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CENTRO UNIVERSITRIO FRANCISCANO UNIFRA

CURSO DE FARMCIA
CONTROLE BIOLGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS

So substncias que, quando injetadas em pacientes causam


elevao da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo
ser:
EXGENOS: Se originam fora do corpo e induzem elevao
trmica quando injetados em animais e no homem.
Exemplos: Origem bacteriana (e seus componentes Gram (+)
Prof. Marcos R. dos Santos

ENDGENOS: produzido internamente pelo hospedeiro em


resposta

ao pirognio exgeno (considerado o mediador

primrio da febre).
Exemplos: diferentes substncias sintetizadas por diferentes clulas
do hospedeiro.

Gram(-), fungos, vrus e no-microbiana


esterides, fraes do plasma).

(alguns

e
frmacos,

Quando purificadas so denominadas de lipopolissacardeos (LPS) para


enfatizar a sua natureza qumica, quando no purificadas podem conter
lpides, carboidratos e protenas.
IMPORTANTE: So termoestveis, porm inativadas por ciclos de
calor

seco,

condies

alcalinas

ou

cidas,

capazes

de

provocar

profundas alteraes fisiolgicas quando administradas via parenteral.

Constituem uma classe de PIROGNIO, so complexos de alto peso


molecular associados membrana externa de bactrias Gram(-)

Devido a estas propriedades, fica evidente a necessidade de sua


deteco e eliminao por parte de fabricantes de produtos parenterais.

negativas e representam a mais significativa fonte de contaminantes


pirognicos de produtos estreis para a indstria farmacutica.

estrutura

qumica

das

endotoxinas

consiste

de

um

polissacardio, ou longas cadeias de acares, e uma gordura, lipdio A. O


polissacardio, que varia de uma espcie bacteriana para outra,
composto da cadeia 0-especfica (construda por unidades que se
repetem, de trs a oito acares) e os ncleos interno e externo. O lipdio
A contm duas glicosaminas modificadas por fosfato (PO4) e nmero
varivel de cidos graxos.

Quimicamente as ENDOTOXINAS so LIPOPOLISSACARDIOS


CADEIA LATERAL
O- ESPECFICA

NCLEO
OLIGOSSACARDIO

POLISSACARDIO
(Carter hidroflico aumenta a potncia)

LPS

UNIDADE
LIPDICA

LIPDIO A
(Funo principal na
endotoxicidade)

PRODUO DE MEDIADORES POR ESTIMULAO DOS


MACRFAGOS POR ENDOTOXINAS
Mensagem
estimulatria

MACRFAGO

LIPOPOLISSACARDIO
(LPS)

Muitas atividades biolgicas so atribudas unidade lipdeo A da


endotoxina, a exemplo:
NCLEO
Receptor CD14 para
complexo LPS-PLL

Protena de ligaolipopolissacardica
(PLL)

- pirogenicidade;
- toxicidade letal;
- leucopenia seguida de leucocitose;
- necrose da medula ssea;

Mediadores da
febre

- queda da presso sangunea;

Lipopolissacardio (LPS) (laranja), liga-se protena de ligaolipopolissacardica (PLL) (verde) no sangue. Ento o complexo ativa o
receptor conhecido como CD14,
estimulando os macrfagos a
produzirem mediadores (esferas vermelhas).

- agregao plaquetria.
- outros fatores.

NVEIS DE CONTAMINANTES PIROGNICOS EM


PRODUTOS FARMACUTICOS
Pode ser realizada de duas formas:
formas:
Os limites mximos de endotoxinas (K) em produtos farmacuticos,
atualmente considerados aceitveis pelo FDA, USP, Farmacopia Europia
e WHO so:

Classe de produto

Parenterais
Radiofrmacos
Parenterais (exceto
radiofrmacos)

- Inativao
- Remoo de endotoxinas

Rota de
administrao

Limite mximo de endotoxina


(K)
(Unidades de Endotoxina
EU)
Pessoa

Kg

Intratecal

14

0,2

Intravenosa

175

2,5

350

5,0

Parenterais (exceto
intratecais)

Hidrlise cido
cido--Base reduz ou elimina a atividade biolgica de
lipopolissacardeos, pela desativao do lipdeo A. Ex:
Ex: HCl ( 30 min a 100
100
C)
Oxidao Possivelmente atravs da oxidao dos cidos graxos presentes
no lipdeos A do LPS
LPS.. Ex:
Ex: H2O2.
Alquilao Promove a reduo da atividade via substituio nucleoflica na
ligao glucosamina do lipdeo A. Ex:
Ex: xido de etileno.
etileno.

Tratamento por calor seco estufas e tneis de conveco, conduo ou


irradiao (infravermelho), para materiais termorresistentes
termorresistentes.. Ex:
Ex: ( 250 C
30
min)
min)..
Radiao ionizante Uso de 60Co para a reduo da toxicidade de
endotoxinas bacterianas
bacterianas.. Com este processo, aumenta a possibilidade de
alteraes qumicas desconhecidas em frmacos e solues parenterais.
parenterais.
Polimixina B Antibitico catinico que pode anular a atividade biolgica do
LPS.
LPS.

Deve-se ressaltar a importncia em trabalhar todo o processo


produtivo em condies adequadas de higiene, dos operadores e
ambiente, alm de empregar matrias-primas com baixas cargas
microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado.
Em resumo, aplicar todos os conceitos de

BPF, de forma que o

produto seja obtido apirognico no primeiro processamento,


dispensando preocupaes quanto processos ou tratamentos
adicionais.

Lavagem Utilizando solventes estreis e apirognicos.


apirognicos.
Destilao A gua recentemente destilada, coletada e mantida em frascos
estreis e apirognicos.
apirognicos.
Ultrafiltrao Uso de membranas com capacidade de reteno de molculas
com tamanho de 100
100..000 daltons ou maiores.
maiores.
Outros mtodos:
mtodos: Osmose reversa, carvo ativo, atrao eletrosttica, atrao
por membranas hidrfoba..

1 Teste da hipertermia em coelhos


2 Mtodo do lisado de amebcitos do Limulus
(LAL)
- gelificao
- turbidimtrico
- cromognico

3 Ensaio da cultura da linhagem de clulas


Ex.: Clulas Mono Mac-6

Teste da hipertermia em coelhos (5.5.2.1


5.5.2.1 PIROGNIOS)
Pg: 226 Farmacopia 5edio
O teste Oficial de Pirognios em coelhos foi descrito
inicialmente na USP XII em 1942:
Fundamenta-se na medida do aumento da temperatura
corporal dos coelhos, aps injeo intravenosa de dose-limite
de 10 ml por Kg de peso, durante perodo no superior a 10
minutos, de soluo estril da substncia ativa ou produto
farmacutico sob anlise.

Seleo dos animais:


- coelhos adultos e sadios;
- preferencialmente da mesma raa;
- pesando no mnimo 1,5 kg;
- mantidos em gaiolas individuais, livre de perturbaes e sob
temperatura controlada (20 C 2 C);
- a reutilizao de animais s pode ser feita aps 48 horas de
descanso, desde que o resultado no tenha sido positivo. Neste caso, ser
necessrio um perodo de 2 semanas de intervalo.

Registro de temperatura:
- Utilizar termmetro clnico de preciso, graduado em 0,1 C,
com tempo de elevao mxima previamente determinado ou qualquer
outro dispositivo de registro de temperatura de igual sensibilidade.
- Introduzir no reto do animal profundidade aproximada de 6
centmetros.
- Se for utilizado registrador, que deva permanecer no reto
durante o perodo de teste, conter os coelhos de maneira que fiquem em
postura natural de repouso.

Adaptao dos animais:


Uma semana antes e at o dia anterior ao ensaio realizar testes
de adaptao simulando as condies do dia do teste:
- acomodar o animais nas caixas de conteno e empregar
o termmetro
- injetar soluo fisiolgica estril (10 mL/kg) simulando a
amostra
- acompanhar e anotar as variaes de temperatura.
Valores acima de 0,3C entre as leituras podem indicar
possibilidade de falso-positivo
- suprimir a alimentao na noite anterior ao ensaio e
durante sua realizao

Procedimento do ensaio:
- Utilizar 3 animais para cada amostra.
- No mnimo 40 minutos antes do ensaio determinar a
temperatura controle (inicial) de cada animal mediante duas
leituras feitas com intervalos de 20 minutos. A mdia das
temperaturas considerada como o valor de T C controle do
animal, que a base para a determinao de qualquer aumento
de temperatura resultante da injeo da soluo teste durante o
ensaio.

Preparao da amostra:
-

todos

os

utenslios

utilizados

para

diluio/preparao da amostra devem ser apirognicos:


vidraria: 200 C 1 h ou 250 C 30 min.
soluo fisiolgica: 121C 15 min. x 3 ciclos
- realizar a diluio no dia do teste
- dose: 0,5 a 10 mL/kg de soluo na concentrao
especificada na monografia do produto
- aquecer a soluo 37 38C antes de injetar

Procedimento do ensaio:
- A disperso da T C controle entre os animais de cada
grupo no deve ser superior a 1,0 C
- No usar animais com temperatura superior a 39,8 C.
- Injetar pela veia marginal da orelha de trs coelhos a
quantidade indicada na monografia. A injeo no deve durar
mais de 10 minutos, a menos que na monografia se especifique
tempo diferente.
- Registrar a temperatura nos tempos de 1:00, 2:00 e
3:00 horas aps a injeo

- No devem ser usados os animais que apresentarem


desvio maior do que + 0,2 C, nas duas leituras da temperatura
controle.

Interpretao dos resultados:


DESVANTAGENS

Se nenhum coelho apresentar um aumento individual de


temperatura igual ou superior 0,5C, em relao t emperatura
controle e a soma dos aumentos dos trs no exceder a 1,4C, o
produto cumpre com os requisitos do teste de pirognios.
Se algum dos coelhos apresentar um aumento igual ou
superior a 0,5C, repete-se o teste com outros 5 co elhos. Neste
caso, se no mais que 3 coelhos apresentarem aumentos
individuais de 0,5 C ou, se a soma dos 8 aumentos individuais de
temperatura no exceder a 3,3C, o produto em exame cumpre
com os requisitos do teste de pirognios.

- Baixa sensibilidade
- Custo elevado
- Interferncias na resposta
- Uso de animais

VANTAGENS

- Qualitativo
- Reproduz resposta
fisiopatolgica
- Detecta pirognios

http
http:://www.
//www.acciusa
acciusa..com/lal/product/LAL%
com/lal/product/LAL%20
20Reagents/index
Reagents/index..html

Nestes casos a especificidade da resposta est intimamente


relacionada com endotoxinas, excluindo outras substncias
termognicas.

Teste de toxicidade de pirognio bacteriano em embrio de


galinha.
Resposta txica em camundongos.
Reduo de ferro em ratos.

(5.5.2.2) Farmacopia Brasileira 5pg


pg:: 227
MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS
- LAL Princpio:
O teste de endotoxina bacteriana usado para detectar ou quantificar
endotoxinas de bactrias gram negativas presentes em amostras para qual
o teste preconizado. Utiliza
Utiliza--se o extrato aquoso dos amebcitos
circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado
e caracterizado como reagente LAL.

MTODO DO LISADO DE AMEBCITOS DO LIMULUS


- LAL Princpio:
um mtodo in vitro onde diluies da amostra so misturadas
com uma soluo do lisado de amebcitos do caranguejo Limulus
Polyphemus. No caso da presena de endotoxinas bacterianas na
amostra sob anlise, estas produzem uma reao de gelificao
com o lisado atravs de um processo enzimtico, possibilitando a
determinao semi-quantitativa da presena de endotoxinas em
produtos farmacuticos.

Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:


H duas tcnicas com sensibilidade diferente para este teste
teste::
1. MTODO DE COAGULAO EM GEL:
GEL: baseado na formao de cogulo
ou gel (mtodo semi
semi--quantitativo)
2. MTODOS FOTOMTRICOS quantitativos que incluem
incluem::
O MTODO TURBIDIMTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez
aps quebra de um substrato endgeno)
endgeno);

Informaes gerais do ensaio - Farmacopia Brasileira:


- Vidrarias e descartveis:
- Padro de referncia de endotoxinas (PRE) e padro de
endotoxina (PE): Todas as vidrarias devem ser despirogenisadas em estufa
usando um processo validado. Utilize um tempo e temperatura mnimos de 250 C
por 30 minutos. Se utilizar descartveis plsticos, como ponteiras e pipetas usem
somente os certificados que indicam ser livres de endotoxinas para no haver
interferncia no teste.

- Teste da sensibilidade do reagente LAL (confirmar a


sensibilidade declarada do regente).

O MTODO CROMOGNICO (baseado no desenvolvimento de cor aps


quebra de um complexo peptdeo sinttico cromgeno).
cromgeno).

- Teste de inibio ou potencializao (determinar possveis

Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que


indicado contrrio na monografia
monografia..

- Mxima diluio vlida (diluio da amostra em que no h

interferncias da amostra sobre o ensaio).

endotoxina detectvel).

Ponto final de Gelificao

Ensaios Turbidimtricos

O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para


deteco de endotoxinas baseia-se na gelificao.

Permite melhor medida quantitativa da endotoxina em grandes faixas


de concentraes.

Mtodo de escolha para testes em nmeros reduzidos ou no


freqentes, para amostras que turvem ou com expectativa de
resultado negativo.

Concentrao de endotoxinas x aumento da turbidez

Exemplo: Monitoramento em processos de materiais e da gua.

Uso em monitoramentos dirios de gua, permitindo medidas de ao


corretiva em caso de desvio de padro da qualidade.
Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, para
interpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes das
amostras.

Ensaios Cromognicos

Reao positiva:
positiva:
Formao de
gel
gel..

A reao enzimtica interrompida no final do tempo prestabelecido pela adio de reagente, antes das leituras.
Espectrofotmetro (405 nm).
Necessidade de elaborao de curva padro de endotoxinas, para
interpolao dos resultados obtidos a partir das avaliaes das
amostras.
Outros mtodos
- ensaios de microdiluio.
- ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente

ENSAIO DO LISADO DE AMEBCITOS


DO LIMULUS
RESULTADOS FALSO NEGATIVOS
agentes desnaturantes
soro ou plasma
pH < 3 ou > 9
Microplate Absorbance Readers

ons clcio > 0,67 M


lipdios, emulses para infuso
glutationa, acetil cistena
cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina
penicilinas semi-sintticas
bactrias Gram (+) : Achromobacter

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Mtodo alternativo para teste de pirognios, fundamentado no efeito


das endotoxinas bacterianas, que induzem a secreo de Interleucina6 por moncitos humanos ou linhagens de clulas monocticas.

Verificar o LIMITE DE ENDOTOXINAS (UE/mL ou mg) preconizado para


a amostra nas farmacopias
- Se no citado, deve-se calcular: L. E. = K/M
onde:

DETERMINAO DE IL-6, IL-1


e TNF

POR ELISA

L. E. = limite de endotoxina
M = dose humana mxima/kg ou por 70 kg administrada numa injeo
por hora.
K = 5 UE/kg (parenterais);
2,5 UE/kg (radiofrmacos);
0,2 EU/ kg (parenterais adm. intratecal)

EXEMPLO:

Calcular a MXIMA DILUIO VLIDA (MDV) para a amostra:

Produto: Diclofenaco de sdio


Dose mxima por Kg (M): 1,07 mg/kg ou 75 mg/70 kg
Forma de apresentao: Ampola de 75mg/3 ml

MDV =

Limite de endotoxinas UE/mL


sensibilidade do lisado ()

Sensibilidade do Lisado (): 0,06 EU/ml

L.E. =
OU

MDV = Limite de endotoxinas UE/mg ou UE/UI x [ ] do produto


sensibilidade do lisado ()

5 UE/Kg

= 4,7 UE/mg

1,07 mg/Kg

MDV =

4,7 UE/mg x 25 mg/ml = 1958

ou 1/1958

0,06 UE/ml

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