UNIVERSIDAD ARTURO PRAT

MICROBIOLOGA

PRACTICO 1: OBSERVACIN MICROSCPICA DE BACTERIAS.

La observacin microscpica permite conocer algunas caractersticas de
las bacterias como: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de
cpsula, esporas, flagelos, movilidad, etc. Constituyen la primera etapa del
estudio de las bacterias y del diagnstico bacteriolgico. Existen numerosas
tcnicas para el estudio de la clula bacteriana, las cuales se enumeran a
continuacin.
1. OBSERVACIN DE BACTERIAS A FRESCO.
Este examen permite observar la clula en estado vivo y evita las
deformaciones artificiales de su morfologa que implican las tcnicas de
coloracin. Su aplicacin ms importante se refiere al estudio de la movilidad.
2. Observacin de bacterias por tincin:
Los procedimientos de coloracin (tincin) cumplen con el objetivo de
aumentar el contraste entre las clulas y su entorno, o de sus partes
constituyentes. Implican desde luego, la muerte de ellas y por lo tanto una
alteracin en su constitucin. En general las bacterias tienen afinidad con los
colorantes derivados de la anilina, y especficamente por aquellos de carcter
bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora cargas electropositivas las
que tendran una fuerte afinidad por las sustancias electronegativas que
normalmente presentan las bacterias en su protoplasma. Entre estos se
encuentran los cidos nucleicos y sus derivados (ADN y ARN).
2.1. Tincin simple: Esta tincin se basa en el empleo de un solo colorante
sobre la clula bacteriana, de manera que todas ellas se observan del mismo
color. Este tipo de tincin sirve, por lo tanto, para observar la forma y
agrupacin de las bacterias.
2.2. Tincin diferencial: Estas tinciones permite efectuar agrupaciones de
bacterias de acuerdo a su diferente afinidad por los colorantes que se utilizan.
As, bacterias que quedan teidas de diferente color pertenecen a grupos
tambin diferentes. La importancia de estas tinciones es que existe cierta
relacin entre la afinidad tintorial de las bacterias y propiedades metablicas o
estructurales como por ejemplo la susceptibilidad o resistencia a determinados
agentes antibacteriano. Entre las tinciones ms importantes estaran las de
Gram y de Ziehl-Neelsen. La tincin de Gram permite separar la mayor parte
de las bacterias; las Gram positivas y negativas. La tincin de Ziehl-Neelsen se
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emplea en la coloracin de los bacilos tuberculosos y organismos similares,

caracterizados por su riqueza en material lipdico.
2.3. Tinciones especiales: Las tinciones especiales tienen por objeto destacar
algunas partes constitutivas de las clulas bacterianas: como por ejemplo
tinciones de flagelos, cpsulas, esporas.
TRABAJO PRCTICO A REALIZAR
1. El instructor dar las explicaciones necesarias acerca de las partes
constitutivas del microscopio, con especial referencia a los mtodos que se usan
en bacteriologa.
Proyeccin de video.
Uso de cada tipo de objetivo y su rendimiento en la observacin.
Ubicacin adecuada del condensador segn sea una tcnica de
observacin a fresco o inmersin.
Limpieza del microscopio.
2. Observacin Microscpica.
2.1. Observacin a fresco
-

En el laboratorio encontrar cultivos de grmenes mviles, efectu un

estudio de la movilidad bacteriana en fresco, con cada uno de estos tipos de
grmenes y establezca su diferencia con respecto a su capacidad de
movimiento, usando la siguiente tcnica:

Colocar una gota de suero fisiolgico (o agua destilada) sobre un portaobjeto

limpio y dispensar sobre ella una asada de cultivo a observar, o bien colocar
una gota de agua con una pipeta Pasteur si se trata de cultivo lquido. En
ambos casos colocar un cubreobjeto sobre la preparacin.

Observar al microscopio con aumento menor, sin inmersin y luego con

aumento mayor, bajando el condensador para disminuir la intensidad
luminosa, hasta un contraste que permita una clara visin.

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2.2. Tincin de Gram

A partir de cultivos microbianos en un medio slido o lquido prepare un
frotis para posterior tincin.
La preparacin de todos los frotis antes de su colocacin, implica tres
etapas: extensin, secado y fijacin, y cuya tcnica se esquematiza en la
siguiente forma:
Pasos en la preparacin de un frotis:
1. Limpiar el portaobjeto con alcohol y pasarlo rpidamente por la llama del
mechero. Deje enfriar.
2. Colocar una gota de agua estril, suero fisiolgico o caldo en el centro de
la lmina.
3. Tomar un asa de platino, esterilizarla a la llama, dejarla enfriar y con ella
recoger una partcula de material que se desea examinar. Disprsela en la
gota, y extienda en una superficie adecuada (1 cm2). Esterilice
nuevamente el asa.
4. Fije la preparacin (objetivo: adherir las bacterias a la superficie del
vidrio) pasando rpidamente dos o tres veces por la llama del mechero,
evitando el sobrecalentamiento que pueda carbonizar las bacterias.
5. El frotis queda entonces listo para ser teido con la coloracin deseada.
Pasos en la tincin Gram:
1. Colorear con cristal violeta, al 1% durante unos 60 seg., cuidando que el
colorante cubra toda la extensin del preparado.
2. Eliminar el exceso de colorante y lavar rpidamente con agua,
manteniendo la lmina en posicin inclinada.
3. Cubrir la preparacin con solucin de Gram o Lugol, dejndola actuar
durante 60 seg, lavar nuevamente con agua.

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4. Descolorar con alcohol al 95% durante 30 seg (o hasta que deje de salir el
colorante) y lavar con agua.
5. Colorear con Safranina durante 10 segundos (contraste).
6. Lavar con agua, secar y observar por inmersin.
La fase de decoloracin con alcohol constituye la etapa ms importante
de la tincin, en ella reside su carcter diferencial.
Aquellas bacterias que retienen el primer colorante se denominan GRAM
POSITIVAS y se observan de COLOR AZUL, y aquellas en que el colorante fue
arrastrado por el alcohol corresponden a GRAM NEGATIVAS observndose de
COLOR ROJO, debido a que captan el colorante de contraste.
Observar con inmersin la morfologa, agrupacin y afinidad tintoreal. Anote si
su cultivo es puro o se trata de una mezcla bacteriana segn el comportamiento
frente a la tincin Gram.
Deber entregar un Informe con los resultados ms relevantes.

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