elegans e
Rhizomucor variabilis, que atacam os ovos destes anfbios. Atravs de identificao
molecular, chega ao nmero de 48 espcies de bactrias cutneas, alm de constatar que a
maior parte dos indivduos de todas as populaes hospedava bactrias contra pelo menos
dos dois fungos. Brucker et al., 2008 detectou dois metablitos com potente ao contra
fungos patgenos, na pele de salamandras da espcie Plethodon cinereus. Estes metablitos
so produzidos pela bactria simbionte Janthinobacterium lividum em concentraes letais
para o fungo Bd. No conjunto, esses trabalhos fornecem evidncia inicial hiptese de que
bactrias cutneo-residentes antifngicas tm um importante papel no sistema de defesa dos
anfbios.
O potencial de alguns elementos dessa comunidade contra patgenos in vitro
conhecido, porm esta propriedade consta em estudos recentes e carece de investigaes
mais profundas, ressaltando o significado desses elementos para os animais num contexto
ecolgico. Poucos demonstram a ao de elementos isolados da microbiota cutnea contra
importantes patgenos que atuam por meio da pele dos anfbios, tais como Aeromonas
hydrophila, que atua na epiderme e trato digestivo, oportunista tornando-se patognica
quando o indivduo est sob stress; Iridovidae, o iridovrus, coloniza a pele e o fgado; e
Batrachochytrium dendrobatidis o fungo quitrdeo considerado principal ameaa s
populaes de anfbios em termos doenas. As colnias desse fungo atacam o epitlio
queratinizado e partes da boca de girinos. (Carey, et al., 1999; Weldon et al.; 2004; RollinsSmith et al., 2002). Mariannaea sp., o qual um fungo ascomiceto que ataca ovos de

40

salamandras e o prprio fungo B. dendrobatidis. No momento, existe grande expectativa que

os resultados positivos de ensaios de inibio de crescimento bacteriano, onde se verifica a
produo de antibiticos com efeito contra esses patgenos, realizados in vitro possam
acontecer in vivo.
Sabemos que algumas populaes declinam de forma rpida quando so expostas
a fungos como Bd, enquanto outras persistem, parecendo oferecer algum tipo de resistncia
contra o agente infeccioso. Essa resistncia pode estar relacionada a variaes na
patogenicidade do agente, a densidade e diversidade de microorganismos na epiderme, bem
como a densidade de patgeno a que o hospedeiro exposto, na eficcia das secrees de
peptdeos antimicrobianos ou nas caractersticas das populaes (como histria de vida,
fisiologia, comportamento e ecologia) e ainda variaes na comunidade microbiana da
epiderme (Harris et al., 2006). A diversidade microbiana sobe a pele dos anuros pode ser um
aspecto determinante durante as interaes da comunidade de microrganismos residentes
com uma espcie patgena com o potencial para invadir o corpo desse hospedeiro.
A riqueza das comunidades microbianas residentes na pele dos anfbios deve ser
modulada por fatores ambientais e fatores inerentes biologia dos animais. A secreo de
alguns compostos, por meio de glndulas drmicas, devem ser importantes componentes na
determinao dos perfis dessas comunidades microbianas. O muco composto de secreo
cida e rica em carboidratos, que podem atrair fungos e bactrias e servir de fonte nutritiva
para esses microorganismos (Ducklow & Michell, 1979; Duellman & Trueb, 1994; Brizzi et
al., 2002). Molculas bioativas, como peptdeos antimicrobianos, secretados por glndulas
granulares, componentes do sistema inato, podem prevenir a invaso de microrganismos
patgenos atravs da pele ou mesmo limitar o crescimento destes sobre a mesma, diminuindo
o risco de infeces, ou mesmo atuar como um agente seletivo, permitindo que apenas

41

algumas populaes se estabeleam sobre a pele (Rollins-Smith et al., 2002; Ashcroft et al.,
2007; Simmaco et al., 1997; Conlon et al., 2007; Bevier et al., 2004; Toledo & Jared, 1995).
Determinadas temperaturas corpreas podem favorecer o crescimento de certos grupos de
microrganismos e prejudicar outros. Este ltimo caso foi observado na espcie Litoria
chloris, que apresenta eventos de febre comportamental aumento da temperatura corprea
por termorregulao o que diminui a infestao por Bd (Woodhams, et al. 2003). Essas
temperaturas febris poderiam favorecer o crescimento de bactrias anti-Bd, como aquelas
detectadas nos trabalhos de (Lam et al. 2009).
A partir das propriedades apresentadas acima, poderamos sugerir que bactrias
drmicas tenham co-evoludo com as espcies de anfbios, desenvolvendo mecanismos de
resistncia contra a ao dos peptdeos antimicrobianos e mesmo contra a ao de outras
entidades microbianas. Por outro lado, haveria uma ocorrncia de espcies bacterianas
produtoras de metablitos antimicrobianos que atuariam como um fator de seleo,
determinando os perfis das microbiotas da pele.
O presente trabalho teve por objetivo a identificao do potencial antimicrobiano
dos morfotipos de colnias bacterianas isoladas das comunidades cutneas amostradas, bem
como uma anlise comparativa da riqueza de comunidades microbianas presentes em anuros
coletados em dois diferentes contextos paisagsticos: fragmento e rea contnua, alm da
comparao dessa riqueza entre quatro espcies de anuros: Proceratophrys boiei, famlia
Cicloramphidae, Dendropsophus minutus, famlia Hylidae, Aplastodiscus leucopygius,
famlia Hylidae e Phyllomedusa distincta, famlia Hylidae. Para isso, partimos da seguinte
hiptese: Animais que mantm contato com um gradiente microbiolgico mais instvel, por
exemplo, aqueles presentes nos fragmentos, tm uma riqueza e nmero de txons com ao

42

anti-patgeno na microbiota da pele maior do que aquelas espcies de anfbios restritas s

florestas.

2. Materiais e mtodos
2.1. Isolamento dos morfotipos de colnias bacterianas
Colnias bacterianas foram isoladas das comunidades utilizadas no trabalho de
determinao da densidade de microbiota cutnea de anfbios

Captulo1. Para cada rea

de coleta, morfotipos foram isolados das espcies: Proceratoprhys boiei, Aplastpdiscus

leucopygius, Phyllomedusa distincta e Dendropsophus minutus. Dessa forma, entidades das
comunidades microbianas foram isoladas no s conforme as espcies, mas tambm destas
em localidades diferentes. Aps a contagem, a placa foi reservada para o isolamento das
colnias, em laboratrio. As colnias foram caracterizadas de acordo com a morfologia
observada com o auxlio de uma lupa da marca (Quimis). Foram utilizadas para
caracterizao: cor, borda, tamanho, brilho, superfcie (lisa ou rugosa) e outros aspectos que
saltasse aos olhos, por exemplo, a presena de grnulos. Foi denominado morfotipo uma
colnia representante de um grupo de colnias com as mesmas caractersticas morfolgicas.
Em uma capela de fluxo laminar (GermFree Laboratories Inc.), as colnias foram
transferidas para novo meio R2A (DIFCO) e isoladas pelo mtodo do esgotamento em
placa,com o auxlio de uma ala de platina, previamente esterilizada em uma chama de bico
de bunsen, , como descrito em Madigan et al., 2009. As colnias isoladas, foram a seguir
inoculadas em meio de cultura R2A slido, em tubo inclinado para seu armazenamento. Uma
pequena coleo microbiolgica foi criada: todos os tubos contendo os morfotipos isolados
foram estocados em geladeira a 8C e repicados a cada seis meses, para que a viabilidade dos
mesmos se mantivesse durante e aps os experimentos. A cada um dos morfotipos foi

43

atribudo um cdigo de identificao que permite o resgate das informaes sobre a sua
procedncia. A denominao RG informa que esse isolado procedente do municpio de
Ribeiro Grande, INT, Fazenda Paraso do Parque Estadual de Intervales, SLP, So Lus do
Paraitinga e NSV, Ncleo de Santa Virgnia. Os dois primeiros nmeros fazem referncia
espcime de anuro utilizada e os ltimos em referncia ao isolado.
Os registros morfolgicos dos isolados foram feitos por fotografia sobre lupa e
para a verificao da pureza dos cultivos, microscopia por colorao de GRAM. As imagens
foram feitas de maneira a ressaltar algumas caractersticas morfolgicas, de acordo com os
padres de descrio definidos por Eaton et al., 1995 e Ogram & Feng, 1997, onde observase principalmente formato, borda, textura, colorao e dimetro da colnia. Foi utilizado o
teste Kruskall-Wallis para as anlises dos nmeros totais de morfotipos isolados das
comunidades microbianas das quatro espcies de anuros.

2.2 Inibio de crescimento bacteriano

O mtodo do trao cruzado (do ingls cross-streak), primeiramente utilizado por
Alexander Flemming (1881-1955) nos estudos da penicilina, hoje bastante empregado nas
pesquisas de microbiologia industrial durante a busca por novos antibiticos e os espectros
de ao destes (Madigan et al., 2009).
As cepas de referncia usadas nos testes foram cedidos pela Fundao Oswaldo
Cruz Fiocruz / RJ. Foram elas: Cocos Gram-positivos: Staphylococcus aureus ATCC
14458; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 e Micrococcus luteus ATCC 7468.
Bacilos Gram-negativos: Escherichia coli ATCC 11229; Proteus vulgaris CCUG
10784; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi ATCC 6539; Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Enteritidis(CT) ATCC 13076; Aeromonas hydrophila

44

IOC/FDA 110-36; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 e Klebsiella pneumoniae subsp.

pneumoniae ATCC 4352. Esses patgenos foram escolhidos aps uma reviso na
literatura acerca das espcies de microrganismos que afetam anfbios e em concordncia com
os patgenos utilizados nos testes de capacidade antimicrobiana com isolados de outras
espcies de anfbios (Ashcroft, 2008). O fungo quitrdio Batrachochytrium dendrobatidis
no foi includo neste estudo devido impossibilidade de obteno de cepas de referncia,
uma vez que, no Brasil, esse patgeno no foi depositado. A importano de cepas se tornou
invivel pelo tempo que seria gasto com a tramitao do processo junto aos rgos
responsveis. Alm disso, resultados mais expressivos deveriam ser obtidos com cepas
isoladas de anfbios brasileiros, devido possvel variao fenotpica, quando comparadas
quelas de outras regies.
O mtodo de trao cruzado consistiu em inocular um novo microrganismo
isolado da pele dos animais em um dos lados da placa, permitindo o crescimento deste
temperatura ambiente, at que a regio inoculada seja coberta por uma massa de clulas
detectada a olho nu (Figura 1A). A seguir, foram inoculadas as bactrias cuja sensibilidade
foi avaliada, ou seja, os patgenos. Estas foram inoculadas em traos perpendiculares e ao
lado oposto prximo massa da bactria isolada dos animais (Figura 1B). Aps 24 horas de
incubao, em temperatura ambiente, foi observado o crescimento, o indicativo da produo
de antibiticos a falta de crescimento dos traos na regio prxima massa de crescimento
do microrganismo produtor (Madigan et al., 2009).
Foi demarcado um trao na linha mdia da placa de Petri, prximo a bactria
isolada dos anuros. Um segundo trao determinava o ponto inicial do inculos das bactrias a
serem inibidas. Um terceiro trao demarcava o limite de crescimento para ser considerada a
inibio, ou seja, quando o crescimento no ultrapassou a terceira linha, foi considerada a

45

inibio do crescimento (Figura 1). Foram realizados controles nos quais foram inoculados
na ausncia de um microrganismo isolado de anuros para verificao da viabilidade dos
patgenos nas condies de crescimento.

Figura 1. Mtodo do trao cruzado utilizado para identificar colnias isoladas dos anuros
com atividade anti-microbiana. A) colnia isolada da pele de anuro B) patgenos em trao
perpendicular bactria do anuro c) traos para anlise do crescimento dos patgenos.

3. Resultados
3.1 Morfotipos
Obtivemos um total de 214 morfotipos bacterianos isolados das espcies
Proceratophrys boiei, Aplastodiscus leucopygius, Phyllomedusa distincta e Dendropsophus
minutus. Foram utilizados os cultivos das comunidades feitos no trabalho anterior (Captulo
1). As colnias isoladas foram registradas por meio de fotografia sobre lupa. Exemplos dos
registros feitos constam na figura 1. Aps essa etapa, foi criado um banco microbiolgico
onde esto depositados todos os isolados de colnias bacterianas obtidas da microbiota
cutnea dos anuros estudados, dessa forma, esses microrganismos esto disponibilizados
para trabalhos de diferentes grupos de pesquisa. Vale mencionar que alguns no se

46

mativeram viveis aps os repliques, feitos a cada seis meses, havendo hoje um total de 161
isolados.

Figura 1. Exemplos de registros fotogrficos feitos a partir dos morfotipos de colnias

bacterianas isoladas das microbiotas residentes de anfbios.

3.2. Densidade de morfotipos

Foi constatado que h diferenas significativas entre as espcies (p= 1,20 -3).
P

Sendo P. boiei a espcie com maior riqueza da qual foram isolados, seguido de P. distincta,
D. minutus e A. leucopygius (Figura 2).

Nmero de morfotipos

160
140
120
100
80
60
40
20
0
A. leucopygius

D. minutus

P. boiei

P. distincta

Espcie

Figura 2 Nmero de morfotipos de colnias bacterianas isoladas em quatro

espcies de anuros.

Uma comparao feita entre as mdias de morfotipos de colnias bacterianas

amostradas de animais em reas contnuas (DP 1,87) e fragmentadas (DP 5,165; p= 6,04 -1 )
P

47

mostrou que no h diferena significativa entre elas (Figura 3), o que pode ser conseqncia
das medidas de disperso observadas. Apesar disso, o nmero total de morfotipos quase
duplica nas reas fragmentadas (149) em relao s reas contnuas (61).

Mdia de Morfotipos

7
6
5
4
3
2
1
0
CONT

FRAG

Paisage m

Figura 3. Mdia do nmero total de morfotipos de colnias bacterianas isoladas em reas

contnuas e fragmentos. CONT so reas contnuas e FRAG so fragmentos.
Houve diferena significativa entre os nmeros totais de morfotipos isolados de
comunidades microbianas das quatro espcies de anuros, acima citadas, em diferentes
localidades (p=4,16 -2 ) (Figura4).
P

Nmero de morfotipos

160
140
120
100
80
60
40
20
0
A. leucopygius

D. minutus

P. boiei

P. distincta

Espcie

Figura 4 Nmero de morfotipos de colnias bacterianas isoladas em quatro de anfbios

em quatro reas de amostragem. INT, Intervales; NSV, Ncleo de Santa Virgnia; RG,
Ribeiro Grande; SLP, So Lus do Paraitinga.

48

3.3. Ensaio de poder inibitrio de patgenos

Todos os morfotipos bacterianos isolados e que se mantiveram em nosso banco
microbiolgico, um total de 161, dos quais 27 apresentaram poder inibitrio contra pelos
menos um dos 10 patgenos utilizados. Proceratophrys boiei foi a espcie para a qual mais
isolados inibidores foram identificados (17), seguida de Phyllomedusa distincta (4) e, depois,
Dendropsophus minutus (3) e Aplastodiscus leucopygius (3) (Tabela 1). Os controles
apresentaram crescimento de acordo com o esperado.
As cepas padro ATCC (American Type Culture Collection), que sofreram
inibio por um maior nmero de cepas isoladas foram: Staphyllococcus aureus (16) e
Streptococcus epidermidis (17), seguidos de Aeromonas hydrophila (11), Micrococcus luteus
(11), Klebisiella pneumoniae (8), Proteus vulgaris (5), Salmonella typhi (4), Escherichia coli
(3), Pseudomonas aeruginosa (3) e, por tlimo, Salmonella enteritidis (1).

P. boiei foi a

espcie com maior nmero de morfotipos com poder inibitrio, sendo a maior parte dos
isolados com potencial contra Staphyllococcus aureus e Streptococcus epidermidis.

P.

distincta teve isolados com potencial contra cinco do dez patgenos testados, D. minutus
possuiu pelo menos um isolado contra praticamente todos os patgenos, com exceo de
Salmonella enteritidis, para a qual menos isolados tiveram efeito. A. leucopugius, assim,
como P. distincta tambm teve isolados com efeitos inibitrios para cinco dos dez patgenos
expostos (Tabela 1).

49

Tabela 1: Efeito inibitrio de morfotipos de colnia bacteriana isoladas de espcies de

anfbios, para cada patgeno testado.
Espcie de anfbio

Morfotipo

SLP2-14
SLP 124-196
RG58-132
RG31-95
SLP124-195
SLP3-16
RG28-51
Proceratophrys boiei SLP150-219
- 17 morfotipos NSV95-167
NSV95-168
NSV95-166
RG58-131
RG30-87
RG30-90
INT70-148
SLP 124-199
SLP128-213

EC AH PA AS SENT ST SEP PV ML KP Total

*
*
*
-

*
*
*
*
*
*
-

*
*
-

*
*
*
*
*
*
*
*
*
-

*
-

*
*
-

*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*

*
*
*
*
-

*
*
*
*
*
*
*
-

*
*
*
*
*
*
-

10
6
4
4
4
3
3
3
3
2
2
2
1
1
1
1
1

INT23-37
INT26-41
INT27-42

*
-

*
*
*

*
-

2
2
1

RG66-140

Aplastodiscus
leucopygius
- 3 morfotipos -

NSV99-177
NSV99-176

*
*

*
*

*
*

*
*

*
-

5
4

NSV97-172

Dendropsophus
minutus
- 3 morfotiopos -

RG102-184
RG102-185
NSV91-160

*
*
-

*
-

*
*
-

*
*
-

*
-

*
*
-

*
-

7
4
1

Phyllomedusa
distincta
- 4 morfotipos -

Abreviaes: EC, Escherichia coli; AH, Aeromonas hydrophila; PA, Pseudomonas aeruginosa; AS,
Staphyllococcus aureus; SE, Streptococcus epidermidis; ST, Salmonella typhi; SEP, Streptococcus
epidermidis; PV, Proteus vulgaris; ML, Micrococcus luteus; KP, Klebisiella pneumoniae.

50

Houve mais bactrias com poder inibitrio isoladas de anuros coletados em reas
fragmentadas. Foram 18 isolados destes contra 11 isolados de anuros de reas contnuas
(Figura 5).

4
7

11

So Lus do Paraitinga

Ncleo de Santa Virgnia

Ribeiro Grande

Intervales

Figura 5: Nmero de isolados com potencial inibitrio em reas de coleta. Sendo reas
fragmentadas: So Lus do Paraitinga e Ribeiro Grande e reas contnuas: Ncleo de
Santa Virgnia e Intervales.

4. Discusso
4.1 Riqueza microbiana
A espcie que apresentou maior riqueza de morfotipos de colnias bacterianas,
Proceratophrys boiei, tambm a espcie na qual houve maior densidade microbiana, em
nossa primeira abordagem (Captulo 1). Isso demonstra que essa espcie um modelo
importante nos estudos da microbiota cutnea de anfbios. Apesar de ainda no possvel
apontar os fatores determinantes das diferenas de riqueza microbiana encontradas nas peles
desses animais, o microhabitat ocupado e o tipo de pele podem ser bons norteadores. O
tegumento de P. boiei bastante rugoso se comparado s outras espcies estudadas,
apresentando diversas protuberncias e verrugas com projees semelhantes a espinhos, com
glndulas mucosas com secreo de glicosaminoglicanos (Felsemburgh et al., 2007). Alm
disso, essa espcie mantm contato com o solo, que apresenta grande diversidade e

51

densidade de entidades microbianas (Atlas & Bartha, 1993). Esses dois fatores devem
determinar maior riqueza de morfotipos encontrada nessa espcie, quando comparada a
Phyllomedusa distincta, Dendropsophus minutus e Aplastodiscus leucopygius.
O tipo de solo, gua, cobertura vegetal e outros, variam em estrutura fsica,
composio de nutrientes, temperatura e potencial de gua o que determinam o tipo de
bactria presente no meio e deve, por conseguinte, determinar a comunidade na epiderme dos
anfbios (Belden & Harris, 2007). Por tanto, os efeitos das alteraes antropognicas, como
aqueles observados quando ocorre no processo de fragmentao de florestas antes contnuas,
acarretam alteraes na composio da microbiota dos microambientes (Zilli et al., 2003).

4.2 Efeito inibitrio

Um grande nmero de morfotipos bacterianos com poder inibitrio do
crescimento de patgenos foi encontrado. Trabalhos anteriores demonstram a ocorrncia de
espcies bacterianas com poder antimicrobiano nas espcies de salamandras Plethodon
cinereus e Hemidactylus scutatum, e nas espcies de anuros Rana mucosa, Rana sierrae,
Notophthalamus viridescens e Lithobates catesbeianus (Harris et al., 2006; Lauer et al.,
2007; Culp et al., 2007; .Lauer et al., 2008; Woodhams et al., 2007; Lam et al., 2009) todas
de ocorrncia dos Estados Unidos da Amrica o que torna difcil a comparao entre essas e
as comunidades da presente pesquisa.
A ocorrncia de um maior nmero de morfotipos com poder inibitrio em P. boiei
deve-se complexidade de morfotipos bacterianos encontrados, que foi superior nesse txon.
Sabemos que o solo abriga grande quantidade de espcies bacterianas produtoras de
secrees antimicrobianas (Gottlieb, 1976). Dessa forma, P. boiei que ocupa esse substrato,
deve abrigar uma pequena parcela das comunidades que ali vivem. Tambm foi observado

52

um maior nmero de morfotipos isolados de indivduos em fragmentos de floresta o que

deve ser uma conseqncia da maior riqueza de morfotipos encontrada nessa paisagem. Esse
aspecto torna-se importante no contexto da proposta feita por Lam et al., 2009, na qual a
proporo de bactrias com poder inibitrio do crescimento do fungo Bd, na espcie de anuro
Rana mucosa, determinante na resistncia das populaes desses animais contra o fungo
patgeno. O que sugere que as populaes de anuros com maior quantidade de morfotipos
bacterianos com poder inibitrio podem ser mais resistentes quando so expostas a
patgenos, no meio natural.
Espcies de patgenos testados j foram identificados como parte das microbiotas
residentes da pele de outros anfbios em trabalhos anteriores, tais como Pseudomonas
aeruginosa, e Staphyllococcus epidermidis e a espcie Aeromonas hydrophila (Lauer et al.,
2008; Culp et al., 2007). O gnero Salmonella j foi detectado em casos de infeco em
anuros (Densmore & Green, 2007). A ocorrncia de entidades bacterianas com poder
inibitrio contra esses patgenos retrata a importncia dessa comunidade como primeira
proteo.

5. Concluso
O estudo da riqueza dos morfotipos bacterianos ressaltou a complexidade
das comunidades microbianas na pele dos anfbios estudados. Ressaltou ainda a existncia de
perfis de comunidades inerentes a cada espcie, havendo maior complexidade em P. boiei,
seguida de P. distincta, A. leucopygius e, por fim D. minutus. O perfil microbiolgico da pele
de anfbios se perfila como fundamental na biologia da conservao de anuros, no entanto, os
fatores que ditam as variaes na microbiota da epiderme em populaes de anfbios anuros

53

no tm recebido ateno. Especula-se que atributos biolgicos, histria de vida, fatores

genticos e seleo natural podem determinar essas variaes na composio da comunidade
microbiana, mas o papel do microclima com as suas conseqncias ecofisiolgicas no tm
sido estudado. possvel que a comunidade microbiana presente nos microhabitats de
florestas sofre algum grau de perturbao quando ocorre a fragmentao dos habitas e, como
verificado no presente estudo, possvel que tal perturbao se estenda microbiota cutnea
doa anfbios, ditando uma maior complexidade, como observado.
Os efeitos observados podem ser diferentes entre espcies, e mesmo entre
paisagens com caractersticas gerais similares. Este trabalho um primeiro passo no
esclarecimento dessas relaes, e a identificao dos morfotipos um passo seguinte
importante para entender como mudam as comunidades microbianas cutneas de anuros nas
paisagens. Nessa perspectiva, a prpria pele dos anfbios, como microhabitat de uma
comunidade que nela habita, deve ser considerada, pois, pode sofrer modificaes derivadas
de fatores ecofisiolgicos como temperatura, estado hdrico do indivduo e outros.
O comprovando poder inibitrio do crescimento de patgenos neste trabalho
ressalta a importncia dessas comunidades como primeira proteo contra agentes
infecciosos. Assim, torna-se indispensvel entendermos de que forma as condies
ambientais e fatores inerentes ao organismo influenciam a microbiota cutnea dos anfbios,
para comearmos a entender quais espcies ou ainda quais condies deixariam as espcies
mais vulnerveis s infeces, caso a estrutura das comunidades microbianas da pele fossem
alteradas.

54

Captulo 3

Identificao de morfotipos de colnias bacterianas isoladas de

comunidades microbianas residentes da pele de quatro anuros da Floresta
Atlntica

55

Resumo

Os anfbios abrigam uma microbiota cutnea complexa e que determinados

componentes dessas comunidades tm efeito comprovado in vitro contra alguns patgenos
conhecidos. Estudos de caracterizao da microbiota cutnea de anfbios, porm, so
escassos e os trabalhos existentes so recentes. A identificao taxonmica e funcional dos
componentes das microbiotas o passo inicial para futuras elucidaes de relaes patgenohospedeiro, alm do entendimento da estrutura e funcionalidade das comunidades
estabelecidas sobre dos anfbios, estabelecendo a interface pele - comunidade microbiana.
Alm disso, a diversidade microbiana presente na pele dos anuros pode ser importante fator
determinante na ocorrncia de doenas cutneas. Neste trabalho, tivemos por objetivo a
identificao de morfotipos de colnias bacterianas isoladas das comunidades microbianas
em estudo, assim como a busca por padres que pudessem ser detectados a partir da
determinao taxonmica desses isolados. Foram identificados 68 isolados de morfotipos de
colnias bacterianas. Entre os quais houve predominncia de bactrias dos filos
Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes e Actinobacteria, tpicas de ambiente, o que
corrobora nossa idia central do papel do ambiente na composio das comunidades
microbianas da pele dos anfbios.

56

1. Introduo
Estudos que confirmam a existncia de uma comunidade microbiana residente na
pele dos anfbios so recentes. As primeiras menes se deram sob a perspectiva do possvel
significado dessas comunidades durante o cuidado parental em espcies de urodelos (Bettin
& Greven, 1986). Mais tarde, foi constatada presena de bactrias produtoras de antibiticos
que tinha ao contra o crescimento de fungos como Mariannaea sp., que atacam os ovos
das fmeas da salamandra (Harris et al., 2006). A partir disso, cada vez mais so publicados
estudos explorando o potencial da microbiota cutnea de anfbios contra agentes patognicos
e, com isso, a diversidade bacteriana e os perfis dessas comunidades tm sido revelados.
Lauer et al., 2007, identificou 14 espcies bacterianas residentes da pele da salamadra
Plethodon cinereus. Em 2008, Lauer e colaboradores identificaram 48 espcies de bactrias
cutneas pertencentes a 16 gneros e 14 famlias, na salamandra Hemidactylium scutatum.
Nesse mesmo trabalho, onde se comparou a composio da microbiota cutnea de H.
scutatum com Plethodon cinereus, verificou-se que a proporo de espcies bacterianas
compartilhadas diminua conforme a hierarquia taxonmica. Assim, haviam quatro filos
compartilhados (100% do total), sete famlias (53%), nove gneros (47%) e oito espcies
(10%). Por isso, foi sugerido que pode haver especificidade de espcies bactrias para com
espcies de anfbios (Lauer et al., 2008).
Estes estudos elucidam o carter inicial da pesquisa em microbiota cutnea de
anfbios. Investigaes sobre a diversidade dessas comunidades so indispensveis nesse
momento, pois, primordial ter o conhecimento sobre quais txons compem essas
comunidades e se h padres.

57

O substrato um importante determinante dos perfis das comunidades

microbianas que sobre ele se estabelecem (Atlas & Bartha, 1993). A pele dos anfbios como
um substrato, pode ser um meio bastante seletivo devido principalmente s caractersticas
morfolgicas e fisiolgicas inerentes a cada espcie desses vertebrados. Tais como, secrees
de peptdeos antimicrobianos, carboidratos, ceras e mucos (Ashcroft et al. 2007). Os perfis
das comunidades residentes na pele dos anuros tambm podem ser influenciados pela
estrutura da comunidade microbiana presente no ambiente, e por sua vez, influenciada por
variveis qumicas e fsicas (Pelczar et al., 1981; Madigan et al., 2004). Alm disso, a
prpria interao da comunidade estabelecida com potenciais colonizadores do ambiente
poderia delimitar o perfil da comunidade (Mangoni et al., 2001; Rollins-Smith et al., 2002).
Nesse aspecto, h indcios de que a comunidade residente seja um fator estimulante para a
produo dos prprios peptdeos (Mangoni et al., 2001; Barbosa, 2010).
Doenas causadas por espcies microbianas oportunistas podem ser deflagradas
mediante

as

mudanas

em

variveis

ambientais,

que

determinam

eventos

de

imunossupresso (Carey et al, 1999). No entanto, pouco se sabe sobre as relaes

microrganismo/hospedeiro que se estabelecem entre micro e macrorganismos, no mundo
natural.

Sabemos que anfbios abrigam uma microbiota cutnea complexa e que

determinados componentes dessas comunidades tm efeito comprovado in vitro contra

alguns patgenos conhecidos (Harris et al., 2006; Woodhams et al., 2007; Lauer et al.,
2007). A identificao taxonmica e funcional dos componentes das microbiotas o passo
inicial para futuras elucidaes de relaes patgeno-hospedeiro estabelecidas na interface
pele - comunidade microbiana. Alm disso, a diversidade microbiana presente na pele dos
anuros pode ser importante fator determinante na ocorrncia de doenas cutneas.

58

No decorrer da pesquisa, isolamos bactrias da comunidade da derme dos

anuros estudados e caracterizamos a atividade antibacteriana de alguns dos morfotipos. No
presente trabalho tivemos por objetivo a identificao de morfotipos de colnias bacterianas
isoladas das comunidades microbianas em estudo, assim como a busca por padres que
pudessem ser detectados a partir da determinao taxonmica desses isolados.

2. Materiais e mtodos
2.1 Identificao dos isolados bacterianos
Para identificao por sequenciamento e anlise filogentica do gene de RNAr
16S, as colnias foram coletadas diretamente das placas de cultivos puros e colocadas
diretamente na reao de amplificao. Um fragmento especfico do gene 16S rRNA foi
amplificado

com

os

oligonucleotdeos

iniciadores

P338F

(5-

ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3) e W031R (5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3),

(Khammar et al., 2005; Xia et al., 2005). Cada reao foi realizada com tampo para Taq
DNA polimerase (Tris HCl 20 mM pH 8.0, KCl 500mM),

dNTPs a 0,25 M, cada

oligonucleotdeo a 0,25 M, MgCl 2 a 1,5 mM, 1,5 unidades de Taq DNA polimerase. Para
R

cada isolado, foi coletada uma nica colnia com o auxlio de um palito de madeira estril e
imersa na soluo da reao. As condies da PCR foram as seguintes: uma etapa de
desnaturao inicial a 94C por 5 min, seguida de 30 ciclos de 94C durante 1 min, 61C por
1 min para o anelamento e, finalmente, 72C durante 30 seg e 72C durante 10 min, para
elongao. O resultado da amplificao foi constatado por eletroforese em gel de agarose
2%, contendo brometo de etdio (0,5 g/mL), em TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1mM) e
posterior observao das bandas de DNA sobre transluminador UV 260 nm (Sambrock et al.,
1989), das bandas com 130 pares de base, aproximadamente.

59

2.2. Clonagem
Ligao
Os produtos de PCR foram clonados utilizando o vetor comercial pGEM -T Easy
P

(50ng), de acordo com as instrues suplementares do fabricante (Promega), utilizando 0,5

L de inserto, contendo aproximadamente 10 ng de DNA amplificado.
Preparo de bactria competente
Clulas bacterianas de E.coli da linhagem SURE foram inoculadas over-night em
10 mL de meio de cultivo SOB (Triptona 2%, Exrato de levedura 0,5%, NaCl 10 mM, KCl
2,5 mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10mM pH 6.8 7.0). O volume de 10 mL deste pr-inculo
foi adicionado a 100 mL do mesmo meio de cultivo e incubado a 37C, com agitao
moderada at atingir uma DO entre 0,4 e 0,6 (A 595nm). As clulas foram colhidas em
tubos de 50 mL, incubadas em gelo por 10 min e ento centrifugadas a 3000 rpm, por 10 min
a 4C. Aps o descarte do sobrenadante, o precipitado foi ressuspendido em 33 mL em FSB
Frozen Storage Buffer (Acetato de potssio 1M pH 7.5, Glicerol 10%, KCl 100mM,
MnCl2 .2H 2 O 45mM, CaCl 2 .2H 2 O 10 mM, HACoCl3 ) e incubado em gelo por 10 min. As
R

clulas foram precipitadas por centrifugao a 3000 rpm, por 10 min a 4C e as clulas
ressuspendidas em 8 mL de FBS. Foram adicionados 280 L de DMSO (concentrao final
3,5%) e, depois uma incubao em gelo por 5 min, mais 280 L de DMSO (concentrao
final 7,0%) foram adicionados e mais uma incubao foi feita em gelo, por 10 min. Alquotas
de 200 L foram banhadas em gelo seco-etanol e ento preservadas em freezer a - 80C
(Sambrock et al., 1989).
Transformao de bactrias por choque trmico
suspenso de clulas competentes, preparadas pelo protocolo acima, foram
adicionadas as reaes de ligao inserto-vetor. Aps 10 min de incubao em gelo, foi

60

realizado um choque trmico em banho-maria a 42C por 90 seg. Uma incubao a 37C de
45 min foi feita em meio lquido SOB e a seguir os as clulas foram inoculadas em meio
slido SOB (gar 2%) contendo Ampicilina 100 g/mL, IPTG 30 g/mL e X-gal 70 g/mL,
seguida da incubao destas placas a 37C, over-night (Sambrook et al., 1989). Um
indicativo de que o inserto de interesse foi acoplado ao vetor a colorao branca da colnia
bacteriana observada na placa. A insero do fragmento implica na inativao do gene lacZ e
a formao de colnias brancas (recombinantes) que so incapazes de metabolizar o X-gal,
por no produzirem a enzima -galactosidase, que cliva esse componente e produz colnias
de cor azul de ndigo. Os clones no recombinantes possuem esse gene ativo sendo capazes
de transcrever e traduzir a enzima, o que torna as colnias azuis.
Extrao de DNA plasmidial
Foram feitas extraes de pequena escala, mini-prep, com modificaes do
protocolo proposto por Birnboim e Doly, em 1979. Para cada cultivo de bactrias
transformadas, como protocolo descrito acima, trs colnias brancas foram coletadas e
inoculadas, separadamente, em 3 mL de meio LB (Triptona 1%, Extrato de levedura 5%,
NaCl 1%) com 100 g/mL de ampicilina (LB-AMP) e crescidas over-night com agitao de
250 rpm, a 37C. Para cada cultivo, 1,5 mL foram transferidos para tubos tipo cnicos de
centrfuga (eppendorf) e centrifugados a 12000 rpm, durante 1 min temperatura ambiente.
O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 300 L de soluo P1
(Tris/HCl 50mM, EDTA 10mM pH 8.0 e RNAse 10 g/mL) com homogeneizao por
inverso. Por conseguinte, a soluo P2 (NaOH 200 mM, SDS 10%) foi adicionada e
homogeneizada por inverso e incubada por 5 min temperatura ambiente. Aps esse tempo
foi acrescentada a soluo P3 (Acetato de potssio 5M, cido actico glacial pH 5.5) gelada

61

e nova homogeneizao foi feita, seguida de uma centrifugao a 12000 rpm, durante 10 min
a 4C. O sobrenadante foi recuperado e o DNA plasmidial precipitado com 600 L de
isopropanol, seguido de centrifugao a 14000 rpm, durante 15 min a 4C. O sobrenadante
foi retirado e o precipitado lavado em etanol 70%. Aps centrifugao a 14000 rpm, durante
10 min a 4C, o lcool foi descartado e aps a secagem do sedimento foi adicionado 50 L
de TE (Tris 10 mM pH 7.5, EDTA 1mM) ou gua e manuteno em geladeira 8C.
Para confirmar se os clones receberam o inserto de interesse foi feito um ensaio de
restrio, seguindo as recomendaes do fabricante (Fermentas Life Sciences), com a
endonuclease EcoRI, enzima que proporciona a liberao do fragmento. A visualizao dos
fragmentos foi feita em gel de agarose (2%) sobre transluminador UV.

2.3. Determinao da seqncia de nucleotdeo e anlise filogentica

O preparo para o seqenciamento dos fragmentos obtidos foi realizado com
modificaes do protocolo proposto por Sanger e Coulson, em 1975. Foi utilizado o kit de
reao BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing, seguindo as recomendaes do
fabricante (Applied Biosystems). As reaes foram fracionadas no aparelho ABI PRISM
3100 Genetic Analyzer/HITACHI, utilizando o servio do Instituto de Qumica,
Universidade de So Paulo IQUSP. As seqncias resultantes foram editadas e preparadas
para anlise utilizando-se o software BioEdit (Hall, 1999). Anlise filogentica foi realizada
comparando-se as seqncias obtidas com as depositadas nos banco de dados do National
Center for Biotechnology Information NCBI (2010) e Ribossomal Database Project,
release 10 - RDP-X.
Seqncias obtidas nesse estudo assim como seqncias obtidas no banco de
dados foram alinhadas utilizando-se o servidor NAST disponvel no site Greengenes

62

(DeSantis et al., 2006). Os dendogramas foram construdos com o auxlio do software

MEGA -5, utilizando-se o mtodo de Neighbor joining com anlise de bootstratping com
1000 repeties.

3. Resultados
Foram identificadas, por seqenciamento e anlise filogentica do gene do RNAr
16S, 68 isolados de morfotipos de colnias bacterianas, o que corresponde a 34,1% do total
de isolados depositados inicialmente em nossa coleo. Foram priorizados os morfotipos que
apresentaram efeito inibitrio (Captulo 2) e que ainda eram viveis no banco
microbiolgico, depois, foram escolhidos mais isolados por espcie, priorizando os
morfotipos mais diferenciados, em termos de aparncia, para maximizar a diversidade. O
tamanho das seqncias obtidas variou entre 125 e 158 pares de base permitindo
identificao para o nvel de famlia, na maioria dos casos, ou ainda gnero. Foram
identificadas 33 isolados (25,8% do total), 12 famlias e 10 gneros bacterianos para a
espcie Proceratophrys boiei; 11 isolados (61%), 7 famlias e 2 gneros para a espcie
Aplastodiscus leucopygius 15 isolados (35,7%), 7 famlias e 6 gneros para Phyllomedusa
distincta e 10 isolados (38,5%), 5 famlias e 3 gneros para Dendropsophus minutus A lista
completa, contendo o cdigo de identificao dos morfotipos, nmero de pares de base
obtidos, seqncia tipo prximas, porcentagem de similaridade e a classificao consta no
Anexo 1, para cada espcie de anfbio.
Apenas bactrias pertencentes s famlias Microbacteriaceae (filo Actinobacteria) e
Pseudomonadaceae (filo Proteobacteria) foram detectados em todos os animais estudados. P.
boiei apresentou o maior nmero de famlias exclusivas (37,5%), assim como a maior riqueza
de famlias. A. leucopygius e P distincta apresentaram apenas duas famlias que no foram

63

detectadas nas demais espcies e D. minutus apenas uma nica famlia (Tabela1). Alm disso,
a maioria dos isolados identificados foram pertencentes ao filo Proteobacteria (Anexos,
figuras 1-4).

Tabela 1. Famlias de bactrias identificadas por espcies de anuro.

Espcie
Famlia
A.
P.
D.
P. boiei leucopygius distincta minutus
1.Xanthomonadaceae
4
2. Brucellaceae
1
3. Enterobacteriaceae
4
3
8
4.Erythrobacteraceae
1
5. Microbacteriaceae
4
1
1
1
6. Nocardiaceae
2
7. Pseudomonadaceae
4
3
2
1
8. Sphingobacteriaceae
2
1
1
9. Flavobacteriaceae
4
10. Comamonadaceae
2
11. Moraxellaceae
2
1
1
12. Bacillaceae
2
1
6
13. Staphylococcaceae
1
14. Cellulomonadaceae
1
15. Patulibacteraceae
1
16. Oxalobacteraceae
2
Obs.: Os nmeros indicam a quantidade de morfotipos para cada famlia
identificada.

4. Discusso
O presente estudo incluiu apenas espcies da Floresta Atlntica do Brasil, a saber,
Proceratophrys boiei, Aplastodiscus leucopygius, Phyllomedusa distincta e Dendropsophus
minutus. Nossos resultados sugerem relao entre a microbiota cutnea dessas espcies e de
outras que so tpicas da Amrica do Norte, por exemplo, Hemidactylium scutatum (Harris et
al., 2006; Lauer et al., 2008); Rana mucosa (Woodhams et al., 2007; Lam et al., 2009), Rana

64

sierrae (Lam et al., 2009), Notophthalamus viridescens (Culp et al., 2007),

Rana

catesbieana (Culp et al., 2007). Nesses trabalhos algumas das bactrias observadas foram
comuns s bactrias observadas nos anuros da Floresta Atlntica do Brasil.
Esse fato pode ser interpretado sob alguns pontos de vista, que no so exclusivos.
Primeiro, possvel que exista ampla distribuio de txons microbianos componentes das
comunidades cutneas de anfbios ao longo de grandes distncias geogrficas. Por outro
lado, possvel que a pele dos anfbios, independente da localizao geogrfica, seja
particularmente favorvel para o estabelecimento de txons parecidos, independentemente da
espcie hospedeira. A observao acima envolve grandes padres sistemticos e no sinaliza
ausncia de especificidade entre espcies.
Comparando ainda os txons bacterianos dos anfbios do presente estudo com
estudos anteriores (Harris et al., 2006; Lauer et al., 2008; Woodhams et al., 2007; Lam et al.,
2009; Lam et al., 2009; Culp et al., 2007), foi possvel constatar que h certa especificidade,
pelo menos no nvel de famlia ou gnero. Em P. boiei, por exemplo, o gnero Camamonas e
as famlias Brucellaceae, Erythrobacteraceae e Nocardiaceae ocorreram somente nessa
espcie. Para A. leucopygius, apenas Staphylococcus foi especfico. P. distincta apresentou
Cedecea e Patulibacter, como gneros especficos. D. minutus no apresentou txons que
no ocorreram em outras espcies de anfbios (Tabela 2). Talvez uma anlise comparativa no
nvel de espcie bacteriana, poderia aumentar o grau de especificidade para com as espcies
de anfbios, como foi demonstrado por Lauer e colaboradores em 2008, ao compararem duas
espcies de salamandras.

65

Tabela 2.Tabela comparativa das famlias e gneros de bactrias cutneas identificadas neste e outros estudos.
Famlia
Enterobacteriaceae

Gnero

1
P. boiei
x

1
A. leucopygius
x

x
x
x
x
x
x

Cedecea
Microbacteriaceae
Microbacterium
Pseudomonadaceae
Pseudomonas
Sphingobacteriaceae
Pedobacter

1
P. distincta
x
x
x

1
D. minutus

x
x
x
x

Flavobacterium
Lysobacter
Stenotrophomonas
Moraxellaceae
Acinetobacter

x
x
x
x
x
x

6-7
R. mucosa
x

7
8
R. sierrae N. viridescens
x
x

x
x

x
x
x
x

8
R. catesbieana

x
x

Flavobacteriaceae
Xanthomonadaceae

2-3-4-8
2-5
P. cinereus H. scutatum

x
x
x
x
x
x
x
x

x
x

x
x

x
x
x
x
x

x
x

Bacillaceae
Bacillus
Comamonadaceae
Comamonas

x
x
x

x
x

Staphylococcaceae

x
Staphylococcus

Patulibacteraceae
Patulibacter

Oxalobacteraceae

x
x

Duganella

x
x

Nocardioidaceae
Nocardioides
Brucellaceae
Erythrobacteraceae
Nocardiaceae
Rhizobiales**
Cellulomonadaceae
Outras

x
x
x
x
x

x
x

Legenda:1. Presente estudo; 2. Harris et al., 2006; 3. Lauer et al., 2007; 4. Culp et al., 2007; 5.Lauer et al., 2008; 6. Woodhams et al., 2007; 7.Lam et al., 2009; 8. Culp et al., 2007. * Girino;
** Ordem.

66

preciso tambm considerar que esses experimentos foram realizados utilizandose mtodos tradicionais de cultivo e que as bactrias identificadas so facilmente isoladas em
meio de cultura R2A. Uma anlise molecular, independente de cultivo, poder complementar
essa comparao fornecendo mais informaes sobre a especificidade da espcie de anuro e
sua comunidade microbiana
Para uma melhor caracterizao sobre o perfil microbiano das comunidades
drmicas de anuros identificadas neste trabalho, constam, como segunda parte desta
discusso, descries das famlias identificadas, baseadas em dados obtidos da literatura
disponvel. A identificao molecular dos isolados revelaram que as comunidades
microbianas como sendo compostas por txons tpicos de gua e solo, principalmente deste
ltimo presena de famlias Gram negativas e positivas, sendo algumas delas produtoras de
substncias proteolticas, ou seja, capazes de produzir um efeito antibitico contra outras
espcies bacterianas. Podem atuar como patgenos oportunista em plantas e animais. Alguns
txons apresentam o espectro de fontes nutritivas restritas enquanto que outras so genricas
em relao a esse aspecto. As faixas de temperatura de crescimento so bastante amplas e,
segundo as descries disponveis, varia de 10 a 36C. Essas caractersticas demonstram que
o substrato pele, oferecido pelos anfbios, pode atender a diversas exigncias fisiolgicas,
constituindo uma complexa interface entre o animal e a microbiota residente de sua pele.
Breves descries das famlias e gneros bacterianas identificados
A famlia Xanthomonadaceae, do grupo Gammaproteobacteria, constituda de
bactrias Gram negativas e foi identificada para morfotipos isolados apenas de P. boiei.
Caractersticas descritas para os membros desta famlia corroboram a nossa idia inicial de
que a comunidade microbiana da pele dos anfbios constituda principalmente de entidades
do microhabitat ocupado. Por exemplo, no gnero Lysobacter as bactrias so tipicamente

67

encontradas no solo, matria orgnica em decomposio e na gua, s vezes em grandes

populaes. Tem atividade proteoltica contra microrganismos, por meio de enzimas e
antibiticos, alm de fungos, cianobactrias e nematide. Alguns isolados apresentam forte
atividade antibitica contra bactrias gram-positivas, especialmente Staphylococcus aureus
alm de bactrias gram-positivas (Kim et al., 2008; Reichenbach, 2006). Tal atividade
antibitica foi detectada no estudo anterior (Captulo 2) e a identificao dos morfotipos se
encontra no Anexo 1. O Gnero Stenotrophomonas composto uma nica espcie: S.
maltophila. A temperatura tima de crescimento 35C e possui um espectro nutricional
restrito. Podem ser isoladas de diversos materiais naturais, infeces humanas e materiais
clnicos (Palleroni & Bradbury et al., 1993). Nosso morfotipo identificado como
Stenotrophomonas tambm apresentou atividade antimicrobiana contra patgenos (Captulo
2). Membros da famlia Erythrobacteraceae, pertencente Classe Alphaproteobacteria, so
gram-negativos e tm sido isolados da gua doce (Lee et al., 2005).
A famlia Enterobacteriaceae, presente nas espcies Proceratophrys boiei,
Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta retrata outro componente da microbiota
cutnea desses anuros, o componente entrico. Esta famlia composta de representantes
gram-negativos, com temperatura de crescimento na faixa de 22 a 35 C e tem ampla
distribuio geogrfica e grande heterogeneidade em sua ecologia, hospedeiros e
patogenicidade para o Homem, animais e plantas (Ewing et al., 1980, Garrity et al., 2005).
Gnero Cedecea constitudo principalmente de patgenos oportunistas que crescem bem
nas temperaturas 15, 20 e 37C em pH 7. Podem tambm colonizar as superfcies dos corpos
humanos e ainda ser isolados de corpos de gua, carrapatos e insetos (Garrity et al., 2005;
Grimont et al., 1981). Outras famlias tpicas de ambiente so:

68

Famlia Microbacteriaceae que pertence classe Actinobacteria so bactrias

gram-positivas esto presentes em vrios ecossistemas terrestres e aquticos e podem estar
associados clinicamente com plantas, fungos, animais. O gnero Microbacterium apresenta
resistncia ao aquecimento e produo de cido ltico a partir de glicose (Evtushenko &
Takeuchi, 2006). A famlia Sphingobacteriaceae composta por bactrias Gram negativas
com crescimento timo em faixa de temperatura que vai de 0 a 30C. Os membros dessa
famlia so comumente isolados do solo, lodo ativado, peixes e de espcimes clnicos. No
h espcies consideradas como patgenos verdadeiros. O gnero Pedobacter composto por
uma maioria de espcies produtoras de heparinase, aerbias obrigatrias e bacilos Gramnegativos. (Steyn et al., 1998; (Gallego et al., 2006). A famlia Cellulomonadaceae,
identificada para bactria residente na pele de A. leucipygius, pertence ordem
Actinomycetales e compreende dois gneros: Cellulomonas e Oerskovia. No primeiro gnero
o principal habitat o solo e apresentam atividade celuloltica. Representantes do gnero
Oerskoviae foram isolados de vrios tipos de solo e regies geogrficas, bem como de
amostras clnicas. Produzem cidos a partir de diversos carboidratos (Stackebrandt, 2006).
Patulibacteriaceae encontrada apenas em P. distincta, uma nova famlia de bactrias Gram
positivas, pertencente classe Actinobacteria e ordem Rubrobacterales. Isoladas de solo. O
gnero Patulibacter composto de bactrias aerbias, parede celular com peptdeoglicanos
(Tkahashi et al., 2006). Oxalobacteraceae uma famlia nova constituda por representantes
tpicos de solos (Green et al., 2007).
Nocardiaceae bactrias gram-positivas e formam substratos com hifas, sendo
amplamente distribudos nos ambientes aquticos e terrestres. Alguns so oportunsticamente
patgenos para animais, inclusive humanos. Alguns representantes so comuns em solo e
parecerem estar envolvidos com ciclagem de matria orgnica (Goodfellow & Maldonado,

69

2006). Neste estudo foram identificados dois morfotipos, apenas de bactrias isoladas de P.
boiei, que por estar associado ao folhio, deve ter obtido cepas de tal substrato, que passaram
a constituir sua microbiota.
A famlia Pseudomonadaceae, presente nas quatro espcies estudadas, composta
por bactrias Gram negativas intolerantes a pH cido, 4.5 ou abaixo (a maioria) e crescem
bem mesmo na ausncia de fatores orgnicos complexos. So amplamente distribudas na
natureza e algumas espcies so patgenos para animais, incluindo o Homem, ou plantas.
Em geral, animais no so boas fontes de espcies de Pseudomonas, a menos que estejam
evolvidos em infeces como patgenos oportunistas, porm no caso dos anfbios possvel
detectar representantes desse gnero como constituintes da microbiota residente desses
animais, como observado no presente estudo e em estudos anteriores (Harris et al., 2006;
Lauer et al., 2007; Culp et al., 2007; Lauer et al., 2008; Woodhams et al., 2007; Lam et al.,
2009). So muito resistentes ao stress ambiental, caracterstica atribuda capacidade de
mudanas no material gentico mediante a mudanas no ambiente. Alm de apresentarem
resistncia a antibiticos (Garrity et al., 2005), isolados identificados como Pseudomonas
neste estudo, apresentaram poder inibitrio do crescimento de patgenos em nosso estudo
anterior (Captulo 2).
Na famlia Flavobacteriaceae as bactrias so Gram-negativas e o timo de
temperatura varia de 25 a 35C (Bernardet at al., 2002). Apesar de possuir ampla faixa de
ambientes (caracterstica marcante dessa famlia): solo, ambientes de gua doce, ambientes
marinhos, doenas em gatos, cachorros, anfbios e rpteis, doenas de peixes marinhos e
dulccolas, doenas em moluscos, crustceos, pssaros, doenas de plantas, simbiontes
intracelulares de insetos, neste estudo esteve presente apenas em P. boiei. Algumas enzimas
com atividade proteolticas so sintetizadas por flavobacterias em diversos ambientes, bem

70

como a pele de P. boiei, pois o potencial antimicrobiano do isolado Flavobacterium se

confirmou em nosso estudo anterior (Captulo 2). Nesse gnero os organismos so
amplamente distribudos no solo e gua doce, onde eles decompem matria orgnica
(Bernardet

et al., 1996). Em muitos casos de doenas,

flavobacterias atuam

oportunsticamente, infeccionando hospedeiros que esto previamente imunologicamente

comprometidos individualmente ou por resultado de perturbaes no ambiente (Bernardet &
Bowman, 2006).
Os organismos pertencentes famlia Comamonadaceae so genotipicamente
muito relacionados e fenotipicamente muito diversos. So Gram negativos e a faixa de
temperatura tima entre 28 e 30C. Esto presentes no solo e gua, podem ser patgenos de
plantas (Willems et al., 1991; De Vos et al., 1985). Foi identificada apenas para dois
morfotipos isolados de P. boiei.
A famlia Moraxellaceae, presente nas espcies de anuros Proceratophrys boiei,
Aplastodiscus

leucopygius

Phyllomedusa

distincta,

pertence

ao

grupo

Gammaproteobacteria e consiste de bactrias Gram negativas, com temperatura tima de

crescimento de 14 a 36 C. Algumas espcies requerem complexos fatores para o
crescimento, enquanto outras crescem em meio com uma nica fonte de carbono e fonte de
energia. Podem ser isolados do solo, gua, alimentos, pele e mucosas de animais, inclusive
humanos (Garrity et al., 2005). Representantes do gnero Acinetobacter, identificado de
isolado de bactria de P. boiei, podem ser encontrados no solo, onde podem degradar matria
orgnica, gua e esgotos. Como patgenos, membros desse gnero so descritos como
oportunistas, causando um amplo espectro de infeces hospitalares (Towner, 2006).
Na famlia Bacillaceae, no presente apenas em A. leucopygius, o gnero Bacillus
apresenta grande diversidade de fisiologia, ecologia e gentica. Apresenta produo de

71

esporos de resistncia qumica e fsica. Degradam grande parte dos substratos derivados de
plantas e animais; so produtores de antibiticos como metablitos secundrios eficazes
contra bactrias Gram positivas, e de enzimas bacteriolticas. Devido formao de esporos,
podem persistir em diversos ambientes estressantes (Slepecky & Hemphill, 2006).
No gnero Staphylococcus da famlia Staphylococcaceae as bactrias so Gram
positivas e muitas espcies so importantes patgenos, como Staphylococcus aureus, um
patgeno oportunista que causa grandes taxas de mortalidade. Podem ser isolados da pele e
membranas mucosas (Gtz et al., 2006), no presente estudo, foi identificado apenas para
morfotipo bacteriano de A. leucopygius. A famlia Brucellaceae tambm composta de
alguns patgenos que causam infeco, penetrando a pele de outros organismos, atravs de
membranas mucosas, em animais endotrmicos e, mais raramente, em ectotrmicos (Breed et
al., 1957).

72

Anexo 1

73

Tabela 1. Identificao dos isolados da espcie Proceratophrys boiei.

Isolado
bacteriano

pb

Sequncias Tipo mais prximas

Simil.

RG28-61

157

NSV95-169

132

RG31-96

157

RG28-58

132

SLP2-2

137

NSV95-168M2B

138

SLP125-206

139

SLP128-212

158

SLP2-1

152

SLP2-4

137

SLP124-196

153

RG57-130

146

SLP3-16

151

RG30-87

150

RG28-51

150

RG31-95

151

Luteimonas aestuarii B9; EF660758

Xanthomonas codiaei LMG 8678 T; Y1076
Brucella melitensis 2000031283; ATCC 23456;
Mycoplana ramosa IAM 13949; D13944
Kluyvera cryocrescens ATCC33435; AF310218
Buttiauxella ferragutiae DSM 9390; AJ233402
Altererythrobacter epoxidivorans JCS350; DQ304436
Erythrobacter flavus SW-46; AF500004
Clavibacter michiganensis DSM 7483; X77434
Curtobacterium luteum DSM 20542; X77437
Clavibacter michiganensis DSM 7483; X77434
Frigoribacterium mesophilum MSL 08; EF466126
Rhodococcus qingshengii djl-6; DQ090961
Rhodococcus erythropolis X79289
Pseudomonas graminis DSM 11363; Y11150
Pseudomonas japonica IAM 15071; AB126621
Olivibacter ginsengisoli Gsoil 060; AB267716
Pedobacter terricola DS-45; EF446147
Microbacterium arborescens DSM 20754; X77443
Microbacterium hominis DSM 12509; AM181504
Flavobacterium soli DS-6; DQ178976
Flavobacterium anhuiense D3; EU046269
Pedobacter soli (T): 15-51; AM279215
Pedobacter wanjuense (T): GH09-10; AM279217
uncultured bacterium; ASP-7; EF679183
uncultured Comamonas sp.; LSS-E5; FJ946520
uncultured bacterium; BPH2027; DQ221467
Erwinia sp. Z2NS-96; FJ784638
Enterobacter sp. VET-37; EU781736
uncultured bacterium; BPH1C4002; DQ221276
Pseudomonas graminis; HhSaOsb; AF511514

0.954
0.954
1.000
1.000
1.000
0.940
1.000
1.000
0.969
0.969
0.962
0.962
0.977
0.977
0.945
0.945
0.731
0.752
1.000
1.000
0.874
0.853
1.000
1.000
1.000
1.000
0.953
0.953
0.953
0.953
1.000

Classificao
Famlia:

Gnero

Xanthomonadaceae
Brucellaceae
Enterobacteriaceae
Erythrobacteraceae
Microbacteriaceae
Microbacteriaceae
Nocardiaceae
Pseudomonadaceae
Sphingobacteriaceae
Microbacteriaceae

Microbacterium

Flavobacteriaceae

Flavobacterium

Sphingobacteriaceae

Pedobacter

Comamonadaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Pseudomonadaceae

Pseudomonas

74

Pseudomonas putida; YTK10; AB079094

1.000
Lysobacter
sp.
C3;
AY074793
1.000 Xanthomonadaceae
Lysobacter
RG58-132
Lysobacter enzymogenes; YC013; EU430118
1.000
151 Acinetobacter sp.; DSM 590; X81659
1.000 Moraxellaceae
Acinetobacter
SLP124-195
uncultured gamma proteobacterium; 1026; EF188481
1.000
151 Stenotrophomonas sp. RBE2CD-33; EF111221
1.000 Xanthomonadaceae
Stenotrophomonas
SLP128-213
Pantoea dispersa (T); LMG2603; DQ504305
0.956
RG30-88
131 Nocardioides furvisabuli (T); SBS-26; DQ411542
1.000 Nocardioidaceae
Nocardioides
Nocardioides terrigena (T); DS-17; EF363712
0.954
INT40-109M1
151 Pseudomonas cedrina (T); type strain: DSM 14938
1.000 Pseudomonadaceae
Pseudomonas fulva (T); AJ 2129; AB046996
1.000
NSV95-161
151 Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
1.000 Bacillaceae
Bacillus
Bacillus weihenstephanensis (T); DSM11821; AB021199
1.000
148 Comamonas testosteroni (T); M11224
0.912 Comamonadaceae
Comamonas
NSV95-168M2A
Comamonas kerstersii (T); type strain: LMG 3475
0.824
NSV95-170
151 Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
1.000 Bacillaceae
Bacillus
Bacillus weihenstephanensis (T); DSM11821; AB021199
1.000
NSV95-162
131 Clavibacter michiganensis (T); LMG 3663 (Type); U09761
1.000 Microbacteriaceae
Leifsonia aquatica (T); JCM 1368; D45057
1.000
RG30-89
125 Devosia riboflavina (T); type strain: DSM 7230; AJ549086
1.000 Rhizobiales
Rhizobium larrymoorei (T); 3-10; Z30542
1.000
INT35-103
144 Flexibacter aurantiacus (T); M62792
1.000 Flavobacteriaceae
Flavobacterium
Flavobacterium johnsoniae (T); type strain: DSM 2064
0.965
INT35-105
144 Flexibacter aurantiacus (T); M62792
1.000 Flavobacteriaceae
Flavobacterium
Flavobacterium johnsoniae (T); type strain: DSM 2064
0.965
INT35-106
144 Flexibacter aurantiacus (T); M62792
1.000 Flavobacteriaceae
Flavobacterium
Flavobacterium johnsoniae (T); type strain: DSM 2064
0.965
INT35-107
151 Azotobacter beijerinckii (T); ICMP 8673; ATCC 19360
0.947 Pseudomonadaceae
Azotobacter chroococcum (T); IAM 12666; AB175653
0.934
NSV95-163
150 Kluyvera cryocrescens (T); ATCC33435; AF310218
1.000 Enterobacteriaceae
Raoultella ornithinolytica (T); CIP 103 364 T; U78182
1.000
SLP124-197
151 Acinetobacter lwoffii (T); DSM 2403; X81665
0.934 Moraxellaceae
Acinetobacter johnsonii (T); ATCC 17909T
0.861
INT40-102M2
151 Stenotrophomonas terrae (T); type strain: R-32768
0.881 Xanthomonadaceae
Stenotrophomonas koreensis (T); TR6-01; AB166885
0.887
Abreviaes: pb nmero de pares de bases nitrogenadas; Simil., similaridade; (T), amostra tipo.Obs.: Os isolados em negrito apresetaram poder
inibitrio nos ensaios de cross-streak.
151

75

Tabela 2. Identificao dos isolados da espcie Aplastodiscus leucopygius.

Isolado
bacteriano

pb

Sequncias Tipo mais prximas

Simil.

SLP16-26

157

SLP17-29

157

SLP97-171

157

SLP97-172

158

NSV92-173

152

NSV98-174

138

SLP17-27

157

SLP17-28

157

NSV99-175

129

NSV99-176

151

NSV99-177

151

Enterobacter asburiae (T); JCM6051; AB004744

Pantoea agglomerans (T); DSM 3493; AJ233423
Pseudomonas parafulva (T); IAM 1541; AB046999
Pseudomonas cremoricolorata (T); IAM 1541T
Staphylococcus equorum (T); RP29; AF527483
Staphylococcus equorum (T); ATCC 43958T
Acinetobacter calcoaceticus (T); type strain: NCCB 22016
Acinetobacter baumannii (T); DSM 30007; X81660
Pedobacter roseus (T); CL-GP80; DQ112353
Pedobacter borealis (T); G-1; EU030687
Kocuria palustris (T); TAGA27 (DSM 11925, type strain)
Kocuria turfanensis (T); HO-9042; DQ531634
Enterobacter cowanii (T); type strain: CIP 107300
Escherichia vulneris (T); ATCC 33821; AF530476
Shigella flexneri (T); X96963
Escherichia albertii (T); type strain: LMG 20976; AJ508775
Agrococcus lahaulensis (T); K22-21; DQ156908
Microbacterium aurum (T); DSM 8600; Y17229
Pseudomonas chlororaphis (T); DSM 50083T (type strain)
Pseudomonas chlororaphis (T); DSM 6698; AY509898
Pseudomonas chlororaphis (T); DSM 50083T (type strain)
Pseudomonas chlororaphis (T); DSM 6698; AY509898

1.000
0.960
0.954
0.954
0.973
0.973
1.000
0.921
0.952
0.863
1.000
0.969
0.953
0.913
1.000
1.000
0.922
0.922
1.000
1.000
1.000
1.000

Classificao
Famlia:

Abreviaes: pb nmero de pares de bases nitrogenadas; Simil., similaridade; (T), amostra tipo.
Obs.: Os isolados em negrito apresetaram poder inibitrio nos ensaios de cross-streak.

Gnero

Enterobacteriaceae
Pseudomonadaceae

Pseudomonas

Staphylococcaceae

Staphylococcus

Moraxellaceae
Sphingobacteriaceae
Cellulomonadaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Microbacteriaceae
Pseudomonadaceae

Pseudomonas

Pseudomonadaceae

Pseudomonas

76

Tabela 3. Identificao dos isolados da espcie Phyllomedusa distincta.

Isolado
bacteriano
pb
Sequncias Tipo mais prximas
Abreviaes: pb nmero de pares de bases nitrogenadas; Simil., similaridade; (T), amostra tipo.
Obs.: Os isolados em negrito apresetaram poder inibitrio nos ensaios de cross-streak.

INT27-42

157

INT26-41

157

RG53-112

151

RG55-116

149

RG55-117

130

RG55-118

151

INT68-141

151

INT68-143

151

INT69-145

150

INT20-33

151

RG66-140

151

INT19-30

155

RG53-111M1

146

RG61-134

150

INT23-37

1074

Enterobacter hormaechei (T); CIP 103441; AJ508302

Salmonella enterica (T); DSM 9221; EU014684
Pseudomonas cedrina (T); type strain: DSM 14938
Pseudomonas fulva (T); AJ 2129; AB046996
Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
Bacillus cereus (T); ATCC 14579; AE016877
Patulibacter minatonensis (T); KV-614; AB193261
uncultured Patulibacter sp.; A09-10F; FJ542906
Clavibacter michiganensis; PD039; AF474328
Curtobacterium luteum (T); DSM 20542; X77437
Endosymbiont of Metaseiulus occidentalis; pAJ240
Escherichia coli; RGR13; DQ118017
Enterobacter sp. HPC64; AY996978
bacterium C20; DQ329338
Endosymbiont of Metaseiulus occidentalis; pAJ240
Escherichia coli; RGR13; DQ118017
uncultured bacterium; hl10b7; DQ279606
Enterobacter sp. HPC64; AY996978
Pseudomonas sp.; LY3; AJ007006
Arthrobacter sp. LF-Tou2; AY641537
Acinetobacter sp. RUH53T; RUH53T (Aci 694)
Acinetobacter calcoaceticus; TS2H; EF151807
Tatumella ptyseos (T); DSM 5000; AJ233437
Xenorhabdus koppenhoeferi (T); USNJ01
Pedobacter roseus (T); CL-GP80; DQ112353
Pedobacter terrae (T); DS-57; DQ889723
Pantoea agglomerans (T); DSM 3493; AJ233423
Escherichia vulneris (T); ATCC 33821; AF530476
Serratia nematodiphila (T); DZ0503SBS1; EU036987
Serratia marcescens (T); KRED; AB061685

Simil.

Classificao
Famlia:

0.967
0.913
1.000
1.000
1.000
1.000
0.886
0.886
1.000
1.000
0.993
0.993
0.993
0.993
0.960
0.960
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.865
0.858
0.952
0.863
0.933
0.960
0.992
0.988

Gnero

Enterobacteriaceae
Pseudomonadaceae

Pseudomonas

Bacillaceae

Bacillus

Patulibacteraceae

Patulibacter

Microbacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae

Cedecea

Pseudomonadaceae

Pseudomonas

Moraxellaceae

Acinetobacter

Enterobacteriaceae
Sphingobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae

Pedobacter

77

Tabela 4. Identificao dos isolados da espcie Dendropsophus minutus.

Isolado
bacteriano

pb

Sequncias Tipo mais prximas

Simil.

RG102-186

151

NSV91-160

151

RG102-186

152

INT74-152

151

INT76-157

149

RG101-180

130

RG102-184

151

INT73-150

151

INT75-155M1

151

INT75-155M2

150

Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192

Bacillus weihenstephanensis (T); DSM11821
Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
Bacillus weihenstephanensis (T); DSM11821
Bacillus weihenstephanensis (T); DSM11821
Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
Bacillus thuringiensis; WS 261; Z84584
Bacillus mycoides; MWS5303-1-4; Z84582
uncultured bacterium; Hel3ad07; FJ229296
uncultured bacterium; N2_S4C03f; AB485545
Microbacterium laevaniformans; AB007416
Microbacterium imperiale; 27v1b; AF526916
Pseudomonas filiscindens; ATCC BAA-697
P. chlororaphis subsp. aurantiaca; ATCC 33663T
Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
Bacillus cereus (T); ATCC 14579; AE016877
Bacillus mycoides (T); ATCC6462; AB021192
Bacillus anthracis (T); ATCC 14578; AB190217
Massilia timonae (T); timone; U54470
Massilia aerilata (T); 5516S-11; EF688526

1.000
1.000
1.000
1.000
0.993
0.993
1.000
1.000
1.000
0.966
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.900
0.907

Abreviaes: pb nmero de pares de bases nitrogenadas; Simil., similaridade; (T), amostra tipo.
Obs.: Os isolados em negrito apresetaram poder inibitrio nos ensaios de cross-streak.

Classificao
Famlia:

Gnero

Bacillaceae

Bacillus

Bacillaceae

Bacillus

Bacillaceae

Bacillus

Bacillaceae

Bacillus

Oxalobacteraceae

Duganella

Microbacteriaceae

Microbacterium

Pseudomonadaceae
Bacillaceae

Bacillus

Bacillaceae

Bacillus

Oxalobacteraceae

78

Anexo 2

79
FILO PROTEOBACTERIA
NSV95-168M2A
Comamonas testosteroni SB3 AJ606335-1
Comamonas sp JNW7 DQ887529-1
PROTEOBACTERIA (beta)
Simplicispira sp JPB-3-01 EU652480-1
SLP3-16
88
87 Comamonas sp AJ550282-1
Comamonas sp 12022 AF078773-1
INT27-42
Pantoea ananatis BD DQ133546-1
INT68-143
Enterobacter aerogenes MA-1 EF210101-1
Enterobacter ludwigii K9 EF175735-1
Escherichia coli O157:H7 BA000007-2
RG61-134
SLP16-26
SLP17-27
INT19-30
RG28-51
RG55-118
SLP17-28
RG30-87
Enterobacter sp TUT1014 AB098582-1
Raoultella ornithinolytica 590681 Y17662-1
INT69-145
86
RG31-96
INT68-141
NSV95-163
85 Agrobacterium tumefaciens ICMP 7474 AY626386-1
RG30-89
Sinorhizobium sp TB2-T-5 AY505132-1
83
Brucella melitensis 2000032857 AY513516-1
94
NSV95-169
RG66-140
SLP97-172
PROTEOBACTERIA (gamma)
Acinetobacter calcoaceticus A2 AF159045-1
Acinetobacter sp GW8 EF550158-1
97 Acinetobacter baylyi mcp11c EF419183-1
SLP124-195
Acinetobacter sp Y11464-1
SLP124-197
INT35-107
NSV99-176
INT26-41
INT40-109M1
Pseudomonas fulva IAM AB046999-1
INT20-33
RG102-184
99
SLP128-212
Azotobacter beijerinckii 8673 AJ308319-1
NSV99-177
RG31-95
Pseudomonas putida MT4 AB180734-1
SLP17-29
Lysobacter sp C3 AY074793-1
98
RG58-132
Lysobacter enzymogenes OH11 AY947529-1
Xanthomonas codiaei LMG Y10765-1
RG28-61
99
SLP128-213
INT40-109M2
Stenotrophomonas sp Y4D EU306340-1
RG28-58
98
Sphingomonas baekryungensis SW-150 AY608604-1
Erythrobacter sp JL-310 AY646156-1
PROTEOBACTERIA (alpha)
INT76-157
INT75-155M2
93
Massilia timonae HNL19 EU373360-1
97

ACTINOBACTERIA
FIRMICUTES
99
BACTEROIDETES
92

Methanocaldococcus Jannaschii DSM 2661

0.1

ACTINOBACTERIA
Figura 1. rvore filogentica baseadaFILO:
em seqncias
do gene 16S rRNA de morfotipos isolados de
colnias bacterianas pertencentes a Proteobacteria, junto com seqncias similares e representativas do
banco de dados do NCBI e RDP. Gerada utilizando o mtodo Neighbor joining com anlise de
bootstraping com 1000 repeties. Quadrado representa a espcie Dendropsophus minutus; crculo,
Proceratophrys boiei; tringulo, Aplastodiscus leucopygius e tringulo invertido, Phyllomedusa
distincta.

80
FILO: ACTINOBACTERIA
88

PROTEOBACTERIA (beta)

PROTEOBACTERIA (gamma)

PROTEOBACTERIA (alpha)

Conexibacter woesei AJ871305-1

ACTINOBACTERIA
RG55-116
Patulibacter minatonensis KV-614 AB193261-1
SLP2-2
RG55-117
NSV95-168M2B
Curtobacterium flaccumfaciens beticola AY273208-1
NSV95-162
Leucobacter komagatae AJ746337-1
Leifsonia aquatica DSM X77450-1
Microbacterium koreense DS68 EU834282-1
RG101-180
ACTINOBACTERIA
Microbacterium oleovorans DSM AJ698725-1
SLP2-4
Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM AJ698726-1
NSV99-175
SLP125-206
Rhodococcus erythropolis HS12 AY168590-1
NSV98-174
Kocuria sp JL-72 AY745813-1
RG30-88
99 Nocardioides sp CNJ892 DQ448722-1
97

FIRMICUTES
99
BACTEROIDETES
92

Methanocaldococcus Jannaschii DSM 2661

0.1

Figura 2. rvore filogentica baseada em seqncias do gene 16S rRNA de morfotipos isolados
de colnias bacterianas pertencentes a Actinobacteria, junto com seqncias similares e
representativas do banco de dados do NCBI e RDP. Gerada utilizando o mtodo Neighbor joining
com anlise de bootstraping com 1000 repeties. Quadrado representa a espcie Dendropsophus
minutus; crculo, Proceratophrys boiei; tringulo, Aplastodiscus leucopygius e tringulo invertido,
Phyllomedusa distincta.

81
FILO FIRMICTES
88

PROTEOBACTERIA (beta)

PROTEOBACTERIA (gamma)

PROTEOBACTERIA (alpha)
97
ACTINOBACTERIA
ACTINOBACTERIA

Staphylococcus equorum ATCC AB009939-1

SLP97-171
RG102-186
INT73-150
99
INT75-155M1
NSV95-170
Bacillus cereus LRN AY138275-1
85 Bacillus anthracis A2084 AE017334-2
INT74-152
RG53-112
NSV95-161
NSV91-160

FIRMICUTES

BACTEROIDETES
92

Methanocaldococcus Jannaschii DSM 2661

0.1

Figura 3. rvore filogentica baseada em seqncias do gene 16S rRNA de morfotipos isolados
de colnias bacterianas pertencentes a Firmicutes, junto com seqncias similares e
representativas do banco de dados do NCBI e RDP. Gerada utilizando o mtodo Neighbor
joining com anlise de bootstraping com 1000 repeties. Quadrado representa a espcie
Dendropsophus minutus; crculo, Proceratophrys boiei; tringulo, Aplastodiscus leucopygius e
tringulo invertido, Phyllomedusa distincta.

82
FILO BACTEROIDETES
88

PROTEOBACTERIA (beta)

PROTEOBACTERIA (gamma)

PROTEOBACTERIA (alpha)
97
ACTINOBACTERIA
ACTINOBACTERIA
FIRMICUTES
99

92

SLP124-196
Flavobacterium johnsoniae IFO AB078043-1
Flexibacter aurantiacus M62792-1
INT35-103
INT35-105
INT35-106
Flavobacterium denitrificans JS14-1 EU599190-1
BACTEROIDETES
Pedobacter sp JC2491 EU652337-1
Pedobacter terricola DS-45 EF446147-1
SLP2-1
NSV92-173
RG57-130
96 Pedobacter wanjuense GH09-10 AM279217-1
RG53-111M1
Methanocaldococcus Jannaschii DSM 2661

0.1

Figura 4. rvore filogentica baseada em seqncias do gene 16S rRNA de morfotipos isolados de
colnias bacterianas pertencentes a Bacterioidetes, junto com seqncias similares e representativas
do banco de dados do NCBI e RDP. Gerada utilizando o mtodo Neighbor joining com anlise de
bootstraping com 1000 repeties. Quadrado representa a espcie Dendropsophus minutus; crculo,
Proceratophrys boiei; tringulo, Aplastodiscus leucopygius e tringulo invertido, Phyllomedusa distincta.

83

Discusso Geral e Concluses

Atravs de nossa pesquisa foi possvel detectar algumas caractersticas das

comunidades microbianas residente na pele das espcies de anuros estudadas:
Dendropsophus minutus, Proceratophrys boiei, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa.
A primeira delas as diferenas de densidades e riquezas microbianas entre as espcies de
anuros. Apesar de ainda no entendermos as implicaes ecolgicas dessas diferenas,
possvel que hajam padres de comunidades relacionados aos grupos taxonmicos, que
podem ser determinados pelas caractersticas do ambiente, pelos atributos da histria de vida
e pela fisiologia inerente a cada grupo. Um primeiro indicativo do papel da paisagem na
composio das microbiotas cutneas foi o achado de uma maior densidade nos
remanescentes, quando comparados s reas contnuas, assim como de uma maior riqueza de
morfotipos. Assim como as diferenas encontradas quando feita a anlise das espcies,
considerando os microhabitats ocupados. A presena de famlias e gneros bacterianos
tpicos de ambiente corrobora a nossa hiptese central da influncia do ambiente sobre as
comunidades da pele. Assim como o impacto sobre essas comunidades como conseqncia
de alteraes no ambiente feitas pelo homem.
A presena de bactrias com propriedades antimicrobianas contra patgenos,
ressalta a importncia dessas comunidades como primeira barreira protetora, pois ainda no
h motivos para acreditarmos que os efeitos verificados in vitro no ocorram no meio
natural. Considerando isso, ento novamente o ambiente atuaria como um mediador da
susceptibilidade dos anfbios aos patgenos, pois alteraes nessas comunidades tambm
afetariam as populaes bacterianas com esse potencial antimicrobiano. Um estudo

84
complementar e mais conclusivo ser feito com base nas anlises da microbiota dos
microhabitas ocupados em comparao microbiota cutnea dos anfbios.
A ocorrncia de famlias e gneros bacterianos que foram identificados em outros
txons de anfbios, inclusive em outra ordem (Urodela), e em outra regio geogrfica
(Amrica do Norte), pode ter relao com processos de seleo dessas bactrias por
caractersticas inerentes s espcies de anfbios. Esse achado pode servir como plataforma
para estudos de distribuio de microbiana, processos de co-evoluo patgeno-hospedeiro e
influencia da microbiota nas doenas emergentes de anuros.

85

Resumo Geral

A pele dos anfbios, assim como de outros animais, atua como primeira
proteo contra agentes patognicos. A comunidade microbiolgica ali residente
composta de algumas espcies de bactrias, e estas, possuem ao antifngica contra
patgenos conhecidos, inclusive Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), o suposto agente
principal de declnios de populaes de anfbios em diversas partes do mundo. Uma vez
que as variveis qumicas e fsicas de um ecossistema influenciam o crescimento,
sobrevivncia e atividade metablica dos microorganismos, a microbiota cutnea que atua
como barreira de proteo nos anfbios contra agente infecciosos, provavelmente afetada
quando determinados parmetros ecofisiolgicos so alterados em ambientes florestais
fragmentados, modulando assim a vulnerabilidade das populaes de anfbios aos agentes
patognicos. Nossa pesquisa esteve focada na caracterizao das comunidades
microbianas residentes da pele dos anfbios em dois contextos de paisagem: fragmento e
rea contnua. Os parmetros utilizados para essas anlises foram a densidade microbiana
e a riqueza de morfotipos de colnias bacterianas. O potencial inibitrio do crescimento de
patgenos tambm foi testado em ensaios do tipo cross-strak. As diferenas de densidade
e riqueza microbiana entre as paisagens e a presena de txons tpicos de ambiente,
apontam para o ambiente como um componente importante na determinao dos perfis das
comunidades microbianas dos anfbios estudados. Essas mudanas so muito
provavelmente conseqncias, mas para o entendimento da extenso e natureza de tais
conseqncias so necessrios estudos adicionais.

86

Abstract

The skin of amphibians, as well as that of other animals, acts as a first protection
barrier against pathogens. The microbial community resident in the amphibian skin is
composed of some species of bacteria that may have antibacterial or antifungal action against
known pathogens, including Batrachochytrium dendrobatidis, the alleged principal agent
T

TT

TT

leading to declines of amphibian populations around the world. Because the chemical and

physical variables of the landscape influence the growth, survival and metabolic activity of
microorganisms, the function of skin as a protective barrier against infectious agents in
amphibians, is likely affected by parameters that are altered in fragmented forest habitats.
Thus, it is important to understand how environmental conditions affect the skin microbiota
of amphibians, and the possible induced changes on vulnerability of amphibians to
pathogens. Our research aimed to characterize the microbial communities living skin of
amphibians in two contexts of landscape: fragment and continuous area. The parameters used
for this analysis were density and richness of microbial morphotypes of bacterial colonies.
The potential inhibition of pathogen growth was also evaluated using a cross-streak test, and
some taxa in these communities were identified using international protocols. The observed
differences in microbial density and richness across landscapes, and the presence of bacterial
taxa typical of given environments, point out to the role of environmental change as an
important component determining the profiles of microbial communities living on the skin of
amphibians. These changes are very likely consequential, but understanding the scope and
nature of consequences require additional study.

87

Referncias Bibliogrficas

Alexander, M.A. & Eischeid, J.K.E. (2001) Climate variability in regions of amphibian declines.
Conservation Biology 15 (4): 930-942.
Amiche, M.; Ladram, A.; Nicolas, P. (2008) A consistent nomenclature of antimicrobial peptides
isolated from frogs of the subfamily Phyllomedusinae. Peptides 29 (11): 2074-2082.

Assis, A.B.; Navas, C.A. and Barreto, C.C. (In prep.) Perfis de microbiotas cutneas em quatro
espcies de anfbios.
Ashcroft, J.W.; Zalinger, Z.B.; Bevier, C.R.; Fekete, F.A. (2007) Antimicrobial properties of two
purified skin peptides from the mink frog (Rana septentrionalis) against bacteria isolated
from the natural habitat. Comparative Biochemistry and Physiology (Part C):1-6.
Ashcroft, J.W. (2008) Antibacterial properties of skin secretions & microflora from
Eleutherodactylus jonhstonei. A theses submitted in partial fulfillment of the
requeriments for the degree of MD/MSc to St Georges University Graduate Studies
Program. School of Medicine. Department of Microbiology. 111p.
Atlas, R.M. & Bartha, R.B. (1993). Effects of abiotic factors and environmental extremes on
microorganisms. In: Microbial Ecology: Fundamentals and Applications (pp. 212245). The Benjamin/ Cummings Publishing Company, Inc.
Atlas, R.M. & Bartha, R.B. (1993). Measurement of microbial numbers, biomass, and activities. In:
Microbial Ecology: Fundamentals and Applications (pp. 165-211). The Benjamin/
Cummings Publishing Company, Inc.
Austin, R.M. (2000) Cutaneous microbial flora and antibiosis in Plethodon ventralis, p. 127-136. In:
The Biology of Plethodontid Salamanders. R.C.Bruce, R.G.Jaeger, and L.D. Houck
(eds.). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.
Barbosa, E.A. (2010) Avaliao da transcrio, expresso e induo de genes que codificam
peptdeos antimicrobianos em Hypsiboas raniceps por ferramentas de biologia
molecular e espectrometria de massa. Dissertao apresentada ao Instituto de Biologia
da Universidade de Braslia como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em
Cincias Biolgicas. Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular. Braslia. 86p.
Becker, C.G (2007) Desconexo de habitats e o declnio global dos anfbios. Dissertao
apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade de Campinas como requisito parcial
para a obteno ttulo de Mestre em Ecologia. Programa de Ps-graduao em Ecologia.
Campinas. 76p.
Belden, L.K. & Harris, R.N. (2007) Infectious diseases in wildlife: The community ecology context.
Frontiers in Ecology and the Environmental 5(10): 533539.
Bernardet, J-F & Bowman, J.P. (2006) The genus Flavobacterium. In: Dworkin, M.; Falkow, S.;
Rosenberg, E.; Schleifer, K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the

88
biology of bacteria: Proteobacteria: Delta and Epsilon Subclasses. Deeply Rooting
Bacteria, Vol. 7. New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp. 481-531.
Bernardet, J.; Nakagawa, Y.; Holmes, B. (2002) Proposed minimal standards for describing new taxa
of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family. International
Journal of Systematic and Evolution Microbiology 52: 1049-1070.
Bernardet, J.; Segers, P.; Vacanneyt, M.; Berthe, F.; Kersters, K; Vandamme, P. (1996) Cutting a
Gordian Knot: Emended description of the genus Flavobacterium, emended description of
the family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydatis nom. nov.
(Basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1978). International Journal of
Systematic Bacteriology 46 (1): 128-148.
Bertoluci, J. 2005. The So Paulo Leaf-frog Phyllomedusa distincta. Reptilia 43: 66-70.
Bettin, C. & Greven, H. (1986) Bacteria on the skin of Salamandra salamandra
(Amphibia:
Urodela) with notes on their possible significance. Zoologischer Anzeiger 216:267270.
Bevier, C.R.; Sonnevend, A.; Kolodziejek, J.; Nowotny, N.; Nielsen, P.F.; Conlon, J. M. (2004)
Purification and characterization on antimicrobial peptides from the skin secretions of the
mink frog (Rana septentrionalis). Comparative Biochemistry and Physiology 139:3138. Part C.
Blaustein, A.R. & Kiesecker, J.M. (2002) Complexity in conservation: lessons from the global decline
of amphibian populations. Ecology Letters 5: 597-608.
Birnboim, H. C. & J. Doly (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7(6): 1513- 1523.
Breed, R.S.; Murray, E.G.D.; Smith, N.R. (1957) Bergeys manual of determinative bacteriology.
7PaPEd. The Williams & Wilkins Company. Waverly Press. Baltimore, USA.
Brizzi, R.; Delfino, G.; Pellegrini, R. (2002). Specialized mucous glands and their possible adaptive
role in the males of some species of Rana (Amphibia, Anura). Journal of Morphology
254:328-341.
Brucker, R.M.; Harris, R.N.; Schwantes, C.R.; Gallaher, T.N.; Flaherty, D.C.; Lam, B.A.; Minbiole,
K.P.C. (2008) Amphibian chemical defense: Antifungal metabolites of the microsymbiont
Janthinobacterium lividum on the salamander Plethodon cinereus. Journal of Chemical
Ecology 34: 1422-1429.
Campos, F.P. (1994) O Parque Estadual Intervales e o servio de reas naturais protegidas. In: Leonel,
C. Intervales. Fundao para a conservao e a produo florestal do Estado de So
Paulo. So Paulo: A fundao. pp.11-19.
Carey, C. & Alexander, M. (2003) Climate change and amphibian declines: is there a link? Diversity
and Distributions 9:111-121.
Carey, C.; Cohen, N.; Rollins-Smith, L. (1999) Amphibian declines: an immunological perspective.
Developmental and Comparative Immunology 23: 459-472.

89
Carnaval, A.C.O.Q.; Puschendorf, R.; Peixoto, O.L.; Verdade, V.K.; Rodrigues, M.T. (2006)
Amphibian chytrid fungus broadly distributed in the Brazilian Atlantic Rain Forest.
EcoHealth 3:41-48.
Christin, M.S.; Mnard, L.; Gendron, A.D.; Ruby, S.; Cyr, D.; Marcogliese, D.J.; Rollins-Smith, L.;
Fournier, M. (2004) Effects of agricultural pesticides on the immune system of Xenopus
laevis and Rana pipiens. Aquatic Toxicology, 67, 33-43
Conlon, J.M., Kolodziejek, J.; Nowotny, N. (2004). Antimicrobial peptides from ranid frogs:
taxonomic and phylogenetic markers and a potential source of new therapeutic agents.
Biochemistry Biophysics Acta 1696: 1-1.
Conlon , J. M.; al-Dhaheri, A.; al-Mutawa, E.; al-Kharrge, R.; Ahmed, E.; Kolodziejek, J.; Nowotny,
N.; Nielsen, P.F.; Davidson, C. (2007). Peptide defenses of the cascades frog Rana
cascadae: implications for the evolutionary history of frogs of the Amerana species
group. Peptides 28:1268-1274.
Culp, C.E.; Falkiniiam III, J.O.; Belden, L.K. (2007) Identification of the natural bacterial microflora
on the skin of Eastern newts, Bullfrog tadpoles and Redbacked salamanders.
Herpetologica 63 (1): 66-71.
Cushman, S.A. (2006) Effects of habitat loss and fragmentation on amphibians: A review and
prospectus. Biological Conservation 128: 231-240.
Daly, J.W. (1995) The chemistry of poisons in amphibian skin. Proceedings of the National
Academy of Science of the United States of America 92: 9-13.
Daly, J.; Padgett, W.L.; Saunders, R.L. Cover, J.F. (1997). Absence of tetrodotoxins in a captiveraised riparian frog, Atelopus varius. Toxicon 35 (5) 705-709.
Daszak, P.; Cunningham, A.; Hyatt, A.D. (2001) Anthropogenic environmental change and the
emergence of infectious diseases in wildlife. Acta Tropica 78: 103-116.
Densmore, C.L. & Green, D. E. (2007). Disease of amphibians. Institute for Laboratory Animal
Research 48(3): 235-254.
De Vos, P.; Kersters, K.; Falsen, E.; Gillis, M.; Segers, P.; De Ley, J. (1985) Comamonas Davis and
Park 1962 gen. Nov., nom. Rev. Emend., and Comamonas terrigena Hugh 1962 sp. Nov.,
nom. ver. International Journal of Systematic Bacteriology 35(4): 443-453.
DeSantis, T.; Hugenholtz, P.; Brodie, L.; Larsen, N.; Piceno, Y; Phan, R; Andersen, G. (2006).
NAST: a multiple sequence alignment server for comparative analysis of 16S rRNA
genes. Nucleic Acids Research 34:394-9.
DeSantis, T.; Hugenholtz, P.; Larsen, N.; Rojas, M.; Brodie, E.; Keller, K.; Huber, T.; Dalevi, D.; Hu,
P.; Andersen, G. (2006) Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and
Workbench Compatible with ARB. Applied Environmental Microbiology (72):506972T.
Ducklow, H.W. & Mitchell, R. (1979) Bacterial populations and adaptations in the mucus layers on
living corals. Limnology and Oceanography 24: 715-725.

90
Duellman W.E. & Trueb L. (1994) Biology of Amphibians. Baltimore/London: Johns Hopkins
University Press.
Eaton , A.D.; Clesceri, L.S.; Greenberg, A.E. (1995) Standard methods. For examination of water
and wastewater. 19PthP edition. APHA, AWWA, WEF.
Echegaray, J. & Hernando, A. (2004). Amenazas de los anfbios. Sustrai 67: 50-52.
Eterovick, P.C.; Carnaval, A.C.O.Q.; Borges-Nojosa, D.M.; Silvano, D.L.; Segalla, M.V.; Sazima, I.
(2005) Amphibian declines in Brazil: An overview. Biotropica 37 (2): 166-179.
Evtushenko, L.I. & Takeuchi, M. (2006) The family Microbacteriaceae. In: Dworkin, M.; Falkow, S.;
Rosenberg, E.; Schleifer, K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the
biology of bacteria: Archaea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Vol.3. New York,
EUA: Springer, 3PaPEd. pp: 1020-1098.
Ewing, W.H.; Farmer III, J.J.; Brenner, D.J. (1980) Proposal of Enterobacteriaceae fam. nov. rev. to
replace Enterobacteriaceae Rahn 1937, nom. fam. Cons. (Opin. 15, Jud. Comm. 1958),
which list standing on nomenclature on 1 January 1980. International Journal of
Systematic Bacteriology 30 (4): 674-675.
Felsemburgh, F.A.; Carvalho-e-Silva, S.P.; de Brito-Gitirana, L. (2007) Morphological
characterization of the anuram integument of the Proceratophrys and Odontophrynus
genera (Amphibia, Anuran, Leptodactylidae). Mcron 38: 439-445.
Fontana, M.F.; Ask, K.A.; MacDonald, R.J.; Carnes, A.M.; Staub, N.L. (2006) Loss of traditional
mucous glands and presence of a novel mucus-producing granular gland in the
plethodontid salamander Ensatina eschscholtzii. Biological Journal of the
Linnean Society 87 (3): 469-477.
Franklin, A.B.; Noon, B.R.; George, T.L. (2002) What is habitat fragmentation? Studies in Avian
Biology 25: 20-29.
Funk, W. C. &; Mills, L. S. (2003) Potential causes of populations declines in forest fragments in an
Amazonian frog. Biological Conservation 111: 205-214.
Gallego, V.; Garca, M.T.; Ventosa, A. (2006) Pedobacter aquatilis sp. nov. isolated from drinking
water, and emended description of the genus Pedobacter. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology 56: 1853-1858.
Garrity, G.M.; Brenner, D.J.; Krieg, N. R.; Staley, J.R. (2005). Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology. The Proteobacteria. Vol. 2. Part B: The Gammaproteobacteria. EUA.
Springer Verlag, 2PaPEd.
Green, S.J.; Michel Jr., F.C; Hadar, Y.; Minz, D. (2007) Contrasting patterns of seed and
root
colonization by bacteria from the genus Chryseobacterium and from the family
Oxalobacteraceae. The International Society for Microbial Ecology Journal
1:291- 299.
Goodfellow, M. and Maldonado, A. (2006) The families Dietziaceae, Gordoniaceae, Nocardiaceae &
Tsukamurellaceae. In: Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.;
Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria: Archaea.

91
Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Vol.3. New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp.
843-888.
Gottlieb, D. (1976) The production and role of antibiotics in soil. The Journal of Antibiotics 29 (10):
987-1000.
Gtz, F.; Bannerman, T; Schleifer, K. (2006) The genera Staphylococcus and Macrococcus. In:
Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.; Stackebrandt, E. The
prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria: Bacteria, Firmicutes,
Cyanobacteria. Vol.4. New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp. 5-75.
Grimont, P.A.D.; Grimont, F.; Farmer III, J.J.; Asbury, M.A. (1981) Cedecea davisae gen. nov., sp.
nov. and Cedecea lapagei sp. nov., new Enterobacteriaceae from clinical specimens.
International Journal of Systematic Bacteriology 31(3): 317-326.
Haddad, C.F.B.; Prado, C.P.A. (2005) Reproductive modes in frogs and their unexpected diversity in
the Atlantic Forest of Brazil. BioScience 55 (3): 207-217.
Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium 41: 95-98.
Harris, R.N.; James, T.Y.; Lauer, A.; Simon, M.A.; Patel, A. (2006) Amphibian pathogen
Batrachochytrium dendrobatidis is inhibited by the cutaneous bacteria of amphibian
species. EcoHealth 3: 53-56.
Harris, R.N.; Brucker, R.M.; Walke, J.B.; Becker, M.H.; Schwantes, C.R.; Flaherty, D.C; Lam, B.A.;
Woodhams, D.C.; Briggs, C.J.; Vredenburg, V.T.; Minbiole, K.P.C. (2009) Skin microbes
on frogs prevent morbidity and mortality caused by a letal skin fungus. The
Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology (3): 818-824.
Heyer, W.; Heyer, R.; Rand, A.S; Cruz, C.A.G.; Peixoto, O.L. (1988) Decimations, extinctions and
colonization of frog populations in southeast Brazil and their evolutionary implications.
Biotropica 20 (3): 230-235.
Heyer, W. R.; Rand, A. S.; Cruz, C. A. G.; Peixoto, O. L.; and Nelson, C. E. (1990). Frogs
Boracia. Arquivos de Zoologia So Paulo 31: 231-410.

of

IUCN 2010. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2010.4. <http://www.iucnredlist.org>.
Downloaded on 27 October 2010.
Joly, P.J.; Morand, C.M.; Cohas, A.C. (2003) Habitat fragmentation and amphibian conservation:
building a tool for assessing landscape matrix connectivity. Biologies 326: 132-139.
Khammar, N.; Malhautier, L.; Degrange, V.; Lensi, R.;Godon, J.-J; Fanlo, J.-L. (2005) Link between
spatial structure of microbial communities and degradation of a complex mixture of
volatile organic compounds in peat biofilters. Journal of Applied Microbiology 98: 476490.
Keisecker, J.M.; Blaustein, A.R.; Belden, L.K. (2001). Complex causes of amphibian population
declines. Nature 410: 681-683.

92
Lam, B.A.; Walke, J.B; Vredenburg, V.T.; Harris, R.N. (2009) Proportion of individuals with antiBatrachochytrium dendrobatidis skin bacteria is associated with population persistence in
the frog Rana mucosa. Biological Conservation 143: 529-531.
La Marca, E.; Lips, K.R.; Ltters, S.; Puschendorf, R.; Ibez, R.; Rueda-Almonacid, J.V.; Schulte,
R.; Marty, C.; Castro, F.; Manzanilla-Puppo, J.; Garca-Perez, J.; Bolamos, F.; Chaves,
G.; Pounds, A.J.; Toral, E.; Young, B.(2005) Catastrophic population declines and
extinctions in neotropical Harlequin frogs (Bufonidae: Atelopus). Biotropica 37 (2): 190201.
Lauer, A.; Simon, M.A.; Banning, J.L.; Andr, E.; Duncan, K.; Harris, R.N. (2007) Common
cutaneous bacteria from the Eastern Red-Backed salamander can inhibit pathogenic fungi.
Copeia (3): 630-640.
Lauer, A.; Simon, M.A.; Banning, J.L; Lam ,B.A.; Harris, R.N. (2008)P PDiversity of cutaneous
bacteria with antifungal activity isolated from female four-toed salamanders.
Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology 2: 145-157.
Lee, K.; Liu, C.; Anzai, Y; Kim, H.; Aono, T; Oyaizu, H. (2005) The hierarchical system of the
Alphaproteobacteria: description of Hyphomonadaceae fam. Nov., Xanthobacteraceae
fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology 55: 1907-1919.
Lips, K.R.; Burrowes, P.A.; Mendelson III , J.R.; Parra-Olea, G. (2005). Amphibian declines in Latin
America: Widespread population declines, extinctions and impacts. Biotropica 37 (2):
163-165.
Lips, K.R.; Brem, F.; Brenes, R.; Reeve, J.D.; Alford, R.A.; Voyles, J.; Carey, C.; Livo, L.; Pessier, A.
P.; Collins, J.P. (2006) Emerging infectious disease and the loss of biodiversity in a
Neotropical amphibian community. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America103 (9): 3165-3170.
Lillywhite, H.B. (1974) Amphibian mucous glands: comparative evidence for an adaptive role in
preventing cutaneous desiccation. Bulletin of the Ecological Society of America 55:
16p.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; Parker, J. (2004) Habitats microbianos, ciclos de nutrientes e
interaes com plantas e animais. In: Microbiologia de Brock. So Paulo: Prentice hall,
10 Ed.
Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; Dunlap, P.V.; Clark, D.P. (2009) Microbial growth. In: Brock
Biology of Microorganisms. Benjamin-Cummings Publishing Company, 12 Ed.
Mangoni, M.L.; Miele, R.; Renda, T.G.; Barra, D.; Simmaco, M. (2001) The synthesis of
antimicrobial peptides in the skin of Rana sculenta is stimulated by microorganisms.
The
Journal of Federation of American Societies for Experimental Biology 15:
1431-1445.
Mendelson III, J.R.; Lips, K.R.; Diffendorfer, J.E.; Gagliardo, R.W.; Rabb, G.B.; Collins, J.P.;
Daszak, P.; Ibez, R.D.; Zippel, K.C.; Stuart, S.N.; Gascon, C.Gascon; Silva, H.R.;
Burrowes, P.A.; Lacy, R.C.; Bolaos, F.; Coloma, L.A.; Wright, K.M.; Wake, D.B.
(2006) Reponding to amphibian loss. Science 314:1541-1542.

93
National

Center
for
Biotechnology
Information
(NCBI).
Disponvel
HTUhttp://www.ncbi.nlm.nih.govUTH. Acessado em: 10 de fevereiro de 2008

em:

Navas, C.A. (1996) Implications of microhabitat selection and patterns of activity on the thermal
ecology of high elevation neotropical anurans. Oecologia 108: 617-626.
NCBI - National Center for Biotechnology Information (2010).
HTUhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/UT
Ogram, A. & Feng, X. (1997) Methods of soil microbial community analisis. In: Christon J, Hurst,
Guy R. Knudsen, Michal J. Mc Inerney, Linda D. Stetzenbach, Michael V. Walter (Eds.)
Manual of Environmental Microbiology Washington: American Society for
Microbiology. p. 422-430.
Palleroni, N.J. and Bradbury, J.F. (1993) Stenotrophomonas, a new bacterial genus for Xanthomonas
maltophilia (Hugh 1980) Swings et al. 1983. International Journal of Systematic
Bacteriology 43 (3): 606-609.
Pelczar , M. &; Reid, R.(1981) Microbiologia Vol II. So Paulo: McGraw-Hill do Brasil.
Plante, A.F. & Parton, W.J (2007) The dynamics of soil organic matter and nutrient cycling In: Paul,
E.A. Soil Microbiology, Ecology and Biochemistry. USA. Elsevier Academic Press.3
Ed. p. 471-500
Pombal Jr., J.P. & Haddad, C.F.B. (2005) Estratgias e modos reprodutivos de anuros (Amphibia) em
uma poa permanente na Serra de Paranapiacaba Sudeste do Brasil. Papis Avulsos de
Zoologia 45 (15): 201-213.
Pouds, J. A.; Bustamante, M.R.; Coloma, L.A.; Consuegra, J.A.; Fogden, M.P.L.; Foster, P.N.; La
Marca, E.; Masters, K.L.; Merino-Viteri, A.; Puschendorf, R.; Ron, S.R.; SnchezAzofeifa, G.A.; .Still, C.J.; Young, B.E. (2006) Widespread amphibian extinctions from
epidemic disease driven by global warming. Nature 439:161-167.
Raffel, T.R.; Rohr, J.R.; Kieseckers, J.M.; Hudson, P.J. (2006) Negative effects of changing
temperature on amphibian immunity under field conditions. Functional Ecology 20: 819828.
Reichenbach, H. (2006) The genus Lysobacter. In: Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer,
K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria:
Proteobacteria:Gamma subclass. Vol. 6. New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp: 939957.
Rollins-Smith, L.A.; Carey, C.; Longcore, J.; Doersam, J.K.; Boutte, A.; Bruzgal, J.E.; Conlon, J.M.
(2002). Activity of antimicrobial skin peptides from ranid frogs against Batrachochytrium
dendrobatidis, the chytrid fungus associated with global amphibian declines.
Developmental and Comparative Immunology 26: 471-479.
Rollins-Smith, L.A.; Doersam, J.K.; Longcore, J.E.; Taylor, S.K.; Shamblin, J.C.; Carey, C.; Zasloff,
M.A. (2002) Antimicrobial peptide defenses against pathogens associated with global
amphibian declines. Developmental and Comparative Immunology 26: 63-72.

94
Rollins-Smith, L.A.; Reinert, L.K.; OLeary, C.J.; Houston, L.E.; Woodhams, D.C. (2005)
Antimicrobial peptide defenses in amphibian skin. Integrative Comparative Biology
45:137-142.
Sambrock, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. 2PaP Ed.
Could Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sanger, F. & A. R. Coulson (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed
synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology 94(3): 441-448.
Saunders, D.A.; Hobbs, R.J.; Margules, C.R. (1991) Biological consequences of ecosystem
fragmentation: a review. Conservation Biology 5(1): 18-32.
Simmaco, M.; Boman, A.; Mangoni, M.L.; Mignogna, G.; Miele, R.; Barra, D.; Boman, H.G. (1997)
Effect of glucocorticoids on the synthesis of antimicrobial peptides in amphibian skin.
The Journal for Rapid Publication of Short Reports in Molecular Biosciences 416:
273-275.
Slepecky, R.A. and Hemphill, H. E. (2006) The genus Bacillus Nonmedical. In: Dworkin, M.;
Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A
handbook on the biology of bacteria: Bacteria, Firmicutes, Cyanobacteria. Vol.4.
New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp. 530-562.
Stackebrandt, E. (2006) The family Cellumonadaceae. In: Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.;
Schleifer, K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the biology of
bacteria: Archaea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Vol.3. New York, EUA:
Springer, 3PaPEd. pp. 983-1001.
Steyn, P.L.; Segers, P.; Vancanneyt, M.; Sandra, P.; Kersters, K.; Joubert, J.J. (1998) Classification of
heparinolytic bacteria into a new genus, Pedobacter, comprising four species: Pedobacter
heparinus comb. Nov., Pedobacter piscium, comb. nov., Pedobacter africanus sp.nov.
and Pedobacter saltans sp. Nov. proposal of the family Sphingobacteriaceae fam. nov.
International Journal of Systematic Bacteriology 48: 165-177.
Toledo, R.C. & Jared, C. (1995) Cutaneous granular glands and amphibian venoms. Comparatyve
Biochemycal Physiology 111A (1): 1-29.
Towner, K. (2006) The genus Acinetobacter. In:Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer,
K.; Stackebrandt, E. The prokaryotes. A handbook on the biology of bacteria:
Proteobacteria:Gamma subclass. Vol. 6. New York, EUA: Springer, 3PaPEd. pp: 746758.
Vos J; Loveren HV; Wester P & Vethaak D (1989). Toxic effects of environmental chemicals on the
immune system. TiPS (10): 289-292.
Weldon, C.; Preez, L.H.; Hyatt, A.D.; Muller, R.; Speare, R. (2004) Origin of the amphibian chytrid
fungus. Emerging Infectious Diseases 10(12):2100-2105.
Willems, A.; Ley, J.de; Gillis, M.; Kersters, K. (1991) Comamonadaceae, a new family encompassing
the acidovorans rRNA complex, including Variovorax paradoxus gen. nov., comb. Nov.,
for Alcaligenes paradoxus (Davis, 1969) Journal of Systematic Bacteriology 41 (3):
445-450.

95
Woodhams, D.C.; Vredenburg, V.T.; Simon, M.A.; Bilheimer, D.B.; Shakhtour, B.S.; Shyr, Y.;
Briggs, C.J.; Rollins-Smith, L. A.; Harris, R.N. (2007) Symbiotic bacteria contribute to
innate immune defenses of the threatened mountain yellow-legged frog, Rana mucosa.
Biological Conservation 138: 390-398.
Woodhams, D.C.; Alford, R.A.; Maranteli, G. (2003) Emerging disease of amphibian cured by
elevated body temperature. Diseases of aquatic 55:65-67.
Zasloff, M. (2002). Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415: 389-395.
Zilli, J.E.; Rumjanek, N.G.; Xavier, G.R.; Coutinho, H.L.C.; Neves, M.C.P. (2003) Diversidade
microbiana como indicador de qualidade do solo. Cadernos de Cincia & Tecnologia
20(3): 391-411.
Zina, J.; Ennser, J.; Pinheiro, S. C. P.; Haddad, C. F. B.; Toledo, L. F. (2007) Taxocenose de anuros de
uma mata semidecdua do interior do Estado de So Paulo e comparaes com outras
taxocenoses do Estado, sudeste do Brasil. Biota Neotropica 7 (2): 49-58.
Xia, S.; Wang, F.; Fu, Y.; Yang, D.; Ma, X. (2005) Biodiversity analysis of microbial community in the
chem.-bioflocculation treatment process. Biotechnology and Bioengineering 89 (6):
656-659.