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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE CINCIAS E TECNOLOGIA


PS - GRADUAO EM ENGENHARIA DE PROCESSOS

TESE DE DOUTORADO

CARLOS ALBERTO BISPO DE SOUSA

PRODUO E RECUPERAO DE CELULASES PRODUZIDAS


POR Trichoderma reesei LCB 48 NA FERMENTAO SEMISSLIDA
DA PALMA FORRAGEIRA.

CAMPINA GRANDE
2014

CARLOS ALBERTO BISPO DE SOUSA

PRODUO E RECUPERAO DE CELULASES PRODUZIDAS


POR Trichoderma reesei LCB 48 NA FERMENTAO SEMISSLIDA
DA PALMA FORRAGEIRA.

Tese apresentada ao Programa de


Ps-Graduao

em

Engenharia

de

Processos da Universidade Federal de


Campina Grande,

como

parte

dos

requisitos necessrios para obteno


do grau de Doutor.

Orientadora: Prof. Dra. Lbia de Sousa Conrado Oliveira

CAMPINA GRANDE
2014

A meus pais: Gensio e


Terezinha

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a UFCG, por me proporcionar mais essa etapa de minha


formao acadmica e a todas as pessoas que fizeram parte do meu dia-a-dia
durante esta perquisa. Inicialmente, agradeo aos colegas do LEB e do grupo
de pesquisa, como Bia, Siumara, ngela, Diogo, Segundo e tantos outros que
comigo colaboraram com sua experincia, apoio e companheirismo.
minha orientadora Lbia de Sousa Conrado, pelos seus ensinamentos,
amizade, orientao

e,

principalmente,

por

ter

mais uma vez confiado

incentivado meu crescimento profissional e pessoal.


Aos professores que avaliaram este trabalho em suas diversas etapas, cujos
ensinamentos prticos, apoio e ateno contriburam para uma melhor conduo
desse trabalho de pesquisa.
Ao Professor Antnio Gilson, coordenador deste programa.
Ao tcnico de laboratrio Jardes Caiara, pelo apoio e amizade recebidos.
minha querida esposa, Livinha.
Ao professor lvaro Lima, da Unit, pelo treinamento recebido em sistemas
bifsicos.
CAPES, pelo financiamento concedido e, por fim, agradeo ao Deus que
creio, de onde emana toda a cincia, sabedoria e vida do Universo, sem o qual
nada seria possvel.

Estamos no caminho que parte dos primeiros princpios ou no que se dirige a eles?
Plato.

RESUMO
A demanda por fontes de energia renovvel tem crescido em todo o mundo.
Nesse contexto, o bioetanol obtido a partir da hidrlise de materiais lignocelulsicos
tem merecido destaque. Porm, a produo das enzimas celulolticas usadas nesse
processo de custo elevado, e este o principal empecilho para a obteno do
etanol celulsico em grande escala. O objetivo deste estudo foi produzir enzimas
celulolticas destinadas a produo de bioetanol, a partir da fermentao semisslida
da biomassa da palma forrageira pelo fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB 48.
O estudo da fermentao revelou que a melhor condio foi atingida com umidade
inicial de 90% e suplementao de 1% de fonte de nitrognio. A atividade mxima foi
alcanada em 110 horas de processo, com produo de 6,45 U/gds. O estudo de
lixiviao das enzimas produzidas revelou como as melhores condies do
processo: a relao solvente/substrato de 20g/ml, agitao de 50rpm e tempo de
contato de 15 minutos, na qual obteve-se extratos brutos com 15,14 U/gds expressa
em carboximetilcelulase (CMCase). As enzimas recuperadas na lixiviao exibiram
atividade CMCase tima em temperatura de 55C e pH timo entre 4,0 e 5,0.
Estudos de estabilidade mostraram que a enzima desativada em valores de pH
superiores a 6,5 e temperaturas superiores a 50C. Ensaios de hidrlise utilisando a
prpria biomassa da palma e o resduo da fermentao como material
lignocelulsico apresentaram respectivamente produtividade mxima de de 334,4
mg/L.h e 308 mg/L.h de glicose em 4 horas de processo. Foi realizado um estudo
de partio das enzimas obtidas utilizando sistemas aquosos bifsicos. O SAB
composto por 18% Peg 4000 e 12% citrato de sdio em pH 5,0 resultou em um fator
de purificao de 5,31 para a CMCase e 61,4 para celobiase. Para FPase o fator de
purificao foi de 2,29

quando a concentrao de citrato usada foi de 16%. A

biomassa da palma mostrou-se vivel tanto para a obteno das enzimas celulases
quanto para a obteno de acares fermentescveis para produo de bioetanol.
Os SABs mostraram-se promissores como etapa inicial de um processo de
recuperao e purificao das celulases produzidas.

palavras-chave: purificao, concentrao, celulase, sistema aquoso bifsico.

ABSTRACT
The demand for renewable energy has grown worldwide. In this context,
bioethanol obtained from the hydrolysis of lignocellulosic materials has been
highlighted . However, the production of cellulolytic enzymes used in the hydrolysis
process is costly, and this is the main obstacle for obtaining cellulosic ethanol on a
large scale. This study was designed to produce cellulolytic enzymes production of
bioethanol from biomass semisolid fermentation of forage cactus by the filamentous
fungus Trichoderma reesei LCB 48. The study revealed that the best fermentation
condition was achieved with 90 % humidity and supplementation 1% of the nitrogen
source . The maximum activity was achieved in 110 hours of process, with production
of 6.45 U/gds . The study of leaching of enzymes produced revealed as the best
process conditions: solvent substrate ratio of 20mL/ g , 50 rpm of agitation and
contact time of 15 minutes , which was obtained in crude extracts with 15.14 U/gds
expressed in carboxymethylcellulase ( CMCase ) . The crude extract was stable for
up to 20 days when stored at room temperature. The enzymes recovered in the
leaching exhibited CMCase activity at optimal temperature of 55 C and optimum pH
between 4.0 and 5.0 . Stability studies showed that the enzyme is deactivated at pH
values above 6.5 and temperatures above 50 C. Hydrolysis assays of pear cactus
biomass itself and the residue fermenting lignocellulosic material presented as
maximum yield of 334.4 mg/Lh and 308 mg/Lh of glucose in 4 process hours
respectively. A study ds enzymes obtained using aqueous two-phase partition
systems was carried out . SAB composed of 18 % PEG 4000 and 12% sodium citrate
at pH 5.0 resulted in a purification factor of 5.31 to 61.4 for CMCase and cellobiase .
FPase for the purification factor was 2.29 when the concentration of citrate used was
16% . Biomass palm proved to be feasible for both obtaining the cellulase enzymes
as to obtain fermentable sugars to bioethanol production. The SABs proved
promising as an initial step in a process of recovery and purification of cellulases
produced .

keywords: purification, concentration, cellulase, biphasic aqueous system

LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1- Palma Forrageira (Opuntia ficus-indica Mill).................................. 19
Figura 2.2- Estrutura lignocelulsica................................................................

22

Figura 2.3- Diagrama representativo do conceito de biorrefinaria


apresentando o potencial de valor agregado dos produtos ............ 23
Figura 2.4- Modo de ao das enzimas do complexo celuloltico.................... 26
Figura 2.5- Fluxograma de um processo de FSS tpico................................... 32
Figura 2.6- Srie de Hofmeister.......................................................................

35

Figura 2.7- Extrao em batelada em SAB...................................................... 40


Figura 2.8- Diagrama de fases expresso em coordenadas retangulares........

41

Figura 2.9- Curvas binodal de sistemas PEG/Citrato obtidos usando


diferentes valores de PEG e Tampo citrato.................................

42

Figura 2.10- Esquema de um processo de bioconverso de lignocelulose


em etanol.......................................................................................

43

Figura 3.1- Etapas do projeto de pesquisa desenvolvidas neste trabalho....... 52


Figura 3.2- Etapas do processo de obteno da biomassa............................. 53
Figura 3.3- Etapas do estudo do processo fermentativo da biomassa da
palma forrageira............................................................................. 58
Figura 4.1- Distribuio granulomtrica das biomassas da palma integral e
da palma lavada............................................................................. 77
Figura 4.2- Acompanhamento cintico da produo de CMCase na
fermentao semisslida da palma integral ..................................................... 79
Figura 4.3- Aspecto dos extratos brutos recolhidos em cada ensaio da PI.....

83

Figura 4.4- Influncia das variveis fonte de nitrognio (N) e umidade (U) na
fermentao da biomassa da palma integral (PI)).........................

84

Figura 4.5- Produo de CMCase em funo da adio de fonte de


nitrognio (N) e umidade (U) na fermentao da biomassa da
palma integral (PI).......................................................................... 85
Figura 4.6- Digrama de Pareto mostrando a influncias das variveis adio
de fonte de nitrognio

(N) e umidade (U) na produo

de

CMCase na fermentao semi-slida da biomassa da palma


lavada (PL)..................................................................................... 87

Figura 4.7. Produo de CMCase em funo da adio de fonte de


nitrognio (N) e umidade (U) na fermentao semisslida da
biomassa da palma lavada (PL)....................................................

88

Figura 4.8 Influncia dos parametros testados na extrao de CMCase.......

91

Figura 4.9. Atividade CMCase em funo da agitao e relao (A);Tempo


de contato e relao (B); e tempo de contato e agitao (C)........

94

Figura 4.10. Efeito da temperatura na atividade enzimtica............................ 97


Figura 4.11. Efeito do pH na atividade enzimtica........................................... 97
Figura 4.12. Atividade residual do extrato aps inoculao em diferentes
valores de pH............................................................................... 99
Figura 4.13. Atividade residual do extrato aps inoculao a diferentes
valores de temperatura................................................................ 100
Figura 4.14. Ensaio de hidrlise da biomassa da palma e do resduo da
fermentao

semisslida

pelas

enzimas

obtidas

na

fermentao................................................................................. 102
Figura 4.15. Superfcies de resposta mostrando a influncia dos parmetros
testados no fator de purificao da CMCase (FP t): A =
Influencia da massa molar de peg (M PEG) e composio de
citrato (% Citrato), B= Influencia do pH e composio de
citrato. C= Influencia do pH e massa molar de PEG (M PEG)...

109

Figura 4.16. Influncias dos parmetros testados no fator de purificao de


FPases ........................................................................................ 112
Figura 4.17 - Superfcies de resposta mostrando a influncia dos
parmetros testados no fator de purificao da FPase (FP t): A
= Influencia do pH e composio de citrato B= Influncia da
massa molar de peg (MPeg) e composio de citrato (%
Citrato), C= Influncia do pH e massa molar de PEG (MPeg)....

114

Figura 4.18. Contribuio das variveis testadas no fator de purificao da


celobiase...................................................................................... 118
Figura 4.19. Superfcies de resposta mostrando a influncia dos parmetros
testados no fator de purificao da FPase (FPt): A = Influncia
do pH e massa molar de PEG (MPeg), B= Influencia do pH e
composio de citrato, C= Influncia da massa molar de peg

(M PEG) e composio de citrato (% CITRATO)........................

119

LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1- Composio qumica da palma forrageira expressa em g/Kg de
matria seca .....................................................................................

19

Tabela 2.2- Constituintes minerais da Palma Forrageira ......................................

20

Tabela 2.3- Agentes precipitantes..........................................................................

35

Tabela 2.4- Partio de biomolculas em SABs....................................................

38

Tabela 3.1- Composio bsica do meio de cultura .............................................

59

Tabela 3.2- Nveis do planejamento experimental ................................................

61

Tabela 3.3- Matriz do planejamento experimental fatorial 22 com trs


repeties ...........................................................................................

61

Tabela 3.4- nveis do planejamento experimental da lixiviao ............................

64

Tabela 3.5- Matriz do planejamento experimental fatorial 22 com trs repeties


no ponto central ..................................................................................

65

Tabela 3.6- Matriz de planejamento para o estudo dos SABs ..............................

68

Tabela 3.7- Valores decodificados utilizados no planejamento .............................

69

Tabela 4.1- Caracterizao das biomassas (base seca).......................................

73

Tabela 4.2- Avaliao da influncia da lavagem, adio de nitrognio e umidade


na obteno de CMCase. ......................................................................................

81

Tabela 4.3- Anlise de varincia ANOVA para os resultados do planejamento


experimental da fermentao com a biomassa da palma integral (PI)

85

Tabela 4.4- Anlise de varincia ANOVA para os resultados do planejamento


experimental da fermentao com a biomassa da palma lavada (PL)

88

Tabela 4.5- Resultados obtidos na variao dos parametros agitao (Ag),


tempo de contato (tc) e relao solvente/substrato (Re) na extrao
da CMCase produzida ........................................................................

90

Tabela 4.6 - Anlise de varincia ANOVA para os ensaios de extrao...............

92

Tabela 4.7 - Resultados das atividades CMCases obtidas para as relaes


solvente/substrato testadas.................................................................

93

Tabela 4.8 - Atividade recuperada por precipitao com etanol ...........................

95

Tabela 4.9- Valores de Atividade celuloltica e AR do extrato empregado na


hidrlise................................................................................................
Tabela 4.10- Produtividade de AR durante o processo de hidrlise da biomassa

101

da palma e do resduo da fermentao semisslida..........................

103

Tabela 4.11- Caractersticas do extrato usado nos ensaios de partio................

104

Tabela 4.12- Parmetros de partio para a enzima CMCase..............................

105

Tabela 4.13- ANOVA para o fator de purificao da CMCase ..............................

108

Tabela 4.14- Parmetros de partio para a FPase..............................................

110

Tabela 4.15- Anova para o fator de purificao de FPase.....................................

113

Tabela 4.16- Atividade em celobiase ....................................................................

115

Tabela 4.17- Teste F para o fator de purificao de celobiase .............................

118

Tabela 4.18- Condies operacionais dos ensaios com maior fator de


purificao (FP).................................................................................

120

Tabela 4.19- Condies operacionais dos ensaios com maior coeficiente de


partio enzimtica (K) e recuperao na fase superior (Yt )............

122

SUMRIO

1 INTRODUO ...................................................................................
1.1 OBJETIVO GERAL.........................................................................
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................
2 REVISO BIBLIOGRFICA...............................................................
2.1 O SEMIRIDO...............................................................................
2.2 A PALMA FORRAGEIRA..............................................................
2.3 BIOMASSA LIGNOCELULSICA.................................................
2.4 BIORREFINARIAS........................................................................
2.5 PRODUO DE BIOETANOL......................................................
2.6 CELULASES ................................................................................
2.7 IMPORTNCIA INDUSTRIAL DAS CELULASES.........................
2.8 OBTENO DE CELULASES........................................................
2.9 PROCESSOS FERMENTATIVOS..................................................
2.9.1 Processos em superfcie.....................................................
2.9.2 Processos submersos.........................................................
2.9.3 Fermentao semisslida...................................................
2.10 RECUPERAO E PURIFICAO DE ENZIMAS...................
2.10.1 Recuperao das enzimas obtidas por fermentao
semisslida....................................................................................
2.10.1.1 Extrao slido - lquido...................................................
2.10.1.2 Recuperao de protenas por precipitao.....................
2.11 SISTEMAS AQUOSOS BIFASICOS............................................
2.11.1 Diagrama de fases.............................................................
2.11.2 Partio de enzimas em sistemas aquosos bifsicos...
2.12 FATOR DE RECUPERAO E DE PURIFICAO DE
PROTENAS..........................................................................................
2.13 ESTADO DA ARTE.......................................................................
3 MATERIAL E MTODO...................................................................
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...............................................
3.1.1 Matria-prima ...........................................................................
3.2 CARACTERIZAO DA BIOMASSA..............................................
3.2.1 Granulometria...........................................................................
3.2.2 Massa especifica aparente......................................................
3.2.3 Massa especfica real..............................................................
3.2.4 Porosidade..............................................................................
3.2.5 pH ...........................................................................................
3.2.6 Cinzas.....................................................................................
3.2.7 Umidade.................................................................................
3.2.8 Slidos solveis totais (Brix).................................................
3.2.9 Acares redutores (AR) e acares redutores totais
(ART)
3.2.10 Determinao da concentrao de celulose
3.3 O PROCESSO FERMENTATIVO...................................................
3.3.1 Microrganismo e inculo.........................................................
3.3.2 Restabelecimento da umidade da biomassa.........................
3.3.3 Substrato e cultivo semisslido.............................................

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3.3.4 Extrao das enzimas.............................................................


3.3.5 Determinao da atividade do complexo celuloltico...........
3.3.6 Determinao das condies operacionais da lixiviao....
3.3.7 Concentrao do extrato bruto por precipitao..................
3.3.7.1 Precipitao com solvente orgnico...................................
3.3.7.2 Precipitao com sulfato de amnio...................................
3.4 CARACTERIZAO DAS ENZIMAS..............................................
3.4.1 Determinao da temperatura tima da atividade
enzimtica
3.4.3 Determinao do pH timo da atividade enzimtica...........
3.5 PURIFICAO DAS ENZIMAS DO EXTRATO UTILIZANDO
SABs......................................................................................................
3.6 AVALIAO DOS ENSAIOS DE PURIFICAO...........................
3.6.1 Determinao dos coeficientes de partio dos SABs.......
3.6.2 Avaliao dos processos de purificao..............................
3.6.3 Determinao do teor de protenas
3.7 APLICAO DO EXTRATO ENZIMTICO OBTIDO NA
HIDRLISE DA BIOMASSA DA PALMA
3.7.1 - Material lignocelulsico e pr-tratamento..........................
3.7.2 Sacarificao enzimtica e fermentao alcolica ...........
4 - RESULTADOS E DISCUSSO........................................................
4.1 CARACTERIZAO DA BIOMASSA..............................................
4.2 - FERMENTAO SEMISSLIDA.................................................
4.2.1 Acompanhamento cintico....................................................
4.2.2 - Avaliao da lavagem da biomassa, da umidade e da
adio de fonte de nitrognio.........................................................
4.3 - EXTRAO DAS ENZIMAS.................................................
4.3.1 - Recuperao de enzimas por precipitao........................
4.3.1.1 - Precipitao com etanol...................................................
4.3.1.2 - Precipitao com Sulfato de amnio................................
4.4 CARACTERIZAO DAS ENZIMAS .............................................
4.4.1 Temperatura tima da atividade CMCase............................
4.4.2 pH timo...............................................................................
4.4.3 Estabilidade enzimtica frente ao pH.................................
4.4.4 Estabilidade enzimtica da CMCase frente temperatura
4.5 APLICAO DO EXTRATO ENZIMTICO OBTIDO NA
HIDRLISE DA BIOMASSA DA PALMA..............................................
4.6 PARTIO DE CELULASES POR MEIO DE SABS......................
4.6.1 Atividade de CMCase.........................................................
4.6.2 - Atividade em FPase.............................................................
4.6.3 - Atividade em Celobiase.......................................................
4.7 AVALIO DAS CONDIES OPERACIONAIS DOS SABs
5- CONCLUSO....................................................................................
Referncias bibliogrficas................................................................

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1 INTRODUO
A grande maioria dos processos industriais destinados produo de
combustveis e de produtos qumicos alimentada por fontes de energia fssil (carvo,
leo e gs natural) cuja utilizao insustentvel em longo prazo, uma vez que so de
natureza no renovvel, com reservas limitadas e sua utilizao apontada como a
principal causa de alteraes climticas e poluio ambiental. Tais fatores so motivo
de preocupao para a economia global e tm incentivado pesquisas no mundo inteiro
que buscam obter insumos e fontes alternativas de energia limpa e renovvel,
valorizando as potencialidades econmicas de cada regio do globo, principalmente no
que diz respeito produo de biomassa.
Nesse contexto, o conceito de biorrefinaria, uma unidade produtora com o objetivo
de substituir produtos e processos baseados em fontes de matria-prima no
renovveis por produtos e processos que utilizem a biomassa como matria-prima,
aproveitando todo o seu potencial econmico e energtico ganha cada vez mais fora,
principalmente pela disponibilidade de diversos tipos de biomassa e pela diversidade
de produtos e utilidades que podem ser obtidas a partir dessa matria-prima.
A palma forrageira (Opuntia ficus-indica Mill) uma planta caracterstica de
regies semiridas, destinada principalmente alimentao animal em perodos de
estiagem. Trata-se de uma biomassa amplamente disponvel nessas regies, cujas
potencialidades econmicas ainda no so muito exploradas. O desenvolvimento de
processos industriais utilizando a palma forrageira como matria-prima pode agregar
valor cultura, pois a biomassa da palma, em especial os clauddios da planta, pode
ser utilizada na obteno de bioetanol e enzimas alm da extrao de substncias
destinadas elaborao de frmacos e artigos de qumica fina.
No que diz respeito produo de bioetanol, tal processo ainda no
economicamente vivel pois a clivagem da celulose presente na biomassa para
produo de acares fermentescveis promovida por enzimas celulases, de custo
elevado. Os custos esto intimamente ligados produtividade das enzimas, geralmente
de origem fngica, e da atividade enzimtica final recuperada no extrato fermentado
bruto. A produo de celulase , portanto o fator chave da hidrlise de material
celulsico e essencial para tornar o processo de converso de materiais
lignocelulsicos em bioetanol vivel.

16

Portanto, necessrio o desenvolvimento de processos fermentativos que


produzam extratos fermentados com alta concentrao de celulases, elevada atividade
enzimtica e estabilidade, alm do grau de pureza requerido para a aplicao a qual se
destina. Alm disso, uma boa recuperao das enzimas produzidas no processo
fermentativo um fator determinante para sua aplicao industrial.
Os processos de purificao enfrentam uma forte demanda na intensificao e
integrao das diversas etapas do processo de forma a aumentar o rendimento, reduzir
o tempo de operao e os custos de produo.

Operaes que integram os trs

passos clssicos do processo de recuperao (separao slido-lquido, concentrao


e isolao primria de produtos) em uma s unidade de operao tem recebido
ateno especial por reduzirem o nmero de etapas necessrias para o processo de
purificao e promoverem alta recuperao com maior economia, quando comparadas
a tcnicas tradicionais.
A utilizao de sistemas aquosos bifsicos (SABs) referida como um processo
adequado para purificao de enzimas, uma vez que permite a obteno de
rendimentos elevados em curtos espaos de tempo e com baixos custos.
Diante do exposto, este trabalho se prope estudar a obteno de enzimas
celulases produzidas pelo fungo filamentoso Trichoderma Reesei LCB 48 em processo
de fermentao semisslida, utilizando os clauddios da palma forrageira (Opuntia
ficus-indica Mill) como suporte e fonte de nutrientes. Alm disso, sero estudadas a
recuperao das celulases produzidas e sua purificao por meio de sistemas aquosos
bifsicos formados por polietilenoglicol e citrato de sdio. Tambm ser avaliada a
aplicabilidade da biomassa da palma e do resduo da fermentao na produo de
acares fermentescveis.
Tais estudos pretendem fornecer informaes operacionais que possam servir de
base para o desenvolvimento de processos produtivos em uma biorrefinaria, que
convertam a biomassa da palma forrageira em insumos com maior valor agregado;
demonstrando a aplicabilidade da biomassa da palma forrageira na cadeia produtiva de
bioetanol.

17

1.1 OBJETIVO GERAL

Produzir, recuperar, purificar e verificar a aplicabilidade de enzimas celulases


obtidas pela fermentao semisslida da palma forrageira (Opuntia ficus-indica Mill).

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

1- Caracterizar a biomassa da palma


2- Obter extrato fermentado bruto, produzido pela fermentao semisslida da
biomassa da palma forrageira.
3- Verificar a possibilidade de recuperao das enzimas por lixiviao e
precipitao por sal ou solvente.
4- Caracterizar as enzimas obtidas quanto ao pH timo e temperatura tima
5- Verificar a aplicabilidade do complexo enzimtico produzido para a hidrlise de
material lignocelulsico.
6- Estudar a purificao das enzimas celulases em SABs do Tipo PEG-Citrato
selecionando as condies operacionais mais adequadas.

18

2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 O SEMIRIDO
O Semirido brasileiro, com rea de aproximadamente 1 milho de Km2, abrange
quase todos os Estados da Regio Nordeste, exceto o Maranho, alm de parte dos
Estados de Minas Gerais e Esprito Santo. A regio tem aproximadamente 21 milhes
de habitantes, o que representa 46% da populao nordestina e 13% da populao
brasileira distribudas em 1.162 municpios. O clima predominante na regio semirida
nordestina brasileira o tropical seco com a evaporao excedendo a precipitao,
com ocorrncia de pequenos perodos de chuvas sazonais (COUTINHO et al., 2013).
Dentre as Regies do Brasil, o Nordeste a que tem apresentado maior
crescimento econmico nos ltimos anos. Entretanto, os indicadores sociais da rea
rural permanecem baixos, pois trata-se de um crescimento assimtrico, concentrado
nos centros urbanos (ALBUQUERQUE, 2012). Portanto, a regio ainda a mais
vulnervel s mudanas no clima.
De acordo com Suassuna (2002), no desenvolvimento de tecnologias agrcolas
para o Semirido - entendidas aqui como aquelas fixadoras do homem no campo
deve-se ter em mente um ponto fundamental: a explorao da capacidade de suporte
da regio. Neste sentido, o Semirido tem uma riqueza enorme de plantas adaptadas
ao ambiente seco que poderiam ser economicamente exploradas, por exemplo: catol,
faveleira, marmeleiro e oiticica como produtoras de leos; pinho e manioba para
obteno de ltex; carnaba para extrao de ceras; bromeliceas para obteno de
fibras; babosa e juazeiro para produo de frmacos; rvores frutferas como o
umbuzeiro e, de um modo geral, as forrageiras.
Portanto, possvel, com o uso de tecnologias apropriadas e o desenvolvimento
de processos produtivos para explorar adequadamente os potenciais naturais do
Semirido, fornecer alternativas econmicas e produtivas para a regio, gerando renda
e agregando valor aos recursos existentes.
2.2 A PALMA FORRAGEIRA
A palma forrageira (Opuntia ficus-indica Mill), apresentada na Figura 2.1, uma
planta caracterstica de regies semiridas, onde cultivada principalmente para

19

alimentao de ruminantes em pocas de estiagem (BARACHO; SILVA; NETO, 2009;


BEZERRA et al., 2012).

Figura 2.1 - Palma Forrageira (Opuntia ficus-indica Mill)

A planta produz frutos e claddios comestveis, podendo ser utilizada tambm na


alimentao humana. Devido s suas propriedades medicinais, a palma pode ser
utilizada como antioxidante, agente anti-inflamatrio e na preveno de lceras (LEE et
al., 2002; PARK et al., 2000; GALATI et al., 2001).
A Tabela 2.1 mostra a composio qumica de palma forrageira, expressa em
g/kg de matria seca.

Tabela 2.1 - Composio qumica de palma forrageira expressa em g/Kg de


matria seca.

(Fonte: Batista, Carvalho e Rocha Filho, 2013)

20

A Tabela 2.2 contm as quantidades dos constituintes minerais presentes na


palma forrageira.

Tabela 2.2- Constituintes minerais da palma forrageira

Fonte: Batista, Carvalho e Rocha Filho (2013).

A cultura da palma tem sido um importante recurso para a criao de gado em


regies ridas e semiridas em diversos pases, tais como Estados Unidos, Mxico,
frica do Sul, Brasil e Austrlia, por dispor de caractersticas morfolgicas e fisiolgicas
apropriadas a essas regies (TEIXEIRA et al., 1999; BEZERRA et al., 2012).
No Nordeste Brasileiro, principalmente no Estado de Pernambuco, so cultivadas
duas espcies de palma, a Opuntia ficus-indica Mill, com as cultivares Gigante e
Redonda, e a Nopalea cochenilifera Salm Dyck, cuja cultivar a palma Mida ou Doce
(FERREIRA et al., 2003). Estas espcies foram introduzidas no Brasil ainda na poca
do Imprio, por determinao de Dom Joo VI, para a criao da cochonilha do carmim
(Coccus cati), que produz um corante natural, muito valorizado naquela poca. Como a
atividade no prosperou, a cactcea passou a ser utilizada como planta ornamental,
at que fosse descoberta sua grande aplicao como forrageira (DOMINGUES, 1963).
Um projeto do INSA (Instituto Nacional do Semirido) lanado em abril de 2012,
procura revitalizar a cultura da palma forrageira por meio da divulgao, pesquisa e
inovao utilizando variedades resistentes Cochonilha-do-carmim, que tem
provocado danos socioeconmicos, principalmente nos Estados da Paraba e
Pernambuco. A finalidade do projeto inserir esta cultura como uma proposta de
poltica pblica sustentvel. As primeiras aes do INSA foram focadas na prtica de
revitalizao da cultura da palma forrageira no Semirido, por meio da realizao de

21

pesquisas cientficas com as variedades resistentes (INSA, 2013). O projeto pretende


fortalecer a palma forrageira como cultura nobre e de importncia econmica a partir de
variedades resistentes praga, fornecendo subsdios para polticas pblicas
direcionadas produo agroecolgica.
Nos ltimos anos, foram desenvolvidos trabalhos de pesquisa que tiveram por
objetivo agregar valor cultura da palma e melhorar suas caractersticas nutricionais.
Arajo et al. (2008), por exemplo, promoveram o enriquecimento proteico da palma
forrageira com Saccharomyces cerevisiae para alimentao de ruminantes. Baracho;
Silva e Torres Neto (2009) estudaram a obteno de etanol a partir da biomassa da
palma por meio de hidrlise cida, como alternativa ao etanol obtido da cana de
acar, para ser produzido em regies ridas ou semiridas.
Alm de aplicaes na alimentao animal e na produo de biocombustveis,
existem alguns estudos sobre a utilizao da palma como matria-prima em
bioprocessos, visando produo de compostos orgnicos de interesse industrial por
fermentao semisslida, tais como amiloglucosidase (SANTANA et al., 2012) e
celulases (SANTOS et al., 2011).
2.3 BIOMASSA LIGNOCELULSICA
Denomina-se biomassa qualquer tipo de matria orgnica proveniente de fontes
vegetais ou animais. So recursos renovveis, formados periodicamente, e no tem o
tempo como fator limitante produo, como acontece com os combustveis fsseis
(MALAJOVICH, 2011).
A biomassa lignocelulsica compreende os resduos agroindustriais e a matria
orgnica provenientes diretamente de fontes vegetais ou resultantes de seu
processamento. O aproveitamento e reciclagem de tais resduos podem reduzir os
problemas ambientais resultantes de sua disposio inadequada na natureza, agregar
valor aos subprodutos da agroindstria e valorizar os recursos naturais ou culturas de
determinada regio. As estratgias de aproveitamento da biomassa lignocelulsica
incluem processos de gaseificao, mtodos de produo de calor e eletricidade
(cogerao), recuperao de energia de resduos slidos urbanos e gs de aterros
sanitrios, produo de biomolculas de interesse industrial; e a obteno de bioetanol,
que visa diminuir a utilizao de combustveis fsseis, assunto de grande interesse na
atualidade (LIU et al., 2011; GOLDEMBERG, 2009).

22

Os materiais lignocelulsicos so constitudos de estruturas duras e fibrosas,


compostas

principalmente

pelos

polissacardeos

celulose

hemicelulose

(aproximadamente 70% da massa seca), intercalados por lignina, uma macromolcula


composta de lcoois aromticos. A lignina encontra-se fortemente unida aos
polissacardeos por ligaes covalentes e hidrognicas. Dependendo da origem do
vegetal, podem ser encontrados nos materiais lignocelulsicos pequenas quantidades
de resinas, cidos graxos, fenis, taninos, compostos nitrogenados e sais minerais de
clcio, potssio e magnsio (LEE, 1997; NEUREITER et al., 2002). A Figura 2.2 exibe a
estrutura lignocelulsica.

Figura 2.2 - Estrutura lignocelulsica

(Fonte: Zampieri, 2011)

Os processos que empregam a biomassa lignocelulsica na elaborao de


produtos e insumos so desenvolvidos de forma se obter aproveitamento mximo da
biomassa com o mnimo de custo em unidades produtivas denominadas biorrefinarias.

2.4 BIORREFINARIAS
As biorrefinarias esto inseridas nos planejamentos de PD&I (Pesquisa,
Desenvolvimento e Inovao) de grande parte dos pases desenvolvidos e em
desenvolvimento,

como

Brasil, mobilizando

esforos

pblicos,

privados e

investimentos direcionados ao aproveitamento otimizado das matrias-primas, com a

23

finalidade de agregar valor s cadeias produtivas da biomassa e reduzir possveis


impactos ambientais das mesmas (VAZ JNIOR, 2011).
Biorrefinaria uma unidade produtiva que integra a gerao de energia e
produtos de valor agregado elevado a partir de biomassa. Dentro do conceito de
biorrefinaria, a biomassa convertida em uma variedade de produtos, com pouco
desperdcio e emisses, trazendo novas oportunidades de ganho. Na biorrefinaria
ocorre o aproveitamento integral de recursos renovveis tais como: celulose,
hemicelulose, lignina, pectina, taninos, amido, cidos graxos, colgeno, quitosana,
corantes naturais e outros constituintes qumicos, na obteno de energia, produtos
qumicos, biomateriais e alimentos (FERNANDO et al., 2006), podendo integrar, em um
mesmo espao fsico, processos de obteno de biocombustveis, produtos qumicos,
energia eltrica e calor (VAZ JUNIOR, 2011).
A Figura 2.3 destaca o potencial econmico dos produtos de uma biorrefinaria.

Figura 2.3- Diagrama representativo do conceito de biorrefinaria apresentando o


potencial de valor agregado dos produtos

(Fonte: Vaz Junior, 2011)

O processo da biorrefinaria envolve um conjunto de rotas tecnolgicas capazes


de fracionar, extrair, separar e converter a matria-prima em diferentes produtos

24

intermedirios ou finais, maximizando os ganhos econmicos, minimizando os


impactos ambientais, e melhorando a eficcia e sustentabilidade das cadeias
agroindustriais.
Os produtos qumicos desenvolvidos a partir de coprodutos e resduos so os que
possuem maior potencial em agregar valor s cadeias produtivas da biomassa, em
funo da participao estratgica da indstria qumica no fornecimento de insumos e
produtos finais a diversos setores da economia, como: petroqumico, farmacutico,
automotivo, construo civil, agronegcio, cosmticos, etc. (VAZ JUNIOR, 2011).
2.5 PRODUO DE BIOETANOL
O Brasil e os Estados Unidos so os maiores produtores de etanol do mundo. A
produo de etanol no Brasil baseia-se na fermentao alcolica da sacarose presente
no caldo da cana-de-acar. Nos Estados Unidos, o etanol obtido a partir da hidrlise
enzimtica do amido de milho, gerando a glicose, que fermentada a etanol pela
levedura Saccharomyces cerevisiae. Ambos os casos possuem tecnologias e os
mercados j maduros e consolidados. O etanol produzido por meio desses processos
conhecido como etanol de primeira gerao (1G), enquanto processos que utilizem a
matria-prima lignocelulsica resultam no chamado etanol de segunda gerao (2G)
(MOLINARI et al., 2011).
As etapas para um processo de produo de bioetanol a partir de biomassa
lignocelulsica so os seguintes: hidrlise da hemicelulose (via cida ou enzimtica);
separao da celulose slida, da lignina e dos acares produzidos; hidrlise cida ou
enzimtica da celulose, produzindo glucose e lignina; fermentao dos acares
produzidos e separao do bioetanol por destilao. A lignina obtida no processo pode
ser utilizada para produo de energia por meio da sua queima (LUIZ JR et al., 2009).
As tecnologias existentes para a obteno de bioetanol a partir de materiais
lignocelulsicos, envolvem a hidrlise dos polissacardeos da biomassa em acares
fermentescveis para posterior fermentao alcolica. O processo de hidrlise utiliza
tecnologias complexas e multifsicas, baseadas na utilizao de rotas cidas e/ou
enzimticas para a separao dos acares e remoo da lignina (CASTRO; PEREIRA
JR, 2010).
A rota cida uma tecnologia j bem conhecida, porm tem como desvantagens
a gerao de substncias txicas, como o hidroximetilfurfural, e grande dificuldades

25

tcnicas em se recuperar o acar produzido a partir do cido. J a hidrlise


enzimtica, na qual os materiais lignocelulsicos so hidrolisados em acares
fermentescveis atravs da ao da enzima celulase, alm de ser um processo mais
eficiente, conduzida sob condies ambiente, e no gera nenhum tipo de resduo
txico (OGEDA; PETRI, 2012).
As enzimas celulases so imprescindveis para a utilizao da rota enzimtica na
converso de materiais lignocelulsicos em acares fermentescveis e a aplicabilidade
industrial deste processo depende da produo dessas enzimas em larga escala.
2.6 CELULASES
As celulases so um grupo de enzimas hidrolticas capazes de promover a
hidrlise de celulose natural ou modificada por pr tratamentos em carboidratos
menores, como unidades de glucose (DAMISA; KUTA; ADABARA, 2013).
Quanto a regio de atuao no substrato celulsico, as celulases so divididas em
trs grupos:
Endoglucanases (EC 3.2.1.4): Tem como nome sistemtico 1,4- b-D-glucana-4glucano-hidrolase. Sua atuao promove de forma aleatria a hidrlise de regies
internas da estrutura amorfa da fibra de celulose, promovendo a liberao de
oligossacardeos com diversos graus de polimerizao, o que resulta em rpida
solubilizao do polmero celulsico. , portanto, a enzima que inicia o processo de
hidrlise (LYND et al., 2002; CASTRO; PEREIRA JR, 2010).
Exoglucanases. So enzimas que atuam na regio externa da celulose.
Compreendem a glucano-hidrolase (EC 3.2.1.74) e a celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91).
A glucano-hidrolase tem por nome

sistemtico 1,4- b-D-glucana-glucano-

hidrolase. Apesar de pouco citada, representa uma importante estratgia na hidrlise


da fibra celulsica, pois sua atuao promove a liberao de glicose diretamente do
polmero (LYND et al., 2002).
A celobio-hidrolase, cujo nome sistemtico 1,4-b -D-glucana-celobio-hidrolase,
participa da hidrlise primria da fibra e responsvel pelo fenmeno da
amorfognese, que promove a desestratificao das fibras por meio de ruptura fsica
do substrato, aumentando as regies intersticiais e transformando as regies cristalinas
do polmero em amorfas. Dessa forma, a taxa de hidrlise da celulose aumenta, pois o
polmero fica mais exposto ao das celulases. A celobio-hidrolase pode ser dividida
ainda em dois tipos: O tipo I hidrolisa terminais redutores e o tipo II hidrolisa terminais

26

no redutores. Tais enzimas so inibidas pelo seu produto de hidrlise (celobiose).


(OHMIYA et al., 1982; CASTRO; PEREIRA JR 2010).
-glicosidase (EC 3.2.1.21). Tem como nome sistemtico b-glicosdeo glucohidrolase. Promove a hidrlise da celobiose e oligossacardeos solveis em glicose.
Assim como a celobio-hidrolase, tambm pode sofrer inibio por seu produto de
hidrlise. (LYND et al., 2002).
As enzimas do complexo celuloltico quando atuam em conjunto apresentam
sinergismo, isto , apresentam um rendimento maior do que a soma dos rendimentos
individuais, caso atuassem isoladamente (CASTRO; PEREIRA JR 2010). Tal atuao
est esquematizada na Figura 2.4.

Figura 2.4- Modo de ao das enzimas do complexo celuloltico

(Fonte: Castro e Pereira Jr, 2010)

2.7 IMPORTNCIA INDUSTRIAL DAS CELULASES


Atualmente, as enzimas celulolticas para fins comerciais so produzidas a partir
de fungos filamentosos como o Trichoderma reesei, o primeiro fungo a ser utilizado na
produo industrial de celulase, e que permanece ainda como a fonte mais
utilizada, tendo passado por processos de seleo e mutao ao longo dos anos com o
objetivo de aumentar sua produtividade. Alm de celulases fngicas, existem tambm
celulases produzidas por via bactrias aerbias e anaerbias (OGEDA; PETRI, 2010).
Nos ltimos 30 anos, a demanda de celulases para processos industriais tem
aumentado consideravelmente em todo o mundo (AKCAPINAR; GUL; SEZERMAN,
2012). Tal interesse devido possibilidade de utilizar as enzimas do complexo

27

celuloltico na converso da biomassa lignocelulsica disponvel para a produo de


carboidratos, destinados numerosas aplicaes industriais (DAMISA; KUTA;
ADABARA, 2013).
Na indstria txtil, as celulases so utilizadas no processamento de fibras
celulsicas com o objetivo de obter tecidos de melhor qualidade e dar efeitos de
acabamento em peas tingidas. As celulases tambm encontram ampla aplicao na
indstria de alimentos, papel e celulose, detergentes domsticos, preparados
enzimticos, entre outros (BHAT, 2000; BON; FERRARA; CORVO, 2008).
Uma aplicao que vem ganhando destaque nos ltimos anos a utilizao de
celulases para bioconverso de biomassa agrcola e materiais lignocelolsicos em
geral em bioetanol. Nesse processo promovida a hidrlise da biomassa
lignocelulsica para converso da celulose em glicose que se trata de um acar
diretamente fermentescvel pela levedura produtora do etanol (OGEDA;PETRI, 2010).
2.8 OBTENO DE CELULASES
Na natureza h diversos microrganismos, tais como fungos dos gneros
Aspergillus e Trichoderma, alm de bactrias dos gneros Bacillus, Streptomyces e
Cellulomonas; que produzem enzimas capazes de catalisar a hidrlise da celulose.
Estes microrganismos podem ser encontrados no solo, degradando matria vegetal
(SANDGREN; STAHLBERG; MITCHINSON, 2005). Porm apenas alguns desses
microrganismos so tidos como verdadeiros celulolticos, isto , so capazes de
degradar a celulose natural (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004).
Os primeiros estudos sobre as celulases ocorreram durante a Segunda Guerra
Mundial, quando soldados das foras armadas norte-americanas, instalados nas
ilhas Solomon, no Pacfico Sul perceberam a deteriorao precoce de objetos
fabricados de algodo. Para propor solues a este problema, uma equipe de trabalho
liderada pelo Dr. Elwyn T. Reese, realizando experimentos no laboratrio das foras
armadas isolou uma linhagem de fungo filamentoso, identificado posteriormente como
Trichoderma viride, ao qual foi atribuda a caracterstica de excretar enzimas capazes
de degradar celulose. At 1953, Dr. Reese e seu grupo de trabalho j haviam
determinado que enzimas naturais, nomeadas celulases, constituem complexos de
diversas enzimas com distintas habilidades na degradao do substrato. Em 1956, Dr.
Reese aliou seus conhecimentos aos da Dra. Mary Mandels. A partir desse momento, o
foco das pesquisas deixou de ser a preveno da hidrlise da celulose e passou a ser

28

o melhoramento da produo das enzimas responsveis

por

esse

fenmeno

(CASTRO; PEREIRA JR, 2010).


Os estudos sobre a produo de celulases no so recentes. Basu e Whitaker
(1953), por exemplo, ainda nos anos 50, pesquisavam a estimulao e inibio de
enzimas celulolticas do Myrothecium verrucaria. O objetivo nessa poca era propor
estratgias para impedir a degradao de tecidos de origem vegetal por esse
microorganismo.
Portanto, desde sua descoberta, a produo de celulases por ao microbiana
tem sido objeto de muitos estudos que buscaram estabelecer as melhores condies
para

a produo

dessas

enzimas a partir do momento em que foram surgindo

aplicaes industriais para as mesmas. Os maiores investimentos e esforos na


produo de celulases, foram observados no incio do sculo XXI, devido
possibilidade de aplicar as celulases na obteno de etanol combustvel (CASTRO;
PEREIRA JR, 2010).
Os processos industriais de produo de celulases envolvem a utilizao de um
microorganismo como agente metabolizador das fontes de carbono presentes em um
meio de cultivo, de forma que as enzimas so sintetizadas e excretadas. Uma grande
quantidade de microrganismos tem sido estudada, de forma a selecionar aqueles que
apresentem alta produtividade (DAMASO et al, 2012).
Alm dos microrganismos, muitos substratos so pesquisados como indutores
na produo das enzimas. Resduos agroindustriais e biomassa celulsica de baixo
custo podem ser utilizados para produzir as celulases, com um rendimento semelhante
ao que se obtm com outras fontes de carbono, o que no s reduz grandemente o
custo da produo dessas enzimas, mas tambm podem contribuir para a conservao
do meio ambiente (ONOFRE et al., 2013).
Como exemplos de substratos estudados para a produo de celulases, esto o
bagao de cana (ONOFRE et al., 2013), casca do maracuj (SOUSA et al, 2012),
bagao de caju (ALCNTARA et al, 2010), casca de goiaba (SANTIAGO et al, 2014)
entre outros. Tais substratos encontram aplicabilidade como fonte de carbono, fonte
indutora e suporte microbiano nos chamados processos de fermentao em estado
slido ou fermentao semisslida.
Elevada atividade celuloltica pode ser obtida a partir dos compostos resduos
agroindustriais empregados, sem a suplementao com nitrognio, minerais ou
vitaminas (ELISASHVILI, 1993). A resposta dos microrganismos aos diferentes tipos

29

de

indutores, tais como celobiose, carboximetilcelulose, celulose microcristalina, e

celulose amorfa, que so indutores de celulases; depende da concentrao e do tipo


do indutor, e da presena de glicose ou outros acares no meio de crescimento.
Os indutores da sntese de enzimas celulolticas tm duas funes, podem

servir

como fonte de carbono para o crescimento celular, e como indutores da sntese


enzimtica (AMORIM, 2010; GONG;TSAO, 1975).
importante ressaltar que um processo de produo de enzimas celulase no
deve causar uma reduo drstica na atividade e estabilidade enzimtica, uma vez a
estabilidade da enzima sob condies adversas necessria para a sua aplicabilidade
em processos industriais. Compreender o mecanismo de estabilidade pode ajudar a
projetar processos e operaes que no reduzam a atividade nem a estabilidade
enzimtica (AKCAPINAR, GUL e SEZERMAN, 2012).
Por motivos econmicos, cada vez mais estudada a produo de celulases "in
loco", ou seja, no local onde a celulase ser aplicada na hidrlise de materiais
lignocelulsicos. A produo de celulases no local uma estratgia importante para o
desenvolvimento de processos de produo de etanol de segunda gerao sustentvel
(DELABONA et al., 2012).
2.9 PROCESSOS FERMENTATIVOS
Os processos fermentativos podem ser classificados, quanto ao desenvolvimento
do agente microbiano, em: processos de superfcie, processos submersos e
fermentao em estado slido ou semisslido.

2.9.1 Processos em superfcie

Nos processos em superfcie, a massa de microrganismos desenvolve-se na


superfcie do meio lquido, retirando oxignio diretamente do ar. Para oferecer uma
grande rea superficial para o desenvolvimento do microrganismo, o meio de cultivo
colocado em recipientes rasos. Os nutrientes chegam at a superfcie por difuso,
medida em suas concentraes vo diminuindo nas camadas superiores. Tambm por
difuso, os produtos do metabolismo se disperso no meio em fermentao.
Pereira Junior (2008) destaca que esse mtodo limita-se ao cultivo de fungos
filamentosos, que tendem a formar pelcula micelial na superfcie do meio. Tais
processos apresentam tempos de fermentao longos e possuem alto custo

30

operacional. Apesar disso, encontra aplicao na produo de vinagre pelo processo


Orleanense.

2.9.2 Processos submersos

Nos processos de fermentao submersa, a clula produtora se desenvolve no


seio do meio lquido, geralmente sob agitao e, no caso de processos aerbicos, h
suplementao de oxignio por borbulhamento (AQUARONI et al, 2001).
Os processos submersos oferecem vantagens em relao aos de superfcie, tais
como a operao de grandes volumes de meio, distribuio uniforme de nutrientes
alm da facilidade de controle das variveis do processo, as quais podem ser ajustadas
em valores timos, resultando em maior eficincia e produtividade. A maioria das
fermentaes industriais importantes, realizada por processo submerso (Pereira
Junior, 2008).
Dentre as desvantagens, pode-se citar o elevado custo inicial na instalao dos
equipamentos na planta e manuteno destes e a baixa concentrao das
biomolculas obtidas (AQUARONE et al., 2001)
2.9.3 Fermentao semisslida

Denomina-se fermentao

semisslida

(FSS) o

processo

no qual

os

microrganismos crescem sobre ou dentro das partculas de uma matriz slida, cujo
contedo de lquido ligado a ela esteja em um nvel de atividade de gua que
garanta o crescimento e metabolismo celular, mas que no exceda capacidade
mxima de ligao da gua com a matriz slida (DEL BIANCHI, MORAES e
CAPALBO, 2001).
Embora a maioria

das enzimas comerciais seja obtida por fermentao

submersa, que tem como atrativos o alto rendimento, o baixo risco de contaminao e
a possibilidade de se utilizar modernos mtodos de controle de processos
(FERNANDES-SALOMO

et

al.,1996),

muitos estudos tem sido realizados com

fermentao semisslida devido a algumas de suas vantagens, como a utilizao de


menor infra-estrutura e matrias-primas mais baratas para a produo enzimtica, o
que aumenta a economia deste tipo de processo, alm da possibilidade de obter-se
um produto concentrado, o que bastante vantajoso (RAJEEV et al., 2009).

31

Ambos os tipos de processos fermentativos apresentam caractersticas


importantes, sendo necessrio a avaliao das vantagens e desvantagens que cada
um apresenta, o que depender do tipo de produto desejado e, principalmente, do
grupo de microrganismos a ser utilizado (AMORIM, 2010).
Embora a fermentao semisslida

proporcione alta

produtividade, alta

concentrao de produtos e necessite de pouco espao e energia; tem como


desvantagem a dificuldade no controle dos parmetros do processo fermentativo
(pH, temperatura, umidade e crescimento celular) e a necessidade de volumes
relativamente

grandes

de

inculo. Alm disso, vrios grupos microbianos no

conseguem se desenvolver em baixos teores de umidade. Por isso so utilizados


fungos filamentosos no processo, pois os mesmos adaptam-se bem a essa condio
(PANDEY et al., 1999).
No desenvolvimento de um processo de fermentao semisslida feita uma
seleo do substrato e de um microorganismo especfico. Alm disso, necessrio o
controle dos parmetros da fermentao propriamente dita, tais como pr-tratamento
do substrato; tamanho de partcula (espao inter-partcula e rea superficial) do
substrato; umidade e atividade de gua (aw) do substrato; temperatura

da

fermentao; perodo de cultivo; manuteno de uniformidade no ambiente do


sistema e taxa de consumo de oxignio (GUTIERREZ-CORREA; TENGERDY,
1997; PANDEY et al., 1999).
A fermentao semisslida tem se mostrado promissora na obteno de diversos
bioprodutos, tais como enzimas (SOUSA, SILVA e CONRADO, 2012; AMORIM, 2010;
LIU et al., 2011; ONOFRE et al., 2013);

cidos

orgnicos, aromas (UENOJO;

PASTORE, 2006) e bioerbicidas (MORAES, ARRUDA e MORAES, 2007). A Figura


2.5 exibe as etapas de um processo tpico de fermentao semisslida.

32

Figura 2.5- Etapas de um processo de FSS tpico

2.10 RECUPERAO E PURIFICAO DE ENZIMAS

Aps a produo das enzimas segue uma outra etapa destinada a recuperao dos
produtos obtidos. Esta fase, denominada de downstream processing, compreende as
fases de separao e purificao do produto. As estratgias utilizadas nessas etapas
dependem dos aspectos citolgicos e fisiolgicos do microorganismo, que determinam
se o produto ser excretado ou permanecer no interior das clulas. Dependendo da
localizao do produto, tcnicas diferentes so empregadas na recuperao dos
produtos obtidos (MONTEIRO; SILVA, 2009).
No caso de produtos intracelulares, as operaes incluem a disruptura das clulas,
o que aumenta a quantidade de impurezas presentes e eleva os custos do processo. O
produto pode ser concentrado por tcnicas de sedimentao, precipitao, filtrao,
centrifugao, extrao por solventes, destilao, evaporao do solvente e secagem.
Caso uma etapa de purificao seja necessria, esta envolver outros procedimentos,
como tcnicas de cristalizao ou a aplicao de mtodos cromatogrficos
(MALAJOVICH, 2011).

33

Os processos downstream para a obteno de enzimas e protenas puras


constituem geralmente uma grande percentagem do custo total de produo,
especialmente se a pureza final for uma exigncia rigorosa. Os custos aumentam com
a diluio na qual o bioproduto gerado na etapa de produo (DWYER, 1984). A
escolha das etapas do processo de recuperao e purificao fortemente dependente
das exigncias do mercado, do custo de processamento, da qualidade final desejada, e
da tecnologia disponvel (SOMMERS et al., 1989; AMRITKAR, KAMAT e LALI, 2004).
importante que todas as etapas do processo de separao e recuperao de
enzimas sejam conduzidas em condies no desnaturantes, ou seja, condies que
no produzam desativaes ou danos irreversveis estrutura enzimtica. A
necessidade de purificao eficaz de protenas em larga escala com reduzido custo
tem resultado na evoluo de uma srie de tcnicas que proporcionam protocolos
rpidos, eficientes e econmicas em menos passos de processamento (AMRITKAR,
KAMAT e LALI, 2004).

2.10.1 Recuperao das enzimas obtidas por fermentao semisslida

Os processos downstream em fermentao semisslida diferem bastante dos


utilizados na fermentao submersa, pois a extrao ocorre a partir do material slido e
no do lquido. Existem produtos que no requerem a extrao do material
fermentado, quando a fermentao semisslida destina-se ao enriquecimento protico
de materiais que serviro como rao animal (SANTOS et al., 2006).
Para se chegar a uma composio adequada para o meio de extrao, deve-se
estudar inicialmente as condies em que a protena de interesse estvel. Por outro
lado, tambm deve ser levado em considerao, as condies nas quais a protena
mais eficientemente libertada das clulas ou substratos. A escolha final geralmente
aquela que combina mximas recuperao e pureza, ou mxima recuperao e
atividade no caso de enzimas. Os fatores levados em considerao na recuperao
das enzimas so: pH, o tipo de tampo salino, e em alguns casos a adio dos
seguintes aditivos: Detergentes, agentes quelantes, ons metlicos, e inibidores
proteolticos (JANSON e RYDN, 1998).

34

2.10.1.1 Extrao slido-lquido

Em alguns casos, a recuperao pode ser feita por prensagem direta, utilizando
uma prensa hidrulica na qual o material fermentado prensado para a obteno do
extrato bruto. Em outros casos, o processo mais conveniente a lixiviao ou
Leaching, que consiste na dissoluo preferencial de um ou mais solutos de interesse
por meio do contato entre um meio slido e um solvente lquido (FERNNDEZ et al,
2012).
O solvente ideal para esta operao de extrao do tipo slido-lquido deve ser
adequado para recuperar o produto de forma seletiva, de preferncia temperatura
ambiente, e com o menor tempo de contato possvel. A soluo a ser utilizada na
lixiviao depende da solubilidade do produto desejado, por exemplo: etanol para
extrao de pigmentos; etanol e etil acetato para extrao de penicilina; gua para
extrao de oxitetraciclina, cefamicina e vitamina C (SANTOS et al., 2006). No caso de
enzimas, costuma-se usar tampes salinos, como o acetato e o citrato de sdio.
A operao de extrao resulta em um extrato enzimtico lmpido. A massa
semisslida pode ser seca a baixas temperaturas, antes da extrao. O material seco
pode ser armazenado para posterior manipulao ou pode ser usado como uma
preparao comercial bruta. Pode-se concentrar o extrato bruto lquido por secagem a
vcuo ou por ultrafiltrao. Aps adio de estabilizantes, como glicerol ou tampes, o
concentrado obtido pode ser vendido na forma lquida para diversas aplicaes
(CASTILHO et al, 1999).
A utilizao direta do extrato bruto evita vrias etapas de processamento comercial
(purificao, concentrao, adio de buffers, estabilizantes e conservantes, liofilizao
e embalagem). A utilizao do extrato bruto obtido por um processo otimizado de
fermentao semisslida pode ser um mtodo relativamente simples de produo local
de celulase para um processo de converso de celulose em etanol (LEVER; HO;
CORD-RUWISH, 2010).
A relao entre a quantidade de slido a ser tratado e o volume de solvente que
ser utilizado de grande importncia. A intensidade e o carter do processo de
extrao slido-lquido dependem principalmente da difusividade do soluto na frao do
solvente selecionado, alm da concentrao de saturao do soluto no solvente, pois
tem relao direta com a fora motriz do processo. Porm, necessrio levar em
considerao que um grande volume de solvente na extrao dos solutos aumenta

35

consideravelmente os custos da purificao e recuperao do produto de interesse.


importante a agitao durante o processo, pois ela favorece a difuso dos solutos no
solvente. Alm disso, a extrao de enzimas e protenas deve ser realizada em valores
de temperatura e pH nos quais a estabilidade seja tima e, sua atividade biolgica seja
igualmente elevada, sem causar danos s biomolculas ou ao solvente ( FERNNDEZ
et al, 2012).
Uma vez obtido o extrato enzimtico bruto, pode-se seguir outras operaes
unitrias com o objetivo de recuperar, concentrar e purificar as biomolculas de
interesse.

2.10.1.2 Recuperao de protenas por precipitao

As protenas ou enzimas de interesse presentes no extrato fermentado bruto podem


ser precipitadas pela adio de sal, solventes ou polmeros orgnicos ou pela variao
do pH e temperatura da soluo (JANSON; RYDN, 1998). Os agentes precipitantes
mais comuns esto listados na Tabela 2.3.

Tabela 2.3- Agentes precipitantes


Agente
Tipo
Sulfato de amnio
Sal
Sulfato de sdio
Sal
Etanol
Solvente
Acetona
Solvente
Polietilenoglicol
Solvente
Fonte: Janson e Rydn, 1998

Propriedades
Facilmente solvel, estabilizante
Facilmente solvel, estabilizante
Inflamvel, risco de desnaturao
Inflamvel, risco de desnaturao
Carga neutra, inflamvel

A propriedade de um sal particular ser utilizado como agente precipitante descrito


pela chamada srie de Hofmeister, mostrada abaixo na Figura 2.6:

Figura 2.6- Srie de Hofmeister

(Fonte: Zhang, 2012)

36

A precipitao por sais um dos mtodos mais comum de precipitao de


protenas, utilizado tanto em escala de bancada quanto em escala industrial. A adio
de sal em uma soluo contendo protenas promove a precipitao destas devido a
uma reduo na solubilidade decorrente de um efeito salting-out (hidrofbico) ou
da combinao de um efeito salting-in (eletrosttico) com um efeito salting-out. O
efeito salting-in faz com que a solubilidade do soluto aumente com o aumento da
concentrao do sal. J o efeito salting-out provoca a reduo da solubilidade com
aumento da concentrao do sal (ARAKAWA et al., 2011).
A reduo da solubilidade das protenas ocorre porque os ons do sal competem
com a protena pelas molculas de gua, diminuindo a solubilidade da protena,
uma vez que a camada de hidratao parcialmente removida e as interaes
protena-protena se tornam relevantes, principalmente no que diz respeito interaes
hidrofbicas (KAUZMANN, 1959). Outra explicao pode ser dada em termos do
aumento da tenso superficial do lquido devido adio de sal, que aumenta a
energia livre necessria para a formao de uma cavidade no solvente, na qual a
molcula de protena estaria dissolvida (ARAKAWA; TIMASHEFF, 1984). No trabalho
de Zhang (2012) podem ser encontradas maiores informaes sobre a interao
protena-protena em solues salinas.
Dentre os sais utilizados para promover a precipitao de protenas, o sulfato de
amnio destaca-se por ser altamente solvel, forma solues de baixa densidade e
seus ons possuem posio favorvel na srie

de Hofmeister com

relao

efetividade de precipitao. Alm disso, o sal apresenta baixo custo, alta pureza,
impede a proliferao de bactrias na soluo e no apresenta efeitos desnaturantes
(DEUTSCHER, 1990).
Quando ocorre a precipitao de protenas por sais, formado um sistema bifsico
constitudo de uma fase lquida concentrada em eletrlito e uma fase composta
contendo a protena precipitada e uma grande quantidade de fase lquida salina, ou
sal ligado intrinsecamente protena. Isto constitui uma desvantagem, pois so
necessrios tratamentos subseqentes como dilise

ou diafiltrao

para

eliminao do sal presente no precipitado e o processamento da fase lquida para


sua reutilizao ou descarte. Esses tratamentos limitam em parte as aplicaes
do processo de precipitao por salting-out devido ao custo dos mesmos. Outra
tcnica para promover a precipitao de protenas a adio de solventes orgnicos,
como o etanol e a acetona (ARAKAWA et al., 2011). .

37

A adio de solventes orgnicos promove a precipitao de protenas devido


diminuio da atividade da gua na soluo, pois a gua substituda pelo solvente
orgnico. A adio do solvente provoca a diminuio da constante dieltrica da
soluo, intensificando as foras de atrao entre as cargas opostas das molculas de
protena, reduzindo o poder de solvatao destas molculas pela gua, uma vez
que h o deslocamento e imobilizao parcial das molculas de gua para a
hidratao do solvente orgnico (SHARMA; KANVAR, 2014).
Nesse processo, as variveis: concentrao do solvente orgnico, concentrao de
protena, pH, fora inica e temperatura so mantidas sob controle. imprescindvel
que as operaes de precipitao com solvente sejam feita baixa temperatura, para
evitar a desnaturao das protenas. Como a adio de um solvente orgnico diminui o
ponto de congelamento da soluo, podem ser utilizadas temperaturas inferiores a 0 C
(JANSON e RYDN, 1998).
A precipitao isoeltrica uma tcnica que explora o fato das protenas
apresentarem baixa solubilidade no seu ponto isoeltrico. Nesta tcnica, ajusta-se o pH
do meio at que este seja igual ao ponto isoeltrico (pI) da protena. Neste pH, a
carga lquida da molcula nula, e a repulso eletrosttica entre as molculas
mnima, prevalecendo as interaes hidrofbicas protena-protena. Em alguns casos,
podem ocorrem desnaturao e inativao da protena precipitada, o que torna
esse processo til na remoo de protenas indesejveis da soluo que contm a
protena-alvo, desde que nas condies de precipitao a protena alvo seja estvel
(NEHETE et al, 2013).
Alm do pH, outro parmetro que influencia a precipitao de protenas em
solues de sais a temperatura. Mantendo a concentrao de sal constante e
variando a temperatura possvel fracionar uma soluo contendo protenas.
(JANSON e RYDN, 1998).
Aps a precipitao por qualquer um dos mtodos apresentados, as protenas so
geralmente recuperadas por centrifugao e utilizadas nas etapas seguintes de
concentrao e purificao.

38

2.11 SISTEMAS AQUOSOS BIFSICOS


O Sistema Aquoso Bifsico (SAB) um mtodo de extrao lquido - lquido que
emprega duas fases aquosas. Os Sabs podem ser formados por gua e dois
polmeros, ou um polmero e um sal. Alm dessas substncias, nos ltimos anos foram
desenvolvidos Sabs formados por outras substncias, como lcoois e lquidos inicos.
No campo da biotecnologia tem sido utilizado na separao e purificao de materiais
biolgicos tais como protenas, enzimas, cidos nuclicos, vrus, anticorpos e
organelas celulares (AMID et al., 2012; RAJA et al.., 2011).
A Tabela 2.4 mostra algumas das aplicaes dos SABs citadas na Literatura
Tabela 2.4 Partio de biomolculas em SABs
Biomolcula

SAB

Autores

Recuperao (%)

Glutenina

PEG 1500/Li2SO4

Do Nascimento et al. 2010

84,9

Protena recombinante

PEG 8000/ Fosfato

Ibarra-Herrera et al. 2011

88

Ovalbumina

Peg4000/cido

Saravanan et al. 2008

87,4

poliacrlico
Bromelina

PEG 3000/MgSO4

Ketnava et al. 2009

108,45

Protease

PEG 8000/Fosfato

Mehrnoush et al., 2012

97,3

Invertase

PEG 300/Na2SO4

Yucekan et al. 2011

90

Papana

PEG 6000/(NH)2SO4

Nitsawang et al. 2006

89,9

Fitase

PEG 6000 + 8000/ Citrato

Bhavsar et al, 2012

96

Peroxidase

PEG 4000-IDA-

Da Silva et al, 2000

64

2+

Cu /Na2SO4
Lipase

2-Propanol/Fosfato

Ooi et al. 2009

99

Protease

2-Propanol/Fosfato

Amid et al, 2012

96,7

Glicirricina

Etanol/Fosfato

Tianwey et al, 2002

92

cido glico

Lquido inico/Na2SO4

Cludio et al. 2012

99

Ficocianina

[Bmim]Cland (LI)/

Zhang et al. 2015

90,23

KH2PO4

A separao espontnea, em fases distintas, devido adio de solues aquosas


de dois polmeros foi inicialmente observada pelo microbiologista holands Beijerinck,
em 1856, ao misturar gar com gelatina ou amido solvel. A fase inferior era rica em

39

gar e a superior em gelatina (ou amido). Em 1956, Albertsson constatou que sistemas
formados por polmeros solveis e solventes orgnicos tambm possibilitam a partio
de materiais biolgicos, ou seja, permitiam que uma terceira substncia introduzida no
sistema fosse coletada, preferencialmente, numa das fases por ajuste de parmetros
fsico-qumicos.
A maioria dos SABs aplicados na recuperao de enzimas so formados por dois
polmeros de cadeia flexvel, como os sistemas formados por PEG (polietileno glicol) e
dextrana ou so formados por um polmero, como PEG, e um sal inorgnico que pode
ser o sulfato de sdio, fosfato de potssio, sulfato de amnio, sulfato de magnsio,
carbonato de sdio entre outros. Atualmente, os sais orgnicos como os citratos,
tartaratos, succinatos tambm esto sendo usados na formao destes sistemas com
sucesso ( GOJA et al., 2013).
H ainda sistemas bifsicos alternativos, como os do tipo lcool-sal, que apresenta
algumas vantagens sobre os SABs convencionais, tais como elevada polaridade, baixa
viscosidade, e fcil recuperao do lcool por evaporao. Alm disso, a tcnica
barata e, dependendo do solvente utilizado, a toxicidade para o ambiente baixa
(TIANWEI, QING e QIANG, 2002; AMID et al., 2012). Porm tais sistemas podem ser
agressivos para enzimas que no toleram a presena de solventes. Recentemente,
SABs formados por lquidos inicos e sais tem se mostrado eficientes na recuperao
de vrias biomolcula (LIU et al., 2011).
O polietilenoglicol (HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH), um polister sinttico neutro,
disponvel em uma grande variedade de massas molares, de poucas centenas a
milhares de Daltons. Uma importante caracterstica do PEG, que em ambiente
aquoso ele exclui outros polmeros de sua vizinhana, no solubilizando-se com eles,
formando SABs do tipo polmero-polmero, como o sistema PEG-Dextrana. Por ser
biodegradvel e atxico, seu descarte no ambiente no oferece grandes riscos
(PORTO et al, 2007). O PEG foi aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration)
para vrias aplicaes farmacuticas, biolgicas e bioqumicas, pois no antignico
nem imunognico.
A partio de biomolculas em SABs apresenta muitas vantagens. Trata-se de uma
tcnica de separao seletiva simples, rpida e de fcil ampliao. Alm disso, por no
conter compostos orgnicos volteis e por apresentar mais de 70% de gua, garante
um ambiente ameno para as biomolculas (ALBERTSON, 1986).

40

A extrao em SABs inicia-se pela preparao do sistema e adio da mistura a ser


separada.

Aps

homogeneizao,

separao

das fases

realizada

por

sedimentao, gravidade ou por centrifugao. As fases so coletadas e utilizadas para


recuperar os produtos de interesse separados da mistura inicial (RAJA et al., 2011).
Rendimentos superiores a 90% podem ser obtidos em apenas um passo de
extrao. Porm, quando um passo no suficiente, possvel a realizao de
repetidas extraes que podem ser conduzidas em unidades de separao em cadeia
ou cascata (DORAN, 2005).
Quando um extrato fermentado bruto adicionado a um SAB, ocorre a distribuio
das biomolculas e fragmentos de clulas entre as fases (Figura 2.7). Sob condies
operacionais adequadas, a protena alvo ser concentrada em uma das fases e os
fragmentos de clulas e protenas no desejadas (contaminantes) migraro para a
outra fase (RAJA et al., 2011).

Figura 2.7- Extrao em batelada em SAB.

2.11.1 Diagrama de fases

A representao grfica utilizada para expressar as concentraes de um


sistema de fases geralmente feita atravs de diagramas retangulares

(Figura 2.8)

devido ao seu alto teor de gua e de grande importncia para os estudos de

41

separao de biomolculas, pois

so usados como ponto de partida para o

desenvolvimento de um processo de extrao.


A concentrao de um dos constituintes do sistema representada no eixo
horizontal e a outra no eixo vertical. A quantidade de gua (ou do terceiro componente)
calculada por diferena.
Figura 2.8 Diagrama de fases expresso em coordenadas retangulares.

A curva que divide a regio em duas fases (FS-PC-FI) denominada de curva


binodal ou curva de equlbrio. Os sistemas cuja composio fica abaixo da binodal
formam uma nica fase (regio monofsica), entretanto os que ficam acima desta
formam duas fases (regio bifsica). As linhas so chamadas tie-lines ou linha
de

amarrao

as

quais

so

retas

que ligam

pontos

no

diagrama

que

representam a composio das duas fases em equilbrio.


Qualquer ponto sobre essa mesma linha fornecer fases superiores e inferiores
com a mesma composio final, embora com diferentes relaes de volumes entre as
fases (SILVA e LOH, 2006). No diagrama de fases so mostrados trs sistemas com
composies globais diferentes P1, P2 e G, localizados em linhas de amarrao

42

diferentes. Outra particularidade mostrada neste diagrama o ponto crtico (Pc) onde
as propriedades fsicas e qumicas das duas fases so teoricamente iguais
(ALBERTSSON, 1986).
Dados de equilbrio so importantes para o planejamento da operao dos SABs,
pois eles informam as quantidades mnimas necessrias para a obteno de um
sistema bifsico a partir da mistura dos componentes. A Figura 2.9, por Exemplo,
mostra as curvas bimodais para sistemas formados por diferentes massas molares de
PEG e citrato de sdio.

Figura 2.9: Curvas Binodal de sistemas PEG/Citrato obtidos usando diferentes


valores de PEG e Tampo Citrato de pH 6,0

(Fonte: Porto et al., 2007)

43

2.11.2 Partio de enzimas em sistemas aquosos bifsicos

O particionamento de biomolculas entre as fases depende principalmente das


relaes de equilbrio do sistema. O coeficiente de partio definido como (Equao
2.1):

[Ct ]
[Cb]

(2.1)

Onde [Ct] e [Cb] so as concentraes do soluto na fase superior e inferior


respectivamente. O coeficiente de distribuio K depende de uma srie de variveis
experimentais: pH, temperatura, presena de sais, peso molecular e concentrao do
polmero, hidrofobicidade e tamanho da protena, entre outras. Mediante o controle
dessas variveis, possvel fazer com que uma protena contida em uma mistura
complexa seja transferida para uma das fases, mantendo as protenas no desejadas
na fase oposta (GMEZ et al., 2006).
Alm disso, h ainda a possibilidade de se conduzir processos biotecnolgicos em
SABs, no qual as biomolculas de interesse podem ser particionadas na medida em
que so produzidas. A Figura 2.8, por exemplo, ilustra um processo de bioconverso
de lignocelulose pr-tratada em etanol, utilizando SABs. A etapa de hidrlise emprega
uma fase inferior rica em celulases (TJERNELD, PERSSON e ALBERTSSON, 1985).

Figura 2.10- Esquema de um processo de bioconverso de lignocelulose em


etanol.

(Fonte: Adaptado de Tjerneld, Persson e Albertsson, 1985)

44

A partio de biomolculas em SABs depende de muitas variveis, tais como o tipo


e concentrao de polmero e sal, as propriedades de superfcie das partculas, o pH e
a temperatura (RATANAPONGLEKA, 2010; GOJA et al, 2013)).
Em geral, o aumento da massa molar e na concentrao de um polmero diminui a
tendncia de partio da protena para a fase rica nesse polmero (DA SILVA E LOH,
2006). Tal fenmeno ocorre porque, com o aumento na massa molar do polmero,
tambm aumentam o comprimento da cadeia do polmero e o efeito de excluso, que
levam a reduo no volume livre. Dessa forma, a partio das biomolculas para a fase
superior dificultada, pois o polmero adquire uma conformao mais compacta, com
ligaes intramoleculares hidrofbicas (MOHAMADE e OMIDINIA, 2007).
Em relao concentrao do polmero, seu aumento tambm aumenta as
diferenas de densidade, ndice de refrao e viscosidade entre as fases, modificando
o valor do coeficiente de partio (RAJA et al., 2011). A viscosidade uma
caracterstica importante, pois funo da concentrao e da massa molar do
polmero.

Um

valor

elevado

de

viscosidade

pode

impactar

no

processo

(RATANAPONGLEKA, 2010). Quanto fase rica em sal, o aumento da concentrao


favorecer o efeito denominado salting-out, ou efeito salino, que fora a biomolcula a
mover-se para a fase superior, rica em polmero (GOJA et al.,2013).
O pH tambm afeta a partio de enzimas em SABs. Na superfcie das enzimas
existem grupos cidos e bsicos com diferentes valores de pKa, originando cargas
eltricas que so funes do pH. A densidade de carga eltrica na superfcie da
protena modifica sua conformao, alterando o coeficiente de partio da enzima (DA
SILVA E LOH, 2006). Se o pH for maior que o pI (ponto isoeltrico) da enzima, a carga
lquida da protena ser negativa. Se o pH for menor que o pI a carga ser positiva, e
se o pH for igual ao pI a carga ser neutra. Quando o pH se eleva, as enzimas ficam
negativamente carregadas, e interagem com as molculas de PEG, aumentando a
partio e recuperao na fase superior dos SABs. (RAJA et al., 2011).

2.12 FATOR DE RECUPERAO E PURIFICAO DE PROTENAS


A avaliao do desempenho ou rendimento de qualquer mtodo de purificao de
protenas baseada em dois parmetros: a recuperao e o fator de purificao da
protena ou atividade enzimtica. Esses valores so obtidos em relao soluo
inicial, relacionando-se a concentrao do material purificado com a concentrao do

45

material inicial, ou quaisquer etapas dentro do bioprocesso, tendo sempre uma etapa
anterior como referncia.
A recuperao da atividade (RA) uma relao entre a atividade total no material
purificado e a atividade total presente no material bruto (em porcentagem), dada pela
Equao 2.2. O fator de purificao (FP) um parmetro que permite comparar a
atividade enzimtica especfica total no material purificado com a atividade enzimtica
especfica total no material bruto, dado pela Equao 2.3 (BIAZUS et al., 2010).

Atividade enzimtica recuperada


Atividade enzimtica inicial

FP

(2.2)

Atividade enzimtica especfica recuperada


Atividade enzimtica especfica inicial

(2.3)

2.13 ESTADO DA ARTE

Nesta seo, sero apresentados resultados presentes na literatura sobre o


aproveitamento da palma forrageira e os avanos na rea de produo de bioetanol a
partir de materiais lignocelulsicos.
Silva et al. (2011) fizeram a caracterizao fsico qumica e bioqumica do farelo da
palma forrageira redonda (Opuntia ficus), destinado a alimentao de ruminantes. Os
resultados mostraram que a palma apresentava 10,1% de matria seca (portanto
89%de umidade), a qual era composta por 15,68% de matria mineral, 5,1% de
protena bruta, 0,96% de extrato etreo, 28,56% de fibra em detergente neutro, 22,02%
de fibra em detergente cido e 49,7% da carboidratos no fibrosos. Os resultados
obtidos revelaram que a palma forrageira redonda (Opuntia fcus)
carboidratos

no

fibrosos,

importante

fonte

de

rica

em

energia. Porm, observaram

reduzidos teores de matria seca e protena bruta. Os fenlicos totais e os taninos


condensados encontrados foram respectivamente de 168 e 119, 71 mg/100g; valores
seguros para a alimentao de ruminantes.
Santos et al. (2011) fizeram a caracterizao fsico-qumica da palma forrageira,
encontrando os seguinte valores: slidos solveis totais 2,96; umidade, 93,96%; pH,
4,45; fibra, 0,47%; protena, 0,29%; acidez, 0,37 mg/L; cinzas insolveis, 0,07%; cinzas

46

solveis, 1,39%; e cinzas totais, 1,46%. Este resultado mostra que a palma, por seu
alto teor de gua, uma boa alternativa para alimentao animal durante a seca, mas
por seu baixo teor protico, de fibras e cinzas no garante a nutrio animal. Porm
adequada para a propagao de fungos e leveduras.
Baracho, Silva e Torres Neto (2009) estudaram o processo de pr-hidrlise cida,
utilizando a raquete

da

palma

forrageira como matria-prima lignocelulsica. As

variveis controladas foram: temperatura, concentrao do cido e razo entre massa


seca e volume de cido, o tempo foi fixado em uma hora. Os autores determinaram
que a melhor razo seria de 1/8; em temperatura de 121 C e concentrao de cido
de 8%. Nessas condies, houve um aumento das pentoses acima de 10500%.
Torres Neto (2010) realizou um estudo de pr-hidrlise cida da palma forrageira
para obteno de um licor pr-hidrolisado rico em pentoses, diminuindo, assim, suas
concentraes na matria-prima. Foi verificada

influncia

das

variveis

temperatura, concentrao de cido e razo matria seca/cido sobre as respostas


soma de pentoses e percentual de aumento de pentoses e, em seguida, foi realizada
uma hidrlise preliminar acompanhada de uma fermentao. Os resultados mostraram
que, operando-se

com

razo

abaixo

de

1/10,

para

quaisquer

valores

de

temperatura e concentrao de cido, obtm-se soma e percentual de aumento de


pentoses acima de 8 g/L e 8000%, respectivamente. Porm, na etapa de fermentao
no foi observada a produo de lcool etlico. Segundo o autor, isto provavelmente
aconteceu pela formao de inibidores durante o processo de hidrlise.
Arajo et al. (2005) estudaram o equilbrio higroscpico da palma forrageira, com o
objetivo de determinar a umidade tima para fermentao slida. Os autores
pretendiam promover o enriquecimento protico da palma forrageira com o cultivo
semisslido de Saccharomyces cerevisiae. O estudo das isotermas de dessoro
mostrou que no processo de fermentao para enriquecer a cactcea, a umidade da
palma forrageira deve estar acima de 90%, o que corresponde atividade de gua
acima de 0,9.
Santos et al. (2011), avaliaram o efeito da fermentao e do teor de gua sobre a
atividade cintica de celulases produzidas atravs da espcie fngica Rhizopus sp,
tendo a palma como nico meio de cultivo. A mxima atividade enzimtica para
CMCase (endoglucanase), foi de 5,7 U/mL a 0,949 de atividade de gua em 96 h, e
para FPase (endoglucanse + exoglucanase) foi de 8,7 U/mL a 0,993 de atividade de
gua em 72 h. Ambas as enzimas foram sintetizadas pelo fungo sem a necessidade de

47

qualquer indutor ou suprimento alm da celulose presente no resduo e gua em


diferentes concentraes.
Santos et al. (2012), utilizaram a palma forrageira como substrato para a produo
de enzimas celulolticas, por meio de fermentao em estado slido, utilizando o
fungo

filamentoso Aspergillus

niger como agente fermentativo. A

palma

foi

desidratada at atingir aproximadamente 2% de umidade. As variveis estudadas


no processo fermentativo foram, a atividade de gua (0,827, 0,892, 0,949, 0,988,
0,993) e o tempo de fermentao (24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h). Os pesquisadores
verificaram crescente produo enzimtica nos trs primeiros dias de fermentao,
independente da atividade de gua. Aps esse perodo, a produo enzimtica
comeou a decrescer em todos os ensaios. Os maiores valores de produo

da

CMCase (7,47 U/mL) ocorreram em 72,38 h e 0,949 de atividade de gua e,


para a FPase, (9,42 U/mL). O tempo de fermentao foi de 74,64 horas e
atividade de gua de 0,986.
Carvalho et al. (2012) realizaram estudos
lignocelulsicas

por

fermentao

da

palma

para

doce

produo

de

enzimas

(Nopalea cochenillifera) em

estado slido atravs do fungo filamentoso Aspergillus niger. A umidade usada foi
de 85% m/m o que equivale a uma atividade de gua aproximada de 0,985. Os
cultivos foram conduzidos em estufa. Foram obtidas atividade de CMCase de 4,66
U/mL e FPase de 7,03U/mL, alm de Xilanase,

Lacase,

Peroxidase

Mn

Peroxidase. O fungo foi capaz de produzir as enzimas sem a necessidade de qualquer


outro indutor alm da palma doce e gua, demonstrando a viabilidade de
utilizao da palma doce como matria-prima para o bioprocesso.
Santana et al. (2012) obtiveram amiloglucosidases por fermentao semisslida
utilizando a palma forrageira como substrato e o microorganismo empregado foi o
Aspergillus niger. A maior atividade enzimtica obtida foi de 60,32 U/g em 72 horas,
com atividade de gua de 0,891. Durante o processo de fermentao, o fungo
sintetizou e excretou esta enzima sem a necessidade de adio de indutores,
demonstrando a viabilidade da palma, como matria-prima para bioprocessos.
Santos et al. (2013) analisaram e quantificaram a atividade das enzimas
endoglucanase (CMCase) e celulases totais (FPase), produzidas por fermentao em
estado slido dos resduos do processamento do cacau, manga e seriguela,
usando o Aspergillus niger como inoculante. Os pesquisadores estudaram o efeito de
teor de umidade (40%, 50% e 60%) e tempo de fermentao (24, 48, 72, 96 e 120

48

horas) na produo das enzimas. A fermentao foi realizada a 30 oC em estufa


bacteriolgica refrigerada. Os pesquisadores comprovaram a eficcia dos resduos
estudados na produo de celulases por fermentao semisslida, destacando-se o
resduo de manga na produo de endoglucanase, atingindo a atividade de 9,32
U/mL, e na produo de celulases totais, o resduo de seriguela, com atividade
enzimtica de 11,62 U/mL.
Amorim (2010) estudou a produo de celulase por fermentao semisslida do
resduo de caju utilizando o microorganismo Trichoderma sp. Foi testado o bagao
integral e o bagao lavado, com reduzido teor de acares. A maior

atividade

enzimtica obtida para o bagao lavado foi de 1,173 U/g em 42 horas de


fermentao quando utilizou 45% de umidade inicial e 1,00% de adio de fonte
de nitrognio e para o bagao sem lavar, a maior atividade enzimtica foi de
1,896 U/g em 18 horas de fermentao quando utilizou 55% de umidade inicial e
0,75% de adio de fonte de nitrognio. A produtividade atingiu maiores valores
com 55% de umidade inicial e 0,75% de adio de fonte de nitrognio tanto
para o bagao lavado como para o bagao sem lavar, com valores de 0,064 U/g.h e
0,105 U/g.h, respectivamente.
Lins (2012) tambm estudando a produo de celulases pela fermentao
semisslida de resduo de caju, mas utilizando o fungo Trichoderma reesei LCB 48,
obteve pico de produo de enzima celulase expressa em CMCase com o valor de
0,71 U/g (0,095 U/mL), nas condies de 45% de umidade inicial e 1% de fonte de
nitrognio durante 238 horas de cultivo. Foi observado que a umidade inicial do
substrato uma varivel determinante na produo das enzimas CMCases, e
que o nvel mnimo de umidade (45%) proporcionou os maiores valores de produo de
CMCase.
Raghuwanshi et al. (2014) estudaram a produo de celulase produzida por um
mutante de Trichoderma asperellum e sua aplicao na hidrlise de celulose. A
produo de FPase, CMCase e -glicosidase foi otimizada em fermentao em estado
slido. No foi observada inibio da produo de celulase com at 20 mM de glicose.
A estirpe mutante produziu FPase (2,2 UI/gds), CMCase (13,2 UI/gds), e -glicosidase
(9,2 UI/gds) sob condies otimizadas, respectivamente; 1,4, 1,3, 1,5 vezes maior do
que o tipo selvagem. O selvagem, bem como estirpe mutante produziram as celulases
na faixa de pH de 4,0-10,0. A sacarificao de sabugo de milho pr-tratado, palha de
trigo e bagao de cana pela celulase da estirpe mutante SR1-7 resultou na libertao

49

de acares redutores a uma taxa de 530,0 mg/g, 290,0 mg/g, e 335,0 mg/g de
substrato, respectivamente, sendo 1,6 vezes mais elevada do que a estirpe do tipo
selvagem.
Silva e Swarnakar (2010) extraram celulases presentes no caju in natura e
demonstraram que tais enzimas promoviam a hidrlise da palma forrageira, produzindo
uma pequena quantidade de glicose.
Lever, Ho e Cord-Ruwish (2010), pesquisaram a produo de celulase "in loco" via
fermentao em estado slido de palha de trigo, utilizando o Trichoderma reesei como
agente da fermentao, como alternativa s preparaes comerciais de celulase. O
extrato bruto foi aplicado na obteno de etanol a partir da palha do trigo, em um
processo de sacarificao simultnea e fermentao com Saccharomyces cerevisiae.
Apesar do baixo rendimento em atividade enzimtica (0.751.2 FPU/gds ou FPU por
grama de substrato seco) foi possvel converter 5% do material lignocelulsico em
etanol, o que levou os pesquisadores a concluir ser possvel a aplicao de extrato
bruto produzido "in loco" ao invs de preparaes comerciais para obteno de etanol
a partir de substratos lignocelulsicos.
Delabona et al. (2012) avaliaram a eficincia do complexo celuloltico de uma cepa
de Trichoderma harzianum, isolado na floresta amaznica, na hidrlise do bagao de
cana-de- acar pr-tratado . Por meio do cultivo em frasco agitado, com diferentes
fontes de carbono, foram obtidas hidrolases glicosil ( FPase , xilanase , e glucosidase). Fontes de carbono selecionados foram , em seguida, mais estudada sob
diferentes condies de pH , utilizando um biorreator de tanque agitado . Foram obtidas
atividades enzimticas de at 121 FPU/g , 8000 UI/g , e 1730 UI/g para celulase ,
xilanase e -glicosidase , quando utilizaram bagao deslignificado com exploso a
vapor. Este complexo enzimtico foi utilizado para hidrolisar bagao de cana-deacar pr-tratado . Uma avaliao comparativa , utilizando um extrato enzimtico de
Trichoderma reesei RUTC30 , mostrou desempenho semelhante ao do complexo do T.
harzianum, sendo este um candidato potencial para a produo de enzimas no local (in
loco).
Shahsavarani et al. (2013) avaliaram a capacidade de Saccharomyces cerevisiae
diplide TJ 14, tolerante a temperatura, para a produo de bioetanol celulsico por
tecnologia de sacarificao semi-simultnea e fermentao. Sob condies de alta
temperatura (39C), o T J14 produziu 45 g/L de etanol a partir de um substrato

50

composto de 100 g (w/v)/L de celulose. Este valor foi superior aos anteriormente
relatados pela literatura.
Akcapinar, Gul e Sezerman (2012) estudaram

estabilidade da enzima

endoglucanase (EGI) produzida por Trichoderma reesei. A enzima apresentou


atividade mxima em temperatura de 50-55C e pH em torno de 5,0. A 50C, as
enzimas mantiveram mais de 65% da atividade inicial em 72 horas de incubao.
Mawadza et al. (2000) purificaram e caracterizaram as celulases produzidas por
duas estirpes de Bacillus (CH43 e HR68). As celulases tiveram atividade tima na faixa
de pH 5 - 6,5 e temperatura tima entre 65 e 70 C para a endoglucanase de CH43 e
HR68, respectivamente.
Tjerneld; Persson e Albertsson (1985) demonstraram a aplicabilidade de SABs
formados por PEG e Dextrana na partio de celulases de Trichoderma reesei, com o
objetivo de desenvolver um processo contnuo para bioconverso extrativa de celulose.
Os SABs compostos por PEG (MM 40000) e Dextrana (MM 40) foram os que
demonstraram maior rendimento. Os coeficientes de partio (K) para as enzimas
endo--glucanase e -glucosidase foram respectivamente de 0,02 e 0,005 na
temperatura de 20C.
Antov et al. (2012) estudaram o particionamento do complexo celuloltico de
Penicillium sp em SABs formados por PEG e Dextrana. O SAB formado por 10% (w /
w) de polietilenoglicol 1500 ; 5% (w/w) de dextrana 500,000 e 80% (w/w) de extrato
bruto a um pH igual a 5 resultou em uma recuperao de 100% da atividade celuloltica
na fase superior, num nico passo de extrao.
Gautam e Simon (2006) avaliaram a influncia do pH e da temperatura sobre o
coeficiente de partio da -glucosidase e protena total para determinar as melhores
condies para a purificao da enzima no SAB formado por PEG 4000 (8% m/m) e
fosfato de potssio (13% m/m). O coeficiente de partio aumentou com o pH e
temperatura durante os intervalos investigados (pH: 6,0 - 7,5; temperatura: 25-55 C).
A maior seletividade foi alcanada com pH de 6,5 temperatura de 25C. Um rendimento
de -glucosidase maior do que 92% foi obtido na fase inferior para valores de pH
inferior a 7,0 e temperaturas abaixo de 35C.
Hemavathi e Raghavarao (2011) utilizaram SABs formados por PEG e sulfato de
amnio para recuperar e purificar -galactosidase e -glucosidase a partir de cevada
(Hordeum vulgare). Foram estudados a influncia dos parmetros: massa molar do
PEG, concentrao de PEG e Sal, pH, adio de sais neutros, razo entre as fases e

51

comprimento da linha de amarrao. As enzimas -galactosidase e -glucosidase


foram seletivamente particionadas para as fases superior e inferior, respectivamente.
As condies adequadas para a purificao foram encontrados para SABs contendo
14% (m/m) de PEG1500 e 13% (m/m) de sulfato de amnio. Uma nica etapa resultou
em uma recuperao de -galactosidase de 98,26%, com fator de purificao de 2,1; e
para -Glicosidase, verificou-se uma recuperao de 92,58%, com fator purificao de
3,3 vezes.
Herculano et al. (2012) estudaram a recuperao e purificao de celulases do
complexo celuloltico do Aspergillus japonicus URM5620 em SABs formados por PEG e
citrato de sdio. Foram avaliados a influncia da massa molar e concentrao do PEG,
da concentrao de citrato de sdio e do pH. Foram analisadas as atividades de glicosidase (G), endoglucanase (CMCase) e celulase total de (FPase). As enzimas
no se comportaram da mesma maneira, a G concentrou-se na fase inferior, e
maiores valores de CMCase e FPase foram detectados na fase superior. Cada enzima
teve sua melhor recuperao e concentrao em diferentes valores de pH, composio
e massa molar, mostrando que possvel a separao e recuperao das enzimas do
complexo celuloltico mediante simples ajuste dos parmetros estudados.
Dustet et al. (2001) obtiveram celulases a partir da fermentao semisslida do
bagao de cana em biorreator, utilizando o fungo Aspergillus niger como agente da
fermentao. Em 48 horas de cultivo foram obtidas atividades CMCase e FPase de 12
e 3 UI/gds respectivamente. Na recuperao, os autores utilizaram SABs formados por
PEG 600 e sulfato de amnio. O SAB formado por 1,5 M de sulfato de amnio em PEG
puro apresentou o melhor rendimento, com fator de purificao de 7,6 para a CMCase
e 7,82 para FPase. A enzima concentrou-se na fase superior, porm com recuperao
de 54 e 56% respectivamente.

52

3 MATERIAL E MTODO
Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Engenharia Bioqumica da
Unidade Acadmica de Engenharia Qumica da Universidade Federal de Campina
Grande (LEB/UFCG).
Inicialmente, foi realizado um estudo para determinar as condies mais
apropriadas para a fermentao semisslida da palma forrageira (Opuntia fcus indica
Mill), utilizando como agente biolgico o fungo Trichoderma reesei LCB48, com o
objetivo de obter extratos brutos com mxima atividade celuloltica. Uma vez
determinadas as melhores condies de produo e recuperao das enzimas do meio
fermentado slido, foi realizado um estudo de concentrao e purificao parcial das
enzimas presentes no extrato utilizando sistema aquoso bifsico formado por PEG e
citrato de sdio. As celulases obtidas foram caracterizadas quanto estabilidade, pH e
temperatura tima de ativao.
Tanto o extrato obtido na fermentao semisslida quanto o recuperado por meio
dos SABs foi aplicado na hidrlise enzimtica da biomassa pr-tratada da palma
forrageira, para avaliar a potencialidade deste recurso no desenvolvimento de um
processo de produo "in loco" de bioetanol; no qual a produo da biomassa, das
enzimas e do biocombustvel poderiam concentrar em uma biorrefinaria instalada no
semi-rido.

3.1 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O fluxograma da Figura 3.1 mostra as principais etapas desta pesquisa. O


procedimento ser descrito detalhadamente nos tpicos a seguir.
Figura 3.1 Etapas do projeto de pesquisa desenvolvidas neste trabalho.

Obteno e caracterizao
da biomassa da palma

Estudo da purificao das


celulases produzidas por
meio de SABs

Estudo dos parmetros


da fermentao
semisslida

Teste de aplicao das


enzimas na hidrlise da
biomassa

Estudo de recuperao
das enzimas por extrao
slido-lquido

Caracterizao das
enzimas obtidas quanto
estabilidade

53

3.1.1 Matria - prima

A palma forrageira (Opuntia fcus - indica Mill) foi adquirida no municpio de Tabira,
PE, coletada em um perodo de estiagem (Janeiro/2013). A Figura 3.2 exibe as etapas
da obteno da biomassa

Figura 3.2 Etapas do processo de obteno da biomassa

Inicialmente, claddios e partes do caule da planta, com boas condies


fitossanitrias, foram lavados com gua proveniente do abastecimento pblico para
remoo das impurezas.

Em seguida o material limpo foi cortado, triturado em

liquidificador industrial, e posto para secar em estufa com circulao e renovao de ar


(65 oC) em bandejas perfuradas at peso constante. Esse valor de temperatura foi
escolhido porque em ensaios preliminares constatou-se que parte do material
fermentava dentro do equipamento durante a secagem quando temperaturas inferiores
a esta foram utilizadas. Uma parte do material triturado proveniente dos claddios e
do caule foi lavada com gua corrente em abundncia antes da operao de secagem,
com o auxlio de uma peneira, para remoo de acares e outros materiais solveis

54

presentes no interior dos claddios antes da operao de secagem. Esta operao foi
realizada com o

objetivo

de

testar

influncia

deste

pr -tratamento

na

fermentao semisslida. Aps a secagem, o material seco foi modo em moinho


de

facas, obtendo -se assim, a biomassa utilizada como substrato no processo

fermentativo.
Aps a secagem, o material seco foi modo em moinho de facas, obtendo-se assim,
a biomassa utilizada como substrato no processo fermentativo.

3.2 CARACTERIZAO DA BIOMASSA

Na caracterizao da biomassa foram avaliados os seguintes parmetros fsicoqumicos: granulometria, densidade, massa especfica, porosidade, pH, cinzas,
umidade, slidos solveis totais (Brix), acares redutores totais (ART) e acares
redutores (AR). As anlises foram feitas em triplicata.

3.2.1 Granulometria

A determinao da distribuio granulomtrica foi realizada com um conjunto de


peneiras Produteste , com malhas de 14, 20, 24, 35, 42, 65 e 115 mesh. Aps a adio
de 100 g da biomassa na peneira superior, o conjunto de peneiras foi agitado por 20
minutos na freqncia 80% do agitador. O material retido em cada peneira teve sua
massa determinada. Os resultados foram expressos como fraes ponderais do
material retido em cada peneira.

3.2.2 Massa especifica aparente

A massa especfica aparente do material foi determinada por meio da adio de 30


g da biomassa em uma proveta de 100 mL, na qual foi lido o volume ocupado pela
amostra. A biomassa foi adicionado suavemente, para evitar compactao. Utilizando a
Equao 3.1 foi possvel calcular a massa especfica aparente (A):

m
V

( g.cm )

(3.1)

55

3.2.3 Massa especfica real


A massa especfica real da biomassa seca (R) foi determinada a partir da relao
entre a massa (m) e o volume da amostra, determinado pelo deslocamento de leo de
soja em uma proveta graduada. Inicialmente, o leo foi colocado na proveta e seu
volume foi lido e anotado (V1). A seguir, foram colocados na proveta com leo 30 g da
biomassa. Aps a deposio total da biomassa na proveta, fez-se a leitura do novo
volume indicado pelo nvel do leo (V2). O volume da biomassa foi obtido pelo volume
de leo deslocado (V2 V1).
A massa especfica real foi calculada pela Equao 3.2:

m
(V2 V1 )

( g.cm 3 )

(3.2)

3.2.4 Porosidade
A porosidade () foi calculada a partir de uma relao entre a massa especfica
aparente e a massa especfica (KEEY, 1991), conforme a Equao 3.3.

A
R

(3.3 )

3.2.5 pH

A determinao do pH foi realizada segundo a metodologia do Instituto Adolfo Lutz


(BRASIL, 2005), utilizando-se um pHmetro. Foi adicionado 1 g da biomassa a 20 mL de
gua destilada. Aps agitao magntica por 20 minutos, a mistura foi filtrada em
algodo. O filtrado foi recolhido para leitura.

3.2.6 Cinzas

O teor de cinzas foi determinado por calcinao em mufla a 550 C (BRASIL, 2005).
Inicialmente, cadinhos de porcelana previamente dessecados e tarados receberam 2 g
de amostra. Aps incinerao da biomassa em bico de Bunsen, os cadinhos foram

56

mantidos na mufla at peso constante. Os cadinhos foram ento resfriados e pesados.


Os resultados foram expressos em porcentagem mssica (m/m).

3.2.7 Umidade

A umidade da biomassa, em base seca, foi determinada pela diferena entre a


massa da amostra mida e aps secagem em estufa a 105 C (BRASIL, 2005). Pesouse 5 g da amostra em recipientes previamente tarados, os quais permaneceram na
estufa at massa constante, sendo em seguida resfriados e pesados. O resultado foi
expresso em porcentagem (m/m).

3.2.8 Slidos solveis totais (Brix)


A leitura do oBrix foi realizada diretamente em refratmetro de Abbe, segundo o
procedimento descrito pelas normas analticas do Instituto Adolfo Lutz (BRASIL, 2005).
Aps adio de 1 g da amostra a 20 mL de gua destilada, a mistura foi
homogeneizada e deixada em repouso por 30 minutos. Aps filtrao em algodo, o
filtrado foi levado ao refratmetro para a leitura do 0Brix. O valor obtido foi multiplicado
pelo fator de diluio.

3.2.9 Aucares redutores (AR) e Acares redutores totais (ART)

Os grupos redutores foram quantificados com base no procedimento descrito por


Miller (1959), que consiste na reduo do cido 3,5 dinitrosaliclico a 3-amino-5nitrosaliclico (DNS), com a oxidao simultnea do grupo aldedo do acar a grupo
carboxlico.
Em 100mL de gua destilada, foi acrescentado 1 g da biomassa, a qual ficou sob
agitao por 30 minutos. Aps filtrao com algodo, transferiu-se 1 mL do filtrado
obtido para um tubo de ensaio contendo 1 mL de soluo DNS. Os tubos contendo as
rplicas do experimento e o branco, que era formado por 1 mL de DNS e 1mL de gua
destilada, ficaram em banho de gua fervente por exatos 5 minutos. Em seguida, os
tubos foram retirados do banho e resfriados temperatura ambiente. Aps resfriarem,
foram adicionados 8 mL de gua destilada a cada tubo, e aps homogeneizao, foi
feito a leitura da absorbncia das amostras em espectrofotmetro a 540 nm.

57

A determinao de ART foi realizada conforme o mtodo de Somogy-Nelson


(DEMIATE et al., 2002). Aps a diluio da amostra, fez-se a hidrlise cida com a
adio de cido clordrico (HCl) 2 mol/L, seguida de aquecimento por 5 minutos em
banho de gua fervente. Aps resfriamento, a soluo foi neutralizada com hidrxido
de sdio (NaOH) a 1 mol/L. Depois, seguiu-se a mesma metodologia utilizada para a
determinao de acares redutores, com a transferncia de 1 mL da soluo para
tubos contendo 1 mL de DNS, aquecimento, adio de gua destilada e leitura .
Os resultados foram expressos em gramas de acares redutores totais ou
acares redutores por 100 g de amostra inicial (g acares/100 g amostra).

3.2.10 Determinao da concentrao de celulose

A determinao do teor de celulose foi feita apenas com a biomassa da palma


forrageira, para verificar a possibilidade da utilizao da biomassa da palma em um
processo de hidrlise enzimtica para produo de aucares redutores. O teor de
celulose contido na biomassa da palma forrageira foi determinado por meio do mtodo
empregado por Xu et al. (2006), o qual consistiu no isolamento da celulase por meio de
uma mistura de cido actico a 80% com cido ntrico a 70% na proporo de 10:1
(v/v). A amostra foi incubada a 120C sob agitao.

Em seguida foi adicionado

hidrxido de sdio para precipitao da celulose. O precipitado foi separado e


determinado gravimetricamente como celulose total.

3.3 O PROCESSO FERMENTATIVO

A o Fluxograma da Figura 3.3 mostra as etapas do processo fermentativo.

58

Figura 3.3 Etapas do estudo do processo fermentativo processo fermentativo da


biomassa da palma forrageira

As etapas do estudo da fermentao esto detalhadas nos tpicos seguintes.

3.3.1 Microrganismo e inculo

O fungo Trichoderma reesei LCB 48 foi fornecido pela Embrapa Semirido


(Petrolina PE). O fungo estava contido em blocos de gar de 4-6 mm no interior de
tubos tipo eppendorf, preenchidos com gua destilada e estocados a temperatura de
8C.
A repicagem do fungo foi realizado em duas etapas. A primeira etapa consistiu na
incubao dos esporos contidos no tubo eppendorf em placas de Petri contendo meio
bsico estril (autoclavado 121 0C por 15 minutos). A composio do meio de cultura
mostrada na Tabela 3.1.

59

Tabela 3.1 - Composio bsica do meio de cultura.

Fonte: Couri e Farias (1995)

Aps inoculao, as placas de Petri foram transferidas para estufa a temperatura de


o

28 C. O tempo de incubao foi de 10 dias.


Do repique obtido nas placas de Petri, foi realizado um segundo repique utilizando
arroz como meio de cultivo (CHVEZ-GARCIA et al., 2008); conforme protocolo da
EMBRAPA/CPATSA. Cerca de 300 g de arroz branco foram imersos em gua destilada
durante 30 minutos. Em seguida, o arroz mido foi recolhido com o auxlio de uma
peneira. Desse arroz, foram transferidos 15g para Erlenmeyer de 250 mL, os quais
foram autoclavados a 121 C por 15 minutos.
Em cada placa de Petri do primeiro repique, adicionou-se cerca de 8 mL de
Tween 80 0,3%. Com o auxlio de uma ala de platina, os esporos contidos no
meio de cultivo foram desprendidos, formando uma suspenso
seguida, transferiu-se
contendo o material

homognea. Em

1mL da suspenso de esporos para cada Erlenmeyer


esterilizado. Os

Erlenmeyers foram incubados a 28 oC por

perodo de 13 dias.
Para o preparo do inculo, adicionou-se 40 mL de uma soluo de Tween 80 a
0,3% (v/v) nos Erlenmeyers contendo o arroz com esporos. Aps, agitao, os
esporos foram transferidos para bquer estril com auxlio de gaze e algodo. A
concentrao de esporos foi determinada por meio de contagem em Cmara de
Neubauer espelhada. De posse da concentrao, foi calculado o volume da suspenso
que deveria ser transferido para Erlenmeyers contendo a biomassa da palma j
hidratado, de forma que foram inoculados 107 esporos para cada grama de substrato.

60

3.3.2 Restabelecimento da umidade da biomassa

A hidratao da biomassa estocada foi calculada realizando-se um balano de


massa, segundo a Equao (3.4). Admitindo-se que a gua tinha massa especfica
(H2O) de 1g/mL na temperatura em que o experimento foi realizado, a massa de gua
foi convertida em volume de gua.

V H 2O

m H 2O

H O
2

m RES

(U 2 U 1 )
(1 U 2 ) H 2O

(3.4)

Onde:
VH 2O

= Volume de gua a ser adicionado

mH 2O = Massa de gua requerida para hidratao do meio

mRES = Massa de resduo seco tomado para fermentao

U1 = Umidade presente na biomassa seca


U2 = Umidade requerida pelo processo fermentativo
Obs.: U1 e U2 expressos em valores decimais
Ao volume de gua medido para a hidratao, foi adicionado uma massa de sulfato
de amnio correspondente a 1% da massa do meio a ser preparado para fermentao
(SANTIAGO et al., 2014). A soluo foi adicionada massa de resduo, a qual foi
homogeneizada e deixada em repouso por 30 minutos.

3.3.3 Substrato e cultivo semisslido

O substrato do processo fermentativo teve a raquete da palma como matria-prima.


Foram estudados segundo um planejamento fatorial 2 2 a influncia da hidratao, ou
seja, umidade em base mida (UBU) e da adio de sulfato de amnio (N). A Tabela 3.2
mostra os nveis do planejamento experimental. A Tabela 3.3 mostra a matriz do
planejamento experimental fatorial 22 com trs repeties no ponto central. Os nveis
foram escolhidos com base na literatura consultada (SANTOS et al., 2012; Santiago et
al., 2014). A atividade monitorada foi a CMCase, expressa em unidades de atividade
por grama de substrato seco, U/gds (Units per gram of dry fermented substrate) e
determinada conforme item 3.3.5.

61

Tabela 3.2- Nveis do planejamento experimental.


Varivel

(-1)

(0)

(+1)

UBU (%)

45

67,5

90

N (%)

0,5

1,0

Tabela 3.3- Matriz do planejamento experimental fatorial 2 2 com trs repeties no


ponto central.
Ensaio

UBU (%)

N (%)

-1

-1

+1

-1

-1

+1

+1

+1

Os ensaios foram conduzidos em Erlenmeyer de 250 mL contendo 10g de cada


substrato autoclavado a 1210C por 15 minutos. Aps inoculao, os Erlenmeyer foram
mantidos em estufa a 28 0C por 48h, as enzimas foram extradas com tampo acetato
de sdio e a atividade enzimtica em CMCase foi determinada para avaliao das
condies dos processos fermentativos.
As condies mais adequadas foram selecionadas para uma nova fermentao, na
qual foi feito um acompanhamento cintico para determinar o melhor tempo de cultivo e
a atividade CMCase mxima possvel.
O cultivo foi acompanhado por 208 horas, com a retirada de amostras em tempos
determinados (15, 22, 28, 37, 45, 52, 61, 69, 76,85, 93, 100, 110, 134, 160, 184, 195, e
208 horas) para anlise do teor de AR, umidade e atividade CMCase.

62

3.3.4 Extrao das enzimas

Inicialmente, a extrao do complexo enzimtico para avaliao dos parmetros da


fermentao foi realizada de forma semelhante ao que fizeram Sousa, Silva e Conrado
(2012). Em cada um dos Erlenmeyer foram adicionados 50 mL de tampo citrato de
sdio 50 x 10-3 mol/L, pH 5,0. Em seguida, os Erlenmeyer foram transferidos para
uma incubadora shaker da marca MARCONI temperatura de 28C, com velocidade
de agitao de 150 rpm, por 30 minutos. A mistura obtida foi filtrada em filtro de gaze e
algodo, ambos estreis, para remoo dos esporos e partculas slidas. O filtrado foi
usado nas determinaes de AR, CMCase e umidade. Posteriormente, fez-se um
estudo da lixiviao para melhorar a eficincia deste processo. Tal estudo est descrito
no item 3.3.6.

3.3.5 Determinao da atividade do complexo celuloltico

A atividade enzimtica do complexo celuloltico foi determinada de acordo com o


protocolo de Ghose (2007), com adaptaes. As adaptaes foram necessrias, uma
vez que o extrato enzimtico encontrava-se j bastante diludo, no sendo possvel
aplicar as diluies que o mtodo original de Ghose (2007) prope. Tais adaptaes
consistiram na alterao do tempo de incubao de 60 minutos por 1 hora e a
quantidade de glicose produzida era diretamente proporcional atividade enzimtica
presente, como fizeram Amorim (2010) e Lins (2012).
Foram determinadas as atividades em carboximetilcelulases (CMCase), celobiase e
FPase (atividade sobre o substrato celulose amorfa).
A determinao da atividade de carboximetilcelulases

ou endoglicanases foi

determinada adicionando-se em um tubo de ensaio 0,5 mL do extrato enzimtico com


0,5 mL de carboximetilcelulose a 1% (m/v), preparada em tampo citrato de
sdio 50 x 10-3 mol/L de pH 4,8. Os tubos foram mantidos em banho termosttico a
50C por

60

minutos. Durante esse perodo, a reao entre as endoglicanases

presentes no extrato e a carboximetilcelulose promoveu a liberao de accares


redutores. Em seguida, a reao foi interrompida pela adio de 1mL de DNS em cada
tubo, dando incio a quantificao dos accares redutores, conforme mtodo descrito
no item 3.2.9.

63

Uma amostra

em

branco

foi realizada para cada anlise, substituindo-se a

carboximetilcelulose por 1 mL do tampo citrato. Dessa forma, determinou-se a


concentrao de acares redutores do extrato enzimtico sem a presena da
carboximetilcelulose (ARbranco ) e a concentrao de acares redutores do
extrato enzimtico aps incubao com a fonte de celulose (ARcom substrato).
Para todas as atividades enzimticas testadas, uma

unidade

de

atividade

enzimtica (U) foi definida como a quantidade de enzima (CMCase, FPase ou


celobiase) capaz

de

liberar

1 mol de glicose por minuto a 50C. A atividade

enzimtica produzida na fermentao semisslida foi expressa em U/gds, a qual foi


calculada seguindo a Equao 3.5. No caso de atividade por unidades de volume, a
leitura de AR deve ser expressa em gramas de AR por mL, ao invs de gramas de AR
por grama de meio fermentado.

AR
x106 ( ARcom substrato ARbranco) x10
Atividade CMCase, FPase, celobiase(U / g ) liberado

180 x60
180 x60

(3.5 )

Nessa Equao, 106 um fator de converso que transforma grama em


micrograma (portanto, mol em micromol), 180 a massa molar da glicose (g/mol), 60
o tempo de reao em minutos, ARcom substrato a leitura de aucares redutores no tubo
contendo o substrato, onde ocorreu reao enzimtica e ARbranco a leitura de
acares redutores no tubo da amostra em branco, onde no houve reao enzimtica
por no haver substrato.
A atividade de celobiase foi feita de forma similar a anterior, sendo que a nica
diferena foi a substituio do substrato carboximetilcelulose por uma soluo de
celobiose 15 mM preparada no mesmo dia da anlise. Uma amostra em branco foi
realizada em cada ensaio, substituindo-se a celobiose pelo tampo citrato.
Por sua vez a atividade FPase ou FPU (celulase total) foi determinada por meio
da dosagem de acares redutores liberados durante a degradao de uma fita de
papel de filtro Whatman n 1 medindo 1,0 x 6,0cm. Inicialmente, 1mL de tampo
citrato de sdio 0,05 M pH 4,8 foi transferido para um tubo de ensaio, no qual foi
adicionado 0,5 mL do extrato enzimtico. O tubo foi transferido para um banho
termosttico a 50C. A tira de papel foi imersa no tubo, dando incio reao das
enzimas com a celulose do papel. O processo foi conduzido por 60 minutos. Em

64

seguida, os acares redutores foram quantificados conforme item 3.2.9. O ensaio em


branco no continha o papel. O resultado foi calculado com o auxlio da Equao 3.5.
Neste trabalho, a atividade celuloltica pode estar expressa nas seguintes
unidades:
- U/mL : Unidades de atividade enzimtica por mililitro de extrato
- U/g: Unidades de atividade enzimtica por grama de substrato mido
-U/gds: Unidades de atividade enzimtica por grama de substrato seco
(Obs. Neste trabalho, para converter U/g em U/gds basta multiplicar o valor em U/g por
dez, uma vez que dez gramas de substrato mido contm 1 grama de palma seca nas
condies de fermentao utilizadas)

3.3.6. Determinao das condies operacionais da lixiviao

Uma nova fermentao foi conduzida com os valores de umidade, fonte de


nitrognio e tempo determinados nos ensaios anteriores como os mais adequados. Na
operao de lixiviao verificou-se a influncia das variveis: Agitao (Ag), tempo de
contato (Tc) e relao solvente/substrato (Re, em mL/g) na extrao das enzimas
produzidas. A atividade CMCase foi medida para a avaliao destes parmetros. O
ensaio foi realizado em incubadora tipo Shaker (MARCONI). O estudo foi realizado
segundo um planejamento experimental 23 . As Tabelas 3.4 e 3.5 exibem
respectivamente os nveis e a matriz do planejamento. Os nveis foram baseados nos
estudos de Sousa, Silva e Conrado (2012).

Tabela 3.4 - Nveis do planejamento experimental da lixiviao


Varivel

(-1)

(0)

(+1)

Ag (rpm)

50

100

150

tc (min)

15

30

45

Re (mL/g)

3,5

65

Tabela 3.5 - Matriz do planejamento experimental fatorial 2 3 com trs repeties no


ponto central.
Ensaio

Ag (rpm)

tc (min)

Re (mL/g)

-1

-1

-1

+1

-1

-1

-1

+1

-1

+1

+1

-1

-1

-1

+1

+1

-1

+1

-1

+1

+1

+1

+1

+1

10

11

3.3.7 Concentrao do extrato bruto por precipitao.

O extrato proveniente da lixiviao encontrava-se bastante diludo. Tal


caracterstica no desejvel, pois alm de impedir a utilizao direta do extrato
aumenta os custos do processo de concentrao e purificao. Algumas tcnicas como
a precipitao com solvente e com sais tm sido utilizado com sucesso na precipitao
de protenas e enzimas.
Com o objetivo de avaliar a precipitao do complexo enzimtico como operao
inicial do processo de recuperao e concentrao das enzimas do extrato bruto foram
testadas duas tcnicas: A precipitao por solvente e a precipitao por adio de sais,
com base na metodologia empregada por Farinas e colaboradores (2011). Foram

66

testadas diferentes concentraes de saturao com solvente orgnico (etanol) e


sulfato de amnia ((NH4)2SO4).
3.3.7.1. Precipitao com solventes orgnicos.

Como agente precipitante, foi utilizado o etanol 95GL, conforme a metodologia


empregada por Santos (2011).
O etanol foi previamente aclimatado em freezer (entre -15 e -25C, de acordo com
o fabricante). Os testes foram realizados com 30mL do extrato enzimtico e foram
conduzidos em banho de gelo. O solvente foi acrescentado lentamente ao extrato
enzimtico sob leve agitao. As propores de solvente testadas foram de 1:1; 1:2 e
1:3 (mL/mL). A precipitao ocorreu por 12 horas a no interior de um freezer vertical a
cerca de -20 C. Esta temperatura foi necessria para diminuir a solubilidade das
enzimas e evitar sua desnaturao pela presena do lcool. Em seguida, os tubos
foram centrifugados ainda frios, (com temperatura de aproximadamente 5C) a 2000
rpm por 10 min. Os precipitados resultantes foram lavados com gua destilada,
deixados temperatura ambiente at evaporao do solvente (constatada pela
ausncia do odor de lcool nos precipitados) e ressuspendidos com tampo citrato
0,05M de pH 4,8. Em seguida, a atividade de CMCase foi determinada e comparada
com aquela que o extrato bruto apresentava.

3.3.7.2 Precipitao com sulfato de amnio.

Inicialmente foram calculadas as massas de sulfato de amnio ((NH 4)2SO4) que


resultasse em solues com 20, 40, 60 e 80 % (massa/volume) da concentrao de
saturao do sal, quando adicionadas a 30 mL de extrato enzimtico contidos em tubos
tipo Falcon. As massas calculadas foram de, respectivamente, 4,236; 8,472; 12,708 e
16,944g. A adio foi feita com agitao branda, em banho de gelo, at completa
solubilizao do sal. As amostras foram ento mantidas em geladeira por 12 horas,
sendo em seguida centrifugadas a 2000 rpm a cerca de 5 C por 10 min. Aps
leve lavagem com gua destilada, o precipitado foi ressuspendido em tampo citrato de
sdio (pH 4,8). A atividade CMCase foi determinada e comparada com a contida no
extrato bruto.

67

3.4 CARACTERIZAO DAS ENZIMAS

3.4.1 Determinao da temperatura tima da atividade enzimtica

O estudo da determinao da temperatura tima da atividade enzimtica foi


baseado na metodologia empregada por Akcapinar, Gul e Sezerman (2012). A
atividade de cada enzima em diferentes temperaturas (25, 40, 55, 70, 85 e 100C) foi
determinada com base na metodologia de Ghose (1987), descrita no item 3.3.5. Cada
enzima (extrato) e substrato (CMC) foram pr-incubados separadamente na
temperatura do ensaio por 5 minutos. Em seguida, 0,5 mL do substrato foram
adicionados a 0,5 mL do extrato. Aps 15 minutos, a reao foi interrompida com
banho de gelo e adio de 1mL de DNS para quantificao de acares redutores. A
atividade residual em cada ensaio foi calculada em relao ao ensaio de maior
atividade, considerando a atividade de 100% na temperatura de maior atividade.

3.4.2 Determinao do pH timo da atividade enzimtica

O estudo do efeito do pH na atividade enzimtica foi baseado na metodologia


empregada por Akcapinar, Gul e Sezerman (2012). A atividade de cada enzima em
diferentes valores de pH (3,0 - 80) foi determinada com base na metodologia de Ghose
(1987), descrita no item 3.3.5. Para este ensaio, a extrao das enzimas por lixiviao
foi realizada com gua destilada, e os ensaios para medio da atividade enzimtica
foram realizados na presena de tampes (tampo glicina-NaOH para pH 3,0; tampo
acetato de sdio de sdio para pH entre 4 e 5,5 e tampo Tris-HCl para pH acima de
6,0. Todos com concentrao de 0,1mol/L). A reao enzimtica foi conduzida por 15
minutos, temperatura de 55C. Passado esse tempo, a reao foi interrompida com
banho de gelo e adio de 1mL de DNS para quantificao de acares redutores. A
atividade residual em cada ensaio foi calculada em relao ao ensaio de maior
atividade, considerando a atividade de 100% no pH de maior atividade.

68

3.5 PURIFICAO DAS ENZIMAS DO EXTRATO UTILIZANDO SABs.

Para o estudo da purificao de celulases por meio de SABs, foram inicialmente


testados SABs formados por polietilenoglicol e tampo citrato de sdio temperatura
ambiente (25 C).
A formao dos SABs foi baseada em dados de equilbrio presentes na literatura,
como no trabalho de Porto et al. (2007), os quais auxiliaram na escolha das
concentraes de PEG e citrato a serem testadas. Este sistema foi escolhido pela
facilidade de operao, pelo baixo risco ambiental oferecido por seus constituintes e
pelas aplicaes existentes na literatura, onde esse tipo de SAB tem sido aplicado com
sucesso na purificao de diversas biomolculas, inclusive celulases, como no trabalho
de Herculano et al (2012).
Os ensaios foram realizados segundo um planejamento experimental fatorial
completo 24 com quatro repeties no ponto central. Foram estudados a influncia da
massa molar do polmero, concentrao do polmero, concentrao do sal e pH na
partio e recuperao de celulases. O extrato utilizado foi proveniente da etapa de
lixiviao. A matriz do planejamento encontra-se na Tabela 3.6.

Tabela 3.6 - Matriz de planejamento para o estudo dos SABs


Ensaio M PEG (g/mol) C PEG (%) C Citrato (%)
1
-1
-1
-1
2
+1
-1
-1
3
-1
+1
-1
4
+1
+1
-1
5
-1
-1
+1
6
+1
-1
+1
7
-1
+1
+1
8
+1
+1
+1
9
-1
-1
-1
10
+1
-1
-1
11
-1
+1
-1
12
+1
+1
-1
13
-1
-1
+1
14
+1
-1
+1
15
-1
+1
+1
16
+1
+1
+1
17
0
0
0
18
0
0
0
19
0
0
0
20
0
0
0

pH
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
0
0
0
0

69

Os valores utilizados para cada nvel esto exibidos na Tabela 3.7. Os nveis
foram baseados nos utilizados por Herculano et al. (2012).

Tabela 3.7 - Valores descodificados utilizados no planejamento


Varivel

-1

+1

Massa molar do PEG (g/mol)


Concentrao de PEG (%m/m)
Concentrao de citrato (% m/m)
pH

4000
18
12
5,0

6000
20
14
6,0

8000
22
16
7,0

3.6 AVALIAO DOS ENSAIOS DE PURIFICAO

3.6.1 Determinao dos coeficientes de partio dos SABs


Os coeficientes de partio foram determinados segundo Prodanovi e Antov
(2008). O coeficiente de partio (K) definido como a concentrao de protena ou
atividade enzimtica na fase superior dividida pelo valor correspondente na fase
inferior, como exibido nas Equaes 3.6 e 3.7.

Kp

CT
CB

(3.6)

KE

AT
AB

(3.7)

Onde CT e CB so as concentraes de protena total em mg/mL nas fases superior


e inferior, respectivamente, e AT e AB so as atividades enzimticas nas fases superior
e inferior, respectivamente.

3.6.2 Avaliao dos processos de recuperao

Para melhor avaliao do processo de recuperao das celulases nos SABs foi
necessrio o clculo de outros parmetros alm dos coeficientes de partio. Portanto
calculou-se a atividade enzimtica especfica (AS), expressa em U/mg; o fator de
purificao (FP) e a recuperao de enzimas na fase superior (RT) e na fase inferior
(RB).

70

A atividade enzimtica especfica da enzima em cada uma das fases ser


determinada conforme Equao 3.8:

Afase

AS fase

C fase

(U / mg )

(3.8)

Onde Afase e C fase so a atividade enzimtica em uma das fases ou etapas e a


concentrao de protenas naquela fase respectivamente.

O fator de purificao da atividade enzimtica em cada uma das fases ou


etapas ser calculada de acordo com a Equao 3.9:

FPfase

AS fase
AS

(3.9)

extrato

Onde ASextrato corresponde a atividade enzimtica especfica do extrato aps a


operao de lixiviao (recuperao das enzimas a partir do meio semi-slido
fermentado).

A recuperao de atividade enzimtica nas fases superior e inferior dos


SABs foram obtidas atravs das Equaes (3.10) e (3.11).

Yt (%)

100
V 1
1 b
Vt K e

Yb (%)

100
V
1 K e t
Vb

(3.10)

(3.11)

Nas quais Vt e Vb so os volumes das fases superior e inferior, respectivamente.

71

3.6.3 Determinao do teor de protenas

A determinao do teor de protenas no extrato e nas fases dos SABs foi realizada
pelo mtodo de Bradford (1976); utilizando-se albumina do soro bovino como padro.
Para a preparao do reagente de Bradford, dissolveu-se 100mg de Coomassie
Brilliant Blue G-250 em 50 mL de etanol 95GL. Em seguida adicionou-se 100mL de
cido fosfrico. A soluo resultante foi diluda para um litro com gua deionizada. A
soluo ficou sob agitao magntica por quatro horas, ao abrigo da luz, sendo em
seguida filtrada em papel qualitativo e transferida para um vidro mbar coberto com
papel alumnio. O reagente foi guardado em geladeira (8 C).
Para a leitura, foram misturados 0,5 mL da amostra com 3,5 mL do reagente. Aps
15 minutos, a leitura da absorbncia foi realizada em espectrofotmetro a 595 nm. Na
ocasio da leitura, foi elaborada uma curva de calibrao a partir de solues padro
de BSA, entre 0 e 0,1 mg/mL (as concentraes dos padres foram 0,02; 0,03; 0,04;
0,05; 0,06, 0,08, 0,09 e 0,1 mg/mL)

3.7 APLICAO DO EXTRATO ENZIMTICO.

3.7.1 - Material lignocelulsico e pr-tratamento

O extrato bruto proveniente da fermentao foi testado em um processo de


sacarificao seguido de fermentao alcolica para se verificar a aplicabilidade dos
extratos produzidos na hidrlise de biomassa lignocelulsica. O material lignocelulsico
escolhido foi a prpria biomassa da palma, inclusive o material slido que constitua o
meio de cultura proveniente da etapa de filtrao do extrato bruto obtido na etapa de
extrao slido-lquido.
Portanto, o teste foi feito com dois tipos de materiais: Resduo seco de palma (RP),
obtido conforme o item 3.1.1 e resduo da fermentao semisslida (RF), obtido por
meio da secagem e moagem da torta mida resultante da lixiviao e filtrao da
fermentao.
Inicialmente, as amostras foram pr-tratadas segundo a metodologia empregada
por Sukumaran et al. (2009). Cerca de 10g das amostras de RP e RF foram imersas
em NaOH 0,1mol/L e deixadas por 1 hora em autoclave a 120C. Aps esfriamento

72

temperatura ambiente, as amostras foram lavadas vrias vezes em gua da torneira


para neutralizar o pH (monitorado por meio de fenolftalena), seguido por uma lavagem
final em gua destilada. Em seguida as amostras foram secas em estufa (65C) e
guardadas em geladeira para posterior utilizao.

3.7.2 Sacarificao enzimtica

A sacarificao enzimtica da biomassa foi realizada conforme a metodologia


empregada por Sukumaran et al. (2009), por meio da incubao da biomassa prtratada seca (RP ou RF) em extrato enzimtico bruto ou proveniente da operao dos
SABs. Foram transferidos 1 grama de biomassa para um balo de 250mL de
capacidade, contendo 50 mL do extrato enzimtico dissolvido em tampo citrato pH 4,8
(50mM). Os frascos foram tampados e permaneceram sob agitao em Shaker a 45C
a 100 rpm por 40 horas.
Medies de AR foram realizadas durante o perodo da hidrlise, em tempos
regulares, para verificar se ocorreu produo de glicose, o que comprovaria a hidrlise
do material lignocelulsico, assim como fizeram Baracho et al. (2009).
A produtividade em termos de glicose foi calculada dividindo-se a quantidade de
glicose produzida pelo tempo que o processo levou para produz-la, de acordo com a
Equao 3.12.

(3.12 )

Onde P a produtividade, ARt a quantidade de AR presente no tempo t, ARi a


quantidade de AR presente no tempo inicial (0h) e t o tempo de processo em horas. A
produtividade foi expressa em miligramas de AR por litro por hora (mg/L.h).

73

4 RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo so mostrados e discutidos os resultados que foram obtidos nesta
pesquisa.

4.1 CARACTERIZAO DAS BIOMASSAS


Os resultados da caracterizao das biomassas, tanto da palma integral (PI)
quanto da lavada (PL) esto apresentados na Tabela 4.1, em base seca.

Tabela 4.1. Caracterizao das biomassas (base seca)


Parmetros analisados
Umidade (%)
Cinzas (%)
ART (g/100g amostra)

Valor PI
11,71 0,28
5,80 0,18
14,44 0,35

Valor PL
9,40 0,14
4,04 0,30
2,73 0,02

9,47 0,62

2,10 0,06

Slidos solveis Totais ( Brix)

60,0 0,00

10,0 0,00

Celulose (%)

37,34 3,97

--------

pH

4,62 0,01

4,76 0,05

0,30 0,01
1,25 0,01

0,27 0,01
1,25 0,01

AR (g/100g amostra)

Massa especifica aparente (g/mL)


Massa especfica (g/mL)

De acordo com Batista, Carvalho e Rocha Filho (2013) a composio qumica da


palma forrageira influenciada pela espcie, idade da planta, variedade, ordem do
claddio e tratos culturais. Nas espcies tradicionalmente cultivadas no Nordeste do
Brasil, dos gneros Opuntia e Nopalea, o teor de matria seca (MS) varia de 99 a 101
g/kg MS; ou seja, a palma possui de 89,9 a 90,1% de gua. A palma utilizada neste
trabalho apresentou cerca de 90% de gua.
A quantidade de gua presente na palma garante a hidratao dos animais
durante a poca de seca, caso seja utilizada na alimentao de ruminantes. Porm,
este percentual de gua o mnimo exigido por muitos microrganismos, como a
Saccharomyces cerevisiae, para o cultivo semisslido em substrato formado pela
biomassa da palma forrageira (Arajo et al., 2005).
Aps processamento da biomassa, a matria seca triturada apresentou umidade
residual de 11,71% para PI e 9,40% para PL. Estes valores de umidade so adequados

74

para o armazenamento das biomassas, uma vez que Arajo et al. (2005), ao
estudarem o equilbrio higroscpico da palma forrageira com o objetivo de determinar a
umidade tima para o cultivo semisslido desta biomassa, concluram que no ocorre
desenvolvimento microbiano na biomassa da palma seca com umidade residual de at
15%, o que corresponde a uma atividade de gua abaixo de 0,35 na temperatura de
30C, pois a atividade de gua mnima para crescimento de microrganismos na
biomassa de palma est em torno de 0,89.
Quanto ao teor de cinzas, Batista, Carvalho e Rocha Filho (2013) afirmam que o
percentual de cinzas na palma varia de 81 a 192g/kg de matria seca (8,1% a 19,2%).
Este valor influenciado por fatores tais como umidade e composio mineral do solo.
O teor de cinzas encontrado neste trabalho para PI e PL foram, respectivamente, cerca
de 5,80 e 4,04% (ou 58 e 40,4 g/Kg respectivamente). Porm, Santos et al. (2011)
chegaram a encontrar um valor de 241,7 g/Kg para o teor de cinzas em base seca.
Torres Neto (2010) encontrou um valor de 91,6 g/Kg para o teor de cinzas na matria
seca da palma. A diminuio do teor de cinzas da palma lavada (PL) foi provavelmente
provocada pela perda de minerais solveis durante o processo de lavagem. Embora o
teor de cinzas das biomassas PI e PL tenha sido inferior aos relatados na literatura,
possvel que as biomassas ainda apresentem micronutrientes suficientes para o
desenvolvimento microbiano.
De acordo com Batista, Carvalho e Rocha Filho (2013), a cinza da palma
formada principalmente por clcio, magnsio e potssio, alm de outros minerais.
Mandels e Reese (1956) estudaram a influncia de minerais na produo de celulases
por Trichoderma viride e concluram que a presena de ctions metlicos tanto podem
induzir quanto inibir a produo de celulases, dependendo da concentrao, pois
alteram o metabolismo do microrganismo. Porm, a combinao de pequenas
quantidades de ons metlicos, tais como: clcio, magnsio, estrncio, zinco e cobalto
importante para o metabolismo do microrganismo e a excreo de celulases.
Na literatura, h relatos da produo de biomolculas por fermentao
semisslida da biomassa da palma utilizando fungos filamentosos, sem a necessidade
de suplementao (SANTOS et al. 2011; SANTOS et al. 2012; CARVALHO et al.,
2012; SANTANA et al., 2012), o que demonstra ter a palma forrageira nutrientes
suficientes para o desenvolvimento dos microrganismos e sua manuteno durante o
processo fermentativo.

75

Em relao ao teor de acares, Batista, Carvalho e Rocha Filho (2013) relatam


que a massa seca da palma constituda por 80% de carboidratos. Neste trabalho
foram avaliados apenas o teor de ART e AR, que representam os carboidratos
imediatamente disponveis para o metabolismo dos microrganismos na fermentao
semisslida. Fawole e Odunfa (2003) mencionam que interessante que a glicose
esteja disponvel no substrato para o microrganismo em quantidade suficiente para
proporcionar um crescimento inicial da populao microbiana, mas no o bastante para
impedir que o microrganismo seja capaz de metabolizar a fonte indutora, a celulose.
Por outro lado, importante que a fonte indutora no apresente um valor percentual
acentuado de forma a inibir a excreo da enzima pelo microrganismo.
Os valores de ART obtidos para a biomassa seca da palma foi de 14,44% para a
PI e 2,73% para a PL, o que mostra que apesar de ter removido boa parte dos
acares, a lavagem no foi completa, exigindo mais tempo e mais gua corrente para
total remoo dos slidos solveis. Torres Neto (2010) encontrou para a palma
forrageira um valor de ART inferior a este trabalho, cerca de 5,20%. J os teores de AR
para PI e PL foram de, respectivamente, 9,47 e 2,10%; o que demonstra ter a massa
seca da palma um teor de monossacardeos suficiente para adaptao do
microrganismo ao substrato na fermentao semisslida.
Na produo de celulases por Trichoderma reesei, tem sido relatado que a
presena da glicose tem efeito inibidor na produo de celulases, como constataram
Mandels e Reese (1953), mas a presena da glicose no incio da fermentao to
importante quanto a de minerais. Segundo estes pesquisadores, em muitos casos, a
produo de celulases por Trichoderma viride s inicia quando os acares presentes
so totalmente consumidos. Arantes e Saddler (2010) afirmam que, geralmente, as
enzimas do complexo celuloltico sofrem inibio pelo seu produto de hidrlise.
De acordo com Chandra, Viswanath e Reddy (2007), a adio de pequenas
quantidades de sucrose e celulose ao meio de cultura (respectivamente 0,03 e 0,05g
por grama de lignocelulose presente) no incio da fermentao promove uma melhor
proliferao do fungo e induz a produo de celulases mais rapidamente. Por outro
lado, Ziga et al. (2011) estudando a produo de celulases por Aspergillus niger
utilizando bagao de cana e farelo de trigo como substrato, verificaram que a adio de
sacarose ao meio de cultura no favorece a produo de celulases. Isso coerente
com os estudos de Seiboth et al. (1997), os quais observaram que o sistema celuloltico
microbiano pode sofrer represso catablica caso estejam na presena de elevadas

76

concentraes de acares, tais como glicose, maltose e arabinose. Fontana e Silveira


(2012) constataram que concentraes de glicose acima de 10% provocam efeito
inibitrio na produo de poligalacturonases por Aspergillus orizae em substrato de
farelo de trigo.
O teor de slidos solveis totais foi relativamente alto para a PI (60Brix) quando
comparado ao teor de ART. Isso significa que, alm de acares, a palma apresenta
um alto teor de outras substncias solveis, tais como cidos orgnicos. J o teor de
slidos solveis para a PL foi de 10Brix, significando que o processo de lavagem da
palma removeu parte dos minerais e outras substncias presentes no substrato, porm
mais uma vez constata-se que o processo de lavagem no foi suficiente para remover
todos os slidos solveis presentes na palma. Durante a lavagem, por mais que se
acrescentasse gua, no se percebia diminuio no Brix.
O teor de celulose na biomassa da palma seca foi de 37,34 %. Este valor foi
superior ao encontrado por Torres Neto (2010), que foi de 20,39%; e ao determinado
por Tosto et al.(2007), que foi de 21,15% para a biomassa da palma forrageira seca.
Lins (2012) determinou um teor de 32,37% de celulose para o resduo agroindustrial do
caju. J Herrera et al. (2004) encontrou um percentual de celulose de 34% para a palha
de sorgo. Portanto, o teor de celulose determinado para a palma neste trabalho
importante, porque alm desse polissacardeo ser uma fonte indutora na produo das
celulases, tambm pode sofrer hidrlise enzimtica, sendo transformado em acares
fermentescveis.
O pH, medido no extrato obtido da palma slida seca, foi de: 4,62 para PI e 4,76
para PL, esses valores demonstram que esse material um substrato adequado para o
desenvolvimento de fungos filamentosos, pois, de acordo com Sohail et al. (2009), a
produo de celulases por Aspergillus niger s tem incio quando o substrato apresenta
valores de pH prximos a 4,0. Segundo os mesmos autores, caso o pH inicial do meio
seja maior que 4,0; ele diminuir no decorrer da fermentao, estabilizando em valores
entre 3,5 e 4,0.
O pH da PL foi mais elevado devido a possvel remoo de cidos orgnicos
durante o pr-tratamento por lavagem. Estes valores foram um pouco superiores ao
determinado por Santos et al. (2011) para a biomassa da palma, que foi de 4,45. J o
valor de pH medido por Torres Neto (2010) foi de 4,12. O pH uma varivel importante
na obteno de enzimas por fermentao semisslida, e o meio cido uma
vantagem.

Segundo

Zheng

Shetty

(2000),

as

enzimas

produzidas

por

77

microrganismos em processos de fermentao semisslida com resduos ctricos


apresentam maior estabilidade frente s variaes de pH. Isto foi confirmado por Souza
et al. (2010), que estudaram a produo de pectinases por Aspergillus niger em
substrato formado por casca e albedo de maracuj (Passiflora edulis flavicarpa), e
verificaram que a enzima era estvel em valores de pH entre 3,5 a 5,5.
A distribuio granulomtrica das biomassas trituradas encontra-se representada
na Figura 4.1.

Figura 4.1 - Distribuio granulomtrica das biomassa da palma integral e da

Massa retida (%)

palma lavada
40
35
30
25
20
15
10
5
0

Palma Integral
Palma lavada

1,18

0,85

0,71 0,425 0,355 0,25 0,125 < 0,125

Malha (mm)
A Figura 4.1 mostra que a lavagem da biomassa da palma resultou em um material
com maior tamanho de gros quando modo. Enquanto a biomassa da palma integral
resultou em um material com 53% das partculas com tamanho superior a 0,425 mm, o
material resultante da triturao da palma lavada apresentava 78,25% das partculas
com tamanho superior a 0,425 mm. Portanto a lavagem da palma diminuiu
consideravelmente a formao de partculas com reduzido dimetro. Os finos
(partculas no retidas pela peneira de 0,125 mm) representaram 10,63% para a palma
integral. A palma lavada tinha apenas 2,49% de finos. possvel que o procedimento
de lavagem tenha removido partculas solveis que, na palma integral, formariam
aglomerados frgeis e quebradios durante a secagem, originando uma grande
quantidade de partculas com reduzido tamanho.
Em relao granulometria do leito para a fermentao semisslida, os estudos
realizados por Botella et al. (2007), que utilizaram diferentes granulometrias de
partculas para a produo de pectinases e xilanases (0,06 a 1,00 mm; 0,74 a 1,00 mm

78

e 1,00 a 1,60 mm) mostraram que o tamanho das partculas no teve influncia
significativa na produo das enzimas.
Porm, de acordo com Souza et al (2010), o tamanho das partculas pode ter
influncia no processo de fermentao semisslida, uma vez que, embora partculas de
reduzido tamanho ofeream maior rea superficial para o ataque microbiano, as
partculas tendem a compactar-se mais facilmente, dificultando a aerao do sistema e
a respirao das clulas. J as partculas maiores facilitam a aerao por promoverem
mais espao Interpartculas, porm prejudicam a absoro dos nutrientes pelo
microrganismo. Por isso, Pinto et al. (2005), ressaltam que o substrato no deve
apresentar aglomerao das suas partculas individuais, para que o ar necessrio ao
desenvolvimento microbiano atravesse os espaos vazios do meio.
O valor da massa especfica aparente para a palma integral e a palma lavada foi de
0,30 e 0,27 g/cm3 respectivamente. De acordo com Souza et al. (2010), os valores de
massa especfica aparente revelam que estes resduos no apresentam tendncia
compactao, gerando os espaos vazios entre suas partculas, suficientes para a
respirao e o metabolismo do microrganismo quando aplicados na fermentao
semisslida. Quanto massa especfica, ambos os resduos apresentaram, como era
de se esperar, o mesmo valor: 1,25 g/cm3.
Com os valores de massa especfica e massa especfica aparente foram calculadas
as porosidades mximas que o leito da fermentao semisslida pode apresentar.
Estes valores foram 0,760 0,01 e 0,780 0,01 para a biomassa processada da palma
integral e da palma lavada respectivamente. A palma integral apresentou maior
porosidade porque tinha maior quantidade de partculas de tamanho reduzido. Esses
valores de porosidade so suficientes para favorecer a aerao do sistema, tornando
disponvel o oxignio necessrio ao desenvolvimento dos microrganismos.

4.2 - FERMENTAO SEMISSLIDA.

4.2.1 Acompanhamento cintico

Uma fermentao foi conduzida utilizando a biomassa seca da palma forrageira


sem a operao de lavagem (PI). Os parmetros iniciais do processo foram baseados
na bibliografia consultada. A umidade foi fixada em 90% (ARAJO et al. 2005). J os

79

demais parmetros, como a adio de 1% de sulfato de amnio e inoculao de 10 7


esporos de Trichoderma Reesei LCB 48 por grama de substrato, seguiram a
metodologia utilizada por Amorim (2010) e Lins (2012) no cultivo semisslido de
Trichoderma reesei em resduo de caju. A fermentao ocorreu a 28C por 280 horas.
Durante o processo, foram recolhidas amostras periodicamente para acompanhamento
da variao de AR, umidade e atividade CMCase no meio fermentado. Os resultados
deste procedimento esto na Figura 4.2. Os dados de atividade no grfico esto
expressos em unidades de atividade por grama de substrato hidratado (U/g), para
facilitar sua comparao com outros parmetros de mesma ordem de grandeza.

Figura 4.2. Acompanhamento cintico da produo de CMCase na fermentao


semisslida da Palma Integral

A Figura 4.2 mostra que, durante as primeiras 50 horas, houve uma grande
reduo no total de acares redutores presentes. Desde as primeiras horas da
fermentao, o microrganismo passou a metabolizar os acares presentes, no
havendo a necessidade de excretar enzimas para hidrolisar a celulose da palma e
produzir mais acares.
Porm, a partir de 25 horas de fermentao, observa-se uma crescente produo
de atividade CMCase, ao mesmo tempo em que o teor de glicose continua diminuindo,
at estabilizar aps 100 horas de fermentao.

80

A atividade CMCase atinge um mximo em 110 horas (0,645U/g ou 6,45 U/gds).


Neste ponto, a produtividade foi de 0,006 U/g.h.
H uma pequena reduo na atividade de CMCase depois das 110 horas. O
grfico mostra a tendncia da fermentao ser conduzida por muito mais tempo, porm
com reduo de produtividade, a qual era 0,002U/g.h nas 208 horas de processo.
Trabalhos desenvolvidos com base na fermentao semisslida da palma
forrageira tm, geralmente, encontrado atividade tima em torno de 72 horas (Santos et
al, 2012; Santana et al., 2012).
O extrato enzimtico com maior atividade obtido nesta etapa deste trabalho foi
0,129 U/mL. Em geral, a produo de celulases por fermentao semisslida tem
produzido extratos com atividade inferior a 1U/mL. Rajeev et al. (2009) estudando a
produo da enzima celulase empregando T. reesei Rut C-30 em farelo de trigo
quimicamente tratado como substrato, produziram nveis apreciveis de atividade de
endoglucanase (0,45 U/mL). J Victor et al. (2003) obtiveram 0,0743, 0,0573 e
0,0502 U/mL de celulase durante 120h de fermentao utilizando serragem,
bagao

de

cana

sabugo

de

milho, respectivamente, como substratos para

produo de celulases por uma cepa de Aspergillus flavus.


Estes valores no diferem muito quando se trata de fermentao submersa, pois
Aguiar e Menezes (2000) estudaram a produo de celulases e xilanases por
Aspergillus niger por meio da

fermentao submersa utilizando o

bagao de

cana-de-acar e obtiveram atividade de CMCase de 0,20 U/mL.


A Figura 4.2 mostra que a umidade permaneceu praticamente constante, em
cerca de 90%. Portanto, havia atividade de gua suficiente para os microrganismos
manterem-se viveis aps 200 horas de fermentao.

4.2.2 - Avaliao da lavagem da biomassa, da umidade e da adio de fonte de


nitrognio.

A lavagem da biomassa da palma triturada teve por objetivo a remoo dos


acares e slidos solveis. Tal procedimento foi realizado porque em ensaios
preliminares verificou-se que, na palma lavada, os fungos se desenvolviam mais
rapidamente. Alm disso, o procedimento de lavagem diminui o teor de glicose no
substrato, forando os microrganismos a buscarem fontes alternativas de carbono,
como a celulose, sendo induzidos a produzirem celulases para quebrar a molcula de

81

celulose e obter glicose para seu metabolismo. Assim, como observaram Amorim
(2010) e Lins (2012), a produo de celulase na biomassa lavada inicia-se mais
rapidamente. Nesta etapa, a avaliao dos resultados foi feita pela determinao da
atividade em carboximetilcelulose (CMCase). O ensaio foi conduzido por 110 horas. Os
resultados obtidos esto na Tabela 4.2, junto com os respectivos desvios-padro.

Tabela 4.2 - Avaliao da influncia da lavagem, adio de nitrognio e umidade na


obteno de CMCase.
Ensaio

U (%)

N (%)

CMCase PI (U/gds) CMCase PL (U/gds)

-1 (45)

-1 (0)

0,089 0,101

0,628 0,011

+1 (90)

-1 (0)

2,078 0,205

4,296 0,058

-1 (45)

+1 (1)

0,000 0,007

0,640 0,002

+1 (90)

+1 (1)

4,870 0,044

3,780 0,046

0 (67,5) 0 (0,5)

1,601 0,031

1,774 0,011

0 (67,5) 0 (0,5)

1,501 0,046

1,622 0,032

0 (67,5) 0 (0,5)

1,349 0,025

1,580 0,044

Como pode ser verificado na Tabela 4.2, o procedimento de lavagem da matria


prima diminuiu a quantidade de gua necessria para o desenvolvimento dos
microrganismos, uma vez que na palma lavada, alm da maior proliferao dos fungos
observou-se a produo de atividade enzimtica no substrato com umidade inicial de
45%, conforme mostra a comparao entre os valores dos resultados dos ensaios 1 e
3.
Alm disso, os mais altos valores de atividade em ambos os casos foram obtidos
com o teor mais elevado de umidade. Isto representa uma vantagem, pois, como a
raquete da palma possui cerca de 90% de umidade, possvel aplicar a biomassa da
palma como substrato para fermentao semisslida in loco com um mnimo de
processamento (apenas triturao e esterilizao), sem a necessidade de se adicionar
gua nesta etapa do processo.
Uma vez que o maior valor de atividade foi obtido para a palma integral, no h
vantagens em lavar a biomassa da palma para compor o substrato da fermentao,
mesmo porque, sendo a gua um recurso escasso no semirido, o procedimento de
lavagem iria desperdiar grande quantidade de gua e produzir um rejeito rico em

82

matria orgnica que poderia poluir os poucos mananciais e reservatrios da regio ou


elevar os custos de produo com seu tratamento antes de ser lanado no ambiente.
De acordo com os estudos de Arajo et al. (2005), a umidade de 90% equivale a
uma atividade de gua (aw) de 0,89 (a 30C) que a mnima necessria para o cultivo
semisslido de Saccharomyces cerevisiae utilizando a biomassa da palma forrageira.
Santos et al. (2011), estudando a produo de celulases de Rhizopus sp. por cultivo
semisslido de palma, determinaram que os melhores valores de atividade de gua
para a produo de CMCase era de 0,949. J Carvalho et al. (2012), que estudaram a
produo de celulases pela fermentao da biomassa da palma doce com Aspergillus
niger determinaram a atividade de gua de 0,985; equivalente a uma umidade de 85%
como a mais adequada.
Entretanto, Amorim (2010) estudou a produo de celulases por Trichoderma sp
em bagao de caju lavado e sem lavar e observou que, para umidade de 45%, o pico
de atividade foi atingido mais rapidamente quando se utilizou a matria-prima lavada.
Lins (2012) alega que o teor de umidade do substrato um dos fatores que mais
afetam o crescimento microbiano e a formao de produto, pois determina a
quantidade de gua inicial disponvel para o microrganismo (a w) e promove a dilatao
do substrato, facilitando a penetrao de miclio para a utilizao do substrato.
Alcntara, Leite e Silva (2013); que estudaram a produo de pectinases por
Aspergillus niger na fermentao semisslida do resduo do caju, determinaram que a
atividade de gua mais favorvel para a sntese das enzimas era superior a 0,9; o que
era atingido, no caso da utilizao do resduo do caju como substrato, em teores de
umidade acima de 35%. Os autores ressaltam que a atividade de gua, a qual est
relacionada umidade, um fator limitante na fermentao semisslida, pois pode
interferir no crescimento do microrganismo e em suas reaes metablicas.
Em relao palma integral, ou seja, a biomassa de palma no lavada, os
resultados da Tabela 4.2 mostram que os ensaios conduzidos com 45% de umidade (1
e 3) resultaram em baixa ou nenhuma atividade celuloltica.
No ensaio 2, com umidade inicial de 90% foi possvel obter atividades maiores.
No ensaio 4, observa-se que, com a suplementao de nitrognio, a atividade
celuloltica mais que dobrou. Este ensaio apresentou a maior produtividade (0,101
U/gds.h), sendo, possivelmente uma condio adequada para operao da FSS.
Em relao ao ponto central (Ensaios 5, 6 e 7), com teor mdio de umidade e
suplementao, observa-se que os valores foram intermedirios aos obtidos com os

83

valores mnimos dos fatores (ensaio 1) e mximos (ensaio 4), sugerindo que a
atividade tem comportamento linear para os nveis estudados.
Alm disso, foi observado que os extratos obtidos nos ensaios com baixa
umidade apresentavam-se mais escuros que aqueles produzidos na presena de
umidades maiores, como pode ser observado na Figura 4.3. Observa-se tambm que
os extratos de cores mais claras possuem maior atividade, os mais escuros
provavelmente possuem maior concentrao de impurezas.

Figura 4.3- Aspecto dos extratos brutos recolhidos em cada ensaio da PI

Para melhor avaliao dos dados experimentais, foi feito o tratamento estatstico
dos dados obtidos com a ajuda do software Statistica 5.0.
O diagrama de Pareto (Figura 4.4) mostra que tanto a umidade quanto a adio
de fonte de nitrognio so parmetros estatisticamente significativos no processo
fermentativo, influenciando positivamente na obteno de atividade celuloltica.

84

Figura 4.4- Influncia das variveis fonte de nitrognio (N) e umidade (U) na
fermentao da biomassa da palma integral (PI)

O modelo de regresso de primeira ordem proposto est na Equao 4.1. Tal


modelo explica 98,9% das variaes.

CMCase=1,64114+1,71475U+0,67575N+0,72025UN

(4.1)

Conforme relatam Alcntara, Leite e Silva (2013), a suplementao do substrato


com sulfato de amnio em pequenas quantidades geralmente resulta em um efeito
positivo na produo enzimtica. Porm, em alguns casos, tal efeito pode ser
considerado desprezvel diante de outros efeitos mais significativos, como o tempo de
fermentao ou a umidade.
A Tabela 4.3 apresenta a anlise de varincia (ANOVA) dos resultados para PI e
o resultado do Teste F, o qual representa a razo entre o F calculado e o Ftabelado. Sempre
que esta relao for maior que 1, a regresso estatisticamente significativa, indicando
que h relao entre as variveis independentes e dependentes. Para que uma
regresso no seja apenas estatisticamente significativa, mas tambm til para fins
preditivos, o valor da razo deve ser no mnimo maior que 4,0 (BARROS NETO et al.
1995).

85

Tabela 4.3. Anlise de varincia ANOVA para os resultados do planejamento


experimental da fermentao com a biomassa da palma integral (PI)
Fonte de variao SQ GL
MQ
Fcalculado
Regresso
15,66 3
5,22
87,00
Resduo
0,17
3
0,06
Falta de ajuste
0,14
1
Erro puro
0,03
2
Total
15,83 6
2
%R
98,9
F tabelado = 9,28
Teste F5%= 9,37

Como pode ser observado na Tabela 4.3, o modelo matemtico obtido poder ser
usado para fins preditivos, pois o Teste F apresentou valor superior a 4,0.
A Figura 4.5 exibe a superfcie de resposta que mostra a influncia da umidade
inicial e concentrao de nitrognio no meio fermentado sobre a atividade CMCase.

Figura 4.5. Produo de CMCase em funo da adio de fonte de nitrognio (N)


e umidade (U) na fermentao da biomassa da palma integral (PI)

Verifica-se a grande influncia que a umidade tem na produo de CMCase e que


tambm a suplementao de nitrognio contribui para o aumento da atividade da
CMCase produzida por Thichoderma reesei LCB 048.

86

As condies operacionais do Ensaio 4 para a fermentao da palma integral (PI),


com umidade inicial de 90% e concentrao de sulfato de amnio em 1% so as mais
adequadas para a conduo do processo fermentativo utilizando a biomassa da palma
integral (PI) como substrato.
Para os ensaios realizados com a biomassa da palma lavada (PL), os resultados
da Tabela 4.2 mostram que os ensaios conduzidos com o menor valor de umidade,
45%, (ensaios 1 e 3) tambm resultaram em valores mais baixos de atividade CMCase,
embora sejam muito superiores aos valores obtidos nas mesmas condies para a PI.
O ensaio 2, com umidade inicial de 90% e nenhuma suplementao foi o que
resultou no valor mais alto de atividade CMCase (4,296 U/gds), apresentando uma
produtividade de 0,0895 U/gds.h. Este ensaio representa uma condio adequada para
o processo da FSS usando PL. Porm, este valor inferior ao resultado obtido no
ensaio 4 para PI (4,870 u/gds com produtividade de 0,101 U/gds.h).
Em relao ao ponto central (Ensaios 5, 6 e 7), observa-se que os valores de
atividade foram superiores aos ensaios 1 e 3, com umidade de 45%; mas inferiores aos
valores dos ensaios 2 e 4, com umidade inicial de 90%, sugerindo um comportamento
linear. A mdia dos trs pontos foi de 1,6587 U/gds; com coeficiente de variao de
6,15%; indicando baixa disperso, ou seja, boa reprodutibilidade das trs repeties.
Para os ensaios conduzidos com a palma lavada (PL), o diagrama de Pareto
(Figura 4.6) mostra que apenas a umidade foi estatisticamente significativa (para p <
0,05) o que significa que a influncia deste parmetro na atividade obtida superior
influncia da suplementao de nitrognio e combinao desses dois fatores, que
inclusive tiveram influncia negativa no processo.

87

Figura 4.6- Digrama de Pareto mostrando a influncias das variveis adio de


fonte de nitrognio (N) e umidade (U) na produo de CMCase na fermentao semislida da biomassa da palma lavada (PL)

O modelo de regresso de primeira ordem proposto para a operao com palma


lavada (PL) est na Equao 4.2. Os parmetros em negrito so aqueles
estatisticamente significativos com 95% de confiana. Os coeficientes negativos na
equao do modelo indicam que nos nveis mais baixos destas variveis onde se
obtm os maiores valores da resposta analisada.

CMCase=2,0457+1,702U - 0,126N - 0,132UN

(4.2)

O ajuste do modelo exibido na Equao 4.2 foi de 0,94; indicando que o modelo
linear adequado para a representao deste processo. Como a influncia da
suplementao com nitrognio e sua interao com o valor de umidade no so
estatisticamente significativos, o modelo pode ser simplificado para (Equao 4.3):

CMCase = 2,045 + 1,702U

(4.3)

88

A anlise de varincia (ANOVA) para os ensaios com PL encontra-se na Tabela


4.4.

Tabela 4.4- Anlise de varincia ANOVA para os resultados do planejamento


experimental da fermentao com a biomassa da palma lavada (PL)
Fonte de variao SQ GL
MQ
Fcalculado
Regresso
12,37 1
12,37
309,25
Resduo
0,15
5
0,04
Falta de ajuste
0,79
1
Erro puro
0,02
2
Total
15,53 6
2
%R
93,56
F tabelado = 6,61
Teste F5%= 46,79

O Teste F na Tabela 4.4 teve um valor superior a 4,0. Portanto o modelo


matemtico obtido pode ser usado para fins preditivos.
Na Figura 4.7 exibida a superfcie de resposta que mostra a influncia dos
parmetros umidade e fonte de nitrognio na obteno de CMCase.

Figura 4.7. Produo de CMCase em funo da adio de fonte de nitrognio (N)


e umidade (U) na fermentao semisslida da biomassa da palma lavada (PL)
.

89

A superfcie da Figura 4.7 mostra a grande influncia que a umidade tem na


produo de CMCase. Porm, neste caso, a suplementao com fonte de nitrognio
reduziu a produo de atividade CMCase pelo Thichoderma reesei LCB 048.
Portanto, as condies operacionais do Ensaio 2 para a fermentao da palma
lavada (PL), com umidade inicial de 90% e nenhuma suplementao a melhor
condio operacional para o processo fermentativo usando a palma lavada.
Comparando-se os dois processos, percebe-se que a lavagem da palma apenas
diminui o tempo em que o complexo celuloltico comea a ser produzido, no
influenciando muito na obteno das celulases. Alm disso, devido s caractersticas
hidroflicas e viscosas que as partculas da palma apresentam quando triturada, o
processo de lavagem torna-se difcil e consome muita gua (cerca de 200 litros de
gua corrente para cada quilo de palma cortada e triturada), o que faz esse processo
invivel, principalmente em regies semiridas. Alm disso, o maior valor de atividade
foi obtido para a palma sem lavar (PI). Portanto, o pr-tratamento da biomassa da
palma baseado na sua lavagem em gua corrente deve ser descartado.
Uma observao importante a ser feita que a palma in natura possui cerca de
90% em umidade. Isso significa que a conduo de um processo que utilize a palma in
loco no necessita de gua para hidratao do substrato, apenas esterilizao com
vapor mido, no havendo necessidade de suplementao.
Embora esse teor de umidade se distancie um pouco do conceito de fermentao
semisslida, o meio de cultura no fica to lquido como em uma fermentao
submersa, pois a biomassa da palma absorve muita gua, tanto que aps a
esterilizao (autoclave a 121 C por 15 minutos) o meio torna-se bastante pastoso. Foi
observado que o desenvolvimento dos fungos d-se principalmente na superfcie do
substrato.

4.3 EXTRAO DAS ENZIMAS

A Tabela 4.5 mostra os resultados do ensaio de lixiviao realizado a partir de


uma fermentao conduzida nas melhores condies de umidade, concentrao de
fonte de nitrognio e tempo que proporcionou a maior atividade das enzimas CMCase
para PI e PL.

90

Tabela 4.5 - Resultados obtidos na variao dos parametros agitao (Ag), tempo de
contato (tc) e relao solvente/substrato (Re) na extrao da CMCase produzida
Ensaio Ag (rpm) tc (min) Re (mL/g) CMCase (U/gds)

*Concentrao
de CMCase (U/mL)

-1(50)

-1 (15)

-1 (2)

2,623 0,045

0,013

+1(150)

-1 (15)

-1 (2)

2,678 0,067

0,013

-1 (50)

+1 (45)

-1 (2)

2,695 0,025

0,013

+1 (150)

+1(45)

-1 (2)

2,519 0,056

0,013

-1 (50)

-1 (15)

+1 (5)

6,036 0,071

0,012

+1 (150)

-1 (15)

+1(5)

5,974 0,143

0,012

-1 (50)

+1(45)

+1(5)

5,816 0,116

0,012

+1 (150)

+1 (45)

+1(5)

5,473 0,169

0,011

0 (100)

0 (30)

0 (3,5)

4,060 0,217

0,012

10

0 (100)

0 (30)

0 (3,5)

4,039 0,121

0,012

11

0 (100)

0 (30)

0 (3,5)

4,153 0,090

0,012

*Obs:Os desvios dos valores de concentrao foram todos inferiores a 0,001 U/mL.

Os valores de CMCase para os ensaios de 1 a 4; de 5 a 8 e de 9 a 11 foram muito


prximos. Estes ensaios tinham em comum o mesmo valor do parmetro relao
solvente/substrato (RE).
O menor valor de atividade recuperada (2,519 U/gds) foi para o quarto ensaio,
que teve tempo e agitao mximos e relao RE mnima. O maior valor observado, de
6,036 U/gds foi para o ensaio 5, que teve tempo e agitao mnimos, mas relao
mxima.Valores intermedirios a esse foram observados nos pontos centrais.
Alm disso, foi verificado que a utilizao de menores volumes de solvente no
contribui significativamente para a obteno de extratos mais concentrados em
atividade enzimtica, uma vez que a concentrao enzimtica variou muito pouco em
funo da variao do volume de tampo adicionado (os valores de atividade nos
extratos variaram entre 0,011U/mL e 0,013U/mL), revelando que no se obtm extratos
brutos mais concentrados ao se trabalhar com pequenos volumes de tampo.
Aparentemente, o principal obstculo recuperao das celulases sua baixa
solubilidade. Os valores de concentrao nos extratos foram prximos porque o
tampo, provavelmente ficou saturado de enzimas em todos os ensaios, o que justifica

91

uma maior recuperao de atividade do meio fermentado com o aumento do volume de


tampo.
O

grfico

de

pareto,

exibido

na

Figura

4.8,

mostra

que

relao

solvente/substrato o parmetro que mais influencia neste processo, embora os


demais parmetros e suas interaes tambm sejam estatsticamente significativos no
nvel de confiana de 95%.

Figura 4.8 Influncia dos parametros testados na extrao de CMCase

O grfico de Pareto mostra ainda que a contribuio da agitao e sua interao


com o tempo de contato tem influncia negativa no processo. Para os mais altos
valores de tempo de contato e agitao houve uma reduo na atividade enzimtica,
causada possivelmente pela agitao do meio, o que pode ter danificado a estrutura
das enzimas, diminuindo sua atividade.
O modelo de regresso linear proposto mostrado na Equao 4.4, no qual:
A=Agitao, B= tempo de contato e C=relao solvente/substrato

CMCase= 3,8241+0,434A+0,399B+1,0980C + 0,564AB+0,464AC+ 0,421BC


-0,506ABC

(4.4)

A tabela 4.6 mostra a anlise de anlise de varincia para os resultados obtidos


nos ensaios do planejamento fatorial para o estudo da extrao.

92

Tabela 4.6 - Anlise de varincia ANOVA para os ensaios de extrao


Fonte de variao
Regresso
Resduo
Falta de ajuste
Erro puro
Total
%R2
F tabelado = 8,89

SQ GL
20,16 7
0,26
3
0,28
1
0,007 2
20,45 10
98,60

MQ
2,88
0,09

Fcalculado
33,23

Teste F5%= 3,73

Como o valor do Teste F foi inferior a 4,0 o modelo significativo, mas no


preditivo para representar a operao de lixiviao com valores de parmetros fora da
faixa estudada.
Os valores testados para a relao solvente/substrato foram pequenos porque
se pretendia obter extratos mais concentrados. Porm, foi demonstrado que a
recuperao de atividade do meio slido fermentado proporcional razo
solvente/soluto empregada. Ou seja, possvel uma recuperao maior de atividade
com o aumento do volume de tampo. H trabalhos na literatura em que foram usadas
relaes de at 20 mL/g para a recuperao de celulases (AMORIM, 2010).
Os resultados obtidos neste trabalho so similares aos encontrados por Pirota et
al. (2013) que estudaram a lixiviao de endoglucanases produzidas por Aspergillus
niger na fermentao semisslida do farelo de trigo. Usando um planejamento
experimental, os autores verificaram a influncia da temperatura, da razo
solvente/substrato e da agitao na recuperao da atividade celuloltica produzida no
meio fermentado. O estudo mostrou que apenas a relao solvente/substrato era
estatisticamente significativa e que as condies mais favorveis para a extrao de
endoglucanases era a utilizao de tampo acetato de sdio 0,2 mol / L, pH 4,8 como
solvente, tempo de contato de 10 minutos e uma relao solvente/substrato de 9:1
(9mL/g).
Como o maior valor de relao solvente/substrato testado neste trabalho foi de
5:1, houve a necessidade de verificar se era possvel aumentar a atividade recuperada
do meio de fermentao pelo aumento da relao solvente substrato. Portanto, um
novo teste foi realizado, variando-se apenas a razo (RE) nos valores de 7,5:1; 10:1;

93

15:1 e 20:1. O tempo de contato foi fixado em 15 minutos, com agitao de 50rpm a
temperatura de 28C. Os resultados deste teste esto na Tabela 4.7.

Tabela 4.7- Resultados das atividades CMCases obtidas para as relaes


solvente/substrato testadas
Ensaio Relao (mL/g) CMCase (U/gds)
1

7,5

7,501 0,124

10

9,214 0,625

15

12,632 0,190

20

15,145 0,292

Como pode ser observado na Tabela 4.7; a utilizao de uma relao


solvente/substrato adequada favorece uma maior recuperao da atividade produzida.
Portanto, pode-se afirmar que o fungo Trichoderma reesei LCB 048 chegou a produzir
atividades de at 15,145 U/gds em 110 horas de fermentao semisslida de palma
forrageira suplementada com 1% de fonte de nitrognio e umidade de 90%. A
produtividade nesse caso foi de 0,137 (U/gds.h). Em relao ao ensaio 5 da Tabela 4.7
no qual foi utilizado uma razo solvente/substrato de 5:1 (mL/g), o ensaio no qual se
utilizou 20:1 (mL/g) apresentou um aumento na recuperao da atividade produzida no
meio semisslido de cerca de 150%.
As superfcies de resposta da Figura 4.9 ilustram a ao dos parmetros da
lixiviao sobre a atividade recuperada do meio fermentado. Mais uma vez fica
evidente a influncia do parmetro Relao solvente/substrato (RE) na atividade
recuperada.

94

Figura 4.9. Atividade CMCase em funo da agitao e relao (A);Tempo de contato


e relao (B); e tempo de contato e agitao (C)

C
As Figuras 4.9A e 4.9B mostram a grande influncia que tem a varivel relao
solvente/substrato no processo de lixiviao, pois para os valores mais altos deste
parmetro que se observam as maiores atividades em CMCase. A Figura C mostra
que o tempo de contato (tc) e a agitao (Ag) tm influncia positiva no processo.
possvel que a influncia da relao solvente/substrato (Re) seja to elevada que
mascare as influencias do tempo de contato e agitao.
Segundo Fernndez e colaboradores (2012), a relao entre a quantidade de
slido a tratar e o volume de solvente de grande importncia. A intensidade e o
carter do processo de extrao slido-lquido dependem em grande parte da
difusividade do soluto na frao do solvente selecionado, assim como da concentrao

95

de saturao do soluto no solvente, pois est diretamente relacionado com a fora


motriz do processo. Por outro lado, necessrio levar em considerao que um grande
volume de solvente na extrao dos solutos aumenta consideravelmente os custos de
purificao e recuperao do produto de interesse.

4.3.1 - Recuperao de enzimas por precipitao

Foram testadas duas tcnicas de precipitao utilizadas para recuperao de


protenas: A precipitao com etanol e a precipitao com adio de sulfato de amnio.

4.3.1.1 - Precipitao com etanol

Os resultados do ensaio de precipitao do complexo enzimtico com etanol


esto na Tabela 4.8

Tabela 4.8- Atividade recuperada por precipitao com etanol


Ensaio

Concentrao de
etanol

CMCase (U/gds)

Recuperao

Extrato bruto

3,64 0,11

50%

0,81 0,02

22,25 %

67%

0,47 0,05

12,91 %

75%

0,51 0,05

14,01 %

Para os ensaios de precipitao foram utilizados extratos fermentados brutos com


atividade em CMCase de 3,64 U/gds. Na Tabela 4.8, a coluna recuperao refere-se
ao percentual dessa atividade original que foi precipitada pela adio de etanol.
Observa-se que a precipitao com etanol no foi eficiente, pois foi recuperada por
precipitao no mximo 22,25% da atividade contida no extrato bruto. A melhor
recuperao foi para a adio de etanol na razo de 1:1.
Nos ensaios 2 e 3 foi precipitada uma quantidade visivelmente maior de protenas,
porm o precipitado apresentava aspecto gelatinoso, uma evidncia de desnaturao
protica.
Mawadza et al. (2000) usaram acetona a 55% na precipitao de celulases
produzidas por Bacillus strains. A recuperao das enzimas foi realizada por

96

cromatografia, entretanto s foram recuperados 12% da atividade inicial do extrato


bruto.

4.3.1.2 - Precipitao com Sulfato de amnio

Dentre as fraes de concentrao testadas, 20, 40, 60 e 80 % (p/v), a de 20 %


no apresentou turvao. As fraes de 40, 60 e 80% apresentaram turvao
crescente, sendo a de 80% a que apresentou maior turvao, portanto maior efeito
salting out. Porm, o precipitado formado era visivelmente pulverulento e no
apresentou tendncia de sedimentao. Alm disso, o extrato apresentava-se um
pouco viscoso. Nas condies de centrifugao testadas no houve a formao do
pelet, nem a deteco de atividade enzimtica. Leite et al (2003) atestam que tal
tcnica no eficiente quando se tem extratos muito diludos.
Leite e colaboradores (2007) utilizaram uma saturao de 80% de sulfato de
amnio para precipitar -glicosidases de Aureobasidium pullulans e Thermoascus
aurantiacus, centrifugando a mistura a 10.000 rpm por 20 minutos, obtendo rendimento
de 91,5%.
Entretanto, Santos (2011), estudando a precipitao de celulases produzidas por
uma linhagem mutante de Aspergillus niger, em farelo de trigo, nas mesmas condies
que este trabalho obteve recuperaes de 18,3% para FPase; 88,4 para CMCase; 64,4
% para -glicosidase e 108,6% para protease. Ainda de acordo com o autor, a
presena de proteases no complexo enzimtico no desejvel, j que as proteases
podem promover a desnaturao de enzimas.
De qualquer forma, a etapa de precipitao, seja com sal ou com solvente, embora
tenha ampla utilizao em ensaios de bancada, no parece uma alternativa adequada
para uma planta, como uma biorrefinaria implantada no semirido, pois, alm de no
serem eficientes para tal substrato, tais tcnicas utilizariam grandes quantidades de sal
ou etanol, aumentando os custos do processo e o volume de rejeitos.

4.4 CARACTERIZAO DAS ENZIMAS

4.4.1 Temperatura tima da atividade CMCase

O efeito da temperatura na atividade CMCase mostrado na Figura 4.10.

97

Atividade residual (%)

Figura 4.10. Efeito da temperatura na atividade enzimtica


100
80
60
40
20
0
25

40

55
70
Temperatura (C)

85

100

Como mostra o grfico da Figura 4.10, o extrato apresentou atividade CMCase


mxima na temperatura de 55C. Este resultado concorda com os de Akcapinar, Gul e
Sezerman (2012), que ao estudarem o efeito da temperatura de endoglucanases
produzidas por Trichoderma Reesei e Pichia pastoris, determinaram que a atividade
mxima (CMCase) era obtida em temperaturas entre 45 e 55 C.

4.4.2 pH timo

Os valores de atividade CMCase testados nos pHs entre 2,5 e 8,5 so exibidos na
Figura 4.11.

Figura 4.11. Efeito do pH na atividade enzimtica

Atividade residual (%)

120
100
80
60
40
20
0
2

pH

98

A atividade enzimtica de complexos enzimticos excretados por fungos tm


atuao na faixa de pH cida. Os maiores valores de atividade foram obtidos para pHs
entre 4,0 e 5,0. A partir do pH 5,0; a atividade enzimtica decaiu acentuadamente, no
sendo mais detectada em pH 7,0.
Este resultado similar aos encontrados por Akcapinar, Gul e Sezerman (2012)
determinaram que o pH timo para endoglucanases produzidas por Trichoderma
Reesei e Pichia pastoris era 5,0.
Os valores de pH e temperatura tima encontrados neste trabalho concordam
tambm com os obtidos por Medina, Nez e Ordeez (2010), que encontraram como
valores timos a temperatura de 50C e o pH de 5,3 para o complexo celuloltico
produzido pelos fungos Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius e Lentinula edodes,
na fermentao semisslida da biomassa da bananeira.
Portanto, no que diz respeito ao comportamento quanto ao pH e temperatura, a
enzima produzida por Trichoderma reesei LCB 48 similar ao apresentado pelo
complexo enzimtico de outros fungos, at mesmo quando induzidos por outras
matrias-primas.
Os mtodos presentes no protocolo da IUPAC, preparado por Ghose (1987), para
medio da atividade celuloltica de extratos enzimticos produzidos por fungos so
conduzidos em pH 4,8 e temperatura de 50C, por serem estes valores timos de pH e
temperatura normalmente apresentados por celulases fngicas.

4.4.3 Estabilidade enzimtica frente ao pH

Mudanas no pH de um determinado meio podem alterar a estrutura das enzimas


presentes por meio de interaes de natureza eltrica. Mudanas brandas no valor do
pH podem promover a dissociao da enzima, que tanto podem lev-la a formas mais
ativas quanto promoverem sua desativao (Nelson e Cox, 2011).
O grfico da Figura 4.12 representa a atividade residual do extrato, em CMCase,
aps inoculao por 24 horas em diferentes valores de pH.

99

Figura 4.12. Atividade residual do extrato aps inoculao em diferentes valores de


pH.

Atividade Residual (%)

140,0
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
0

6
pH

10

12

A atividade residual foi calculada em relao atividade do extrato no pH padro


de leitura da atividade CMCase (pH 4,8), ao qual foi atribudo o valor de 100%
(0,210U/mL). Conforme pode ser observado na Figura 4.13, a incubao do extrato
bruto em valores de pH superiores a 4,8 promoveram um aumento da atividade
CMCase, atingindo o valor mximo de 26% quando a enzima foi incubada no pH de 6,5
(0,265 U/mL). Porm, em valores de pH acima de 6,5 a atividade enzimtica sofre uma
reduo muito brusca, sofrendo desativao irreversvel em valores de pH acima de
7,0. No pH de 10,7 a atividade residual era de apenas 3% (0,006 U/mL). Tal
comportamento indica que a enzima possui baixa estabilidade frente ao pH.
Os valores encontrados so similares aos apresentados na literatura para
celulases fngicas. Gao et al. (2008) verificaram que as celulases CMCase e

glicosidase produzidas por Aspergillus terreus M11 em substrato de palha de milho


exibem considervel estabilidade na faixa de pH de 2 a 5.
4.4.4 Estabilidade enzimtica da CMCase frente temperatura

A estabilidade da CMCase frente temperatura mostrada na Figura 4.13, na


forma de atividade residual

100

Figura 4.13. Atividade residual do extrato aps inoculao a diferentes valores de


temperatura

Atividade Residual (%)

100
80
60

T= 50C
T= 60C

40

T= 70C
T= 80C

20
0
0

20

40
60
Tempo (min)

80

100

A enzima CMCase produzida mostrou-se sensvel temperatura, desativando-se


irreversivelmente durante o perodo de incubao. Alm disso, houve diminuio da
atividade com o tempo de incubao em todas as temperaturas estudadas. A reduo
de atividade foi mais rpida nas temperaturas mais elevadas. Na temperatura de 50C,
a enzima ainda apresentava mais de 40% de sua atividade inicial em 90 minutos de
incubao. Nas temperaturas superiores a 60C, a enzima j tinha perdido mais de
80% de sua atividade nos dez primeiros minutos de ensaio, o que demonstra que a
estabilidade da enzima frente temperatura baixa, no sendo adequada sua
utilizao em processos acima de 50C.
Akcapinar, Gul e Sezerman (2012), ao estudarem a termoestabilidade de
endoglucanases produzidas por uma cepa mutante de Trichoderma reesei , verificaram
que as enzimas produzidas por este microrganismo era estvel por at 72 horas na
temperatura de 50 C, mantendo ainda 53% de sua atividade inicial aps este perodo.
Porm, o microrganismo utilizado por esses autores foi modificado geneticamente para
produzir celulases mais estveis.

101

4.5 APLICAO DO EXTRATO ENZIMTICO OBTIDO NA HIDRLISE DA


BIOMASSA DA PALMA.

O extrato enzimtico utilizado nos ensaios de hidrlise apresentou os valores de


atividade exibidos na Tabela 4.9.

Tabela 4.9 Valores de Atividade celuloltica e AR do extrato empregado na hidrlise


Parmetro

Valor

Acares redutores (mg/mL) 0,318 0,013


Atividade CMCase (U/mL)

0,181 0,006

Atividade FPase

0,101 0,005

(U/mL)

Atividade Celobiase (U/mL)

0,028 0,007

Os dados da Tabela 4.9 revelam a presena de acares redutores no extrato


bruto, os quais podem atuar como inibidores da atividade celuloltica.
Quanto a atividade enzimtica, o extrato bruto apresentava maior atividade de
CMCase e menor atividade de celobiase, sendo o valor de atividade FPase
praticamente intermedirio. De acordo com Ogeda e Petri (2010), o Trichoderma reesei
produz um extrato enzimtico que pode conter no mximo 4% de enzimas que atuam
sobre a celobiose, as -glucosidases, por isso chamadas de celobiases, Ainda
segundo esses autores, parte das celulases excretadas por esse fungo atuam sobre
carboximetilcelulose (cerca de 45%). Isso explica porque a atividade em CMCase no
extrato foi superior a de celobiase. A FPase depende da ao sinrgica das demais
enzimas do complexo, por isso apresentou atividade intermediria.
Como foram empregados 50 mL do extrato para cada balo contendo 1g de
biomassa ou de resduo da fermentao, havia na mistura reacional um total de 9,05U
de CMCase; 5,05 U de FPase e apenas 1,4 U de celobiase. A Figura 4.14 mostra um
aumento na concentrao de acares redutores (glicose) durante o perodo de 52
horas de processo, o que significa que as enzimas presentes no extrato foram capazes
de catalisar a clivagem da celulose da biomassa da palma e do resduo da fermentao
da palma em acares redutores. Os resultados da hidrlise so mostrados na Figura
4.14.

102

Figura 4.14- Ensaio de hidrlise da biomassa da palma e do resduo da


fermentao semisslida pelas enzimas obtidas na fermentao
3,5
3,0

AR (g/L)

2,5
2,0
1,5

Biomassa pr-tratada

1,0

Resduo da fermentao prtratado

0,5
0,0
0

10

20

30

40

50

tempo (h)
Observa-se que, para um tempo de 48 horas houve em geral um aumento na
concentrao de AR. Para a biomassa pr-tratada, observou-se um aumento de 0, 442
g/L para 3,016 g/L, o que corresponde a um aumento de 6,8 vezes. J para o resduo
da fermentao, a variao do teor de AR no mesmo perodo foi de 0,335 g/L para
2,287g/L, o que corresponde tambm a um aumento de cerca de 6,8 vezes. Nesse
perodo, a produo de AR foi de 2,57g/L para a biomassa pr-tratada e 1,95 g/L para
o resduo da fermentao pr-tratado.
Observa-se que, j nas primeiras horas do processo, h a converso de celulose
em glicose (ARBiomassa e ARResduo, para a hidrlise da biomassa e do resduo da
fermentao respectivamente), sendo que por volta de 6,5 horas do incio do processo,
a taxa de converso diminui. A produtividade mxima ocorre nas primeiras horas do
processo. Os valores de produtividade (PBiomassa e PResduo) so exibidos na Tabela 4.10.

103

Tabela 4.10. Produtividade de AR durante o processo de hidrlise da biomassa da


palma e do resduo da fermentao semisslida

0,00 0,00

0,00 0,00

PBiomassa
(mg/L.h)
0

66,87 0,01

61,65 0,00

334,4

308,2

88,42 0,00

81,48 0,00

252,6

232,8

17

102,60 0,04

80,41 0,00

120,7

94,6

21

105,10 0,01

75,90 0,08

100,2

72,2

25

112,41 0,01

76,61 0,00

90,0

61,2

28

118,36 0,01

76,76 0,01

84,6

54,8

41

128,66 0,01

97,60 0,01

62,8

47,6

Tempo (h) AR Biomassa (mg)

ARResduo (mg)

PResiduo
RF (mg/L.h)
0

Ogeda e Petri (2010) apontam que a reduo na produtividade de glicose pode ser
causada por inibio pelos produtos da hidrlise, como glicose e celobiose. Portanto,
esta etapa pode ainda ser otimizada, seja com o aumento da concentrao do extrato
ou com o melhoramento do pr-tratamento da biomassa da palma. Destaca-se ainda
que este ensaio demonstrou ser o resduo da fermentao semisslida da palma
forrageira uma fonte de celulose que pode ser hidrolisada. Portanto a biomassa
utilizada na fermentao pode ser reaproveitada no processo de hidrlise subsequente.
Embora os valores de converso obtidos sejam baixos, deve-se levar em
considerao o fato do extrato bruto no ter passado por nenhum processo de
concentrao e apresentar valores baixos de atividade por encontrar-se diludo.
Sukumaran et al. (2009), por exemplo, obtiveram extratos contendo os produtos da
hidrlise de bagao de cana; palha de arroz e biomassa de aguap. A concentrao de
AR ao final de 48h de hidrlise foi de 14,20 g/L; 26,30 g/L e 17,79 g/L. Porm, o extrato
enzimtico de Trichoderma Reesei RUT 30 produzido na fermentao semisslida do
farelo de trigo, que apresentava valores iniciais de atividade FPase e CMCase de
1,4U/mL e 14,98 U/mL respectivamente, teve seus valores de atividade aumentados
para 13,65 e 45,22 U/mL respectivamente, mediante precipitao com acetona gelada
na razo de 4:1 (4 partes de acetona para cada parte de extrato).
Ogeda e Petri (2010) ressaltam que a hidrlise enzimtica de materiais
lignocelulsicos geram glicose e celobiose, que por serem inibidores das celulases

104

acabam diminuindo o rendimento da operao. Este problema pode ser contornado


com adio de mais celulases, ou o uso de extratos mais concentrados, o que eleva os
custos. Uma soluo apontada por estes autores seria o processo conhecido como
sacarificao simultnea e fermentao (SSF), no qual o microrganismo fermentador
adicionado no mesmo vaso em que ocorre a hidrlise, convertendo imediatamente a
glicose e celobiose geradas em etanol, evitando perda de atividade. Alm disso, o
etanol produzido impede o desenvolvimento de microrganismos oportunistas, que
degradariam os acares produzidos.
Lever, Ho e Cord-Ruwish (2010) concordam que a sacarificao e fermentao
simultnea o melhor caminho. Os autores defendem ainda que o processo seja
realizado no mesmo local em que a matria lignocelulsica gerada, de preferncia
sem tratamento algum do extrato fermentado bruto, como foi feito nesta pesquisa, de
forma a reduzir os custos.

4.6 PARTIO DE CELULASES POR MEIO DE SABS

O extrato bruto utilizado nos ensaios de partio no passou por nenhum


tratamento alm da centrifugao, tendo sido obtido diretamente da etapa de lixiviao,
nas melhores condies do processo. As caractersticas do extrato enzimtico bruto
utilizado nos ensaios esto exibidas na Tabela 4.11.

Tabela 4.11 - Caractersticas do extrato usado nos ensaios de partio


Parmetro

Valor

pH

4,8 0,01

Densidade (g/ml)

1,00 0,05

Teor de protenas solveis (g/ml)

32,3 2,9

Acares redutores (mg/mL)

0,248 0,000

Atividade CMCase (U/mL)

0,104 0,008

Atividade FPase

0,055 0,005

(U/mL)

Atividade Celobiase (U/mL)

0,033 0,001

A Tabela 4.11 mostra que o extrato bruto apresentava reduzido teor de protenas
solveis.

105

Aps a formao dos SABs, constatou-se que a fase superior era rica em PEG e a
fase inferior era rica em citrato de sdio.
4.6.1 Atividade de CMCase

Os valores dos parmetros: coeficiente de partio de protenas (Kp), coeficiente de


partio de CMCase (KCMC); fator de purificao na fase inferior (FPb), fator de
purificao na fase superior (FPt), recuperao da enzima na fase inferior dos SABs
(Yb) e recuperao da enzima na fase superior dos SABs (Yt) esto exibidos na Tabela
4.12, alm dos valores de Massa molar de PEG (MM), composio de PEG (P),
composio de citrato (C) e pH utilizados nos ensaios.

Tabela 4.12. Parmetros de partio para a enzima CMCase


E

MM

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
6000
6000
6000
6000

P (%) C (%)
18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
20
20
20
20

12
12
12
12
16
16
16
16
12
12
12
12
16
16
16
16
14
14
14
14

pH

Kp

KCMC

FPb

FPt

Yb (%)

Yt (%)

5
5
5
5
5
5
5
5
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
6

0,07
0,16
0,14
0,11
0,22
0,67
2,48
1,26
0,81
0,55
0,60
0,55
2,42
3,33
1,74
2,41
1,28
1,17
1,13
1,03

0,72
0,55
0,84
0,64
0,85
0,62
1,37
0,99
1,21
0,79
2,08
1,57
5,16
2,40
18,20
4,25
2,03
2,34
2,77
3,14

0,53
0,79
0,56
0,67
0,75
1,28
1,89
1,57
0,77
0,85
0,44
0,58
0,45
1,07
0,10
0,45
0,60
0,58
0,49
0,39

5,31
2,71
3,38
3,87
2,90
1,19
1,05
1,22
1,15
1,24
1,53
1,60
0,92
0,77
1,09
0,74
0,95
1,16
1,20
1,18

36,22
50,09
33,61
42,31
47,94
57,92
30,59
41,92
38,78
52,35
23,82
29,10
16,00
31,78
4,26
17,43
28,73
25,59
22,42
20,35

63,78
49,91
66,39
57,69
51,74
42,08
69,41
58,08
61,22
38,51
76,18
70,10
83,43
68,22
95,74
81,72
71,27
74,41
77,58
79,65

O valores do coeficiente de partio de protenas, Kp, mostrados na Tabela 4.12


revelou que as protenas particionaram-se preferencialmente para a fase inferior, rica
em citrato, nos ensaios conduzidos a pH 5,0. O valor mais expressivo foi observado
para o ensaio 1, que presentava os menores valores dos nveis testados no

106

planejamento. Neste mesmo ensaio foi observado o maior valor do fator de purificao
da CMCase (FPCMC), o qual foi de 5,31 vezes.
As enzimas CMCases particionaram-se preferencialmente para a fase superior, rica
em PEG, em quase todos os ensaios. Aparentemente, o aumento do pH contribuiu
para uma maior partio das enzimas na fase superior dos SABs. O ensaio 15 foi o que
apresentou o maior valor de partio de CMCase (KCMC = 18,20).
Alvarez, Mendoza e Hernndez (2009), tambm verificaram a preferncia das
CMCases pela fase rica em Peg ao estudarem a partio de celulases produzidas por
Aspergillus niger em SABs formados por PEG 1500 e tampo fosfato de sdio. Nesse
sistema, os autores observaram uma recuperao de 90% da atividade enzimtica na
fase superior dos SABs. Herculano et al. (2012) estudaram a partio de celulases
produzidas por Aspergillus japonicus URM5620 em SABs formados por PEG e citrato
de sdio. Os autores observaram um coeficiente de partio mximo de 3,03 para o
sistema formado por 20% de PEG1000 e 20% de citrato de sdio em pH 6,0.
O ensaio 15 apresentava os valores mais elevados de concentrao de pH e
concentrao de citrato (%Citrato). Observando-se os resultados de KCMC na Tabela
4.16, percebe-se que o pH e a composio de citrato de sdio (C) tiveram grande
influncia no processo, pois foi nos nveis mais elevados destas variveis que foram
observados os mais altos valores de partio e consequentemente o mais alto valor de
recuperao na fase superior (Yt) que foi de 95,74%.
De acordo com Raja et al. (2011), o efeito do pH no particionamento de protenas
em SABs d-se por meio da alterao da carga da protena. A carga lquida da protena
depende de se o pH maior do que o ponto isoeltrico (negativo), menor que o ponto
isoeltrico (positivo), ou igual ao o ponto isoeltrico (zero). O ponto isoeltrico (PI) das
principais endoglucanases produzidas por Trichoderma Reesei varia entre 3,9 e 7,5
(Ogeda e Petri, 2010); portanto os nveis de pH testados (5,0; 6,0 e 7,0) eram
superiores aos PI de algumas dessas enzimas, carregando-as negativamente. Nessa
situao, a enzima concentra-se preferencialmente na fase superior, elevando o valor
do coeficiente de partio (Raja et al., 2011).
O Fator de purificao (Fp) um parmetro que reflete o aumento de pureza da
enzima em uma das fases do SAB. Esse parmetro revela o quanto a atividade
especfica da fase aumentou em relao atividade especfica do extrato bruto. O valor
mximo observado foi de 5,31 para a fase superior do ensaio 1. Isso significa que na

107

fase superior deste SAB havia proporcionalmente uma relao entre a atividade
enzimtica e a concentrao de protenas totais 5,31 vezes maior que no extrato bruto.
Esse valor superior ao observado por Fisher et al. (2014), que estudaram a
partio do complexo celuloltico produzido pelo Aspergillus niger na fermentao
semisslida de farelo de arroz e bagao de cana. Os autores observaram um fator de
purificao mximo de 2,0 quando trabalharam com SABs compostos por 22% PEG
2000 e tampo citrato de pH 7,0.
De acordo com Fisher et al. (2014) a purificao no ocorre de forma homognea
para todas as enzimas do complexo celuloltico. A influncia dos valores dos
parmetros testados na varivel-resposta fator de purificao na fase superior dos
SABs, FPt , exibida no diagrama de Pareto da Figura 4.15.
Figura 4.15. Diagrama de Pareto para o fator de purificao da CMCase

Uma vez que o processo de purificao de uma determinada protena em SABs


um processo complexo, influenciado por muitas variveis, no possvel avaliar ou
perceber a contribuio de cada parmetro individual quando se varia mais de uma
varivel ao mesmo tempo, apesar disso, os resultados do planejamento experimental
pode revelar algumas tendncias.
O diagrama de Pareto da Figura 4.15 mostra que os valores do FPt foram
fortemente influenciados pelos valores de pH e da concentrao de citrato. Porm,
estas variveis apresentam efeito negativo na varivel resposta FPt, o que significa que

108

so nos menores valores destes parmetros que so obtidos os valores mais elevados
de fator de purificao ou aumento de pureza. A massa molar do PEG (MPEG) tambm
apresentou efeito negativo.
O modelo de regresso linear de primeira ordem apresentado na Equao 4.5 foi
proposto para a avaliao do Fator de purificao das CMCases, FPt. Os valores em
negrito so os estatisticamente significativos a 95% de confiana. Como a eliminao
de variveis no estatisticamente significativas ao nvel de 95% no resultou em
melhorias no modelo, elas foram mantidas. No modelo, A= Massa molar do PEG; B=
Composio de PEG; C= Composio de citrato e D= pH
FPt= 1,758 0,249A 0,682B 0,682C 0,787D +0,297AB 0,006AC +
0,207AD 0,103BC + 0,217BD + 0,332CD 0,087ABC 0,324ABD

(4.5)

0,077ACD + 0,028BCD

O modelo da Equao 4.5 apresentou R2 igual a 0,92; sendo capaz de explicar 92%
das variaes presentes no processo. A anlise de varincia (ANOVA) para este
processo est na Tabela 4.13.

Tabela 4.13 - ANOVA para o fator de purificao da CMCase


Fonte de variao SQ GL
MQ
Fcalculado
Regresso
26,21 10
2,62
10,08
Resduo
2,35
9
0,26
Falta de ajuste
2,09
2
Erro puro
0,04
3
Total
28,56 19
2
%R
92,56
F tabelado =
3,14
Teste F5%= 3,21
A anlise de varincia para o fator de purificao da CMCase na Tabela 4.13 d um
resultado de 3,21 para o Teste F. Portanto possvel obter um modelo estatisticamente
significativo, porm ele no poder ser usado para fins preditivos, j que o Teste F
apresentou um valor inferior a 4,0 (BARROS NETO, SCARMNIO E BRUNS, 1995).
As superfcies de resposta da Figura 4.15 mostram a influncia das trs variveis
que mais afetam o valor do Fator de purificao: pH, concentrao de citrato (%
Citrato) e massa molar do PEG (M PEG) no FPt da CMCase.

109

Figura 4.15. Superfcies de resposta mostrando a influncia dos parmetros


testados no fator de purificao da CMCase (FP t): A =Influencia da massa molar de
peg (M PEG) e composio de citrato (% Citrato), B= Influencia do pH e composio de
citrato. C= Influencia do pH e massa molar de PEG (M PEG)

As superfcies de resposta da Figura 4.15 mostram que so nos menores nveis das
variveis pH, concentrao de citrato e massa molar de PEG que se obtm os maiores

110

valores do fator de purificao. Tais superfcies mostram ainda, que o aumento no valor
qualquer uma dessas variveis resulta na diminuio do fator de purificao das
CMCases, apresentando efeito negativo para o processo de purificao. Portanto, a
melhor condio experimental para o FPCMC foi com 18% de PEG 4000 e 12% de
tampo citrato pH 5,0.

4.6.2 - Atividade em FPase

Os valores dos parmetros: coeficiente de partio de protenas (Kp), coeficiente de


partio de FPase (KFPase); fator de purificao na fase inferior (FPb), fator de
purificao na fase superior (FPt), recuperao da enzima na fase inferior dos SABs
(Yb) e recuperao da enzima na fase superior dos SABs (Yt) esto exibidos na Tabela
4.14, alm dos valores de Massa molar de PEG (MM), composio de PEG (P),
composio de citrato (C) e pH utilizados nos ensaios.

Tabela 4.14 - Parmetros de partio para a FPase


E

MM

P (%)

C (%)

pH

Kp

KFPase

FPb

FPt

Yb (%)

Yt (%)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
6000
6000
6000
6000

18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
20
20
20
20

12
12
12
12
16
16
16
16
12
12
12
12
16
16
16
16
14
14
14
14

5
5
5
5
5
5
5
5
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
6

0,07
0,16
0,14
0,11
0,22
0,67
2,48
1,26
0,81
0,55
0,60
0,55
2,42
3,33
1,74
2,41
1,28
1,17
1,13
1,03

0,45
2,75
2,96
1,87
2,20
3,04
19,00
3,85
1,40
0,96
1,20
1,13
3,38
1,08
2,83
1,89
9,19
11,53
1,83
4,00

0,04
0,02
0,01
0,04
0,23
0,22
0,09
0,23
0,73
0,68
0,67
0,77
0,85
1,83
0,62
0,94
0,09
0,06
0,33
0,14

0,24
0,43
0,32
0,74
2,29
1,00
0,66
0,70
1,26
1,19
1,34
1,59
1,19
0,59
1,01
0,73
0,65
0,58
0,53
0,55

47,63
16,66
12,54
19,97
26,20
22,02
3,09
15,60
35,33
47,63
35,23
39,50
24,80
51,00
22,24
32,24
8,18
6,54
30,47
16,68

52,37
83,34
87,46
80,03
73,80
77,98
96,91
84,40
64,67
52,37
64,77
63,74
77,48
49,00
77,76
67,76
91,82
93,46
69,53
83,32

111

Os dados de KFPase exibidos na Tabela 4.14 revelam que a enzima FPASE


particionou-se preferencialmente para a fase superior, rica em PEG. O maior valor de
KFPase foi observado para o ensaio 7 (KFPase = 19), que possua os maiores nveis de
composio em PEG e citrato, e os menores nveis de massa molar de PEG e pH
testados, 4000g/mol e 5,0 respectivamente.
Herculano et al. (2012) tambm observaram a partio da FPase para a fase
superior, ao estudarem a recuperao do complexo celuloltico do Aspergillus japonicus
URM5620 por meio de SABs. Os autores observaram valores de coeficiente de
partio de no mximo 2,98 para SABs formados por 24% de PEG1000, 15% de
Citrato e pH 8,0; valor inferior ao obtido neste trabalho.
Neves et al.(2012) observaram um valor de coeficiente de partio de 14,42 para a
fitase produzida por Absidia blakesleeana URM5604, em um SAB composto por 26%
PEG 400 e 20% citrato de sdio em pH 6,0. Assim como neste trabalho, o valor
mximo obtido por esses autores foi observado no SAB de maior concentrao de
PEG, maior concentrao de citrato, menor massa molar de PEG e menor valor de pH.
Conforme mostram os dados de fator de purificao na fase superior dos SABs
(FPt) exibidos na Tabela 4.14 o maior valor de FPt foi encontrado para o ensaio 5, cujo
valor foi de 2,29.
Semelhantemente, Neves et al. (2008) observaram um valor de fator de purificao
de 1,75 para a fitase produzida por Absidia blakesleeana URM5604, em SABs
formados por PEG 8000 e citrato de sdio de pH 6. J Ycekan e nal (2011)
encontraram valores de fator de purificao de at 3,3 para a partio da invertase do
tomate em SABs formados por PEG 2000 e sulfato de sdio em pH 5,0.
Os efeitos observados para os parmetros testados so exibidos no Diagrama de
Pareto da Figura 4.16.

112

Figura 4.16 Influncias dos parmetros testados no fator de purificao de


FPases.

Como pode ser observado na Figura 4.16, as interaes entre os parmetros


apresentaram maior influncia no processo do os valores individuais. A concentrao
de citrato (%Citrato), por exemplo, tem pouca influncia sozinha, mas as combinaes
dessa varivel com cada um dos demais parmetros estudados representam os efeitos
mais significativos do processo.
O pH mostrou-se uma varivel importante, pois foi a que apresentou maior efeito
isoladamente. Porm, seu efeito positivo inferior ao efeito negativo produzido pela
interao dessa varivel com a concentrao de citrato, de efeito negativo. Alm disso,
a interao da concentrao de citrato com a massa molar do PEG e a concentrao
de PEG tambm apresentaram efeitos significativamente elevados e negativos, sendo
essas interaes as variveis que mais influenciam no valor de FPFPASE. Essa
afirmao corrobora com o fato de que o maior valor de FP FPASE foi observado no
ensaio 5 da Tabela 4.14 (2,29), o qual apresentava o nvel mximo de concentrao de
citrato e os nveis mnimos das demais variveis.
Um modelo de regresso de primeira ordem proposto para este processo est na
Equao 4.6. As variveis em negrito so estatisticamente significativas a 95%.
FPt = 0,8795 0,1675A 0,1375B + 0,1325C + 0,3150D + 0,2750AB
0,3650AC - 0,0075AD 0,3550BC + 0,2475BD 0,5975CD + 0,1375ABC
0,1150ABD + 0,1000ACD + 0,2250BCD

( 4.6)

113

O modelo da Equao 4.6 apresentou R2 igual a 0,88. Ele capaz de explicar 88%
das variaes apresentadas pelo processo.
A anlise de Varincia exibida na Tabela 4.15 foi utilizada se verificar a consistncia
do modelo proposto:

Tabela 4.15- Anova para o fator de purificao de FPase


Fonte de variao
Regresso
Resduo
Falta de ajuste
Erro puro
Total
%R2
F tabelado = 3,96

SQ GL
4,039 13
0,540 6
0,531 2
0,008 3
4,579 19
88,2

MQ
0,311
0,090

Fcalculado
3,45

Teste F5% = 0,87

A anlise de varincia mostrada na Tabela 4.15 para o fator de purificao de


FPase apresentou valor do Teste F inferior unidade. Portanto, o modelo sugerido no
representa adequadamente as influncias dos parmetros no processo, devendo ser
descartado.
As superfcies de resposta da Figura 4.17 foram construdas para a obteno de
tendncias a respeito da influncia das variveis que mais influenciam no Fator de
purificao da FPase.

114

Figura 4.17 - Superfcies de resposta mostrando a influncia dos parmetros


testados no fator de purificao da FPase (FPt): A = Influencia do pH e composio de
citrato B= Influncia da massa molar de peg (MPeg) e composio de citrato (%
Citrato), C= Influncia do pH e massa molar de PEG (MPeg)

A Figura 4.17 A, embora no mostre uma relao muito clara entre os parmetros
pH e concentrao de citrato (% Citrato) no fator de purificao da FPase, mostra que
valores baixos de pH, assim como valores baixos de concentrao de citrato no
contribuem para o aumento no fator de pureza da FPase (FP t). Na Figura 4.17 B, podese perceber que altas concentraes de citrato favorecem o fator de purificao,e que a

115

massa molar do PEG, contribui muito pouco no processo, ou seu efeito muito
pequeno quando comparado ao da concentrao de citrato. Porm, PEGs de massas
molares menores contribuem para o aumento de FPt. A Figura 4.17 C tambm mostra
que so nos menores valores de massa molar de PEG que so observados os mais
elevados valores de FPt. O aumento do pH aumenta o fator de purificao das FPases
(FPt)
4.6.3 - Atividade em Celobiase

Os valores dos parmetros: coeficiente de partio de protenas (Kp), coeficiente de


partio de Celobiase (KCelo); fator de purificao na fase inferior (FPb), fator de
purificao na fase superior (FPt), recuperao da enzima na fase inferior dos SABs
(Yb) e recuperao da enzima na fase superior dos SABs (Yt) esto exibidos na Tabela
4.12, alm dos valores de Massa molar de PEG (MM), composio de PEG (P),
composio de citrato (C) e pH utilizados nos ensaios.

Tabela 4.16 - Atividade em celobiase


E

MM

P (%)

C (%)

pH

Kp

KCelo

FPb

FPt

Yb (%)

Yt (%)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
4000
8000
6000
6000
6000
6000

18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
18
18
22
22
20
20
20
20

12
12
12
12
16
16
16
16
12
12
12
12
16
16
16
16
14
14
14
14

5
5
5
5
5
5
5
5
7
7
7
7
7
7
7
7
6
6
6
6

0,07
0,16
0,14
0,11
0,22
0,67
2,48
1,26
0,81
0,55
0,60
0,55
2,42
3,33
1,74
2,41
1,28
1,17
1,13
1,03

0,83
0,70
0,85
0,75
4,97
3,2
0,86
0,52
4,90
0,89
0,47
0,47
0,81
0,69
0,79
0,30
1,04
1,22
1,57
1,02

5,43
7,23
4,98
6,10
0,92
2,03
26,05
17,31
1,89
4,21
16,29
16,39
27,25
32,27
13,82
32,84
24,53
21,36
21,56
18,95

61,64
31,93
30,57
38,26
21,10
9,74
9,01
7,16
11,42
6,82
12,66
14,14
9,06
6,72
6,29
4,12
19,90
22,15
29,87
18,95

33,23
43,88
33,23
39,34
13,58
21,15
41,40
57,72
13,48
49,58
58,24
57,78
54,91
61,74
50,51
74,78
44,11
39,88
33,82
43,98

66,77
56,12
66,77
61,69
86,42
78,85
58,60
42,28
86,52
50,42
41,76
42,22
45,9
38,26
49,49
25,22
44,11
39,88
33,82
43,98

116

Os valores obtidos para o coeficiente de partio de celobiase, K CELO, foram


bastante variveis, conforme mostram os resultados para esta varivel na Tabela 4.28.
Na maioria dos ensaios, a enzima particionou-se preferencialmente para a fase inferior,
rica em sal. J para os ensaios 5, 6, 9 e pontos centrais, a enzima foi particionada para
a fase superior, rica em PEG.
Gautam e Simon (2006) tambm observaram a partio preferencial de glucosidase, (um tipo de celobiase) produzida por Trichoderma reesei, para a fase
inferior de SABs formados por PEG 4000 e fosfato de potssio quando o pH atingia
valores superiores a 6,5.
O maior valor de partio (4,97) foi encontrado no ensaio 5, o qual apresentava os
menores valores dos parmetros: massa molar de PEG, concentrao de citrato e pH,
dentre os nveis estudados.
O valor de KCELO obtido neste trabalho foi superior ao encontrado por Herculano et
al. (2012) para a partio de -glucosidase (um tipo de celobiase) produzida por
Aspergillus japonicus, que foi de 3,89 para SABs formados por 24% PEG 8000 e 20%
citrato de sdio em pH 8,0.
Apesar

de

literatura

mencionar

que

as

-glucosidases particionam-se

preferencialmente para a fase rica em sal (GALTAM e SIMON, 2006) os maiores


valores de coeficiente de partio de celobiases neste trabalho foram observados na
fase rica em PEG, conforme pode ser verificado nos ensaios 5 e 9 da Tabela 4.28. O
mesmo foi observado por Herculano et al. (2012), que determinaram uma das
condies em que a glucosidase concentrava-se na fase superior como a mais
adequada.
Gautam e Simon (2006) verificaram que a superfcie de - glucosidase tornou-se
positivamente carregada quando o pH do sistema foi aumentado de 6,0 para 8,0. Os
autores perceberam aumento na partio da enzima, que apresenta PI de 8.7, para a
fase rica em sal. De acordo com Ratanapongleka (2010) deve-se levar em
considerao a possibilidade de desnaturao da enzima durante o processo de
partio.

Nesses

casos,

enzima

desnaturada

tem

uma

rea

superficial

significativamente maior do que a protena nativa, e a superfcie exposta muito mais


hidrofbica, causando tambm diferente particionamento entre a enzima ativa e a
desnaturada.

117

Neste trabalho, porm, no levou-se em considerao a presena de celulases


desnaturadas nos SABs. A avaliao dos efeitos dos parmetros testados foi realizada
com base nas atividades enzimticas presentes nas fases dos extratos.
Uma outra explicao para o fato da enzima celobiase ter tido o mais alto valor de
coeficiente de partio na fase PEG pode ser dada com base no argumento de
Mayerhoff e Franco (2004), de que a fase de PEG pode eliminar inibidores durante a
extrao e a composio do sistema acaba favorecendo a atividade da enzima,
elevando seu valor. Esta suposio explica por que alguns pesquisadores acabam
detectando recuperaes de atividade superiores a 100% em uma das fases, como
Herculano et al. (2012) e Porto et al. (2007).
Dentre as enzimas estudadas, a celobiase foi a que apresentou maior fator de
purificao, conforme mostram os resultados deste parmetro na Tabela 4.16
O valor de FPCELO de 61,64 foi observado no ensaio 1, o qual possua os menores
nveis de todos os parmetros testados. O valor obtido neste trabalho foi muito superior
ao encontrado por Herculano et al. (2012), que foi de penas 1,97 para a partio de glucosidase produzida por Aspergillus japonicus. O SAB mais eficiente era formado por
24% PEG 8000 e 20% citrato de sdio em pH 8,0. Hemavathi e Raghavarao (2011)
encontraram um fator de purificao de 3,3 para a -glucosidase da cevada, utilizando
SABS formados por PEG 1500 e sulfato de amnio.
H relatos na literatura de que elevados valores de fator de purificao podem ser
obtidos nas operaes com SABs. Mohamadi e Omidinia (2007), por exemplo,
encontraram um fator de purificao de 474,3 ao estudarem a partio de fenilalanina
desidrogenase de Bacillus badius em SABs formados por PEG, sulfato de amnio e
NaCl.
Observando-se os valores de fator de purificao obtidos em cada ensaio, percebese o quanto este parmetro varia mediante alteraes nas condies operacionais do
processo. Isso mostra a importncia de se otimizar as condies operacionais dos
SABs.
O digrama de Pareto da Figura 4.18 mostra a influncia das variveis estudadas no
fator de purificao da celobiase.

118

Figura 4.18. Contribuio das variveis testadas no fator de purificao da


celobiase

O pH e a concentrao de citrato nos SABs foram os principais fatores que


influenciaram o fator de purificao da celobiase.
O modelo proposto para representar o processo exibido na Equao 4.7. Os
parmetros em negrito so significativos ao nvel de confiana de 95%.
FPcelo= 18,576 - 2,679A -2,264B -8,390C -8,636D + 3,322AB + 0,464AC +
1,725AD - 0,0241BC+ 2,662BD + 6,034CD -2,113ABC 2,541ABD0,637ACD 1,500BCD

(4.7)

O modelo da Equao 4.7 apresentou R2 igual a 0,95. Ele explica, portanto, apenas
95% das variaes apresentadas pelo processo.
A anlise de varincia deste processo exibida na Tabela 4.17

Tabela 4.17 - Teste F para o fator de purificao de celobiase


Fonte de variao
SQ
GL
MQ
Fcalculado
Regresso
2902,13 3
967,37
16,36
Resduo
945,65 16
59,10
Falta de ajuste
115,98
2
Erro puro
73,613
3
Total
3847,78 19
2
%R
95,01
F tabelado = 3,24
Teste F5% = 5,05

119

O Teste F da Tabela 4.17 apresentou valor superior a 4,0. Portanto, o modelo


proposto para o fator de purificao de celobiase significativo e preditivo.
As superfcies de resposta obtidas para o modelo so mostradas na Figura 4.19.

Figura 4.19. Superfcies de resposta mostrando a influncia dos parmetros


testados no fator de purificao da FPase (FPt): A = Influncia do pH e massa molar de
PEG (MPeg), B= Influencia do pH e composio de citrato, C= Influncia da massa
molar de peg (M PEG) e composio de citrato (% CITRATO)

C
As superfcies de resposta mostram que as variveis pH e citrato apresentam
grande influncia no fator de purificao das celobiase (FPt), sendo que a interao
entre esses dois parmetros bastante significativa, conforme mostra a superfcie da

120

Figura 4.19 B. So nos menores nveis das variveis pH e citrato que so observados
os mais altos valores de FPt. A massa molar do PEG tambm influencia, sendo que
nos menores valores de massa molar de PEG foram observados os maiores valores de
purificao de celobiase na fase superior dos SABs (FPt).
4.7 AVALIO DAS CONDIES OPERACIONAIS DOS SABs

Uma das vantagens que a utilizao dos SABs oferece a promoo do


aumento de pureza nos extratos, representado pelo fator de purificao (FP).
A Tabela 4.18 resume os valores dos parmetros que resultaram em mximo
fator de purificao para os ensaios de partio realizados.

Tabela 4.18 - Condies operacionais dos ensaios com maior fator de purificao (FP)
Enzima

MPEG

%PEG

%Citrato

pH

CMCase

4000

18

12

FPase

4000

18

16

Celobiase

4000

18

12

FP

Yt (%)

0,72

5,31

63,78

2,2

2,29

73,80

0,83

61,64

66,77

De acordo com a Tabela 4.18, o PEG de massa molar 4000 foi o mais
adequado, dentre as massas molares testadas, para o aumento de pureza das trs
atividades investigadas. Os maiores valores de fator de purificao para todas as
atividades foram observados nos ensaios conduzidos com o menor teor de PEG (18%)
e o menor valor de pH (5,0) entre os nveis testados.
Quanto ao teor de citrato, apenas a atividade expressa em FPase foi beneficiada
pelo aumento na concentrao de sal dos sistemas.
Pode-se afirmar que, no geral, os valores dos parmetros que resultaram em
mximo fator de recuperao foram praticamente os mesmos, o que significa que o um
SAB formado por 18% PEG 4000 e 12% Citrato de sdio em pH 5,0 vai promover o
aumento de pureza tanto das CMCases quanto das celobiases, sendo essa uma
condio adequada para aplicao de SABs em um processo de purificao de
celulases.
Quanto a FPase, como j foi mencionado anteriormente, trata-se de uma
atividade promovida pelo sinergismo de diferentes celulases, entre endoglucanases e
exoglucanases. Portanto o aumento de pureza deve levar em conta a ao e

121

quantidade de cada enzima envolvida na degradao da celulose amorfa. Por isso a


condio operacional em que deu-se seu maior aumento de pureza diferiu das
CMCase e celobiases apenas pelo fato da concentrao de citrato ser maior para este
processo. O fato das condies operacionais terem sido praticamente as mesmas
revela uma vantagem: O fato de poder promover um aumento na pureza de todas as
atividades testadas em uma nica operao.
A purificao de enzimas individuais de interesse quando se quer recuperar
apenas a enzima alvo. No caso das celulases destinadas a processos de hidrlise de
biomassa, interessante que tenha um preparado enzimtico composto por todas as
enzimas que atuam na converso da celulose em glicose. Por isso, dentre as
atividades testadas, a FPase tem maior importncia para esse processo, por
representar verdadeiramente a capacidade do preparado enzimtico na converso da
celulose em glicose.
Para a utilizao das celulases produzidas na hidrlise de matrias
lignocelulsicos, interessante a produo de extratos que aproveitem o mximo da
sinergia entre as celulases, sendo a atividade FPase muito importante nesse processo.
Uma vez que a celobiase a enzima que transforma dmeros de acares em glicose,
e que a enzima produzida em menor quantidade pelo fungo (OGEDA e PETRI, 2006),
um processo que consiga enriquecer a quantidade dessa enzima no extrato certamente
aumentar a atividade em FPase e a aplicabilidade do extrato produzido.
As condies elencadas na Tabela 4.18 podem servir de ponto de partida para
um estudo de otimizao dos SABs, seja testando nveis menores para as variveis
estudas ou estudando outros parmetros que no foram testados neste trabalho, com a
finalidade de se obter enzimas em propores otimizadas no extrato para aplicao na
hidrlise enzimtica.
Alm disso, possvel que a utilizao de extratos mais concentrados nos SABs
resulte em processos mais eficientes, onde a quantidade de enzimas recuperadas e
aumento de pureza promovido nessa etapa torne vivel a aplicao dos SABs como
parte de um processo de donwstream de celulases.
O coeficiente de partio e a recuperao das enzimas tambm deve ser levado
em conta, uma vez que a melhor operao de um SAB aquela em que se tem
elevada recuperao da enzima em uma das fases, com mximo aumento de pureza
possvel. A Tabela 4.19 resume os valores dos parmetros que resultaram em mximo
coeficiente de partio (K) e recuperao (Yt) para as enzimas estudadas.

122

Tabela 4.19 - Condies operacionais dos ensaios com maior coeficiente de


partio enzimtica (K) e recuperao na fase superior ( Yt )
Enzima

MPEG

%PEG

%Citrato

pH

Yt (%)

CMCase

4000

22

16

18,20

95,74

FPase

4000

22

16

19,00

96,91

Celobiase

4000

18

16

4,97

86,42

Os dados da Tabela 4.19 revelam que o valor de massa molar do PEG que mais
influenciou a recuperao das enzimas tambm foi a menor dentre as testadas, ou
seja, o PEG 4000. Alm disso, a concentrao de citrato em seu nvel superior (16%)
influenciou positivamente a partio e recuperao das trs atividades celuloltica
testadas. As melhores condies para a recuperao de cada enzima diferem de uma
para a outra em apenas um parmetro: o pH ou a concentrao de PEG.
A semelhana entre as condies operacionais que resultam em mxima
recuperao das enzimas tambm vantajosa no que diz respeito a otimizao do
processo para obteno de um extrato com varivel composio de cada uma das
atividades pelo simples ajuste dos parmetros operacionais.

123

5 CONCLUSO

Os resultados da caracterizao fsico-qumica da biomassa da palma forrageira


revelaram que este material adequado para utilizao em processos de
fermentao semisslida.

O estudo cintico da fermentao semisslida mostrou que a atividade CMCase


atinge um pico de atividade de 6,45 U/gds em 110 horas de processo. Alm
disso, o estudo concluiu que no h necessidade de se lavar a biomassa para
remoo de inibidores e que a adio de (NH 3)4SO4 em 1% favorece o processo
fermentativo. A umidade do substrato deve ser de 90%, o que vantajoso, pois
a biomassa da palma in natura j apresenta esta umidade.

A relao solvente/substrato o parmetro que mais influencia no processo de


extrao das enzimas a partir do meio fermentado. Uma condio adequada
para a mxima recuperao de atividade a partir da biomassa da palma
fermentada : relao solvente/substrato de 20 mL/g, tempo de contato de 15
minutos e agitao de 50rpm.

A CMCase apresentou temperatura tima de 55C e pH timo entre 4,0 e 5,0. O


extrato mantm 40% de sua atividade quando incubada a 50C por 1 hora.

O extrato bruto produzido pela fermentao semisslida da biomassa da palma


tem aplicao potencial na hidrlise de materiais lignocelulsicos. A biomassa da
palma forrageira e o resduo da fermentao semisslida mostraram-se teis na
produo de glicose por meio da hidrlise enzimtica. Foi observada uma
produtividade de AR mxima de 334 mg/Lh e 308 mg/Lh em 4h, para a hidrlise
da biomassa da palma e do resduo da fermentao, respectivamente.

A CMCase apresentou um coeficiente de partio mximo de

18,20 com

recuperao mxima de 95,74% Quando o SAB era composto por 22% PEG
4000 e 16% de citrato de sdio em pH 7,0. O maior valor de fator de purificao
foi de 5,31; para o SAB composto por 18% PEG 4000 e 12% citrato de sdio em
pH 5,0.

A FPase apresentou um coeficiente de partio mximo de 19 com recuperao


mxima de 96,91% quando o SAB era tambm composto por 22% PEG 4000 e
16% de citrato de sdio, porm de pH 5,0. O maior valor de fator de purificao

124

foi de 2,29; para o SAB composto por 18% PEG 4000 e 16% citrato de sdio em
pH 5,0.

A Celobiase apresentou um coeficiente de partio mximo de 4,97 com


recuperao mxima de 86,42% quando o SAB era tambm composto por 18%
PEG 4000 e 16% de citrato de sdio, porm de pH 5,0. O maior valor de fator de
purificao foi de 61,64; para o SAB composto por 18% PEG 4000 e 12% citrato
de sdio em pH 5,0.

Os SABs formados por PEG e citrato de sdio mostraram-se adequados como


etapa inicial de um processo de recuperao e purificao de celulases obtidas
da fermentao semisslida da palma forrageira.

125

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