Diseño y Simulación de Un Sistema para El Control Del Estado Metabólico de Células Animales en Cultivo

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOTECNOLOGA
DISEO Y SIMULACIN DE UN SISTEMA PARA EL CONTROL DEL

ESTADO METABLICO DE CLULAS ANIMALES EN CULTIVO
MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO CIVIL QUMICO Y

MAGISTER EN CIENCIAS DE LA INGENIERA MENCIN QUMICA
DAMIN FRANCISCO BAEZA FERNNDEZ
PROFESORES GUA:
ZIOMARA P. GERDTZEN HAKIM
J. CRISTIAN SALGADO HERRERA
MIEMBROS DE LA COMISIN:
LEANDRO HERRERA ZEPPELIN
M. ELENA LIENQUEO CONTRERAS
CLAUDIA ALTAMIRANO GMEZ (PUCV)
Este trabajo ha sido parcialmente financiado por los proyectos
FONDECYT 11080016 y 11090268
SANTIAGO DE CHILE
AGOSTO 2012
Resumen
Resultados experimentales sealan que las clulas animales pueden alcanzar mltiples estados
metablicos con distintas razones de tasa de produccin de lactato a tasa de consumo de glucosa
(L/G), logrndose razones muy por debajo de la razn estequiomtrica igual a 2 [mol/mol].
En el presente trabajo de tesis se plante y ajust un modelo metablico que describe el metabolismo de un cultivo de control y se corrobor su falta de capacidad de alcanzar ms de un estado
estacionario a travs de la comparacin con datos experimentales y un anlisis de estabilidad posterior. La simplificacin de dicho modelo inicial, la obtencin de un nico punto atractor como estado
estacionario y el anlisis de variaciones de niveles de expresin gnica de ciertas enzimas glicolticas permiti el planteamiento de un modelo de regulacin que vara la concentracin de la enzima
lactato deshidrogenasa (LDH) con el cual se simul un cultivo hasta alcanzar estado metablico
alterado (L/G <0,1 [mol/mol]).
El modelo metablico regulado se utiliz para la simulacin de un cultivo continuo alterado para
el diseo y ajuste de controladores proporcional (P), basado en modelo lineal y basado en modelo
no lineal para la regulacin de la concentracin de glucosa de entrada frente a perturbaciones en
el crecimiento celular. La simulacin de la respuesta de lazo cerrado del sistema mostr una fuerte
interaccin de lazos con el lazo de control de crecimiento celular y los anlisis de robustez y de
sensibilidad permitieron concluir que el controlador P posee una mayor robustez que el controlador
basado en modelo lineal, pero que este ltimo posee una mejor respuesta frente a limitantes que
podran existir a nivel industrial. Por otra parte, el pobre desempeo del controlador basado en
modelo no lineal demuestra un desafo de ajuste del mismo producto de las mltiples posibles
fuentes del mal desempeo.
Como lnea de trabajo futuro se puede mejorar la respuesta simulada de los controladores basados en modelo, analizando la eliminacin de offset para el caso lineal y los problemas de rendimiento del basado en modelo no lineal.
Experimental data indicate that mammalian cells can reach multiple steady states having distinct
ratios of lactate production rate to glucose consumption rate (L/G), reaching ratios well below
the stoichiometric ratio of 2 [mol/mol].
In the following thesis a metabolic model that describes the metabolic response of a control
culture was proposed and fitted, and its lack of capacity of reaching more than one steady state was
verified by means of comparison with experimental data and further through a stability analysis.
The simplification of said initial model, the obtainment of a sole atractor point as steady state and
the analysis of the variation of gene expression levels of certain glycolytic enzymes supported
the establishment of a regulation model that varies the concentration of the lactate dehydrogenase
(LDH) enzyme, with which a culture presenting a metabolic shift was simulated and a distinct
steady state was reached (L/G <0,1 [mol/mol]).
The regulated metabolic model was used to simulate a continuous culture with a metabolic
shift for the design and parametrization of a proportional (P), linear model based and non linear
based controlers for the regulation of glucose feed concentration faced with disturbances related to
cell growth. Closed loop response simulations show a strong loop interaction with the cell growth
control loop, and robustness and sensibility analysis concluded that the P controller is more robust
than a linear model based controller, but the latter adapts better to limitations that could exist on
an industrial scale. Moreover, the poor response observed for the non linear model based controller gives way to an additional parametrization problem due to the many possible sources of poor
performance.
Guidelines for future work can be related to improving the simulates response of the model
based controllers through possible studies of offset elimination for the linear based and performance
problems of the non linear based.
ii
A Toms
Agradecimientos
Quisiera agradecer a todos los involucrados en la etapa universitaria de mi vida, gracias a los que
conoc durante los diferentes tramos del plan de estudios; a mis amigos de primer ao, a mis amigos
de especialidad y a los que conoc por esas casualidades de la vida. No se me puede olvidar tampoco
la casa de estudios que, a pesar de que la facultad de ciencias fsicas y matemticas corresponde a un
espacio alejado del resto de la universidad, da cabida para la pluralidad que existe en nuestro pas.
Por lo mismo, quiero agradecer a mis padres por haberme impulsado a estudiar en la Universidad
de Chile.
Agradezco a mis profesores guas por la paciencia y el apoyo que me entregaron durante mi
trabajo de tesis, gracias por tener una perspectiva clara y distinta de lo que son las enseanzas del
departamento y por su calidez a la hora de responder las consultas.
Agradezco tambin a los proyectos de iniciacin FONDECYT 11080016 y 11090268 por el
financiamiento del proyecto en el cual me vi involucrado.
Finalmente, a todos los artistas que conformaron la biblioteca de msica que escuch durante
todo el tiempo que estuve escribiendo la tesis, se agradece la inspiracin.
iv
ndice General
Resumen
Agradecimientos
IV
1. Introduccin
1.1. Organizacin de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2. Objetivo de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3. Objetivos especficos de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. Antecedentes
2.1. Metabolismo en clulas animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. Antecedentes biolgicos de la alteracin del estado metablico en clulas animales
3. Modelo metablico celular animal
3.1. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2. Descripcin matemtica de metabolismo celular animal . . . . . . . . . . . . . . .
10
3.3. Modelacin de sistema bio-reactor-cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
3.4. Condiciones de simulacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
3.5. Ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
3.5.1. Metodologa de ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3.5.2. Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados
22
3.6. Anlisis estadstico de parmetros ajustados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.6.1. Prueba de t de Student . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.6.2. Resumen de parmetros ajustados y resultados de anlisis estadstico . . .
27
3.7. Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema . . . . . . . . . . . . . .
29
3.7.1. Anlisis de estabilidad por medio de valores propios . . . . . . . . . . . .
29
3.7.2. Anlisis de estabilidad por medio de diagrama de fases . . . . . . . . . . .
31
3.8. Discusin de resultados de la simulacin del modelo ajustado . . . . . . . . . . . .
32
4. Simplificacin del modelo metablico
35
4.1. Motivacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
4.2. Descripcin del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
4.2.1. Vas metablicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
4.2.2. Cinticas enzimticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4.3. Ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
4.3.1. Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados
40
4.3.2. Anlisis estadstico de parmetros ajustados . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
4.4. Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema . . . . . . . . . . . . . .
44
4.5. Discusin de resultados de simplificacin de modelo . . . . . . . . . . . . . . . .
45
5. Modelo de regulacin
47
5.1. Motivacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5.2. Anlisis de sensibilidad del modelo metablico inicial . . . . . . . . . . . . . . . .
48
5.3. Planteamiento de modelo de regulacin gnica inicial . . . . . . . . . . . . . . . .
53
5.4. Modelo de regulacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
5.4.1. Funcin de Hill . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
5.4.2. Ajuste de parmetros de modelo de regulacin . . . . . . . . . . . . . . .
57
5.5. Validacin de modelo de regulacin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
5.5.1. Comparacin con datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
5.5.2. Clculo de razn estequiomtrica L/G . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
5.5.3. Reversibilidad de estado metablico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
5.6. Discusin de resultados de simulacin con modelo de regulacin . . . . . . . . . .
67
6. Control del estado metablico
70
6.1. Motivacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
vi
70
6.2. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
6.2.1. Caractersticas del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
6.2.2. Objetivo de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
6.2.3. Anlisis de respuesta de lazo abierto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
6.3. Criterios de diseo de controladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
85
6.4. Control clsico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
86
6.4.1. Diseo de controlador proporcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
6.4.2. Resultados de ajuste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
6.5. Control avanzado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
6.5.1. Control ptimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
6.5.2. Controlador basado en modelo lineal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
98
6.5.3. Controlador basado en modelo no lineal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.6. Anlisis de robustez de controladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
6.6.1. Controlador proporcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
6.6.2. Controlador basado en modelo lineal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
6.7. Anlisis de sensibilidad de controladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
6.7.1. Restriccin de concentraciones de glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
6.7.2. Aumento de intervalo de muestreo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
6.7.3. Aumento de intervalo de muestreo y restriccin de concentraciones de glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
6.8. Discusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
7. Conclusiones
146
Glosario
151
Referencias
156
Apndices
167
A . Ecuaciones de balances de masa utilizadas para el modelo metablico de una clula

animal en cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
vii
A .1. Gliclisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

A .2. Pentosa fosfato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
A .3. Ciclo TCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
A .4. Transporte y metabolismo de amino cidos . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
B . Velocidades de reaccin y parmetros para el modelo metablico de una clula animal172
C . Parmetros de simulacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
D . Cdigos MATLAB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
viii
ndice de figuras
3.1. Vas metablicas del metabolismo celular de una clula animal. . . . . . . . . . .
11
3.2. Diagrama del sistema de reactor con cultivo celular operando en forma continua. .
12
3.3. Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo de control. 15

3.4. Razn L/G observado experimentalmente para el cultivo de control. . . . . . .
16
3.5. Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo alterado. 17

3.6. Razn L/G observado experimentalmente para el cultivo alterado. . . . . . . . .
17
3.7. Simulacin de cultivo de control con modelo sin ajustes. . . . . . . . . . . . . . .
18
3.8. Simulacin de cultivo de control con modelo ajustado. . . . . . . . . . . . . . . .
23
3.9. Simulacin de cultivo alterado con modelo ajustado. . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.10. Diagrama de fases para el estado estacionario del modelo metablico inicial. . . . .
32
4.1. Modelo metablico simplificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4.2. Simulacin del cultivo de control con el modelo simplificado ajustado. . . . . . . .
41
4.3. Simulacin del cultivo alterado con el modelo simplificado ajustado. . . . . . . . .
41
4.4. Simulacin del cultivo de control con el modelo simplificado sin ajustar. . . . . . .
43
4.5. Diagrama de fases para el estado estacionario del modelo metablico simplificado.
45
5.1. Diagrama con ubicacin de enzimas afectadas dentro de la cadena de reacciones

metablicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
5.2. Glucosa extra celular utilizada para anlisis enzimtico de sensibilidad. . . . . . .
51
5.3. Menores valores de MSE para las concentraciones de lactato. . . . . . . . . . . . .
52
5.4. Menores valores de MSE para las concentraciones de piruvato. . . . . . . . . . . .
52
5.5. Simulacin de cultivo alterado con implementacin de funcin F(t). . . . . . . . .
54
ix
5.6. Funcin de Hill con diferentes valores de coeficiente de Hill (n) y KX = 0, 5. . . . .
57
5.7. Resultados de simulacin de modelo con modelo de regulacin gnica para LDH
en cultivo alterado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
5.8. Comparacin de curvas de glucosa y lactato simulados con modelo metablico con
regulacin con cultivo celular alterado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
5.9. Comparacin de curva de concentracin celular simulada con modelo metablico

con regulacin con cultivo celular alterado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
5.10. Comparacin de curva de L/G simulada con cultivo celular alterado. . . . . . .
62
5.11. Resultados de clculo de L/G para cultivo de control simulado. . . . . . . . . .
64
5.12. Resultados de clculo de L/G para cultivo alterado simulado. . . . . . . . . . .
64
5.13. Resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado frente a pulsos de glucosa

(valores experimentales). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
5.14. Resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado simulado frente a pulsos de

glucosa (acercamiento de eje). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
5.15. Acercamiento de resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado simulado

frente a pulsos de glucosa (acercamiento de eje). . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
6.1. Representacin grfica del proceso y las diferentes variables que lo afectan. . . . .
72
6.2. Montaje experimental con los lazos comunes de control utilizados. . . . . . . . . .
73
6.3. Montaje a simular con el lazo de control a disear. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74
6.4. Origen de perturbaciones a analizar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
6.5. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
6.6. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la

concentracin de glucosa de entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
6.7. Efecto de la perturbacin por medio de un escaln y anti-escaln en el coeficiente

de dilucin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
6.8. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente
de dilucin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
6.9. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % del coeficiente de dilucin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
79
6.10. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la tasa de

crecimiento celular mximo max . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
6.11. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la tasa

de crecimiento celular mximo max . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
6.12. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la constante

S . . . . . . . . . .
de activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
82
6.13. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la

S . . . .
constante de activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
83
6.14. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la constante

S (aumento de
de activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
intervalo de simulacin). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
6.15. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control proporcional de la
concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular
abierto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
6.16. Acercamiento de respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control proporcional de la
abierto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
6.17. Concentraciones de glucosa y lactato extracelular y concentracin celular simulada para la respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la
concentracin de glucosa de entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
6.18. Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % del parmetro max con la
inclusin del lazo de control proporcional de la concentracin de glucosa de entrada
con el lazo de control de crecimiento celular cerrado. . . . . . . . . . . . . . . . .
xi
92
6.19. Respuesta optimizada del sistema obtenida por minimizacin del ITAE de la respuesta frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada
con la inclusin del lazo de control proporcional de la concentracin de glucosa de
entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado. . . . . . . . . . . . .
93
6.20. Prediccin de modelo de proceso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
6.21. Lazo de control con controlador basado en modelo. . . . . . . . . . . . . . . . . .
97
6.22. Esquema de proceso de identificacin de sistemas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

6.23. Muestreo utilizado para la estimacin de modelo ARX (variables de desviacin). . 102
6.24. Comparacin de simulacin de L/G con modelo ARX y muestreo. . . . . . . . 103
6.25. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa
de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto. . . . . . . . . . . . 106
6.26. Respuesta del sistema con = 0, 1 frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa
de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto. . . . . . . . . . . . 106
6.27. Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de dilucin con
la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada
con el lazo de control de crecimiento celular abierto. . . . . . . . . . . . . . . . . 107
concentracin de glucosa de entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
6.29. Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % de la tasa de crecimiento celular mxima, max , con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin
de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado. . . . . 109
6.30. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del parmetro
max con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de
entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado. . . . . . . . . . . . . 110
xii
6.31. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 30 % del offset seguido
por un escaln de un 10 % del parmetro max con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de
crecimiento celular cerrado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.32. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del parmetro
max seguido por un escaln de un 10 % del offset con la inclusin del lazo de
control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de
crecimiento celular cerrado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
6.33. Estructura bsica de una red neuronal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.34. Red perceptrn multi-capa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.35. Red perceptrn multi-capa ligada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.36. Red cascada completamente conectada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.37. Estructura bsica de la red neuronal a construir. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
6.38. Conjunto de datos utilizados para la identificacin de sistemas con red neuronal
(datos no escalados). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
6.39. Simulacin de conjunto de muestra utilizado para el entrenamiento de la red neuronal ptima con red neuronal de 1 capa oculta con 24 neuronas (datos escalados). . 119
6.40. Estructura de la red neuronal ptima. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.41. Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control basado en modelo
no lineal de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
concentracin de glucosa de entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.43. Respuesta optimizada del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.44. Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente
de dilucin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
xiii
6.47. Respuesta del sistema frente a un escaln de un 5 % de la tasa de crecimiento celular
mxima, max , con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de
glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado. . . . . . . 126
6.51. Respuesta del sistema frente a un escaln de un 5 % de la tasa de crecimiento celular
6.54. Dependencia del offset de la magnitud de la perturbacin de la tasa mxima de
crecimiento celular max . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
xiv
6.55. Respuesta del controlador proporcional discreto utilizando un intervalo de muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max . . . . . . . . . . . 133
6.56. Acercamiento de respuesta del controlador proporcional discreto utilizando un intervalo de muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max . . . 133
6.57. Comparacin de dinmica de variable de salida del controlador proporcional con
su aproximacin discreta utilizando un intervalo de muestreo de 0,004 [hr], frente
a una perturbacin de un 10 % de max . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
6.58. Respuesta del controlador basado en modelo lineal frente a una perturbacin de un
10 % de max con una alimentacin de concentraciones restringidas de glucosa. . . 135
6.59. Respuesta del controlador proporcional discreto con un intervalo de muestreo de
0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max con una alimentacin de
concentraciones restringidas de glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
6.60. Acercamiento de respuesta del controlador proporcional discreto con un intervalo
de muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max con una
alimentacin de concentraciones restringidas de glucosa. . . . . . . . . . . . . . . 136
6.61. Comparacin de dinmica de variable de salida del controlador proporcional con
su aproximacin discreta utilizando un intervalo de muestreo de 0,033 [hr], frente
a una perturbacin de un 10 % del coeficiente de dilucin. . . . . . . . . . . . . . . 138
6.62. Respuesta del controlador basado en modelo lineal de la Figura 6.30, con el intervalo de muestreo modificado a 1 [hr], frente a un escaln de un 10 % de la tasa de
crecimiento celular mxima, max , con la inclusin del lazo de control ptimo de la
cerrado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
6.63. Respuesta del controlador basado en modelo lineal de la Figura 6.30, con el intervalo de muestreo modificado a 1 [hr] y restricciones sobre la concentracin de
glucosa disponible, frente a un escaln de un 10 % de la tasa de crecimiento celular
xv
Captulo 1
Introduccin
El crecimiento de la industria biotecnolgica en la ltima dcada no ha sido menor, alcanzando
casi un 16 % solamente en EE.UU. En particular, las industrias biotecnolgicas relacionadas con los
productos farmacuticos han aumentado en casi un 2 % en 5 aos. Ms all de que los bio-procesos
llevan ms de una dcada instaurados dentro de la industria, el aumento de una industria que tiene
una capitalizacin de mercado que rodea los 360.000 millones de dolares ha generado inters en
los estudios relacionados con dicha rea [1].
Dentro de los procesos biotecnolgicos, los cultivos celulares animales son relevantes en la
industria farmacutica debido a que participan en el proceso productivo de una gran cantidad de
productos farmacuticos entre los que se encuentran las enzimas, anticuerpos monoclonales, vacunas virales, hormonas e inmunoreguladores tales como IgG, lactoferrina, clorofila, vacunas contra
la influenza, etc [25]. Sin embargo, los cultivos donde se producen bio-farmacuticos generalmente requieren de condiciones de cultivo especficas, lo que hace que sean susceptibles a una baja
productividad o una muerte celular significativa debido a leves variaciones en las condiciones de
operacin.
El alto valor de los productos farmacuticos otorga una gran importancia a la optimizacin de
los bio-procesos involucrados en la produccin de los mismos. Por esta razn, la investigacin y
desarrollo ha orientado los estudios bioqumicos hacia la comprensin del metabolismo celular y
las dinmicas del crecimiento [4, 6], as como tambin las condiciones de cultivo que favorecen la
formacin de los productos deseados [2, 7, 8].
En un cultivo celular, la cantidad de producto metablico deseado es proporcional al nmero de
clulas presentes en un cultivo. Adems, a partir del conocimiento bsico de las reacciones bioqumicas aparecen la concentracin de sustrato, las condiciones de reaccin o cultivo y la existencia o
1
no de un producto inhibitorio como factores incidentes en la dinmica del crecimiento celular. Es

con esto que se justifica la obtencin de una alta concentracin celular como un objetivo establecido
en el diseo de los bio-procesos, considerndose un punto de operacin deseado.
La dependencia del crecimiento celular de la concentracin de productos metablicos inhibidores genera la posibilidad de aumentar la concentracin celular por medio de la disminucin de
los mismos en el cultivo. Sin embargo, la dificultad y el alto costo de remover selectivamente un
compuesto en un cultivo crea la inquietud de buscar formas alternativas para la misma finalidad,
generndose el desafo de controlar las condiciones de cultivo con la finalidad de obtener bajas
concentraciones de producto inhibitorio.
El estudio del problema descrito ha revelado que las clulas animales son capaces de alterar
su respuesta metablica frente a una determinada concentracin de glucosa y alcanzar un estado
metablico alterado con una menor produccin de lactato, metabolito inhibidor del crecimiento
celular animal [9].
La sensibilidad de los cultivos celulares animales frente a las condiciones de cultivo pone exigencias sobre el diseo de controladores para mantener un estado metablico bajo o alterado, en
donde en la literatura se ha catalogado un estado como alterado cuando la proporcin de la tasa de
produccin de lactato y la tasa de consumo de glucosa en un cultivo es inferior a la razn de 0,1
[mol/mol], muy por debajo de la razn estequiomtrica igual a 2,0 [mol/mol] que se ha observa
bajo condiciones de cultivo sin mayor restriccin de sustrato [12]. Esto genera un desafo importante al aplicar las teoras de control para mantener un cultivo, sensible a las condiciones de cultivo,
en un estado metablico alterado, un problema de control de procesos que no ha sido abordado
anteriormente. Por otra parte, el diseo de controladores para determinados bio-procesos, en donde
el fenmeno bioqumico que ocurre al interior de un bio-reactor no es de conocimiento absoluto,
ha motivado la utilizacin de modelos dinmicos para simular un sistema biolgico complejo. La
descripcin de un sistema biolgico por medio de un modelo dinmico permite la simulacin de la
respuesta dinmica del sistema frente a una determinada seal de entrada evitando el costo asociado
a la recopilacin de datos experimentales, siempre y cuando el modelo represente adecuadamente
el proceso y/o fenmeno bioqumico abordado.
Sumado al creciente inters por el modelamiento de bio-procesos se encuentra el diseo de
controladores de distinta ndole para regular diferentes condiciones de cultivo que requieren de especial atencin debido a la sensibilidad de estos cultivos frente a ellas. Con un modelo matemtico
2
de proceso es posible disear controladores de diferente ndole mediante los controladores clsicos
proporcional (P), proporcional derivativo (PD), proporcional integral (PI) y proporcional integral
derivativo (PID), y controladores de tcnica avanzada como lo son el control ptimo y el control
difuso, tarea que se ha llevado a cabo y se ha aplicado en la industria [10].
1.1.
Organizacin de la tesis
Esta tesis posee la siguiente estructura:

En el segundo captulo se presentan los antecedentes bioqumicos relacionados con el fenmeno de la variacin del estado metablico en clulas animales. Se plantean los antecedentes
tericos de la produccin de lactato y los antecedentes experimentales que enmarcan la variacin del estado metablico, fenmeno a simular por medio de un modelo metablico.
En el tercer captulo se muestra la construccin del modelo metablico inicial que se utiliz
para el desarrollo del sistema biolgico completo. Tambin se incluyen la metodologa de
ajuste de parmetros del modelo metablico inicial y un anlisis de estabilidad del mismo que
corrobora la falta de capacidad del modelo inicial de alcanzar ms de un estado estacionario.
El cuarto captulo incluye los criterios de simplificacin del modelo metablico construido
en el tercer captulo, su ajuste y un anlisis de estabilidad que justifica la necesidad de incluir
un modelo de regulacin para describir el fenmeno de alteracin de estado metablico.
El quinto captulo describe los antecedentes biolgicos relacionados con el fenmeno de
la variacin del estado metablico y documenta la integracin del modelo de regulacin
gnica en el modelo matemtico del cuarto captulo para poder describir el fenmeno de
variacin del estado metablico. Se presentan los supuestos realizados para el planteamiento
de este modelo de regulacin y los resultados obtenidos de la comparacin con resultados
experimentales que presentan diferentes modos de operacin a lo largo del cultivo. El modelo
final obtenido ser utilizado para la simulacin de un sistema de bio-reactor continuo cuya
alimentacin de glucosa ser controlada por un controlador cuyo diseo se presenta en el
captulo sexto.
En el sexto captulo se presenta el diseo y simulacin de tres controladores de la alimentacin de glucosa a un cultivo animal para la regulacin de su estado metablico. Se simul
3
y analiz la respuesta del sistema de lazo abierto a fin de establecer la perturbacin ms

relevante para el sistema utilizando el modelo metablico desarrollado en los captulos anteriores, haciendo hincapi en la reversibilidad de la variacin del estado metablico. Se
resuelve el problema de diseo del controlador de la concentracin de glucosa bajo la premisa del problema servo frente a una perturbacin de un 10 % del coeficiente de dilucin.
Los controladores diseados incluyen un controlador proporcional, un controlador basado en
modelo lineal y un controlador basado en modelo no lineal, todos ajustados por medio de la
minimizacin del error integral ponderado por el tiempo (ITAE).
1.2.
Objetivo de la tesis
El objetivo principal de la presente tesis es el diseo de un sistema de control que permita

obtener la estrategia ptima de alimentacin de glucosa a un reactor continuo con un cultivo de
clulas animales a fin de mantener dicho cultivo celular operando bajo las condiciones de operacin
necesarias para mantener un estado metablico alterado.
1.3.
Objetivos especficos de la tesis
Los objetivos especficos de la presente tesis son los siguientes:

1. Establecer un modelo metablico y simular un cultivo continuo con regulacin gnica para
clulas CHO.
2. Simular un cultivo de clulas CHO en un reactor continuo bajo diferentes condiciones de
operacin (batch, continuo y fed-batch).
3. Disear diferentes estrategias de control de la alimentacin del cultivo para la regulacin del
estado metablico en clulas CHO.
4. Analizar y comparar la respuesta de diferentes controladores frente al problema de mantener
el cultivo celular en un estado metablico alterado.
Captulo 2
Antecedentes
2.1.
Metabolismo en clulas animales
El metabolismo celular animal puede ser considerado como un circuito de reacciones metablicas, catalizadas enzimticamente y de alta complejidad, que puede comienzan con la entrada
del sustrato principal al citoplasma de una clula animal. Junto con existir una red de reacciones
qumicas que se correlacionan para formar la completitud del metabolismo existen metabolitos participantes de dichas reacciones que se relacionan entre s por medio de estas reacciones catalizadas
enzimticamente.
La gliclisis es la va metablica que abarca la transformacin de glucosa en piruvato para
formar simultneamente 2 molculas de adenosin trifosfato (ATP), compuesto valioso porque se
relaciona con la produccin de energa para que la clula pueda llevar a cabo sus funciones bsicas.
La reaccin global que ocurre en la gliclisis es la siguiente:
Glc + 2NAD 2Pyr + 2NADH + 2H +
(2.1)
de donde cada molcula de glucosa forma dos molculas de piruvato.

El piruvato es considerado uno de los metabolitos ms relevantes del metabolismo celular animal por ser un compuesto que relaciona tres grandes hitos metablicos: el consumo de glucosa, la
produccin de lactato y el transporte de piruvato al compartimento mitocondrial que luego participar en el ciclo del cido tricarboxlico (TCA). El piruvato regula el primero de estos hitos pues la
produccin de piruvato ocurre de manera irreversible en la reaccin catalizada por la enzima piruvato quinasa (PK, E.C.# 2.7.1.40 [11]) y se ha observado en clulas de rin de hamster beb (BHK)
que bajo condiciones comunes de cultivo un 69 % del total de glucosa consumida es utilizada para
5
producir piruvato [13]. La produccin de lactato y el transporte de piruvato al espacio mitocondrial

son reacciones paralelas lo que hace que tericamente el flujo de piruvato hacia la mitocondria, al
igual que la cantidad de piruvato utilizado para producir lactato, podra variar dependiendo de la
concentracin de enzima catalizadora de la reaccin de generacin de lactato y de la actividad de
los canales de transporte de piruvato hacia la mitocondria. Por otra parte, la formacin de lactato
es producto de la reaccin catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH, E.C.# 1.1.1.27
[11]) y consiste en la siguiente reaccin de xido-reduccin:
Pyr + NADH Lac + NADH +
(2.2)
con lo que, tericamente, la relacin estequiomtrica mxima entre la glucosa y el lactato (L/G)
es 2,0. Sin embargo, se ha observado experimentalmente que dicha relacin estequiomtrica, en
el estado estacionario del cultivo celular continuo, puede disminuir alcanzando valores de hasta
0,03 [mol/mol] y que vara dependiendo de las condiciones de cultivo que llevaron a dicho estado
estacionario, como por ejemplo el uso de diferentes concentraciones de alimentacin de glucosa o
glutamina y/o duracin de modos de operacin batch, fed-batch y/o continuo [12].
2.2.
Antecedentes biolgicos de la alteracin del estado metablico en clulas animales
Estudios relacionados con el anlisis de la respuesta metablica de una clula animal han concluido que frente a concentraciones inferiores a 1,24 [mM] de glucosa residual se observa una
variacin en los flujos especficos de produccin de lactato y de consumo de glucosa [13]. Sumado a esto, el anlisis de flujos metablicos indica que las mismas concentraciones bajas afectan la
proporcin de piruvato que pasa a la mitocondria y a formar lactato. Se ha observado que frente a
una concentracin de 0,14 [mM] de glucosa la clula produce casi un 80 % menos de lactato y la
entrada de piruvato al ciclo TCA pasa a ser 132 veces lo que sera con una concentracin de 1,24
[mM] de glucosa [13]. Los anlisis de flujos metablicos han confirmado que las clulas animales,
bajo condiciones de baja concentracin de glucosa, distribuyen de distinta manera los productos
metablicos, dando pie a un metabolismo ms eficiente pues se favorece las reacciones de produccin de adenosin trifosfato (ATP), metabolito vital para la produccin de energa de la clula, y no
las de lactato [14].
La variacin de los flujos metablicos en clulas animales expuestas a bajas concentraciones

residuales de glucosa apoyan los hallazgos experimentales de que la razn L/G puede alcanzar
valores de hasta 0,03 [mol/mol] [12].
A fin de entender el fenmeno de la variacin del estado metablico en una clula animal
es necesario entender los antecedentes biolgicos que permiten definir un criterio respecto a lo
que se puede considerar una variacin del estado metablico en estas clulas. En primer lugar,
la alteracin del estado metablico en una clula animal tiene como respuesta ms representativa la variacin de la razn estequiomtrica L/G. Bajo este criterio el estado metablico de
una clula se puede clasificar en tres grupos: normal o alto (L/G 1[mol/mol]), intermedio
(1, 0[mol/mol] > L/G > 0, 1[mol/mol]) y alterado o bajo (0, 1 L/G) [12]. Si bien el fenmeno de variacin del estado metablico parece ser netamente a nivel de regulacin metablica,
se ha constatado experimentalmente que la respuesta metablica diferencial entre un cultivo en un
estado u otro va de la mano con una variacin de niveles de expresin de genes asociados a la
produccin de ciertas enzimas, en particular en gliclisis [15].
Se han realizado comparaciones de los niveles de expresin de los genes asociados a algunas
de las enzimas que participan en la gliclisis a fin de tener una nocin de qu genes sufren de
una variacin de los niveles de expresin al variarse el estado metablico. Los resultados de estos
anlisis con las enzimas afectadas se encuentran resumidos en la Tabla 2.1, en donde se detalla si
los niveles de expresin de genes asociados a ciertas enzimas sufren variacin al estar en un estado
metablico alterado.
Tabla 2.1: Resumen anlisis de variacin de niveles de expresin gnicos de un cultivo con su
estado metablico alterado en comparacin a un cultivo sin variacin de su estado metablico [15].
Anlisis Gnico
Enzima Anlisis Protemico PCR Tiempo Real
GeneChip
Microarray cDNA
TPI
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
PGM
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
No hay variacin
EN
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
LDH
Si hay variacin
Si hay variacin
No hay variacin
Si hay variacin
PK
No hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
PFK
No hay variacin
Si hay variacin
Si hay variacin
No hay variacin
De la Tabla 2.1 se puede concluir, al comparar un estado metablico de control con uno alterado,
que el fenmeno de la variacin de estado metablico no ocurre nicamente a nivel metablico.
El hecho de que el fenmeno se lleve a cabo tambin a nivel de expresin de genes asociados a
7
determinadas enzimas sugiere que podra haber una variacin en la cantidad de enzimas afectadas.
Captulo 3
Modelo metablico celular animal
3.1.
Antecedentes
Los altos costos que implica llevar a cabo estudios experimentales relacionados con la ingeniera metablica han generado un cambio en el enfoque de los mismos estudios. Con lo anterior, el
planteamiento de modelos matemticos que describen la dinmica del metabolismo celular ha tenido un mayor nfasis en la ltima dcada. El planteamiento de modelos matemticos se ha aplicado
para diversas lneas celulares, desde lneas de metabolismo simple como es el caso de las bacterias,
hasta modelos metablicos para redes metablicas complejas como son las de las clulas animales
[4, 6, 1619].
Para el caso particular de la presente tesis se ha optado por abordar el modelamiento del metabolismo celular de linea celular animal y especficamente de la cepa de clulas de ovario de hamster
chino (CHO). La revisin exhaustiva de la literatura permite concluir que los modelos metablicos
poseen vas metablicas comunes que se diferencian tanto en el orden secuencial de sus reacciones,
como tambin en los parmetros utilizados para representar las cinticas enzimticas involucradas.
Por lo mismo se hace necesario tomar una base metablica correcta de la lnea celular a simular para
desarrollar el sistema de ecuaciones que representa un sistema bioqumico complejo como es el de
un cultivo celular animal en un bio-reactor, esto con la finalidad de obtener una respuesta simulada
de acuerdo a lo observado experimentalmente. Adems, de la literatura se pueden rescatar numerosos modelos que simulan el metabolismo celular animal pero ninguno aborda especficamente el
problema de trazar un modelo metablico capaz de seguir la dinmica de un cultivo celular que
cambia de estado metablico.
3.2.
Descripcin matemtica de metabolismo celular animal
La base para la representacin matemtica del cultivo celular es el modelo de metabolismo celular. La representacin de dicho modelo metablico puede tener diferentes formas dependiendo del
fin de dicho modelo como tambin puede tener un planteamiento matemtico diferente como es una
descripcin estocstica o por medio de ecuaciones diferenciales ordinarias [20]. La finalidad ltima del modelo a utilizar es representar de manera fiel la respuesta metablica de un cultivo celular
animal frente a determinadas condiciones de operacin. Se ha tomado como base el metabolismo
de una lnea celular animal por su relevancia en la industria farmacutica [4].
El metabolismo de las clulas animales consiste, a grandes rasgos, en una red de reacciones qumicas catalizadas enzimticamente que siguen cinticas determinadas, en donde dichas velocidades
dependen de los metabolitos participantes en cada reaccin metablica. Se ha tomado como base
un modelo matemtico que contempla 46 ecuaciones diferenciales ordinarias que cierran el balance
de masa de 44 metabolitos internos y 2 compuestos extra celulares como modelo metablico. El
modelo metablico inicial se basa en modelos cinticos existentes y ha sido validado utilizando los
anlisis de flujos metablicos [21].
El modelo metablico utilizado para clulas animales, obtenido del planteamiento del balance
de masa por metabolito y considerando un volumen constante, est planteado por medio de ecuaciones diferenciales ordinarias de la forma general:
~
dC
~
= S~r ~(C)
dt
(3.1)
~ corresponde al vector de concentraciones de los distintos metabolitos celulares, S es la

en donde C
~ corresponde al
matriz estequiomtrica,~r es el vector de velocidades de reaccin asociados, y ~(C)
vector de transporte y consumo. El modelo anterior es no lineal debido a que las velocidades de
reaccin tienen la forma:
~
ri = rimax fi (C)
(3.2)
~ es una funcin no lineal que

en donde rimax es la constante de velocidad de la reaccin i y fi (C)
10
~ involucrados. Las cinticas

describe la dependencia de la velocidad de reaccin de los reactantes C
enzimticas obtenidas para el modelo son en su mayora de forma de Michaelis-Menten y algunas
expresiones cinticas son derivables utilizando el mtodo de Cha [22, 23].
En la Figura 3.1 se encuentra un diagrama del metabolismo celular a utilizar como base de
planteamiento, en donde se detallan las reacciones enzimticas y los metabolitos que participan en
las mismas [21]. Los balances de masa y las expresiones de velocidades de cada una de las especies
involucradas se encuentra en el Anexo A.
D-glucosa
GlcTr
GSSGR GSSG
GSHOX
GSH
D-glucosa
ATP
HK
ADP, H +
NADP + NADPH
H 2O
Glucosa-6-fosfato
G6PD
PGI
ADP, H
Ribulosa-5-fosfato
6PGD
TK1
Xilulosa-5-fosfato
TK2
ALDO
Gliceraldehido 3-fosfato
TPI
Pi, NAD +
GPI
NADH
Nucletidos
1,3 Bifosfoglicerato
ADP
PGK
Biomasa
ATP
BSL2
3-fosfoglicerato
Lipidos
PGM
BSL1
EN
Serina
Lactato
Serina
SDT
LDH
Lactato
MCT
NAD +
A, ASC
Alanina
Oxaloacetato
Malato
2-fosfoglicerato
A, ASC
CoASH
H 2O
BSL3
Fosfoenol piruvato
ADP + H +
PK
ATP
Piruvato
TCT
NADH
CoASH, H +CO
2
NAD +
PDHC
Piruvato
Citrato
Acetil CoA
CoASH, H +
Citrato
Acetil CoA
CS
NADH
Glutamina
ACON
Oxaloacetato
Leucina
Y+
Lisina
CO 2
Leucina
aKetoadipato
NADH
CO 2
CoASH, NAD +
Glutaril CoA
FUMH
H 2O
CO 2 , NADH
Aspartato
a-ketoglutarato Glutamato
Asparagina
Ornitina
Urea
FADH 2
X-AG
Treonina
SCS
FAD
Sucinato
Y+
ASC
Arginina
Treonina
H 2O
Sucinil CoA
SDH
Glutamato
Glutamate
g-semialdehyde
Arginina
KGDH
Fumarato
Asparagina
NADH
CO 2
Acetoacetil CoA
CO 2
X AG
NADPH
H+
H 2O
CoASH, H +
NAD +
Lisina
Glutamato
a-ketoglutarato
Malato
CoASH
Glutamina
NADP +
IDH
NAD +
Acetoacetato
CO 2
NH 4
NAD +
MDH
a-ketoglutarato Glutamato
A, ASC,L,N
H2 O
Isocitrato
NADH
H+
RN
Alanina
PRPP
BSN
EP
Fructosa-1,6-bifosfato
Dihidroxiacetona fosfato
PRPPS
Ribosa-5-fosfato
Sedoheptulosa-7-fosfato
TA
CO2
RPI
Eritrosa-4-P
Fructosa-6-fosfato
ATP
PFK
NADP + NADPH
6-fosfogluconato
NH 4
aKetobutirato
GDP, Pi, H +
GTP, CoASH, H 2O
HCO3-
Metilmalonil CoA
CoASH
NAD
CO 2
NADH
Propionil CoA
Aspartato
Figura 3.1: Vas metablicas del metabolismo celular de una clula animal. Las reacciones con
color gris fueron agrupadas de manera de contemplar una nica reaccin desde el reactante inicial
de la cadena reactiva en gris hasta el producto final de la reaccin [21].
3.3.
Modelacin de sistema bio-reactor-cultivo
Previa a la integracin del modelo de metabolismo celular inicial a un modelo de bio-reactor

con clulas en cultivo, se realiz una auditora exhaustiva del modelo a fin de verificar los balances
11
Figura 3.2: Diagrama del sistema de reactor con cultivo celular operando en forma continua. (a)
diagrama del bio-reactor con las variables de operacin asociadas, y (b) una ampliacin de una
clula del cultivo con los flujos y las velocidades asociadas a los mismos, r perm y rmct (ver Anexo
A). Fe es el flujo de entrada, Fs es el flujo de salida, Cglc,e es la concentracin de glucosa entrante,
e es la concentracin de glucosa del flujo de salida, Ce es la concentracin de lactato del flujo
Cglc
lac
de salida, Xcel es la concentracin celular presente en el flujo de salida, VR es el volumen del reactor,
y Vcelula es el volumen celular.
de masa internos y la correspondencia de las expresiones de cinticas asociadas a cada reaccin enzimtica. La auditora consisti principalmente en la verificacin de los planteamientos de balances
de masa, anlisis de las diferentes cinticas en base a los mtodos de construccin utilizados y la
revisin bibliogrfica de los parmetros de dichas cinticas.
Una vez verificado el modelo de metabolismo inicial, se procedi a englobar el mismo dentro
de un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias que representa la interaccin entre un bioreactor y el cultivo celular. Para plantear el sistema matemticamente se realiz un balance de masa
global para el bio-reactor y un balance de biomasa, adems de balances de masa por especie para la
glucosa y el lactato extra celular, omitiendo el balance existente de estos ltimos en el modelo de
metabolismo celular inicial. Si bien es sabido que las clulas animales no solo consumen glucosa,
este trabajo se enfoc netamente en la glucosa como sustrato principal debido a que el consumo del
mismo es ms significativo que el de otros sustratos como la glutamina [13, 24].
De esta manera el sistema de ecuaciones para el bio-reactor es obtenido por las ecuaciones del
balance de masa realizado sobre el bio-reactor descrito en el diagrama de la Figura 3.2.
12
Las ecuaciones siguen el planteamiento general de balance de masa:

Acumulacin = Entrada - Salida + Generacin - Consumo
Que se traduce en lo siguiente para el caso del sistema completo:
Balance global del reactor

d(RVR )
= e Fe s Fs
dt
Suponiendo un reactor perfectamente agitado (R = s ) y que la densidad del medio alimentado es
igual al del medio de cultivo (R = e )
d(VR )
= Fe Fs
dt
(3.3)
Balance de especies en el reactor

Glucosa:
e V )
d(Cglc
R
dt
e
= Fe Cglc,e Fs Cglc
rcons VR
donde rcons corresponde a la tasa de consumo de glucosa por parte del cultivo celular.
e )
d(Cglc
dt
Fe
Fs e
Cglc,e Cglc
r perm Xcel Vcel
VR
VR
(3.4)
donde r perm [mmol/L s celula] corresponde a la tasa de permeacin de glucosa desde el medio al
citoplasma, por clula, y Xcel [109 celulas/L] a la concentracin celular en el reactor.
Lactato:
e V )
d(Clac
R
e
= Fe Clac,e Fs Clac
+ rgen VR
dt
donde rgen es la tasa produccin de lactato por parte del cultivo celular. El medio alimentado no
contiene lactato por lo que Fe Clac,e = 0.
e )
d(Clac
Fs e
+ rmct Xcel Vcel
= Clac
dt
VR
(3.5)
rmct [mmol/L s celula] corresponde a la tasa de produccin de lactato extra celular para una
clula.
Para los anteriores balances de masa se supuso constante el volumen del reactor y el volumen
13
de la clula, un consumo uniforme de glucosa y una produccin uniforme de lactato por parte del
cultivo celular.
Balance de biomasa en el reactor
d(Xcel VR )
= Fe Xcel,e Fs Xcel + Xcel VR
dt
en donde es la tasa de crecimiento del cultivo celular. Se supuso que no hay entrada de nuevas clulas con el medio de alimentacin con lo que Fe Xcel,e = 0. Adems, se plante que el crecimiento
celular segua una dinmica de tipo monod de la siguiente forma:
e
Cglc
I
Klac
= max S
I
e
e
Klac +Clac
Kglc +Cglc
(3.6)
S [mmol/L] es la constante de
en donde max [1/hr] es la tasa mxima de crecimiento especfico, Kglc
I [mmol/L] es la constante de inhibicin
activacin de crecimiento por la presencia de glucosa y Klac
del crecimiento por la presencia de lactato. Debido al alcance del problema a desarollar en la
presente tesis se supuso que no existe muerte celular pues se busca analizar el comportamiento
de un cultivo celular previo a cualquier indicador de muerte celular. De esta manera, el balance
resultante de biomasa es:
d(Xcel )
= ( Fs ) Xcel
dt
3.4.
(3.7)
Condiciones de simulacin
Para la simulacin de la respuesta dinmica del bio-reactor se utilizaron las condiciones de

operacin descritas en la literatura [25]. Esto con la finalidad de comparar las curvas obtenidas
experimentalmente con dicho montaje y sus condiciones de operacin con las curvas simuladas y,
de ser necesario, realizar un ajuste de los parmetros cinticos.
De esta forma, la simulacin del cultivo de control considera las siguientes condiciones de
operacin:
Etapa Batch: El cultivo de clulas animales permanece durante 45 horas en un reactor batch
de 250 [mL] de capacidad con una concentracin inicial de glucosa de 18,4 [mM].
Etapa Continua: Posterior a la etapa con modo de operacin batch, se da inicio a un modo
de operacin continuo hasta cumplir 250 horas de cultivo. El coeficiente de dilucin durante
14
esta etapa es de 0,031 [1/hr] y se alimenta el cultivo con una concentracin constante de
5,276 [mM] de glucosa.
Los resultados experimentales observados para un cultivo bajo las condiciones de cultivo de
control se muestran en las Figuras 3.3 y 3.4.
20
1.8
Conc. Glucosa
Conc. Lactato
1.6
16
1.4
14
Conc. Celular [109/L]
Conc. Lactato, Glucosa [mM]
18
12
10
8
6
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
0
0
250
50
100
150
Tiempo [hr]
200
250
Figura 3.3: Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo de control
[25]. El cultivo consiste en un modo de operacin batch hasta las 45 [hr] y una operacin continua
desde las 45 [hr] hasta el final.
15
2.5
L/G [mol/mol]
1.5
0.5
0
0
50
100
Tiempo [hr]
150
200
250
Figura 3.4: Razn L/G observado experimentalmente para el cultivo de control [25]. El cultivo
consiste en un modo de operacin batch hasta las 45 [hr] y una operacin continua desde las 45
[hr] hasta el final.
Por otra parte, las condiciones de operacin reportadas en [25] para un cultivo con estado metablico alterado son:
Etapa Batch: El cultivo permanece en modo de operacin batch con una concentracin inicial de glucosa de 0,722 [mM], en un reactor de 550 [mL] de capacidad, hasta alcanzar una
concentracin de 0,278 [mM] de glucosa en el bio-reactor.
Etapa Fed-Batch: Posterior a la etapa batch, se mantiene el cultivo con una concentracin
extra celular de 0,278 [mM] de glucosa por medio de la alimentacin intermitente de una
corriente de entrada de glucosa con una concentracin de 66,704 [mM].
Etapa Continua: A las 105 horas de operacin se da inicio a un modo de operacin continuo
con las mismas condiciones de operacin utilizadas para la etapa continua del cultivo de
control.
Los resultados experimentales observados para un cultivo bajo las condiciones de cultivo alterado recin mencionadas se muestran en las Figuras 3.5 y 3.6.
16
3.5
6
Conc. Glucosa
Conc. Lactato
5
2.5
Conc. Lactato, Glucosa [mM]
2
1.5
1
0.5
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
0
0
300
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 3.5: Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo alterado
[25]. El cultivo consiste en un modo de operacin batch hasta aproximadamente las 23 [hr], una
operacin fed-batch hasta las 105 [hr], y una operacin continua desde las 105 [hr] hasta el final.
1.8
1.6
L/G [mol/mol]
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
250
300
Figura 3.6: Razn L/G observado experimentalmente para el cultivo alterado [25]. El cultivo
consiste en un modo de operacin batch hasta aproximadamente las 23 [hr], una operacin fedbatch hasta las 105 [hr], y una operacin continua desde las 105 [hr] hasta el final.
La comparacin de las concentraciones de las Figuras 3.3 y 3.5 muestra concentraciones menores de glucosa residual en los tramos anteriores al modo de operacin continuo (previo a las 45
[hr] para el cultivo de control y a las 105 [hr] para el cultivo alterado) debido a que dentro de las
17
condiciones de operacin del cultivo alterado existe una mayor restriccin de la glucosa alimentada
al cultivo. Por otra parte, las concentraciones de lactato son muy inferiores para el cultivo alterado,
observndose un mximo de concentracin cercano a 3,5 [mM] para el cultivo alterado comparable
con cerca de 20 [mM] para el cultivo de control. A su vez, la concentracin celular alcanzada hacia
el final del cultivo de control oscila en torno a los 1,3 [109 /L] mientras que para el cultivo alterado
se alcanzan valores cercanos a los 5 [109 /L].
En cuanto a las curvas de la razn L/G, en la Figura 3.6 se observan valores inferiores a los
0,2 [mol/mol] en todo el tramo continuo del cultivo alterado de la (a partir de las 105 [hr])
3.5.
Ajuste de parmetros
El modelo dinmico planteado fue simulado considerando las condiciones de operacin del
cultivo de control y la respuesta metablica celular fue contrastada con resultados los experimentales de la literatura [25]. Para la simulacin del crecimiento celular se utilizaron como parmetros
S = 0, 05[mM] y K I = 14[mM] provenientes de la literatura [26]. Los remax = 0, 033[1/hr], Kglc
lac
20
1.8
18
1.6
16
1.4
14
Lactato, Glucosa [mM]
sultados se muestran en la Figura 3.7.
12
10
8
6
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
0
0
250
50
100
150
Tempo [hr]
200
250
Figura 3.7: Simulacin de cultivo de control. : Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada de gluco-
sa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental de lactato, : Conc. experimental de glucosa, : Conc.
celular experimental
Al analizar la Figura 3.7 se puede observar, para la curva de glucosa, un tramo de baja variacin
18
de concentracin (hasta las 46 horas de simulacin) y luego una fuerte diminucin de la concentracin debido a que se inicia la etapa continua del cultivo y el consumo de parte del cultivo es
menor al flujo de salida del reactor por lo que se produce un lavado de glucosa (la concentracin de
glucosa alcanza una concentracin de equilibrio menor producto de una variacin del coeficiente
de dilucin, el cual genera una variacin negativa de la concentracin de glucosa al interior del
reactor) hasta alcanzar un nuevo equilibrio. Esto tambin es identificable para la concentracin
celular en donde existen dos tramos claros con una dinmica diferente. Por otra parte, la curva
de concentracin de lactato no tiene una variacin apreciable a simple vista pero aumenta de una
concentracin de 0 [mM] hasta aproximadamente 0,002 [mM], muy por debajo de lo observado
experimentalmente.
De la Figura 3.7 tambin se observa que el sistema no fue capaz de retratar los resultados experimentales en primera instancia por lo cual se estudi la posibilidad de realizar un ajuste de los
parmetros del modelo de metabolismo celular inicial para obtener un mejor ajuste de los resultados de simulacin, a los datos experimentales. Un ajuste de parmetros se fundament en que, si
bien los parmetros de modelo utilizados inicialmente son todos obtenidos de la literatura correspondiente, el modelo corresponde a la relacin de modelos cinticos de una misma lnea celular
con la finalidad de revisar la respuesta metablica de una clula a nivel citoplasmtico y mitocondrial, no a nivel extra celular como es el caso de la presente tesis. La ligazn forzada de cinticas
de diferentes fuentes de literatura tiene como consecuencia que algunas reacciones enzimticas se
vuelvan controlantes de manera injustificada y los tiempos de las respuestas metablicas simuladas no corresponde a lo observado experimentalmente. Adems, los parmetros cinticos iniciales
corresponden a una lnea celular animal con variaciones de especies como homo sapiens [27, 28]
y rattus [29], y condiciones metablicas como deficiencia enzimtica [30] y estrs oxidativa [31],
lo que otorga una determinada variabilidad que se observa al simular la respuesta del cultivo a un
nivel macro como es el cultivo al interior de un bio-reactor.
Se realiz un ajuste manual de los parmetros cinticos basndose en las curvas experimentales
del cultivo de control. Se simul el sistema completo del bio-reactor con el cultivo celular bajo
las condiciones experimentales para los cuales se obtuvieron los resultados experimentales para la
concentracin extra celular de glucosa, lactato y la concentracin celular para el cultivo de control.
19
3.5.1.
Metodologa de ajuste de parmetros
La metodologa utilizada para el ajuste manual de los parmetros del modelo, cuyas ecuaciones
y parmetros se encuentran en los Anexos A y B, respectivamente, fue la siguiente:
1. Amplificacin de todas las velocidades enzimticas pertenecientes a la gliclisis excepto la
velocidad asociada a la permeacin de glucosa, es decir, las expresiones cinticas relacionadas con la actividad enzimtica de la hexoquinasa, glucosa 6-fosfato isomerasa, fosfofructoquinasa, aldolasa, triosefosfato isomerasa, gliceraldehido fosfato isomerasa, fosfoglicerato
quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa y piruvato quinasa (ver rHK , rPGI , rPFK , rALD , rT PI ,
rGPI , rPGK , rPGM , rALD , rPK en Apndice B) fueron amplificadas por un factor Pk . La finalidad de la amplificacin es aumentar la velocidad de reaccin de la gliclisis para evitar que
se produzcan reacciones controlantes intermedias, esto por medio del aumento de la cantidad
de enzimas catalizadoras que participan en la gliclisis. La motivacin detrs de la amplificacin estuvo en que se observ que las curvas de concentracin de la Figura 3.7 tienen una
respuesta metablica que calza cualitativamente con los resultados experimentales pero que
no ocurre dentro del rango de tiempo establecido.
2. La amplificacin descrita anteriormente tuvo como resultado un primer ajuste que, cualitativamente, coincida con las curvas experimentales pero que se presuma poda tener menor
error de ajuste a las curvas. En determinados tramos de la simulacin la pendiente de la concentracin de glucosa era muy baja, lo que se asoci a que el consumo de glucosa tambin
era muy bajo dado por una cantidad insuficiente de transportadores de glucosa hacia el compartimento citoplasmtico. Con el anterior supuesto se ponder la velocidad de permeacin
de glucosa (ver r perm en Apndice B) por un factor PGLC para obtener un mejor ajuste a la
curva de concentracin de glucosa experimental, obtenindose resultados positivos.
3. Una vez ajustada la curva de concentracin de glucosa se procedi al ajuste de parmetros
relacionados directamente con la produccin de lactato. La concentracin citoplasmtica de
lactato depende de dos reacciones; el lactato citoplasmtico es parte de los productos de
la catlisis enzimtica de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) y es transportado extra
celularmente por medio de los canales de transporte de monocarboxilatos de la clula. Al
ponderar ambas velocidades por un factor comn los resultados no fueron satisfactorios por
lo que se opt por ponderar las velocidades asociadas a la enzima LDH (ver rLDH en Apndice
20
B) y al transporte de monocarboxilatos por los factores PLAC y Pk2 , respectivamente. De esta

manera se aument la cantidad de enzimas participantes en la reaccin rLDH para aumentar
la produccin de lactato y se aument el nmero de transportadores de lactato cuya accin es
descrita por la tasa rMCT .
4. Debido a que exista una concentracin de lactato citoplasmtico superior a 0,1 [mM], concentracin esperable para el metabolismo de una clula que no presenta alteracin en su
estado metablico [21], se modific la relacin de equilibrio planteado entre la concentracin de lactato extra celular y citoplasmtico (ver rMCT en Apndice B). Inicialmente de 100,
se ponder dicha relacin de equilibrio por PLAC1 . El efecto bioqumico de lo anterior corresponde a aumentar la constante de equilibrio entre el lactato extracelular y el citoplasmtico
de manera que la diferencia entre ambos debe ser 100 veces ms alta para que el flujo de
lactato extracelular sea con direccin hacia el citoplasma y no hacia el exterior.
5. Se procedi a ajustar la curva de la concentracin celular. Este ajuste se dej para despus
de los ajustes de las curvas de concentracin de glucosa y lactato porque la cintica de crecimiento planteada considera una menor cantidad de parmetros y, por lo mismo, se supuso una
menor dificultad de ajuste. Los parmetros de crecimiento celular usados inicialmente fueron
obtenidos de la literatura [26] y el ajuste de los mismos fue sin tomar en consideracin las
variaciones en el offset de las curvas de concentracin de lactato y glucosa provocados, pues
los parmetros se volveran a ajustar por medio de la obtencin de los mnimos cuadrados.
La finalidad de realizar un primer ajuste de forma manual era para tener un acercamiento prctico de la incidencia de los distintos parmetros cinticos en la respuesta metablica y tambin
para tener un primer conjunto de parmetros con un orden de magnitud establecido, de manera de
ahorrar recursos computacionales en un segundo ajuste.
Una vez obtenidos los parmetros de forma manual se procedi a hacer ajuste de los mismos
por medio de la minimizacin de la suma ponderada de los residuales cuadrticos. La suma de los
residuales cuadrticos totales se calcul a partir de la siguiente frmula:
n
= (i, j i, j )
i j=1
21
(3.8)
en donde
experimental
i, j = 0 = (Ci
experimental
(t) Cisimulado (t))0 (Ci
(t) Cisimulado (t))
(3.9)
i = { glucosa, lactato, conc. celular }

j = 1, , n
en donde corresponde a la suma ponderada de la suma de los residuales cuadrticos i, j de
cada una de las curvas de concentracin i a comparar en determinados tramos j de la simulacin.
~ simulado corresponde al conjunto de datos simulados, C
~ experimental al conjunto de datos experimenC
~ simulado y C
~ experimental
tales y n es el tamao de la muestra. Los conjuntos de datos de los vectores C
deben ser del mismo tamao y comprender las concentraciones para los mismos instantes de tiempo de manera que sean comparables. Los pesos i, j corresponden a
1
,
2
en donde corresponde a
la desviacin estndar de la suma de los residuales para una curva de concentracin i en un tramo
j. La finalidad de utilizar pesos diferentes en diferentes tramos de la simulacin fue para darle un
mayor peso a los tramos difciles de ajustar como fueron los puntos de la segunda mitad de la etapa
continua. Se consideraron la suma de los residuales cuadrticos de las curvas de concentracin de
glucosa y lactato, junto con la curva de concentracin celular. Adems, la curva de concentracin
de lactato fue dividida en tres tramos en donde el tramo 1 corresponde al conjunto de puntos ubicados de 0 a 46 [hr] de cultivo, correspondiente a la etapa batch del cultivo, el tramo 2 de 46 a 134
[hr], que incluye los datos experimentales de la primera mitad de la etapa continua y el tramo 3 de
134 a 231 [hr], que abarca los datos experimentales desde la mitad de la etapa continua hasta el
final del cultivo.
La metodologa del ajuste de parmetros fue por medio del mtodo de minimizacin no lineal
sin restricciones de la suma de los residuales cuadrticos aplicando el mtodo simplex NelderMead a un punto inicial P0 , que en este caso, correspondi al vector con los parmetros ajustados
manualmente [32].
3.5.2.
Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados
La anterior minimizacin del valor de la suma de los residuos cuadrticos obtuvo como resultado los valores de los ponderadores exhibidos en la Tabla 3.1.
22
20
15
1.5
Tabla 3.1: Resumen de parmetros ajustados.

Parmetro
Valor
GLC
P
6.132,2
PLAC
5.987,9
LAC1
P
855,4
k
P
10.434,5
Pk2
100,7
10
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
0.5
0
0
250
50
100
150
Tiempo [hr]
200
250
Figura 3.8: Simulacin de cultivo de control. : Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada de gluco-
sa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental de lactato, : Conc. experimental de glucosa, : Conc.
celular experimental.
23
15
5
10
4
3
2
1
0
0
100
200
Tiempo [hr]
0
0
300
100
200
Tiempo [hr]
300
Figura 3.9: Simulacin de cultivo alterado. : Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada de glucosa,
-: Conc. celular simulada,
: Conc. experimental de lactato, : Conc. experimental de glucosa, : Conc.

celular experimental. El cultivo consiste en un modo de operacin batch hasta aproximadamente las 23 [hr],
una operacin fed-batch hasta las 105 [hr], y una operacin continua desde las 105 [hr] hasta el final.
Las curvas resultantes del anterior ajuste de parmetros se encuentran en las Figuras 3.8 y
3.9. Se aprecia de la Figura 3.8 que el ajuste de parmetros es cualitativamente satisfactorio, las
curvas obtenidas de la simulacin siguen la dinmica de la respuesta metablica del cultivo animal,
observada a nivel experimental, frente a las condiciones de operacin detalladas en la seccin 3.4
con la existencia de errores de ajuste al final del tramo continuo. La reduccin del error de ajuste
por medio del aumento del peso asociado al ltimo tramo de ajuste gener una prdida significativa
de la respuesta experimental en los tramos anteriores por lo que se opt por mantener el ajuste
realizado para darle robustez al modelo frente a cambios en el modo de operacin del cultivo. An
as, no puede considerarse como nica solucin al problema de reduccin del error de ajuste.
La introduccin de un consumo adicional de glucosa para la formacin de biomasa (rendimiento de sustrato) podra superar el problema del error de ajuste pero dicho consumo no es constante lo
que significara un trabajo de ajuste de parmetros de un modelo de consumo de sustrato considerado innecesario. Dicho trabajo se desestim pues las curvas simuladas logran captar cualitativamente
y, hasta una extensin satisfactoria, cuantitativamente la dinmica del cultivo en ambos modos de
operacin adems que el anlisis de la curva experimental de la razn L/G deja en evidencia
que existe una reduccin de la razn L/G hacia el final del cultivo. Si bien dicha reduccin no es
24
suficiente para considerarse una variacin a un estado metablico alterado [12], si demuestra que
hay una variacin en la cantidad de lactato producido con respecto al consumo de glucosa en dicho
tramo.
Tal como se observa en la Figura 3.9, el modelo metablico ajustado no es capaz de retratar
la respuesta metablica de un cultivo alterado. De la Figura 3.9 se tiene que el cultivo simulado
produce una cantidad mxima de lactato que casi cuadriplica al mximo obtenido de manera experimental y producto de este exceso de lactato la inhibicin del crecimiento es muy fuerte para
un cultivo celular animal con una variacin de estado metablico. La baja de concentracin que
se nota en la curva de concentracin de lactato de la Figura 3.9 corresponde al inicio del modo de
operacin contnuo (105 [hr]).
Adems, tanto para el cultivo de control como el alterado, las concentraciones de glucosa y lactato, y la concentracin celular tienen valores muy semejantes al final del cultivo. Esto justific un
anlisis comparativo del estado estacionario para ambos cultivos, por lo que se procedi a obtener
el estado estacionario de cada uno por medio de la simulacin hasta obtener una variacin inferior
a 1 105 para las concentraciones de lactato extra-celular y citoplasmtico, glucosa extra-celular
y citoplasmtico, piruvato citoplasmtico y mitocondrial, volumen y concentracin celular.
La similitud de los valores de estado estacionario alcanzado para los cultivos alterado y de
control permite suponer que el modelo es capaz de entregar una respuesta metablica nica, lo que
establecera que el modelo con su actual ajuste de parmetros no es capaz de retratar ms de un
estado metablico.
3.6.
Anlisis estadstico de parmetros ajustados
3.6.1.
Prueba de t de Student
Para establecer la significancia estadstica de los parmetros obtenidos a partir del anterior
ajuste, se realiz un anlisis estadstico a los parmetros ajustados. Bajo la suposicin de que el
error asociado a los residuales de un ajuste, definidos en la ecuacin 3.9, siguen una distribucin
gaussiana, se realiz un test de hiptesis a los parmetros ajustados por medio del anlisis de los
intervalos de confianza aplicando una distribucin t de Student.
La prueba de t de Student consiste, bsicamente, en la comparacin de dos muestras de datos
en donde una muestra soporta una hiptesis nula de una prueba estadstica y la otra a la hiptesis
25
a respaldar. A su vez, una prueba de t de Student pareada es utilizada cuando existen muestras
dependientes, es decir, que se ha realizado un mismo experimento con muestreo de un nmero n de
datos, al menos dos veces y se desea realizar una comparacin entre ellas.
Obtenidos el par de espacios muestrales para cada hiptesis se procede a calcular el estadstico t,
que en este caso corresponden al conjunto de datos simulados de concentracin celular, de glucosa
y de lactato con el modelo sin ajuste de parmetros y al conjunto de los mismos datos simulados
con el modelo con ajuste de parmetros:
t=
CD 0
sConc,D / n
(3.10)
en donde CD y sConc,D son el promedio y la desviacin estndar, respectivamente, de las diferencias entre los valores Ci, j de cada conjunto muestral i = inicial, a justado en donde j = 1, , n,
siendo n el nmero de datos a comparar y 0 es la media poblacional de la diferencia entre el dato experimental y el simulado. La constante 0 es diferente a cero cuando se desea analizar si el
promedio de la diferencia CD entre muestras es significativamente diferente de la media 0 .
Una vez calculado el estadstico t se procede a hallar el p-value de la muestra en una Tabla de
distribucin t de Student utilizando el valor t calculado y los grados de libertad de la muestra que
corresponden a n 1, y para concluir respecto de la significancia estadstica de la diferencia entre
muestras se fija un nivel de confianza y, si dicho p-value se encuentra bajo el nivel fijado, se rechaza
la hiptesis nula [33].
Para el caso particular del anlisis de los parmetros ajustados se llev a cabo una prueba t de
Student pareada a los residuales para el caso base de las curvas simuladas sin ajuste de parmetros
considerado como hiptesis nula H0 y los residuales del modelo con el ajuste del parmetro i,
considerada la hiptesis a probar Hi . Lo que se busca comprobar, a travs de la prueba t de Student,
es que el promedio de la diferencia de residuales CD = D es significativamente distinto de cero, es
decir que 0 = 0 de manera de poder concluir que el ajuste del parmetro analizado es significante.
El establecimiento de significancia de un parmetro permite suponer, con una alta probabilidad,
que la diferencia en la respuesta simulada que se genera al realizar el ajuste de dicho parmetro no
es por otro efecto ms que por la variacin del parmetro en cuestin [34].
26
De esta manera se tiene:
H0 : pi = pi,0
(3.11)
i = { GLC, LAC, LAC1, k, k2 }

Hi : pi 6= pi,0
(3.12)
i = { GLC, LAC, LAC1, k, k2 }

en donde pi corresponde al ponderador i y pi,0 corresponde al valor de dicho ponderador previo al
ajuste de parmetros.
3.6.2.
Resumen de parmetros ajustados y resultados de anlisis estadstico
En la Tabla 3.2 se tienen los valores de los ponderadores utilizados en el ltimo ajuste y su
nivel de significancia dentro del modelo. La significancia de un parmetro es el resultado de la
prueba t de Student para un intervalo de confianza de un 95 %, de asociarse a un p-value superior
a 0,05 se rechaza la hiptesis alternativa Hi para dicho parmetro i y se concluye que el ajuste de
dicho parmetro para el tramo en cuestin de una curva de concentracin no es significante, es
decir, que cualquier la diferencia que se podra haber generado en una curva de concentracin no
es necesariamente producto del ajuste realizado con Pi .
Tabla 3.2: p-values y significancia al 95 % de parmetros ajustados
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
Parmetro
p-value Significante p-value Significante p-value Significante
GLC
P
0,0001
SI
0,0005
SI
0,0170
SI
PLAC
0,0001
SI
0,0011
SI
0,0123
SI
LAC1
P
0,0056
SI
0,0081
SI
0,0590
NO
k
P
0,2561
NO
0,0059
SI
0,0118
SI
Pk2
0,4074
NO
0,0013
SI
0,0038
SI
Se desprende de la Tabla 3.2 tambin que el ajuste de los parmetros es significante a casi todos
los niveles salvo por 3 parmetros (PLAC1 , Pk y Pk2 ). Se pueden considerar aislados debido a que
cada uno de dichos parmetros produce un cambio insignificante en el promedio de los residuales
en nicamente una curva, lo que no es motivo suficiente de descarte. Tambin se concluye que los
27
parmetros PLAC , PGLC tienen una alta significancia pues poseen los valores p-value ms bajos para
los casos de las curvas de concentracin de glucosa y de lactato.
Con el fin de analizar la relevancia del ajuste de cada parmetro en cada curva de concentracin
y comparar dichos ajustes con la simulacin con el modelo sin modificacin de sus parmetros se
compar la respuesta simulada del modelo sin ajustes y con un nico parmetro de ajuste PGLC ,
PLAC , PLAC1 , Pk y Pk2 aplicado, con los datos experimentales utilizados para su ajuste. La comparacin se llev a cabo por medio de los residuales (, ver ecuacin 3.9).
El de las curvas simuladas con el modelo inicial sin variacin de parmetros se muestra en la
Tabla 3.3.
Tabla 3.3: de las curvas simuladas con el modelo sin ajuste y ajustado con sus respectivos intervalos de confianza calculados para un 95 % de probabilidad.
Modelo
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
Sin ajustar 5, 575 1, 092 9, 178 2, 202
0, 455 0, 127
Ajustado 0, 701 0, 157 0.525 0.643 0, 155 0, 119
Tabla 3.4: de las curvas simuladas con los parmetros ajustados con sus intervalos de confianza
calculados para un 95 % de probabilidad.
Parmetro
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
GLC
P
5, 567 1, 091 9, 173 2, 201 0, 456 0, 127
LAC
P
5, 575 1, 092 9, 178 2, 202 0, 455 0, 127
PLAC1
5, 575 1, 092 9, 178 2, 202 0, 455 0, 127
k
P
5, 575 1, 092 9, 178 2, 202 0, 455 0, 127
k2
P
5, 575 1, 092 9, 178 2, 202 0, 455 0, 127
El resultado de la comparacin de los datos simulados y experimentales se muestra en la Tabla
3.4. De la comparacin con los resultados de la Tabla 3.3 se observa una mayor importancia del
ajuste del parmetro PGLC en comparacin a los parmetros PLAC , PLAC1 , Pk y Pk2 pues es el que
posee una mayor reduccin del error de ajuste cuando es ajustado por s solo. Por otra parte, los
parmetros restantes poseen un error de ajuste muy similar y no con diferencias significativas con
respecto al caso basal sin ajuste de parmetros.
Finalmente, la comparacin de los valores calculados de de la Tablas 3.3 y 3.4 permite suponer que es muy probable que los ajustes ms incidentes en la reduccin del de las curvas de
concentracin de glucosa, lactato y celular se llevaron a cabo a nivel de los parmetros involucrados en planteamiento del crecimiento celular descrito en la ecuacin 3.6 pues se reduce casi en un
28
orden de magnitud para el error de ajuste a las curvas de concentracin de glucosa y de lactato y a
prcticamente un 25 % el error de ajuste a la curva de concentracin celular.
3.7.
Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema
Como se aprecia en la Figuras 3.8 y 3.9, el modelo inicial retrata la respuesta metablica del
cultivo sin variacin de estado metablico pero no es capaz de describir la del cultivo frente a
condiciones bajo las cuales se induce un cambio en el estado metablico de la clula. Es por esto
que se hace necesario corroborar si la carencia de una respuesta metablica acorde con lo obtenido
experimentalmente corresponde a un error de planteamiento del modelo o de las condiciones de
simulacin. Para esto, la existencia de un nico punto estable apuntara a que el modelo matemtico
inicial no tiene ms de un estado estacionario estable y, por ende, el sistema biolgico planteado
requiere de la inclusin de un modelo adicional de regulacin del estado metablico.
3.7.1.
Anlisis de estabilidad por medio de valores propios
Considerando el sistema de ecuaciones diferenciales

~ = f (C,
~ )
C
(3.13)
~
~ 0 , se puede escribir matricialmente como
con el vector de condiciones iniciales C(0)
=C
~ = AC
~
C
(3.14)
~ = eAt C
~0
C
(3.15)
tiene la siguiente solucin analtica
que se puede escribir tambin de la forma

~ =
C(t)
c j e jt w[ j]
(3.16)
j=1
donde j y w[ j] corresponden a los valores y vectores propios de A, respectivamente.

La forma general de j es
j = a j + ib j
29
(3.17)
con lo que la expresin 3.16 queda de la forma

~ =
C(t)
c j ea jt [cos(b jt) + isin(b jt)]w[ j]
(3.18)
j=1
en donde el valor de b j incide en la oscilacin y el valor de a j determina la estabilidad de la

respuesta del sistema frente a una perturbacin.
La perturbacin de un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales dentro de una
~ s tiene la forma f (C
~ s + ) y se puede escribir como la siguiente
vecindad de su estado estacionario C
expansin de Taylor (considerando una perturbacin pequea)

n f
n f
n

j
j
= f j (C
= f j (C
~ s + ) f j (C
~ s) +
~ s) +
~ s ) + J jk
f j (C
~
~

xs
j=1 Ck C
j=1 Ck C
j=1
s
s
(3.19)
~ ).
en donde J jk es el componente de la fila j y columna k de la matriz jacobiana J de f (C,
De la aproximacin anterior se tiene
~ s + , ) f (C
~ s ) + J(C
~ s , )
f (C
(3.20)
De esta manera el estudio del estado estacionario de un sistema de ecuaciones diferenciales

ordinarias se relaciona con el anlisis de la respuesta del sistema ante una perturbacin . De las
~ s ) es constante en el tiempo por lo que
deducciones anteriores se tiene pues f (C
~ s)
d f (C
dt
= J(xs , )
=0
(3.21)
por lo que el anlisis de la estabilidad del estado estacionario frente a una perturbacin se
convierte en un anlisis de los valores propios de la matriz en la vencindad .
De la ecuacin 3.18 se puede deducir que la incidencia de a j en la estabilidad del estado estacionario de un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias depende de lo siguiente:
Si a j = Re( j ) j < 0, entonces para cualquier perturbacin el estado estacionario ser estable en la vecindad .
Si a j = Re( j ) j > 0, entonces para cualquier perturbacin el estado estacionario ser inestable.
Si a j = Re( j ) j 0, entonces para cualquier perturbacin el estado estacionario ser neu30
tralmente estable en la vecindad .

El criterio utilizado para establecer que un punto corresponde al estado estacionario fue que
el valor de la derivada para el crecimiento celular y para los metabolitos citoplasmticos, extracelulares y mitocondriales de glucosa, lactato y piruvato fuese inferior a 1 105 o que el valor
de la iteracin n no superara en 1 105 el valor de la iteracin (n 1) durante 10 iteraciones. El
objetivo de presentar dos criterios de estado estacionario es para superar posibles oscilaciones en
los valores de las concentraciones.
La aplicacin del anlisis numrico descrito al modelo metablico inicial concluy que la matriz
jacobiana evaluada en el estado estacionario del modelo inicial es semi-definida negativa, es decir,
que todos sus valores propios tienen parte real menor o igual o cero. Esto descarta la posibilidad
de que el estado estacionario sea inestable. Sin embargo, la existencia de valores propios iguales a
cero no permite concluir, solamente del anlisis de los valores propios, que el estado estacionario
~ s.
es un punto atractor estable en una vecindad de C
3.7.2.
Anlisis de estabilidad por medio de diagrama de fases
Con la motivacin de que el anlisis de los valores propios del jacobiano evaluado en el estado
estacionario no fue concluyente en cuanto a la estabilidad del estado estacionario del modelo inicial, se realiz un anlisis de estabilidad por medio de un diagrama de fases. El diagrama de fases
consiste esencialmente en un grfico de las trayectorias que sigue un sistema cuando es perturbado
desde el estado estacionario Pss hasta otro punto Pi , en donde las trayectorias trazan el comportamiento desde el punto Pi hasta alcanzar nuevamente el equilibrio, que puede coincidir con el punto
Pss .
La relevancia de ver el comportamiento del sistema planteado frente a perturbaciones recae,
bsicamente, sobre la respuesta del sistema frente a perturbaciones en la concentracin de lactato y
de glucosa. Es por esto que el diagrama de fases se realiz considerando solamente perturbaciones
en la concentracin de lactato y glucosa. La eleccin de los puntos iniciales de las trayectorias fue
de manera aleatoria, se escogi de manera aleatoria la magnitud de la perturbacin dentro un rango
de entre 0 y 18,4 [mM], y 0 y 20 [mM] para la concentracin de glucosa y lactato en el estado
estacionario, respectivamente. La obtencin de las trayectorias asociadas a cada perturbacin fue
por medio de la simulacin del sistema completo en bajo un rgimen continuo durante 1.000 horas.
31
El resultado de la construccin del diagrama de fases se presenta en la Figura 3.10, se puede

observar que para las condiciones probadas solo existe un punto atractor estable que corresponde
al estado estacionario del modelo inicial.
20
18
16
Conc. Lactato [mM]
14
12
10
8
6
4
2
0
0
8
10
12
Conc. Glucosa [mM]
14
16
18
20
Figura 3.10: Diagrama de fases para el estado estacionario del modelo metablico inicial. El punto
rojo corresponde al estado estacionario del sistema PSS y los puntos azules a los puntos iniciales Pi
(perturbaciones al estado estacionario).
3.8.
Discusin de resultados de la simulacin del modelo ajustado
En primer lugar se puede notar, de los resultados de la simulacin del modelo ajustado, que
el sistema tiene una respuesta metablica cualitativamente similar al obtenido experimentalmente.
Esto respalda la metodologa utilizada para obtener los parmetros de ajuste y es secundado por
el anlisis de significancia realizado por medio de prueba t de Student. Se observ que, salvo por
tres casos puntuales, el ajuste se defini significante con una probabilidad mayor a 95 %, llegando
32
en casos a ser superior al 99,99 %. De esta manera la utilizacin de los ponderadores PGLC , PLAC ,
PLAC1 , Pk y Pk2 se justifica debido a que tiene una alta probabilidad que la reduccin del que
genera el uso de dichos ponderadores no ocurre por otro factor que no sea el ajuste de parmetros
que se genera.
A su vez, se observa tambin que el ponderador PGLC es el factor de ajuste que genera mayor reduccin del entre los ponderadores utilizados reducindose el de 4, 224 1, 916, 9, 078 2, 221
y 139, 626 93, 632 a 3, 807 2, 034, 8, 769 2, 279 y 44, 395 21, 009 de las curvas simuladas
de glucosa, lactato y concentracin celular, respectivamente. Sin embargo la comparacin de los
y sus intervalos de confianza identifican al ajuste de parmetros del modelo de crecimiento celular como lo ms incidente en el ajuste final del modelo metablico, logrndose valores de de
0, 354 0, 075, 0, 66 0, 152 y 0, 085 0, 057 de las curvas simuladas de glucosa, lactato y concentracin celular, respectivamente. As, se puede considerar que los ajustes que se llevaron a cabo son
requeridos para lograr que el modelo metablico utilizado simule mejor las curvas de concentracin
experimentales.
A pesar de lo anterior se constat que el ajuste realizado no es capaz de captar con precisin la
respuesta dinmica en las ltimas horas de cultivo observada a nivel experimental, correspondiente
a la fase estacionaria. A nivel experimental se observ una reduccin de la tasa de produccin de
lactato corroborado con una baja de la razn L/G hasta aproximadamente 1,5 [mM] (ver Figura
3.4), que no se considera producto del fenmeno de variacin de estado metablico por los rangos
de variacin en las que se encuentra pero si puede considerarse una variacin que no es capaz de
captar el modelo metablico debido a que este ltimo simula nicamente la regulacin metablica
que se puede llevar a cabo en un cultivo que, de acuerdo a la literatura, no es la nica que existe
[15].
La falta de capacidad del modelo ajustado de captar la dinmica de un cultivo celular animal
con una leve variabilidad de la tasa produccin de lactato y un mayor consumo glucosa es lo que
ha generado el error de ajuste observado. An as, se considera que el modelo metablico ajustado
es una aproximacin matemtica suficiente para retratar la respuesta metablica de un cultivo que
no posee variacin de su estado metablico. Por otra parte, la inclusin de un modelo adicional de
regulacin de consumo de glucosa para la formacin de biomasa se considera tambin innecesario
debido a que genera una complejizacin excesiva del modelo actual.
Los resultados obtenidos en el marco de la simulacin del modelo metablico permiten concluir
33
que el modelo es capaz de adoptar la respuesta metablica de un cultivo clulas animales que no
presentan variacin en su estado metablico. Sin embargo, el modelo metablico inicial no tiene la
misma respuesta metablica que un cultivo animal en un estado metablico alterado, la principal
diferencia yace en el exceso de produccin de lactato por parte del cultivo simulado. Se puede
notar tambin que el estado estacionario alcanzado tanto para las condiciones de cultivo de control,
como alterado, es el mismo lo que respalda que el modelo metablico tiene un nico punto atractor
estable.
Finalmente, la existencia de un nico atractor estable genera la posibilidad de que el fenmeno
de la alteracin de respuesta metablica no ocurre solamente a nivel metablico y que podra existir
un sistema de regulacin interno en otro nivel fuera de lo metablico. La literatura respalda que
el fenmeno de variacin del estado metablico ocurre tambin a nivel de niveles de expresin
gnicos, lo que sustentara la inclusin de un modelo de regulacin gnica dentro del modelo inicial
para poder obtener la respuesta metablica de un cultivo celular animal que presenta una variacin
en su estado metablico [15].
34
Captulo 4
Simplificacin del modelo metablico
4.1.
Motivacin
Para ahorrar recursos computacionales asociados a la implementacin y corroboracin de un

modelo de regulacin continuo se opt por simplificar el modelo metablico obtenido en el Captulo
3. La base para dicha simplificacin fue una simplificacin del mismo modelo inicial ajustado con
datos experimentales de consumo de glucosa y galactosa de cultivos de clulas CHO [35].
4.2.
Descripcin del modelo
4.2.1.
Vas metablicas
El modelo simplificado inicial posee las vas metablicas presentadas en la Figura 4.1, en donde las cinticas de las reacciones corresponden a cinticas enzimticas de la forma de MichaelisMenten. Como base se utiliz un modelo de metabolismo de clulas CHO simplificado de la literatura [35]. Las reacciones asociadas al consumo de galactosa fueron suprimidas del modelo original
por la relevancia otorgada al consumo de glucosa en el fenmeno de la variacin del estado metablico, debidamente justificada en la seccin 2.2 y la cintica para el ciclo TCA fue reemplazada
por la reaccin rTCT del modelo completo (ver Apndice B).
35
D-glucosa
Glc Tr
D-glucosa
HK
Glucosa-6-fosfato
PFK
Lactato
MCT
LDH
Lactato
AlaAT
Piruvato
Ala Tr
Alanina
Alanina
TCT
Ciclo TCA
Figura 4.1: Modelo metablico simplificado.
4.2.2.
Cinticas enzimticas
Las cinticas que definen las diferentes vas metablicas del modelo simplificado inicial se
presentan a continuacin:
Gliclisis
Transporte de glucosa [36]
f
rGlcTr =
e
r
c
kGlcTrCGLC
kGlcTr
CGLC
Ce
(4.1)
Cc
GLC
GLC
1 + K GlcTr
+ K GlcTr
GLC
GLC
kGlcTr = 77, 47[hr1 ]

r
kGlcTr
= 7, 75 101 [hr1 ]
GlcTr
KGLC
= 1, 5[mM]
Hexoquinasa [27]
f
c
c
vmax,HK CMgAT
PCGLC
rHK =
Cc
GLC
1 + K HK
+
i,GLC
HK K HK
Ki,GLC
MgAT P
c
c
CMgAT P
CG6P
HK
HK
Ki,MgAT P
Ki,G6P
36
c
c
vrmax,HK CMgADP
CG6P
HK K HK
KG6P
MgADP
c
c
CMgAT PCGLC
HK K HK
Ki,GLC
MgAT P
Cc
Cc
MgAT P G6P
+ K HK
K HK
i,G6P i,MgAT P
(4.2)
vmax,HK = 72 105 [hr1 ]

vrmax,HK = 60[hr1 ]
HK
2
KMgAT
P = 6, 3 10 [mM]
HK
2
Ki,MgAT
P = 6, 3 10 [mM]
HK
KMgADP
= 2, 3 101 [mM]
HK
Ki,MgADP
= 2, 3 101 [mM]
HK
= 4 102 [mM]
KG6P
HK
Ki,G6P
= 6, 7[mM]
HK
KGLC
= 0, 1[mM]
HK
Ki,GLC
= 0, 1[mM]
Fosfofructoquinasa [37]
rPFK = (
c Cc
CAT
f
P F6P
kPFK K PFK
K PFK
AT P
F6P
Cc
c
PY R
CADP
r
2
kPFK
K PFK K PFK
FBP
ADP
1 + L( )3
0
1 + L( )4
(4.3)
Cc
c
c
c
PY R
CF6P
Cc P
CADP
CADP
2
)(1 + AT
)
+
+
(1
+
)
= (1 + PFK
PFK
PFK
PFK
PFK
KF6P
KAT
KADP
KFBP
KADP
P
(4.4)
Cc
c
c
c
PY R
Cc
CAT
CADP
CADP
P
2
= (1 + 0F6P
)(1
+
)
+
+
(1
+
0 PFK
0 PFK
0 PFK
0 PFK )
PFK
KF6P
KAT
K
K
K
FBP
P
ADP
ADP
0
PFK K PFK
KF6P
AT P
0 PFK 0 PFK
KF6P KAT P
Cc
L = L0 (
(4.6)
c
CAMP
AT P
1 + K PFK
1 + e K PFK
i,AT P
c
CAT
P
1 + d K PFK
i,AT P
37
(4.5)
AMP
1+
c
CAMP
PFK
KAMP
)4
(4.7)
r
kPFK
PFK K PFK
k
KADP
FBP
= PFKPFK
PFK
KAT P KF6P
(4.8)
kPFK = 6, 75 104 [mM]

PFK
2
KAT
P = 8 10 [mM]
PFK
= 1, 8 101 [mM]
KF6P
0
PFK
KAT
= 2, 5 101 [mM]
P
0
PFK
= 20[mM]
KF6P
PFK
KFBP
= 4, 02[mM]
PFK
KADP
= 2, 71[mM]
PFK
1
Ki,AT
P = 8, 7 10 [mM]
PFK
KAMP
= 6 102 [mM]
d = 0, 01[]
e = 0, 01[]
L0 = 13[]
Transportador de tricarboxilato [38, 108110]
rTCT = kTCT
c
CPY
R
TCT +Cc
KPY
R
PY R
kTCT = 19, 62 101 [mM/hr]

TCT
2
KPY
R = 2, 00 10 [mM]
Metabolismo de lactato
38
(4.9)
Transportador de monocarboxilato [38]
rMCT =
Ce
Cc
r
LAC
LAC
kMCT
kMCT K MCT
K MCT
r
1+
c
CLAC
MCT
Kf
e
CLAC
MCT
Kr
(4.10)
kMCT = 3, 66 102 [mM hr1 ]

r
kMCT
= 710, 03[hr1 ]
K MCT
= 5 102 [mM]
f
KrMCT = 1, 9386[mM hr1 ]
Lactato deshidrogenasa [37]
f
rHK =
Cc
PY R
1 + K LDH
PY R
c
c
c
c
vmax,LDH CNADH
CPY
CLAC
vrmax,LDH CNAD
R
LDH
LDH
LDH
LDH
KPY R KNADH
KLAC KNAD
c
c
c Cc
c
c Cc
C
CNADH
CPY
CNAD
CLAC
LAC
NAD
+ K LDH + K LDHR KNADH
LDH + K LDH + K LDH + K LDH K LDH
PY R NADH
NADH
LAC
NAD
LAC NAD
(4.11)
vrmax,LDH
LDH K LDH
vmax,LDH KLAC
NAD
LDH K LDH K LDH
KPY
R NADH eq
(4.12)
vmax,LDH = 5, 1036 108 [mM hr1 ]

LDH
KPY
R = 0, 6[mM]
LDH
KNADH
= 8 103 [mM]
LDH
KLAC
= 17[mM]
LDH
= 2, 53 101 [mM]
KNAD
LDH
= 2[]
Keq
Al comparar el modelo simplificado con el modelo metablico completo se observan las siguientes diferencias:
Las vas metablicas de la gliclisis han sido acopladas en las reacciones asociadas a la PK
y de la PFK.
39
Se ha eliminado por completo la va de la pentosa fosfato. El modelo inicial descrito en [35]

no incluye la va de la pentosa fosfato y se opt por omitir dicha va metablica porque
la literatura indica que el fenmeno de regulacin gnica afecta principalmente los flujos
metablicos que llegan al punto de interseccin generado por el consumo de piruvato hacia
la mitocondria y para la produccin de lactato [13].
El modelo inicial tampoco incluye una descripcin detallada de la sntesis de aminocidos ni
del ciclo TCA. Estos procesos metablicos han sido abordados por medio de un tapn que
busca simular un consumo sin una descripcin detallada del mismo.
Se escogi dicho modelo simplificado porque describe las vas metablicas relevantes para el
fenmeno de la variacin del estado metablico que son aquellas vas cuyo punto en comn es el
piruvato. La relevancia del piruvato yace en que se puede transportar hacia el espacio mitocondrial
o se puede utilizar para generar dos productos lactato o alanina, cuya distribucin define el estado
metablico del cultivo. La produccin de lactato, producto inhibitorio de crecimiento celular, y
alanina, aminocido generado con la presencia excesiva de piruvato, son fenmenos bioqumicos
propios de un estado metablico de control [13].
4.3.
Ajuste de parmetros
Al igual que para el modelo completo, se realiz un trabajo de ajuste del modelo a curvas
experimentales de glucosa, lactato y de crecimiento celular para un cultivo de control.
4.3.1.
Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados
A diferencia del ajuste realizado para el modelo metablico completo, en el modelo simplificado, nicamente se tuvo como resultado de ajuste la necesidad de ponderar la expresin r perm por
I del ajuste realizado para el
un ponderador PGlc = 0, 485. Se mantuvieron los valores de max y Klac
modelo completo. Las curvas resultantes de la simulacin del cultivo de control y alterado con los
parmetros ajustados se encuentran en las Figuras 4.2 y 4.3, respectivamente.
40
15
1.5
20
10
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
0.5
0
0
250
50
100
150
Tempo [hr]
200
250
Figura 4.2: Simulacin del cultivo de control con el modelo simplificado ajustado. : Conc. simulada
12
10
5
de lactato, : Conc. simulada de glucosa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental de lactato, :
Conc. experimental de glucosa, : Conc. celular experimental. El cultivo consiste en un modo de operacin
batch hasta las 45 [hr] y una operacin continua desde las 45 [hr] hasta el final.
8
6
4
2
4
3
2
1
0
0
100
200
Tiempo [hr]
0
0
300
100
200
Tempo [hr]
300
Figura 4.3: Simulacin de cultivo alterado con el modelo simplificado ajustado. : Conc. simulada
de lactato, : Conc. simulada de glucosa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental de lactato, :
Conc. experimental de glucosa, : Conc. celular experimental.
41
4.3.2.
Anlisis estadstico de parmetros ajustados
Al igual que para el modelo metablico completo se realiz un anlisis estadstico por medio de
la prueba t de Student a fin de saber la significancia de los parmetros de ajuste utilizados. Como
ya fue adelantado, el resultado del ajuste del modelo di como resultado un nico factor de ajuste
PGlc = 0, 485. A priori, la necesidad de un nico ajuste de la magnitud mencionada deja en claro que
el modelo sin ajuste posee un comportamiento bastante cercano a lo visto experimentalmente para
el cultivo de control. Resultados de la simulacin del cultivo de control sin el ajuste de parmetros,
i.e. PGlc = 1, se encuentran retratadas en la Figura 4.4. Sin embargo, cabe destacar que el modelo a
ajustar incluye las modificaciones descritas en la seccin 4.2.1.
Los p-values y la significancia del parmetro de ajuste PGlc se encuentran en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1: p-values y significancia al 95 % de parmetros ajustados.
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
Parmetro
p-value Significante p-value Significante p-value Significante
PGlc
0,1298
NO
0,1160
NO
0,0069
SI
El parmetro de ajuste PGlc no es significante en el caso de la raz del error cuadrtico medio
de las curvas de concentracin de lactato y glucosa, pero si en el caso de la curva de concentracin
celular. Sin embargo, cabe sealar que probabilidad de que el ajuste no sea por la variacin de
PGlc , para ambas curvas donde no existe significancia, es sobre el 85 % lo que no permite descartar
completamente el ajuste realizado. Por otra parte, la comparacin de la curva de concentracin
celular de la Figura 4.4 con la de la Figura 4.2 aclara la alta probabilidad predicha (1 - p-value) de
que la variacin del del ajuste sea producto del ajuste del ponderador PGlc (sobre 99 %).
42
30
1.8
1.6
25
20
15
10
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
5
0.2
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
0
0
250
50
100
150
Tempo [hr]
200
250
Figura 4.4: Simulacin de cultivo de control con el modelo simplificado sin ajustes. : Conc. simu-
lada de lactato, : Conc. simulada de glucosa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental de lactato,
: Conc. experimental de glucosa, : Conc. celular experimental.
La simulacin de los datos experimentales nuevamente presenta un error de ajuste en el mismo

tramo en el cual se observ para la simulacin utilizando el modelo inicial. Este error de ajuste,
tal como se plante en el captulo anterior no resta capacidad de captar la respuesta de un cultivo
celular sin variacin alguna en su estado metablico pero si muestra una prdida de generalidad al
suponer que los cultivos de control no poseen variacin de su razn L/G.
El residual del ajuste, , de las curvas simuladas con el modelo simplificado sin ajuste de parmetros se muestra en la Tabla 4.2.
Tabla 4.2: de las curvas simuladas con el modelo sin ajuste, de la Figura 4.4, con sus respectivos
intervalos de confianza calculados para un 95 % de probabilidad.
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
2, 717 0, 638 3, 593 1, 003 0, 883 0, 208
Finalmente, el de las curvas simuladas con el modelo simplificado con el ajuste nico del parmetro PGlc se muestra en la Tabla 4.3 y los valores de para el modelo simplificado completamente
ajustado se encuentran en la Tabla 4.4.
Al igual que para el modelo inicial el modelo simplificado presenta una reduccin de los valores absolutos promedios de al comparar el modelo sin ajustes con el ajustado. Tambin para este
43
Tabla 4.3: de las curvas simuladas con el parmetro PGlc ajustado con su intervalos de confianza
calculado para un 95 % de probabilidad.
Parmetro
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
PGlc
3, 765 0, 736 5, 619 1, 466 0, 811 0, 195
Tabla 4.4: de las curvas simuladas con el modelo ajustado con sus respectivos intervalos de
confianza calculados para un 95 % de probabilidad.
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
0, 576 0, 218 0, 62 0, 62 0, 156 0, 131
ajuste de parmetros se observa que hay una mayor disminucin de los valores absolutos promedios
de una vez ajustado el modelo de crecimiento celular, lo que nuevamente otorga suma incidencia
a dicho modelo. Sin embargo, se observan que los valores de para el modelo simplificado son
un 51,3 % y un 61,9 % ms bajos para las curvas de concentracin de glucosa, lactato, respectivamente, y un 94,1 % mayor para la curva de concentracin celular en comparacin al modelo inicial
sin ajustes por lo que el modelo simplificado sin ajustes logra representar mejor las curvas de concentracin que su smil anterior lo que puede deberse al hecho de que el modelo simplificado fue
utilizado para simular curvas cultivos batch de clulas CHO [35], es decir, se simul su dinmica
considerando un sistema cultivo-bioreactor, al contrario del modelo inicial en donde el objetivo fue
estudiar la dinmica intracelular de los metabolitos [21].
4.4.
Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema
La falta de capacidad del modelo simplificado de obtener la respuesta metablica de un cultivo

alterado con un nico juego de parmetros y la similitud del estado estacionario alcanzado para el
cultivo de control y el alterado motiv a un anlisis de estabilidad del estado estacionario obtenido
por el modelo simplificado para el cultivo de control.
Se realiz el mismo anlisis de la seccin 3.7, en donde el vector de valores propios del estado
estacionario es semi-definida negativa con un nico valor propio con parte real igual a 0. El restante
de los valores propios poseen partes reales que van desde 0, 021 hasta 2, 333 1010 .
Debido a que el vector de valores propios define al sistema como neutralmente estable, se construy un diagrama de fases que se dispone en la Figura 4.5, se puede observar que existe tambin
un nico punto atractor estable que corresponde al estado estacionario del modelo simplificado.
44
25
Lactato [mM]
20
15
10
0
0
10
12
Glucosa [mM]
14
16
18
20
Figura 4.5: Diagrama de fases para el estado estacionario del modelo metablico simplificado.
El punto rojo corresponde al estado estacionario del sistema PSS y los puntos azules a los puntos
iniciales Pi (perturbaciones al estado estacionario).
4.5.
Discusin de resultados de simplificacin de modelo
La simplificacin del modelo se llev a cabo para reducir el nmero de variables a manipular y
para ahorrar recursos computacionales, logrndose reducir los tiempos de simulacin del modelo
inicial a un 17 % usando su simplificacin. Si bien con la simplificacin se pierde la posibilidad de
observar en detalle lo que ocurre a nivel intracelular, los resultados avalan que el modelo simplificado es capaz de representar la respuesta metablica del cultivo de control.
De esta manera, los resultados obtenidos para el modelo simplificado pueden considerarse satisfactorios pues adems de ser comparables con los datos experimentales, coinciden con aquellos
obtenidos para el modelo metablico inicial. Sin embargo, al igual que los resultados obtenidos
para el modelo completo, es muy probable el requerimiento de un modelo adicional de regulacin
45
es necesario para capturar la respuesta metablica alterada.
46
Captulo 5
Modelo de regulacin
5.1.
Motivacin
Tal como se indic en la descripcin general de lo que son los modelos metablicos, la catlisis enzimtica es la que define las reacciones que componen las diferentes vas metablicas. Son
las enzimas (E) las que participan con un sustrato (S) para generar un producto metablico (P).
Ahora bien, dicho fenmeno enzimtico puede ser definida matemticamente como una ecuacin
o planteamiento que relaciona E, S y P, en donde para el caso de las ecuaciones de cintica enzimtica existen formas generales o variaciones de stas. Uno de los planteamientos enzimticos
ms utilizados es la forma de Michaelis-Menten en donde se supone una reaccin enzimtica de la
forma:
k1
*
E+S )
ES
k1
y se realiza el desarrollo de la cintica enzimtica considerando las suposiciones de MichaelisMenten (disociacin del complejo intermediario ES es la etapa controlante en la reaccin y estado
cuasi-estacionario), de manera de que la velocidad de formacin del producto P tiene la forma de
la ecuacin 5.1.
r = rmax
S
KM + S
(5.1)
donde rmax = kcat E0 , siendo E0 la concentracin total inicial activa de enzima, y kcat la constante
cataltica que corresponde a la constante de velocidad de la conversin del complejo ES al complejo
EP (k2 ). La construccin de ecuaciones de tipo Michaelis-Menten supone que la cantidad de enzima
activa se mantiene constante a lo largo del tiempo y es por ello que se utiliza la concentracin inicial
E0 .
47
En su mayora, las cinticas enzimticas utilizadas tanto en el modelo inicial como el simplificado son variaciones de la cintica de tipo Michaelis-Menten que consideran una componente rmax ,
ponderado por una funcin no lineal que depende de un sustrato S, que supone una concentracin
constante de enzimas activas. Sin embargo, estudios protemicos y de nivel de expresin de genes
de cultivos CHO, cuyo estado metablico se ha visto alterado, concluyen que existe una variacin
reversible de los niveles de expresin de ciertas enzimas glicolticas [15]. De esta manera, apoyado
en los resultados experimentales relativos a la variacin del nivel de expresin de genes de las enzimas glicolticas, se podra descartar la suposicin terica de Michaelis-Menten relacionada con
la concentracin total invariante de las enzimas activas, para ciertas cinticas.
Una variabilidad de cantidad de enzimas se traducira en que dos estados metablicos diferentes podran tener diferentes cantidades de enzimas catalizando las reacciones metablicas o que
la misma concentracin de enzimas podra tener una actividad variable en el tiempo. Lo anterior
no podra ser representado por un mismo conjunto de parmetros tal como se corrobor con los
resultados de las simulaciones utilizando el modelo inicial y simplificado, respectivamente presentados en las Figuras 3.8 y 4.2, y con los anlisis de estabilidad del estado estacionario simulado por
ambos.
Utilizando como base lo indicado antes se propuso el desarrollo de un modelo adicional de regulacin enzimtica a implementarse en el modelo inicial. El modelo de regulacin debe considerar
una variacin de la cintica enzimtica de ciertas cinticas glicolticas producto de una variacin
de concentracin de las enzimas participantes o de una variacin de actividad.
De los antecedentes experimentales fue posible suponer que un modelo de regulacin debe
partir de la base de que hay variacin en el nmero de enzimas activas en el metabolismo celular
animal y para esto se realiz un estudio de sensibilidad del modelo metablico inicial frente a la
variacin en la cintica de algunas reacciones metablicas.
5.2.
Anlisis de sensibilidad del modelo metablico inicial
La finalidad del anlisis de sensibilidad de la respuesta metablica del modelo metablico inicial fue para determinar las enzimas ms incidentes en el metabolismo trazado. Para dicho anlisis
se procedi a utilizar el modelo metablico inicial sin ajuste alguno de parmetros, pues la relevancia yace en la respuesta del modelo mismo frente a diferentes perturbaciones y no la comparacin
48
con datos experimentales. Como base para establecer el marco numrico de las perturbaciones se
utilizaron los datos de PCR en tiempo real de la literatura [15], resumidos en la Tabla 5.1. La Tabla
5.1 muestra la comparacin de un cultivo de control y un cultivo alterado, en cuanto a los niveles
de expresin de seis genes, analizados por medio de PCR en tiempo real. En la Figura 5.1 se tiene
un diagrama que muestra la ubicacin de las enzimas de la Tabla 5.1 en el contexto de las vas
metablicas. Las enzimas afectadas por la variacin de los niveles de expresin de dichos genes
se utilizaron como base para el anlisis de la sensibilidad del modelo metablico inicial frente a
perturbaciones en las cinticas de las velocidades asociadas a dichas enzimas.
Tabla 5.1: Variacin de niveles del estado metablico alterado comparado con el estado metablico
basal (sin variacin) de expresin por PCR en tiempo real [15]. X indica que hay un nivel de
expresin X veces menor en el cultivo alterado, en comparacin con el cultivo de control.
Gen
Variacin de Nivel de Expresin
Fosfofructoquinasa (PFK)
2, 0
Triosefosfato Isomerasa (TPI)
7, 3
Fosfoglicerato Mutasa (PGM)
2, 4
Enolasa 3 (EN)
2, 3
Piruvato Quinasa (PK)
2, 9
Lactato Deshidrogenasa 1 (LDH)
2, 4
49
(-7
TP
PFK (-2,0)
,3
)
CITOPLASMA
PGM (-2,4)
EN (-2,3)
PK (-2,9)
MITOCONDRIA
LDH (-2,4)
Figura 5.1: Diagrama con ubicacin de enzimas afectadas dentro de la cadena de reacciones metablicas.
Utilizando como base los niveles de variacin obtenidos por PCR en tiempo real se ponderaron
las cinticas enzimticas por un ponderador Ei [0 1], en donde i = {PFK, T PI, PGM, EN, PK, LDH}
son cada uno de las enzimas de la primera columna de la Tabla 5.1. Bajo los supuestos iniciales se
tendra una actividad mxima, constante e igual a la concentracin inicial de enzima, es decir que
Ei = 1. Es por esto que, para analizar la relevancia de cada una de las enzimas en la perturbacin del
sistema, se utiliz como base de comparacin la respuesta simulada del modelo metablico inicial
sin ajustes frente a las condiciones de glucosa retratadas en la Figura 5.2 con la ponderacin de
50
las velocidades cinticas rPFK , rT PI , rPGM , rEN , rPK y rLDH por su respectivo Ei = 1/i , donde i
corresponde a la variacin del nivel de expresin de la enzima i (segunda columna de la Tabla 5.1).
6
Ceglc(t) [mM]
5
4
3
2
1
0
0
200
400
600
800
Tiempo [hr]
1,000
1,200
1,400
Figura 5.2: Glucosa extra celular utilizada para anlisis enzimtico de sensibilidad.
Se traz como base de comparacin la respuesta simulada de concentracin de piruvato y de

lactato citoplasmtico del modelo metablico inicial frente a la concentracin de glucosa de la Figura 5.2 con la velocidad enzimtica de las seis enzimas en cuestin ponderadas simultneamente
por sus respectivos ponderadores Ei . Posterior a esto se simul la respuesta del modelo metablico
inicial bajo las mismas condiciones de glucosa con la perturbacin de todas las posibles combinaciones que se pueden obtener de las seis enzimas, a fin de abarcar todas las posibilidades de
perturbacin que pueden afectar el sistema. La utilizacin de la respuesta de concentracin de piruvato y de lactato se debe a que son los metabolitos que sufren cambios ms significativos de
concentracin en el fenmeno de la alteracin del estado metablico [13].
Se compar, por medio del error cuadrtico medio (MSE), las concentraciones de piruvato y
lactato citoplasmtico obtenidas para el caso base (todas las velocidades enzimticas ponderadas simultneamente) con las concentraciones obtenidas para cada una de las tuplas posibles de enzimas
perturbadas.
El MSE se calcul como el promedio de la suma de los residuales entre dos muestras de n datos,
como se indica en la ecuacin 5.2
ni=1 (C{PFK, T PI, PGM, EN, PK, LDH},i C j,i )2
~
~
(5.2)
MSE(C{PFK, T PI, PGM, EN, PK, LDH} (t), C j (t)) =
n
51
~ {PFK, T PI, PGM, EN, PK, LDH} (t) corresponde al vector de concentracioen donde para este caso C
~ j (t) es el vector de
nes de lactato o piruvato con las seis enzimas variadas en concentracin y C
concentraciones con variaciones a las enzimas que pertenecen a la combinacin j de enzimas.
Los resultados de los menores valores de MSE, es decir las curvas de concentracin ms semejantes a las observadas para el caso base, obtenidos con sus respectivas combinaciones enzimticas
se encuentran en las Figuras 5.3 y 5.4.
PGM/EN/LDH/PFK/PK
0.05
TPI/LDH/PFK/PK
MSE
0.03
LDH/PFK/PK
LDH/PFK
0.04
0.02
0.01
0
0
Combinaciones Enzimticas
Figura 5.3: Menores valores de MSE para las concentraciones de lactato.
0.05
0.04
TPI/LDH/PK
LDH/PK
0.02
0.01
TPI/PGM/EN/LDH/PK
TPI/LDH/PFK/PK
MSE
0.03
Combinaciones Enzimticas
Figura 5.4: Menores valores de MSE para las concentraciones de piruvato.
De las mismas Figuras 5.3 y 5.4 se puede notar que la enzima LDH se encuentra en todas las
52
combinaciones, lo que sugiere que dicha enzima es de suma relevancia en un posible modelo de
regulacin interno pues las curvas ms semejantes al caso base son las simuladas con una tupla que
incluye la variacin de rLDH . Adems destacan la incidencia de las enzimas PK y TPI.
Los resultados obtenidos son esperables pues se analizaron las concentraciones de lactato y de
piruvato, compuestos ms cercanos a las enzimas de menores valores de MSE. La presencia de
TPI dentro de los menores valores de MSE tambin es esperable por la alta variacin del nivel de
expresin gnico (ver Tabla 5.1).
5.3.
Planteamiento de modelo de regulacin gnica inicial
De la seccin anterior qued establecido que existen velocidades enzimticas ms significativas

cuando se trata de alteraciones al modelo matemtico trazado. Lo anterior, sumado a que no existe
un nico juego de parmetros que retrate ms de un estado metablico, motiva la posibilidad de
que existan diferentes juegos de parmetros que permitan que el modelo metablico inicial tenga
la respuesta metablica deseada. Con esto en mente se procedi a realizar una bsqueda manual de
juegos de parmetros que corroboran esta hiptesis.
Para corroborar lo anterior y tener una primera aproximacin del orden de magnitud de los juegos de parmetros requeridos, se realiz un ajuste manual de parmetros de un nico ponderador F
que pondera las cinticas enzimticas en donde participa la enzima LDH en el modelo simplificado,
de manera de obtener una nueva cintica rLDH

= F rLDH . Para el ajuste del ponderador F se vari
el valor de ste en tramos de 21 horas que tuvo como resultado una funcin discreta F(t). La razn
de utilizar intervalos de 21 horas para hacer una primera estimacin de parmetros se debe a que
cada 21 horas se cumple un hito operacional en el cultivo; las primeras 21 horas corresponden a la
etapa batch del cultivo y las siguientes 84 horas a la etapa fed-batch. Se mantuvo constante el factor
F posterior a las 105 horas de cultivo porque la concentracin de glucosa se mantiene relativamente
constante una vez iniciado el modo continuo de cultivo.
53
1 107
1, 5 108
1, 8 108
F(t) =
1 109
2, 5 1010
3 1011
0 t < 21
21 t < 42
42 t < 63
63 t < 84
84 t < 105
105 t
La respuesta metablica obtenida por la implementacin de la funcin F(t) se encuentra en la

Figura 5.5. La funcin F(t) entrega cinco juegos de parmetros diferentes que permiten al modelo
tener una respuesta metablica de bajo error en lo que corresponde a la curva de concentracin de
3.5
5
lactato simulada con respecto a la curva de concentracin experimental.
2.5
2
1.5
1
3
2
1
0.5
0
0
100
200
Tiempo [hr]
0
0
300
100
200
Tempo [hr]
300
Figura 5.5: Resultados de simulacin de cultivo alterado con implementacin de funcin F(t). :
Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada de glucosa, : Conc. celular simulada, : Conc. experimental
de lactato, : Conc. experimental de glucosa, : Conc. celular experimental.
Una vez obtenida la respuesta del modelo simplificado frente a la variacin de la cintica rLDH
se procedi al planteamiento de un modelo de regulacin que relacionara las variaciones de la
cintica con las condiciones de cultivo.
La simulacin de las curvas de concentracin del cultivo alterado gener errores de ajuste notorios en las curvas de concentracin extracelular de glucosa y concentracin celular. Sin embargo,
54
hay que destacar que la finalidad del ajuste manual fue tener una nocin del orden de magnitud
de los valores que debe adoptar el modelo de regulacin, as como tambin el efecto que genera
la inclusin de una variabilidad en los parmetros cinticos. An asi, en la Figura 5.5 se observa
que la curva de concentracin celular simulada pasa muy por debajo de la curva experimental en
el tramo continuo del cultivo, la respuesta simulada para dicho tramo se encuentra en un valor cercano a 3 [109 /L] y experimentalmente se tienen valores que oscilan alrededor de 5 [109 /L]. Dicha
diferencia se sustenta adems en que la curva de concentracin de glucosa residual simulada se
encuentra por sobre la curva experimental, esto es producto de una baja concentracin celular. La
concentracin de glucosa en el reactor es resultado del consumo del cultivo celular, cuya densidad
est por debajo de la cantidad de clulas observadas experimentalmente.
En vista de las observaciones anteriores se ajust nuevamente la constante de activacin de
S . Si bien para todos los cultivos celulares es justo
crecimiento por la presencia de glucosa, Kglc
suponer una misma relacin de dependencia del crecimiento celular de la concentracin de glucosa
S . La anterior variacin se debe a que,
y de lactato, puede existir una variacin del parmetro Kglc
dependiendo del estado metablico en el que se encuentran las clulas, se observa una respuesta
de crecimiento celular distinta, asociado a una constante distinta de activacin por glucosa. La
S corresponde a una constante de activacin aparente que contempla la ponderacin
constante Kglc
de actividades de los diferentes transportadores de glucosa, GLUT1, GLUT3 y GLUT5 que existen
en la clula. Al variar de estado metablico, la clula podra cambiar la forma de distribucin
de la glucosa por los diferentes transportadores de glucosa lo que se refleja como un cambio de
ponderacin del Kglc,i asociado a un canal i de glucosa [39, 40].
5.4.
Modelo de regulacin
Con los parmetros aproximados para lograr la respuesta metablica deseada se procedi a
idear un modelo que relacionara dichos parmetros con el fenmeno bioqumico de la variacin
del estado metablico. La literatura seala y recalca en que la alteracin del estado metablico
es producto de bajas concentraciones de glucosa residual y es por esto que se opt por relacionar
valores de F con la concentracin extra celular de glucosa [12, 13]. Adems, la alteracin del
estado metablico corresponde a un fenmeno reversible y los cultivos en estados metablicos
bajos presentan una respuesta instantnea frente a perturbaciones en la glucosa residual [15, 41].
55
Los elementos descritos indican que el modelo de regulacin deba ser una funcin continua que
depende, al menos, de la concentracin de glucosa extra-celular y que modifique la cintica de la
LDH, rLDH . Adems, el desglose matemtico presentado en la seccin 5.1 limita el rango de la
funcin a un valor entre 0 y 1.
5.4.1.
Funcin de Hill
La funcin de Hill es utilizada comnmente para describir el acople de un promotor SX a una

protena X y [42].
Suponiendo el acople de n molculas de SX a X, la protena X puede estar unida a n molculas
de SX , descrito por el complejo [nSX X], o sin unir, descrito por el trmino X0 . De esta manera la
concentracin total de protenas XT es:
[nSX X] + X0 = XT
(5.3)
Lo anterior bajo la suposicin de que cualquier estado intermedio de acople, es decir cuando el
nmero de molculas acopladas es inferior a n, es despreciado.
La tasa de colisiones moleculares necesarias para la formacin del complejo [nSX X] viene dada
por el producto de la concentracin de protena libre, X0 , y la concentracin de SX elevado a n:
rcolision = kON X0 SXn
(5.4)
en donde el parmetro kON corresponde a la tasa de formacin del complejo [nSX X]. El motivo
de la potencia es por la probabilidad de encontrar n copias de SX en un mismo instante. A su vez,
la tasa de disociacin del intermediario [nSX X] es:
rdisociacion = kOFF X0 [nSX X]
(5.5)
La tasa total de concentracin de [nSX X] corresponde a la diferencia entre la tasa de colisiones

y de disociaciones:
d([nSX X])
= kON X0 SXn kOFF X0 [nSX X]
dt
56
(5.6)
en donde el equilibrio alcanzado cuando
d([nSX X])
dt
= 0 es:
kOFF X0 [nSX X] = kON X0 SXn
(5.7)
Al sustituir la ecuacin 5.7 en la ecuacin 5.3 se tiene:

kOFF
[nSX X] = (XT [nSX X]) SXn
kON
(5.8)
Finalmente, se puede despejar la ecuacin de Hill:

Sn
[nSX X]
= n X n
XT
KX + SX
donde KXn =
kOFF
kON
(5.9)
es el coeficiente de activacin y n es el coeficiente de Hill, que determina la
forma de la funcin de Hill. A mayor valor de n la funcin de Hill se asemeja ms a un escaln

perfecto como se puede apreciar en la Figura 5.6.
1
0,4
0,6
0,8
n=1
n=2
n=4
n=8
n = 16
n = 100
0,8
[nSXX]/XT
0,2
0,6
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,2
0,4
0,6
0,8
Concentracin de SX
Figura 5.6: Funcin de Hill con diferentes valores de coeficiente de Hill (n) y KX = 0, 5.
5.4.2.
Ajuste de parmetros de modelo de regulacin
Posterior al ajuste manual de los parmetros del modelo de regulacin discreto se reemplaz el
perfil discreto de parmetros F por el modelo continuo que modifica la cintica rLDH para obtener
57
un modelo de Hill dado por:
0
rLDH
=
SXn
rLDH
KXn + SXn
(5.10)
La literatura seala que la tasa de produccin de lactato en clulas de rin de hamster beb
(BHK) se encuentra en su mximo y relativamente constante con concentraciones de glucosa residual sobre 1,24 [mM] [13], el cul se supuso que es aplicable para clulas CHO debido a la similitud
de las tasas de reaccin de sus cinticas enzimticas glicolticas [43]. De esta manera, para el ajuste
de parmetros del modelo de regulacin se realiz un ajuste del coeficiente de Hill, n, manteniendo
fijo el parmetro KX = 1, 24[mM]. La metodologa utilizada fue, al igual que para otros ajustes de
parmetros, un ajuste manual para obtener un valor inicial para un ajuste por minimizacin de los
residuos cuadrticos por el mtodo de Nelder-Mead.
Resultados ajuste de parmetros de modelo de regulacin
El ajuste del coeficiente de Hill (n) di como resultado un valor n = 14, 74, lo que indica la
existencia de 15 molculas de acople que participan en la expresin del gen de la LDH. Las curvas
3.5
resultantes del ajuste del coeficiente de Hill del modelo de regulacin se encuentra en la Figura 5.7.
2.5
2
1.5
1
3
2
1
0.5
0
0
100
200
Tiempo [hr]
0
0
300
100
200
Tiempo [hr]
300
Figura 5.7: Resultados de simulacin de modelo con modelo de regulacin gnica para LDH en
cultivo alterado. : Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada de glucosa, : Conc. celular simulada,
: Conc. experimental de lactato, : Conc. experimental de glucosa, : Conc. celular experimental.
58
Se observa de la Figura 5.7 que hay tramos donde la concentracin de lactato se mantiene
relativamente constante. Esto se produce en tramos donde la concentracin de glucosa es lo suficientemente baja como para que rLDH tome un valor cercano a cero.
La simplicidad del modelo de regulacin permiti obtener por medio del ajuste de pocos parmetros la respuesta metablica de un cultivo alterado debido a que consisti en el ajuste de un
nico parmetro. Es aquella simpleza la que reduce la exactitud del resultado, generando errores
de ajuste en la curva de lactato de mucho menor valor que sin el modelo de regulacin. Adems,
en conjunto con el nuevo ajuste del modelo de crecimiento celular se pudo eliminar los errores
de ajuste de las curvas de glucosa y de concentracin celular. De esta manera se puede considerar
que la respuesta metablica simulada cumple tanto cualitativamente como cuantitativamente con
lo observado experimentalmente. La mejora cuantitativa del ajuste de las curvas simuladas a los
datos experimentales se ve claramente representado en la Tabla 5.2, en donde los valores de se
redujeron a menos de un 0,1 % para el caso de la curva de lactato, y a un poco ms de un 5 % en el
caso de la concentracin celular.
Tabla 5.2: de las curvas simuladas con el modelo sin regulacin y con regulacin con sus respectivos intervalos de confianza calculados para un 95 % de probabilidad.
Modelo
Conc.Glucosa
Conc.Lactato
Conc.Celular
Sin regulacin 0, 43 0, 136
5, 947 1, 56
2, 171 0, 65
Con regulacin 0, 025 0, 029 0, 006 0, 095 0, 119 0, 17
5.5.
Validacin de modelo de regulacin gnica
5.5.1.
Comparacin con datos experimentales
El modelo de regulacin tiene las cualidades buscadas para simular la respuesta metablica
experimental de un cultivo de control y alterado de acuerdo con la literatura [25]. Sin embargo, una
nica fuente experimental para corroborar la capacidad del modelo final generaliza en exceso el
modelo sin precedentes. Por ello se simul y se compar con otra fuente de datos experimentales.
De modo de validar el modelo, fue simulada la respuesta metablica para un cultivo alterado
con las condiciones presentadas en la Tabla 5.3 (datos no publicados). El cultivo consiste de tres
etapas, al igual que el cultivo alterado utilizado para fijar los parmetros del modelo, una batch, fedbatch y continua. Para la simulacin de las curvas se modific solamente el parmetro Kglc a fin de
59
obtener una curva de concentracin celular con el menor valor de la suma de residuos cuadrticos.
De esta manera las curvas obtenidas de concentracin de lactato y de glucosa corresponden a la
respuesta metablica propia del modelo y es posible una comparacin idnea con los resultados
experimentales.
Tabla 5.3: Condiciones de cultivo utilizados experimentalmente para obtener un cultivo de clulas
MAK en un estado metablico alterado (datos no publicados). Fe corresponde al flujo de alimentacin durante el modo de operacin fed-batch, Cglc,e es la concentracin de glucosa del medio
alimentado durante el modo fed-batch, Fe,2 corresponde a dosificaciones adicionales utilizadas durante la etapa continua, y Cglc,e,2 es la dosificacin de glucosa de dichas dosificaciones adicionales.
Tiempo
Modo de
de OpemL
1
OperaFe [ mL
hr ] Cglc,e [mM] Fe,2 [ hr ] Cglc,e,2 [mM] D [ hr ]
racion
cion
[hr]
Batch
0 - 19
Fed19 - 32
0,257
64,087
Batch
Fed32 - 38
0,686
64,087
Batch
Fed38 - 55
0,206
64,087
Batch
Fed55 - 68
0,848
64,087
Batch
Fed68 - 83
0,871
64,087
Batch
Fed83 - 95
0,163
64,087
Batch
Continuo 95 - 105
2,203
5,551
0,033
Continuo 105 - 122
0,885
5,551
0,033
Continuo 122 - 133
0,03
La comparacin de los resultados simulados con los experimentales para la concentracin de
glucosa, lactato y celular se observan en las Figuras 5.8 y 5.9. La comparacin permite establecer
que la simulacin tiene una respuesta similar a la obtenida experimentalmente salvo por la curva de
concentracin celular en el tramo que se ubica entre las 95 [hr] y el final del cultivo. La existencia
de una diferencia de los resultados obtenidos por la simulacin y los experimentales se justifica
con la simpleza del modelo de crecimiento celular utilizado. El uso de un modelo de crecimiento
simplificado facilita la parametrizacin de ste pero puede provocar problemas de ajuste adicionales
producto de la exclusin de fenmenos como la muerte celular o la variacin de la constante de
activacin de crecimiento celular por glucosa, Kglc , y de la suposicin de que todas las clulas
60
de un cultivo son idnticas. Es posible reducir el error asociado a la diferencia entre la curva de
concentracin celular simulada y la experimental por medio de la variacin de la constante Kglc
pero la disminucin de la concentracin celular en el tramo de cultivo en cuestin genera una mayor
concentracin de glucosa residual, una mayor concentracin de lactato producto del aumento en la
tasa de produccin de la misma y, por lo mismo, una mayor razn L/G.
A pesar de la presencia de dicha diferencia en las curvas de concentracin celular, la curva
simulada se asemeja en el comportamiento cualitativo con la curva experimental. Adems, de que
el cultivo se encuentra dentro de los rangos experimentales cuando se trata de la razn L/G
como aparece en la Figura 5.10.
5
Batch
Continuo
Fed-Batch
Conc. Glucosa y Lactato [mM]
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo [hr]
Figura 5.8: Resultados de comparacin de curvas de glucosa y lactato simulados con modelo metablico con regulacin con cultivo celular alterado. : Conc. simulada de lactato, : Conc. simulada
de glucosa, : Conc. experimental de lactato, : Conc. experimental de glucosa.
61
Fed-Batch
Batch
Continuo
Conc. Celular [109 clulas/L]
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo [hr]
Figura 5.9: Resultados de comparacin de curva de concentracin celular simulada con cultivo
celular alterado. : Conc. celular simulada, : Conc. celular experimental.
3.5
Continuo
Fed-Batch
Batch
3
L/G [mol/mol]
2.5
1.5
0.5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo [hr]
Figura 5.10: Resultados de comparacin de curva de L/G simulada con cultivo celular alterado.
-: Conc. celular simulada, : Conc. celular experimental.

5.5.2.
Clculo de razn estequiomtrica L/G
A fin de verificar que el modelo final se encuentra dentro del marco terico establecido se calcul la razn estequiomtrica L/G para el cultivo de control y el alterado durante la simulacin
para corroborar que dicho valor no excediera el lmite terico de 2,0 al final del cultivo, cuando
se encuentra ms cerca de alcanzar el estado estacionario. Durante el estado transiente si pueden
existir valores de L/G superiores a 2,0 [mol/mol], y se han observado experimentalmente [25],
62
por tratarse de una etapa en donde el cultivo vara hasta llegar a, de tener, un estado estacionario
estable.
El valor de L/G corresponde a la razn entre la tasa especfica de produccin de lactato qlac
y la tasa especfica de consumo de glucosa qglc

. Donde las tasas especficas de glucosa y lactato se
calculan experimentalmente por medio de las ecuaciones 5.11 y 5.12, respectivamente.
qglc
=
Sglc,i Sglc,i1
2
(Xi VR,i + Xi1 VR,i1 )
ti ti1
qlac
=
Slac,i Slac,i1
2
(Xi VR,i + Xi1 VR,i1 )
ti ti1
(5.11)
(5.12)
en donde Xi corresponde a la concentracin celular, VR,i al volumen del reactor, Sglc,i al consumo
acumulado de glucosa y Slac,i a la produccin acumulada de lactato en el tiempo i.
El consumo acumulado de glucosa y la produccin acumulada de glucosa son calculados por
medio de balances de masa entre un instante pasado t 1 y el instante actual t. Las ecuaciones de
balance de masa para modo de operacin batch/fed-batch/continuo se encuentran detalladas en las
ecuaciones 5.13 y 5.14.
e,t
e
e
i1
Sglc = Cglc,e
Fe i1 (ti ti1 ) +Cglc,i1
Vi1 Cglc,i
Vi Cglci1 Fs i1 (ti ti1 ) Vi
e,t
e
e
Slac = Clac,i
Vi Clac,i1
Vi1 +Claci1 Fs i1 (ti ti1 )
(5.13)
(5.14)
Debido a que el clculo de la derivadas temporales qglc

y qlac
, por medio de una diferencia entre
dos puntos, genera un resultado de alta frecuencia de oscilacin cuando se varan las condiciones
de cultivo se opt por calcular la derivada exacta de Sglc y Slac de una funcin Spline en el tiempo t.
La derivada de la funcin Spline se calcul en lnea por medio de la funcin dNaturalSPLINE.mat
(ver Apndice D) utilizando los ltimos 10 puntos con un intervalo de separacin mnimo de 0,01
horas a fin de evitar errores numricos.
Los valores calculados para los cultivos de control y alterado simulados con las condiciones
de simulacin descritas en la seccin 3.4 se encuentran en las Figuras 5.11 y 5.12. Se corrobor,
por medio de los clculos realizados, que el modelo final con regulacin se atiene al marco terico
63
relativo a la relacin estequiomtrica existente entre la produccin de lactato y el consumo de

glucosa (L/G), para las etapas continuas en ambos cultivos.
2,5
L/G [mol/mol]
1,5
0,5
0
0
50
100
150
200
250
Tiempo [hr]
Figura 5.11: Resultados de clculo de L/G para cultivo de control simulado. Cultivo batch hasta
las 45 [hr] y cultivo continuo desde las 45 [hr] hasta el final del cultivo. : L/G simulada.
4
3,5
L/G [mol/mol]
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
Tiempo [hr]
200
250
300
Figura 5.12: Resultados de clculo de L/G para cultivo alterado simulado. Cultivo batch hasta
las 23 [hr], fed-batch de las 23 hasta las 105 [hr] y cultivo continuo desde las 105 [hr] hasta el final
del cultivo. : L/G simulada.
En la Figura 5.11 se observa que la razn L/G se mantiene en un rango cercano a 2 [mol/mol]
alcanzndose un valor de 1,97 [mol/mol] hacia el final del cultivo.
Por su parte, la Figura 5.12 muestra la dinmica del cultivo alterado en donde, entre las 21 y 105
[hr] de cultivo, hay una mayor variabilidad del valor de L/G debido a que corresponde a la etapa
64
fed-batch del cultivo en donde los cultivos son inducidos a un estado metablico bajo. Por otra parte,
los valores de L/G superan el mximo terico en el tramo fed-batch por la naturaleza discreta
del clculo de la razn L/G; la tasa de produccin de lactato se calcula en el tiempo t en base a
la diferencia de concentracin entre t y t 1 y para la tasa de consumo de glucosa se considera la
alimentacin en el tiempo t 1 por lo que si en el tiempo t se aumenta la concentracin de glucosa
de entrada este afectar en t + 1 la tasa de consumo de glucosa pero afectar en t, generndose de
manera aparente una mayor razn L/G. Lo anterior afecta los estados transientes de cultivo pero
no afecta cuando un cultivo tiene una operacin de menor variacin de la concentracin de glucosa
de entrada como son la operacin batch y continua.
El valor de la razn L/G al final del cultivo alterado corresponde a 0,019 [mol/mol] que
concuerda con los rdenes de magnitud observados experimentalmente para cultivos en estados
metablicos alterados [12, 25].
5.5.3.
Reversibilidad de estado metablico
Junto con establecerse experimentalmente que el fenmeno de alteracin del estado metablico
es un fenmeno que ocurre tanto a nivel gnico como metablico, se ha concluido que el fenmeno
no tiene carcter irreversible. La literatura seala que cultivos inducidos a un estado metablico
alterado vuelven a un estado metablico alto cuando son expuestos a condiciones de alta concentracin de glucosa [25]. Estudios de los niveles de expresin gnico sealan que, si bien existe una
variacin de los niveles de expresin de algunos genes, dicha variacin no corresponde a una mutacin y por tanto el fenmeno gnico es reversible [15]. Ademas se ha observado experimentalmente
que la razn L/G de un cultivo celular alterado tiene la dinmica presentada en la Figura 5.13
cuando es perturbado desde el estado estacionario con pulsos de hasta 2,0 [mM] de glucosa. En
la Figura 5.13 se muestra que un cultivo alterado vuelve a un estado metablico bajo luego de ser
perturbado.
65
L/G [mol/mol]
1.5
0.5
-0.5
-10
10
20
30
40
50
Tiempo [hr]
Figura 5.13: Resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado frente a pulsos de glucosa de
: 0,25 [mM], : 0,5 [mM], : 1,0 [mM] y : 2,0 [mM] [41].
En vista de los resultados experimentales de la Figura 5.13 se procedi a corroborar la capacidad

del modelo metablico con regulacin de revertir el estado alterado obtenido para las condiciones
de cultivo alterado de la seccin 3.4. Para esto se simul la respuesta metablica frente a perturbaciones de glucosa de 0,3, 0,6, 1,2, 2,3 y 8,4 [mM] desde el estado estacionario y se grafic la razn
L/G, resultados mostrados en las Figuras 5.14 y 5.15.
2.5
L/G [mol/mol]
1.5
0.5
0
0
200
400
600
Tiempo [hr]
800
1,000
1,200
Figura 5.14: Resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado simulado frente a pulsos de
glucosa de : 0,3 [mM], : 0,6 [mM], : 1,2 [mM], : 2,3 [mM] y : 8,4 [mM].
66
0.25
L/G [mol/mol]
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
200
400
600
Tiempo [hr]
800
1,000
1,200
Figura 5.15: Acercamiento de resultados de clculo de L/G de un cultivo alterado simulado

frente a pulsos de glucosa de : 0,3 [mM], : 0,6 [mM], : 1,2 [mM] y : 2,3 [mM].
La Figura 5.14 muestra que el sistema vuelve a un estado metablico alterado luego de perturbarse con pulsos de glucosa de 2,3 [mM] o menos, y que es capaz de volver a un estado metablico
alto con una perturbacin muy alta de glucosa, retratada en la Figura 5.14 con la curva de respuesta
frente a una perturbacin de glucosa de 8,391 [mM].
La generacin de un cambio de estado metablico al aplicar un pulso de 8,4 [mM] de glucosa
se debe a que genera un aumento de la glucosa al interior del reactor al nivel de que el modelo de
0
regulacin alcanza su saturacin y la velocidad de reaccin rLDH
se aproxima al valor anterior de
rLDH , es decir que
SXn
n
KX +SXn
tiende a 1.
De la Figura 5.15 se puede concluir que el sistema demora ms en volver al estado metablico
alterado a mayor pulso de glucosa, lo que se observa experimentalmente tambin y que se muestra
en la Figura 5.13. Tal como aparece en la Figura 5.13, la Figura 5.14 muestra que el valor de la
razn L/G del estado estacionario alcanzado posterior al pulso de glucosa es menor al valor
inicial y que a mayor pulso se alcanza una razn L/G menor en el estado estacionario.
5.6.
Discusin de resultados de simulacin con modelo de regulacin
Los resultados de la simulacin de las curvas de concentracin de glucosa, lactato y celular con
el modelo que incluye regulacin gnica muestra que se ha logrado obtener un modelo matemtico
67
capaz de captar la respuesta metablica de un cultivo celular sin variacin de su estado metablico
y de un cultivo celular cuyo estado metablico se ha visto alterado. Los resultados adems avalan
que el modelo metablico obtenido es capaz de captar la dinmica observada a nivel experimental
para cultivos bajo diferentes condiciones de cultivo lo que es de suma relevancia para el estudio
de la variacin del estado metablico. Estos resultados tambin respaldan la capacidad del modelo
metablico de retratar la reversibilidad del fenmeno de la variacin del estado metablico logrando
simular el paso de un cultivo celular en un estado metablico alterado a su estado metablico basal
y en los marcos de tiempo observados experimentalmente.
La obtencin de un modelo metablico representativo que contempla el fenmeno de variacin
del estado metablico puede ser utilizado para el anlisis de respuestas metablicas bajo diferentes condiciones de cultivo con lo que se podra cuantificar el efecto sobre las concentraciones de
glucosa y lactato de utilizar diferentes modos de operacin, as como estudiar los efectos sobre
la concentracin celular. Esto permite reducir significativamente los costos asociados a montajes
experimentales y a personal especializado que se requiere para llevar a cabo estudios de este tipo a
nivel de laboratorio. Adems, permite representar la respuesta del sistema para el diseo y anlisis
de diferentes controladores para regular el estado metablico, el objetivo principal de la presente
tesis.
La revisin de la literatura indica de que, en materia de modelos de regulacin gnica, existen
aprontes estandarizados para enfrentar el planteamiento de un modelo de regulacin gnica. Los
modelos comnmente usados siguen un planteamiento diferencial en donde se traza un nmero de
ecuaciones diferenciales que buscan representar la variacin de la concentracin mRNA y de protenas en el tiempo, o un planteamiento booleano en donde los efectos positivos o negativos sobre
la concentracin de protena en el tiempo son representados como una serie de funciones ON/OFF
[4447]. Sin embargo, dichos modelos requieren del conocimiento mnimo de los genes afectados
as como una descripcin detallada de los factores que inciden en su activacin o represin. Es por
esto que el apronte utilizado para el desarrollo del modelo de regulacin utilizado en esta tesis se
puede considerar emprico.
Existe evidencia experimental que soporta que la relacin entre la tasa de produccin de lactato
y la concentracin residual de glucosa es de tipo Monod [13], es por esto que la utilizacin de una
funcin de Hill para regular la produccin de lactato es un apronte que tiene precedentes.
Respecto a la corroboracin del modelo con regulacin, lo realizado se puede considerar su68
ficiente para corroborar la veracidad del modelo de regulacin pues se constat que el modelo
con regulacin es capaz de retratar resultados experimentales de una fuente ajena a la utilizada para
ajustar el modelo que comprende tambin mltiples etapas de cultivo con condiciones diferentes de
operacin. Se corrobor adems que la matriz de cinticas enzimticas se encuentra bien planteada
debido a que, alcanzado el estado estacionario, no supera 2,0 la razn L/G.
La respuesta metablica del sistema frente a diferentes pulsos de glucosa concuerda con lo observado experimentalmente y se constat que el fenmeno de alteracin del estado metablico de
un cultivo es representado debidamente con sus caractersticas ms relevantes. Qued comprobado
que la simulacin los cultivos alterados simulados poseen una baja razn L/G y que el fenmeno de alteracin su estado metablico tiene el carcter reversible que tambin se ha observado
experimentalmente.
69
Captulo 6
Control del estado metablico
6.1.
Motivacin
Cmo ya ha sido detallado en los captulos previos, la alteracin del estado metablico de un
cultivo celular animal requiere de un trabajo de laboratorio minucioso. Esto sumado a la fcil reversibilidad del fenmeno da cabida al problema tcnico de mantener un cultivo celular en un estado
metablico bajo sin la necesidad de tener personal especializado constantemente supervisando el
cultivo. Es por esto que una solucin al problema tcnico descrito pasa por el diseo de un controlador capaz de generar la estrategia de alimentacin ptima para mantener un estado metablico
bajo. De manera que el objetivo de un controlador a disear sera mantener un cultivo alterado
dentro de un rango de operacin deseado de L/G.
La gran variedad de controladores permiten escoger de un abanico de posibilidades que van
desde controladores clsicos como son los controladores P, PD, PID, la utilizacin de mtodos de
control avanzados como son los controladores ptimos, donde el objetivo del controlador es variar
las condiciones de operacin de manera de llevar un proceso a su punto de operacin ptimo, un
controlador difuso que contempla el establecimiento de reglas de control que permiten al controlador tomar una determinada accin en base a un determinado escenario de control, o mtodos de
control inteligente que utilizan como base una red neuronal artificial para construir un controlador
basado en modelo, entre otros [4850].
A priori, para el diseo de dicho controlador se deben analizar las distintas variables manipulables y su incidencia en la reversibilidad de la variacin del estado metablico. Adems se debern
considerar todos los lazos posibles de control que podran haber aparte del lazo de regulacin del
estado metablico.
70
6.2.
Antecedentes
6.2.1.
Caractersticas del sistema
Para disear correctamente un lazo de control para cualquier sistema es necesario conocer las
distintas variables que participan en l. El detalle de los diferentes tipos de variable consideradas a
nivel de laboratorio se lista ms abajo y un desglose del sistema a controlar se muestra en la Figura
6.1 [9].
Variables de entrada manipulables: En esta categoria se encuentran la tasa de dilucin, el flujo
de gases O2 , N2 y CO2 (para regular la concentracin de oxgeno disuelto), la temperatura,
concentracin de glucosa alimentada, concentracin de glutamina alimentada, concentracin
de amino cidos alimentados y el flujo de NaOH (para regular el pH cido del cultivo debido
a la produccin de cido lctico [26]).
Variables de salida: Comprende la concentracin de glucosa, lactato, concentracin de clulas, volumen, tasa de consumo de oxgeno (OUR), tasa consumo especfico de glucosa,
oxgeno disuelto (DO), pH, densidad ptica (OD), tasa de crecimiento celular (), tasa de produccin especfica de lactato y razn consumo de glucosa a produccin de lactato (L/G).
Medibles: De las anteriormente mencionadas las variables medibles on-line comprenden: concentracin de glucosa, de lactato y celular, volumen, OUR, OD, pH y DO.
No medibles o solamente calculables: Por otra parte las variables de salida que no son
medibles con sensores pero que son calculables incluyen la tasa consumo especfico
de glucosa, tasa de crecimiento celular (), tasa de produccin especfica de lactato y
razn consumo de glucosa a produccin de lactato (L/G). Tambin se considera una
perturbacin medible un error en la concentracin de glucosa de entrada requerida.
Perturbaciones:
Medibles: Las perturbaciones medibles que podran existir son las asociadas a los errores propios de los equipos utilizados. Por ejemplo, las bombas peristlticas utilizadas
pueden tener un error de hasta un 5 % y que puede ser medido por flujmetros [25].
No medibles: Las perturbaciones no medibles existentes se asocian principalmente con
el crecimiento celular. No son medibles y se deben principalmente a que los cultivos
71
celulares son muy sensibles a las condiciones de cultivo a la cual son expuestas las
clulas, generndose variaciones en el coeficiente de crecimiento producto de variaciones de pH, de concentracin de sustrato, de concentracin de metabolitos inhibidores
de crecimiento, etc.
Perturbaciones
Medibles
Entradas
Manipulables
No Medibles
Proceso
Salidas
Medibles
Salidas
No Medibles
Figura 6.1: Representacin grfica del proceso y las diferentes variables que lo afectan.
6.2.2.
Objetivo de control
La finalidad del controlador a disear es producir la estrategia ptima de alimentacin de glucosa para mantener el cultivo celular en un estado metablico alterado (L/G inferior a 0,1). De
esta manera se tiene el estado metablico del cultivo como variable de salida, y la variable manipulada por el controlador es la concentracin de glucosa de entrada. Un montaje experimental
comnmente utilizado para alterar el estado metablico de un cultivo celular animal se presenta en
la Figura 6.2 y el lazo de control a disear y simular se incluye en la Figura 6.3.
La seleccin de la concentracin de glucosa de entrada por sobre otras variables manipulables,
principalmente la tasa de dilucin (D, manipulado por medio de la variacin del flujo de entrada y de salida) es que, experimentalmente, en un cultivo continuo el coeficiente de dilucin es
manipulado en funcin de la tasa de crecimiento celular, , de manera que D = para evitar un
lavado/acumulacin innecesaria del cultivo, es decir, que la concentracin celular baje/suba debido
a que el flujo de salida es mayor/menor que . La tasa de dilucin adems cumple con la restriccin
de ser menor que un valor crtico Dc que corresponde al valor mximo que puede adoptar la tasa de
crecimiento del cultivo celular, con esto se asegura evitar un lavado completo del cultivo. En vista
de lo anterior se tiene que el sistema descrito corresponde a un planteamiento con ms de un lazo
72
de control simultneo, transformndolo de un sistema simulado de un nico lazo simulado (SISO)

a un sistema de mltiples lazos (MIMO).
Figura 6.2: Montaje experimental con los lazos comunes de control utilizados [9]. Lnea punteada
representa lazo de control asociado a variable de entrada y que acta sobre variable manipulable.
Lnea continua representa flujo de entrada de variable manipulable.
73
Figura 6.3: Montaje a simular con el lazo de control a disear. Lnea punteada representa lazo
de control asociado a variable de entrada y que acta sobre variable manipulable. Lnea continua
representa flujo de entrada de variable manipulable. La tasa de dilucin se fija a travs del volumen
y los flujos volumtricos de entrada y salida del reactor y se fija en base a la tasa de crecimiento
celular. El lazo de control de la concentracin de glucosa de entrada en base a la variable L/G
es el lazo a disear.
6.2.3.
Anlisis de respuesta de lazo abierto
Previo a la eleccin y diseo del controlador se analiz la respuesta del sistema de lazo abierto
frente a diferentes perturbaciones. Se opt por analizar el problema de regulacin y no el problema
servo pues el objetivo del controlador es mantener el cultivo alterado en un estado metablico bajo
frente a posibles perturbaciones, no modificar el set-point relacionado con el estado metablico
L/G, es por esto que se analiz nicamente la respuesta de lazo abierto frente a las posibles
perturbaciones que podran existir y no slo la respuesta frente a variaciones en la variable manipulable.
De los lazos existentes presentados en la Figura 6.2, el nico considerado para la simulacin
de la respuesta es el lazo de control de la tasa de crecimiento celular en funcin del coeficiente
de dilucin. Esto debido a que el modelo planteado considera solamente el flujo de productos y
reactivos metablicos y supone el control ideal del restante de las variables (pH, temperatura y
concentracin de oxgeno) de manera que se mantienen constantes e inafectadas por la variacin
de estado metablico.
74
Las perturbaciones aplicadas para el anlisis fueron escalones y anti-escalones de un 10 % del

estado estacionario de la concentracin de glucosa de entrada, el coeficiente de dilucin, la constanS y el coeficiente mximo de crecimiento celular,
te de activacin de crecimiento celular Kglc
max .
La concentracin de glucosa y el coeficiente de dilucin fueron elegidos como perturbaciones relevantes pues se relacionan con errores comunes observados en los equipos de dosificacin y en las
S y
bombas utilizadas para alimentar el reactor. Por otra parte, los parmetros de simulacin Kglc
max
se escogieron por tratarse de parmetros que modifican la dinmica del crecimiento celular y que se
ha observado experimentalmente que pueden variar a lo largo de un cultivo [41]. Adems, tal como
S corresponde a un valor ponderado de la actividad de los
se seal anteriormente, el parmetro Kglc
transportadores de glucosa y por lo mismo puede sufrir variaciones dependiendo de las condiciones
de cultivo. Por otra parte, max se ha utilizado como un parmetro que busca englobar tanto la tasa
de crecimiento como la tasa de mortalidad del cultivo, que tambin es sensible a las condiciones
de cultivo. De manera grfica, las perturbaciones consideradas para el anlisis de respuesta de lazo
abierto y la variable medible se presentan en la Figura 6.4.
Perturbaciones
No Medibles,
Calculables
s
Medibles
D
Entradas
Manipulables
Ce,glc
,K glc
Proceso
Salidas
L/G
Figura 6.4: Origen de perturbaciones a analizar.
Para el anlisis de la respuesta frente a dichas perturbaciones se utiliz como punto de partida
el estado estacionario alcanzado por el cultivo alterado simulado en base a las condiciones indicadas en la seccin 3.4, cuyo valor estacionario de L/G es 0,014 [mol/mol]. Si bien el valor
estacionario de L/G de 0,014 [mol/mol] es obtenible de manera terica no es representativo de
lo logrado a nivel prctico principalmente porque para alcanzar el estado estacionario se requieren,
tericamente, de ms de 500 horas de cultivo. Sin embargo, para los efectos de anlisis y simulacin
se puede considerar correcto.
75
Escaln de la concentracin de glucosa de entrada

En las Figuras 6.5 y 6.6 se presentan las respuestas del sistema frente a un escaln y un antiescaln en la concentracin de glucosa que entra al reactor. Un aumento de la concentracin en
cuestin genera un aumento en la razn L/G, esto se debe a que aumenta la concentracin de
glucosa al interior del reactor lo que afecta directamente la funcin de regulacin del cultivo (ver
ecuacin 5.10) y retrata la sensibilidad del metabolismo y su cadena reactiva frente a una variacin
en la condicin de cultivo ms relevante para el estado metablico, la concentracin residual de
glucosa. Frente a incrementos en la concentracin de sustrato, los cultivos animales tienden a una
mayor tasa de produccin de lactato lo que genera una inevitable alza en la razn L/G [13].
La reduccin de la razn L/G cuando enfrentado a una baja en la concentracin de glucosa
alimentada se debe a que disminuye la concentracin de glucosa al interior del reactor y el cultivo
celular alcanza un nuevo estado estacionario con una concentracin menor de clulas. La baja de
concentracin celular se debe a que la tasa de crecimiento celular () disminuye producto de una
menor disponibilidad de sustrato (menor concentracin de glucosa residual) y se genera un lavado
de clulas del cultivo.
6
0.06
L/G
Set Point
Ce,glc
5.5
0.05
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Ce,glc [mM]
0.04
0.03
0.02
0.01
5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
2
50
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.5: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la concentracin
de glucosa de entrada. --: set point 5 % de set point.
La dinmica de las respuestas de las Figuras 6.5 y 6.6 son de primer orden, libres de respuesta
inversa y sub-amortiguadas. La corroboracin de la respuesta sub-amortiguada es por la existencia
de un overshoot (diferencia positiva entre el valor mximo alcanzado y el valor alcanzado para
76
el estado cuasi-estacionario) que es mayor para el caso del escaln. Para ambos casos el error de
ajuste existente, al final de la simulacin, de la razn L/G con respecto al set point es superior al
5 %. Tambin se puede observar que ambas respuestas no tienen tiempos muertos pues el sistema
responde inmediatamente tanto al escaln como al anti-escaln.
5.5
0.015
Ce,glc
4.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Ce,glc [mM]
2
50
0.01
0.005
0
0
L/G
Set Point
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.6: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada. --: set point 5 % de set point.
Escaln del coeficiente de dilucin
La respuesta del sistema frente a perturbaciones en el coeficiente de dilucin se encuentran
retratadas en las Figuras 6.8 y 6.9.
En comparacin con el escaln de la concentracin de glucosa de entrada se observa que el coeficiente de dilucin es ms incidente en el fenmeno de reversin del estado metablico alterado al
estado metablico basal. El estado metablico que posee el cultivo, en el nuevo estado estacionario
que se alcanza a las 300 horas, es caracterstica de un cultivo sin variacin de su estado metablico, donde la razn L/G es aproximadamente 2,0. Lo anterior es producto de una baja de la
concentracin de clulas en el reactor que genera un aumento de la concentracin de glucosa en el
reactor producto de un menor consumo de sustrato por parte del cultivo. Del balance de masa de
biomassa en el reactor (ver ecuacin 3.7), un aumento del coeficiente de dilucin sin consideracin
de la tasa de crecimiento celular genera el lavado del cultivo y las condiciones inversas genera una acumulacin de clulas que afecta directamente la densidad celular. La disminucin de la
cantidad de clulas posteriormente afecta la concentracin de glucosa al interior del reactor debido
77
al consumo de las mismas; una menor concentracin celular significa un menor consumo neto de
glucosa lo que genera un aumento en la disponibilidad de glucosa y, por la funcin de regulacin
implementada, genera un alza en la produccin de lactato y las clulas que no han sido lavadas
pasan a un estado metablico alto. La explicacin del efecto inverso (anti-escaln del coeficiente
de dilucin), es anlogo y es explicitado a travs de la Figura 6.7.
Figura 6.7: Efecto de la perturbacin por medio de un (a) escaln y (b) anti-escaln en el coeficiente
de dilucin.
Para el caso de la aplicacin de un anti-escaln se observa una disminucin fuerte de la razn
L/G y nuevamente, al hacer la comparacin de la Figura 6.9 con la Figura 6.6, se puede notar
que el efecto de un cambio en el coeficiente de dilucin sobre la razn L/G es ms relevante
para el problema de regulacin que el efecto ocasionado por una variacin de la concentracin de
glucosa alimentada porque el valor final de L/G del cultivo se aleja mucho ms del set point
llevando el cultivo a un estado metablico basal.
78
0.036
2.5
L/G
Set Point
Ce,glc
D
0.034
D [hr1]
Ce,glc [mM]
0.032
L/G [mol/mol]
1.5
0.5
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.8: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin. --: set point 5 % de set point.
0.032
0.015
0.03
0.01
0.028
0.005
Ce,glc
Ce,glc [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.026
50
0
0
L/G
Set Point
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.9: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % del coeficiente
de dilucin. --: set point 5 % de set point.
La dinmica de las respuestas de las Figuras 6.8 y 6.9, al igual que para las perturbaciones de
la concentracin de glucosa de entrada son de primer orden y no tienen respuesta inversa. El error
de ajuste de la razn L/G al final de la simulacin con respecto al set point es superior al 5 % y
es mucho mayor al observado para el escaln positivo y negativo de la concentracin de glucosa.
Ambas respuestas tampoco tienen tiempos muertos pero si presentan una dinmica muy dife79
rentes entre s. La respuesta frente a un escaln del coeficiente de dilucin presenta un overshoot
por lo que es una respuesta sub-amortiguada mientras que la ausencia de overshoot para la respuesta frente a un anti-escaln del coeficiente de dilucin es indicador de una respuesta crticamente
amortiguada o sobre-amortiguada.
Escaln de max
Junto con realizarse perturbaciones de variables manipulables del sistema se perturbaron parmetros del crecimiento celular como max para analizar la respuesta del sistema frente a variaciones
en el crecimiento celular. En la Figuras 6.10 y 6.11 se observa una respuesta opuesta al observado
para el escaln del coeficiente de dilucin. La tasa de crecimiento celular planteada (ver Ecuacin
3.6) es directamente proporcional al parmetro max y, por lo mismo, un aumento/reduccin de
max manteniendo constante el coeficiente de dilucin genera un aumento/disminucin de la concentracin celular. Las perturbaciones realizadas para el coeficiente max fueron de un 10 % de
manera de realizar una comparacin de respuesta de lazo cerrado, bajo las mismas condiciones,
con las otras variables estipuladas para el anlisis. Si bien pueden existir variaciones de la tasa de
crecimiento de un cultivo que excedan el 10 % planteado, experimentalmente no se ha observado
que dichas perturbaciones ocurran bajo condiciones continuas de cultivo ni tampoco por tiempos
prolongados [41].
Tal como se indic para el caso del coeficiente de dilucin, un aumento/reduccin de la concentracin celular genera un mayor/menor consumo de glucosa y, por tanto, una disminucin/aumento
de la produccin de lactato producto del aumento o la baja en la glucosa disponible al interior del
reactor.
80
0.082
5.5
0.08
0.078
0.015
L/G [mol/mol]
0.084
max [hr1]
Ce,glc [mM]
6.5
0.01
L/G
Set Point
0.005
4.5
4
0
Ce,glc
max
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.076
0.074
50
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.10: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la tasa de
crecimiento celular mximo max . --: set point 5 % de set point.
7
0.08
2.5
L/G
Set Point
Ce,glc
max
Ce,glc [mM]
5
0.07
L/G [mol/mol]
0.075
max [hr1]
1.5
0.5
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.065
50
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.11: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la tasa de
crecimiento celular mximo max . --: set point 5 % de set point.
S
Escaln de Kglc
Finalmente, la ltima perturbacin realizada fue a la constante de activacin de crecimiento

S , cuyos resultados se aprecian en las Figuras 6.12, a 6.14. La
celular por presencia de glucosa, Kglc
curva presentada en la Figura 6.14 corresponde a la simulacin de la respuesta de lazo abierto de

la Figura 6.12 con un tiempo de simulacin extendido, esto a fin de mostrar que dicha perturbacin
81
es capaz de llevar el cultivo a un estado metablico alto pero con una mayor demora que los casos
de un escaln de un 10 % en el coeficiente de dilucin y un anti-escaln de un 10 % en el parmetro
max .
S genera una reduccin en la tasa de
Un aumento en el valor del parmetro de crecimiento Kglc
crecimiento celular por el planteamiento de este ltimo (ver ecuacin 3.6). Se puede considerar
S no es de tan alta incidencia como el caso de las
que el efecto de la perturbacin positiva de Kglc
respuestas frente a perturbaciones de max y el coeficiente de dilucin debido al mayor tiempo

de estabilizacin en un estado metablico basal. El menor efecto se debe principalmente a que la
S no es explcita y el efecto de la perturbacin se ve amortiguado
relacin inversa entre y Kglc
por el valor de la concentracin de glucosa extra celular en el estado estacionario. De manera ms

e es de 0,225 [mM] y el valor de K S previo
clarificadora, en el estado estacionario el valor de Cglc
glc
al escaln es de 0,316 [mM] por lo que, de acuerdo a la ecuacin 3.6, la tasa de crecimiento celular
en el estado estacionario se puede escribir como ss = 0, 4155 y en el valor de en el instante
de la perturbacin es ss = 0, 3925. De acuerdo a los clculos anteriores se tiene que el escaln
S genera una reduccin efectiva de aproximadamente 5 % de lo que permite
de un 10 % de Kglc
fundamentar la gran diferencia que existe entre la respuesta frente a un anti-escaln de max y la
S .
respuesta ante un escaln de Kglc
0.36
0.09
Ce,glc
0.08
KSglc [mM]
L/G [mol/mol]
0.34
Ce,glc [mM]
KSglc [mM]
0.07
0.32
0.06
0.05
L/G
Set Point
0.04
0.03
0.02
0.01
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.3
50
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.12: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la constante de
S . --: set point 5 % de set point.
activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
82
0.32
0.015
Ce,glc
4
0
0.3
10
20
30
Tiempo [hr]
L/G [mol/mol]
KSglc [mM]
Ce,glc [mM]
KSglc [mM]
0.01
0.005
0.28
50
40
L/G
Set Point
0
0
50
100
150
200
Tiempo [hr]
250
300
Figura 6.13: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un anti-escaln de un 10 % de la consS . --: set point 5 % de set
tante de activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
point.
0.36
2.5
L/G
Set Point
Ce,glc
KSglc [mM]
Ce,glc [mM]
5
0.32
L/G [mol/mol]
0.34
KSglc [mM]
1.5
0.5
4
0
500
1000
Tiempo [hr]
1500
0.3
2000
0
0
500
1000
Tiempo [hr]
1500
2000
Figura 6.14: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % de la constante de
S . --: set point 5 % de set point.
activacin de crecimiento celular por presencia de glucosa, Kglc
Discusiones
En la Tabla 6.1 se presentan las caractersticas ms importantes de las curvas resultantes de la
aplicacin de escalones y anti-escalones, de las variables mencionadas, al sistema con sus lazos
de control sin efecto. As mismo, se incluyen nicamente las perturbaciones cuya respuesta lleva
83
a un aumento de la razn L/G pues el objetivo de control es mantener el sistema en un estado

metablico alterado (L/G < 0, 1[mol/mol]. La caracterizacin de cada curva incluye el valor
estacionario de la respuesta (B), la magnitud en que excede el mximo valor de dicho valor estacionario (A), el overshoot (O), el factor de amortiguamiento () y la razn de decaimiento (RD),
donde:
O=
O = exp( p
2
A
B
1 ()2
(6.1)
RD = O2
(6.2)
(6.3)
Tabla 6.1: Caracterizacin de curvas de respuesta con lazos del sistema abiertos.
Variable Perturbacin
A
B
O
RD
Cglc,e
10 %
0,0427 0,0152 2,809 0,312 7,892
D
10 %
0,429
1,97
0,218 0,437 0,0473
max
-10 %
0,461 1,9702 0,234 0,42 0,0548
S
Kglc
10 %
0,285 1,9686 0,145 0,524 0,021
Todas las respuestas consideradas en la Tabla 6.1 tienen un factor de amortiguamiento inferior
a 1, esto implica que las respuestas son subamortiguadas. Las respuestas sub-amortiguadas son
aquellas que tienen un tiempo de respuesta menor a las respuestas sobreamortiguadas ( > 1) o
crticamente amortiguadas ( = 1), pero una mayor oscilacin. A simple vista se corrobora dicho
resultado con la existencia de un overshoot en todas las curvas, caracterstica propia de respuestas
con inferior a 1.
El sistema es muy sensible tanto frente a un escaln positivo como negativo de la concentracin
de glucosa de entrada, con esto se puede concluir que la pendiente de la curva en el tiempo del
escaln es prcticamente vertical y por ende igual a . Adems, de la Tabla 6.1 se tiene que para
las perturbaciones de la concentracin de entrada de glucosa el factor de amortiguamiento es el ms
bajo lo que implica que posee una oscilacin ms pronunciada que se puede notar a nivel del valor
del overshoot y la razn de decaimiento.
De los resultados anteriormente retratados de la respuesta del sistema frente a perturbaciones
84
positivas y negativas de diversa ndole se tiene que las perturbaciones ms incidentes sobre el
fenmeno de la variacin del estado metablico son un escaln de un 10 % en el coeficiente de
dilucin y un anti-escaln de un 10 % en el parmetro max .
Cabe destacar que la magnitud instantnea del coeficiente de dilucin y la tasa de crecimiento
celular, en su tiempo de inicio, es igual en ambos casos pues al alcanzar el estado estacionario
el valor de se equipara con el del coeficiente de dilucin. Lo anterior permite respaldar que la
comparacin entre ambas perturbaciones determina que un escaln del coeficiente de dilucin es
la perturbacin ms significativa sobre el sistema. Si bien ambas perturbaciones logran la reversibilidad del cambio de estado metablico haciendo que el cultivo vuelva a tener una razn L/G
igual a 2, dicha reversin se lleva a cabo de manera ms rpida en el caso de la perturbacin del
coeficiente de dilucin.
Lo anterior permite establecer que frente a una perturbacin de un 10 % del coeficiente de
dilucin es que el controlador debe responder adecuadamente frente al problema de regulacin.
Con esto se establece un criterio de diseo de controlador sumamente relevante debido a que, del
anlisis de lazo abierto, la perturbacin de un 10 % del coeficiente de dilucin genera el efecto ms
incidente, una vuelta al estado metablico basal en el menor tiempo.
6.3.
Criterios de diseo de controladores
A fin de realizar una comparacin objetiva de controladores de diferente ndole fue necesario
establecer los criterios de diseo de stos. Tal como se coment anteriormente, el objetivo de control
es adoptar la estrategia de alimentacin ptima de manera de mantener un cultivo en un estado
metablico alterado. Para esto se han fijado los siguientes parmetros de diseo:
Rendimiento frente al problema de regulacin: Cada controlador diseado debe considerar el problema de regulacin por la naturaleza del objetivo de control. Se defini como
perturbacin ms relevante un escaln en el coeficiente de dilucin de un 10 % sobre el valor
del estado estacionario alcanzado para el cultivo alterado (0,031 [hr1 ]).
Definicin de estado metablico alterado: A fin de cuantificar el rendimiento de los controladores frente a la mantencin del estado metablico se defini una banda de 5 % de la
razn L/G del estado estacionario alcanzado de 0,014 [mol/mol], obtenido por medio de
simulacin del cultivo alterado descrito en la Seccin 3.4, como set point.
85
Apertura de lazos: Para el diseo del sistema de control de la alimentacin de glucosa, el

lazo de control que relaciona el coeficiente de dilucin con la tasa de crecimiento celular se
mantuvo abierto. Es decir, debido a la existencia de interacciones entre lazos de control en
sistemas que comprenden ms de un lazo se debe ajustar cada lazo de control manteniendo
los otros lazos abiertos [51].
Supuestos: A fin de poder visualizar plenamente la accin pura del controlador se ha optado
por suponer idealidad de los equipos involucrados en el lazo de control. Es decir, se ha supuesto que no existen errores asociados a la medicin de datos y que las variables calculadas
se encuentran disponibles de manera inmediata. Sin embargo, para paliar la falta de robustez
que significa la aplicacin de dicha idealidad, se tom un escaln de un 10 % en el coeficiente
de dilucin, lo cual corresponde al doble de la magnitud reportada a nivel experimental [25].
La finalidad del supuesto de una medicin sin error es para facilitar la comparacin de los
diferentes controladores a disear, liberando las respuestas de ruido producto de errores de
medicin. Por otra parte, la omisin de los tiempos muertos producto de muestreos y clculos
corresponde a una normalizacin de los tiempos de respuesta de los controladores y permite
incluir dentro del diseo los controladores continuos. Sin embargo, la sensibilidad frente a
condiciones reales de operacin, como la imposibilidad de tener un proceso de muestreo sin
tiempos muertos, deber ser analizada.
6.4.
Control clsico
Los denominados controladores clsicos incluyen controladores proporcionales (P), proporcionales derivativos (PD), proporcionales integrales (PI) y proporcionales integrales derivativos (PID),
siendo ste ltimo el de uso ms comn en la industria.
El planteamiento bsico de los controladores clsicos es el controlador proporcional que, tal
como sugiere su nombre, parte con la implementacin de un controlador cuya accin de control
busca corregir el error de desviacin del set point () por medio de la aplicacin de una accin de
control proporcional a dicho error, de la manera que se plantea en la ecuacin 6.4.
Cglc,e (t) = cP (t) +Cglc,e (t 1) = Kc (t) +Cglc,e (t 1) + cs
(6.4)
donde cP (t) corresponde a la accin de control proporcional, Kc a la ganancia de control, es la

86
diferencia entre la variable medida y su set point (ysp ym ), y cs corresponde a la accin de control
cuando es igual a 0. Para el objetivo de control planteado se espera que no se vare la concentracin
de glucosa de entrada cuando se est operando en el set point, es decir que
dCglc,e (t)
dt
= 0 cuando
= 0, y para cumplir con esta restriccin cs debe ser igual a cero.

La componente derivativa de los controladores PD y PID se presenta en la ecuacin 6.5 y busca
predecir el error futuro de la variable de salida aplicando una accin de control proporcional a la
gradiente de error en el tiempo t.
Cglc,e (t) = cD (t) +Cglc,e (t 1) = Kc D
d((t))
+Cglc,e (t 1) + cs
dt
(6.5)
Finalmente, los controladores PI y PID presentan una componente integral que tiene la forma
de la ecuacin 6.6, donde I es la tasa de reseteo del controlador, es decir, el tiempo que se demora
la componente integral en repetir la accin proporcional del controlador. La funcin de la integral
en la componente I de los controladores PI y PID busca reducir el error de ajuste al set point del
controlador pues un error persistente en el tiempo quedar incluido en dicha integral y se reflejar
en la accin de control.
Kc
Cglc,e (t) = cI (t) +Cglc,e (t 1) =
(t)dt +Cglc,e (t 1) + cs
(6.6)
As, el controlador proporcional corresponde nicamente al planteamiento de la ecuacin 6.4 y

los controladores PI, PD y PID corresponden a la suma de dos o ms de las ecuaciones 6.4, 6.6 y
6.5, respectivamente.
El ajuste de los parmetros de control Kc , D y I puede ser por medio de diversos mtodos que
pueden variar desde un mtodo simple como es el mtodo de decaimiento de un cuarto, en donde
se ajustan los parmetros fijando el valor de la razn de decaimiento para que sea igual a 1/4,
mtodos de rendimiento integral-temporal como son los criterios de minimizacin de IAE (error
integral absoluto), ISE (error integral cuadrado) y/o ITAE (error integral absoluto ponderado por
el tiempo), o un mtodo semi-emprico como es el de Cohen y Coon que consiste en aproximar la
respuesta de lazo abierto de un sistema por un sistema de primer orden con retardo [52].
87
6.4.1.
Diseo de controlador proporcional
Se descartaron los controladores que poseen componente integral (PI y PID) porque el criterio
de diseo estipulado requiere de una mantencin del estado metablico que se traduce en mantener
el valor de L/G en una banda de un 5 % alrededor del set point por lo que la precisin de
control con respecto al set point no necesita ser alto y, por lo mismo, la componente integral del
controlador es innecesario. Por otra parte, el comportamiento ruidoso que puede tener la razn
L/G en las fases de transicin permite justificar el uso de un controlador proporcional por sobre
un controlador proporcional derivativo. De esta manera, a fin de retratar el comportamiento bsico
de los denominados controladores clsicos, se opt por disear un controlador proporcional.
El mtodo utilizado para el ajuste de parmetros del controlador proporcional es la minimizacin del error integral absoluto ponderado por el tiempo. El error integral absoluto ponderador por
el tiempo o ITAE consiste en la suma continua de la desviacin de la variable de salida con respecto
al set point, ponderado por el instante temporal en que ocurren, como se aprecia en la ecuacin 6.7.
Z
ITAE =
t | (t) | dt
(6.7)
en donde la minimizacin del ITAE fue a lo largo un intervalo de 40 [hr] para asegurar el menor
tiempo de respuesta dentro de ese rango de tiempo. Debido a que el tiempo t pondera el error (t),
un intervalo muy grande prioriza los errores que ocurren hacia el final del intervalo por lo que el
tiempo de respuesta del controlador puede verse afectado.
Por otra parte, los errores integrales absoluto y cuadrado se presentan en las ecuaciones 6.8 y
6.9, respectivamente.
Z
IAE =
| (t) | dt
(6.8)
ISE =
2 (t)dt
(6.9)
Se escogi la minimizacin del ITAE por sobre la minimizacin del IAE e ISE debido a que,
para efectos prcticos, se prefiere una accin de control que asegura una vuelta rpida a la banda
de control. El criterio de minimizacin del IAE permite reducir errores pequeos (preferido para
errores inferiores a 1) y la minimizacin del ISE permite reducir grandes errores (mayores que
88
1) que podran existir. La minimizacin se llev a cabo utilizando aplicando el mtodo simplex
Nelder-Mead a un punto inicial obtenido tras un ajuste manual del controlador [32].
6.4.2.
Resultados de ajuste
Como resultado de la minimizacin del ITAE, el parmetro Kc obtenido fue 1.362, corroborado
por medio de la comparacin del valor de ITAE para valores de Kc de diferente orden de magnitud.
La simulacin de la respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de dilucin
con el lazo de control de la concentracin de glucosa cerrado se presenta en las Figuras 6.15 y 6.16.
La dinmica de la variable manipulable, Cglc,e , sigue la misma dinmica que la densidad celular de
la Figura 6.17 constatndose que se disminuye la concentracin de glucosa para alimentar la cantidad requerida por el cultivo cuya concentracin va disminuyendo a lo largo del tiempo producto
del lavado de clulas en el bioreactor. Por otra parte, el aumento del coeficiente de dilucin genera
un lavado de lactato y, para mantener la L/G la accin de control alimenta una concentracin
de glucosa levemente superior al requerido por el cultivo celular de manera que se genera una diferencia positiva entre el flujo de glucosa que entra y la que sale con lo que existe una acumulacin.
La simulacin de la respuesta del controlador proporcional fue hasta las 1.000 [hr] debido a que
la propagacin de errores numricos gener una oscilacin creciente que impidi la simulacin
en MATLAB por un intervalo ms largo. La fuente de generacin de dichos errores propagados
podra deberse a que el sistema de ecuaciones diferenciales es de tipo Stiff lo que, en conjunto
con una aproximacin asinttica de la respuesta de control al set point, establecido requiere de una
tolerancia numrica muy pequea para evitar las oscilaciones observadas.
Tabla 6.2: Valores de ITAE para diferentes valores de Kc . valor ptimo obtenido.
Kc
ITAE
1.858,1
0,07
1.625,9
0,08
1.393,6
0,05
1.362,2
0,008
929,1
0,09
696,8
0,1
El sistema con control proporcional se demora aproximadamente 5 horas (a partir de la hora 10,
cuando se perturba el sistema) en estabilizarse la razn L/G dentro de la banda de 5 % del set
point.
89
Debido a que el lazo de control que manipula el coeficiente de dilucin en funcin de la tasa de
crecimiento celular se encuentra abierto, la respuesta de la Figura 6.16 no es la misma que existe
al cerrar el lazo de control faltante (ver Figura 6.19) debido a que la interaccin entre ambos lazos
genera variaciones en la respuesta. La simulacin de la respuesta dinmica con ambos lazos de
control cerrados fue considerando un control perfecto del coeficiente de dilucin a travs de la
restriccin D = y realizando un escaln de un 10 % en el coeficiente max . Al analizar la nueva
respuesta de control observamos que existe una mayor oscilacin antes de entrar a la banda de
control y que la razn L/G se demora ms en asentarse dentro de la banda (aproximadamente
20 horas), lo que se debe a la existencia de una interaccin entre ambos lazos de control y requiere
de un segundo ajuste. La interaccin de dos lazos es un problema tpico de los problemas MIMO de
control, en donde la variacin de una variable manipulable asignada para el control de una variable
de salida afecta adems otra variable de salida, lo que puede generar oscilaciones indeseadas y
desajustes de la respuesta controlada [51].
20
Cglc,e
0.035
0.018
0.016
0.014
0.034
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
10
0.012
0.01
0.033
10
0.032
0.008
0.006
0.004
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.002
20
0
200
400
600
Tiempo [hr]
800
0.031
1000
0
0
200
400
600
Tiempo [hr]
800
1000
Figura 6.15: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la concentracin

de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control proporcional de la concentracin de
glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto.
90
5.5
Cglc,e
0.036
0.018
0.016
0.014
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4.5
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.002
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.16: Acercamiento de respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control proporcional de la concentracin
de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto. --: set point 5 % de
set point.
0.25
5.5
5
4.5
Conc. Celular [10 /L]
Conc. Glucosa Extracelular

Conc. Lactato Extracelular
0.2
0.15
0.1
0.05
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0
0
200
400
600
Tiempo [hr]
800
0.5
0
1000
200
400
600
Tiempo [hr]
800
1000
Figura 6.17: Concentraciones de glucosa y lactato extracelular y concentracin celular simulada

para la respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de
glucosa de entrada.
91
5.5
Cglc,e [mM]
0.036
0.018
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.016
D [hr ]
0.014
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4.5
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
4
0
10
20
30
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.18: Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % del parmetro max con la inclusin del lazo de control proporcional de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de
control de crecimiento celular cerrado.
Para el ajuste del controlador proporcional con ambos lazos de control cerrados se minimiz
nuevamente el valor del ITAE en un intervalo de 40 horas. El nuevo valor de Kc fue 870,4 y el resultado de la simulacin de la respuesta del sistema ante una perturbacin de un 10 % del parmetro
max , con ambos lazos de control cerrados, se muestra en la Figura 6.19.
92
0.018
5.5
Cglc,e [mM]
0.036
0.018
0.016
D [hr1]
0.014
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4.5
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.002
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.19: Respuesta optimizada del sistema obtenida por minimizacin del ITAE de la respuesta
frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del
lazo de control proporcional de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de
crecimiento celular cerrado.
Al igual que para el ajuste sin el lazo de crecimiento celular cerrado, se realiz una comparacin
simple con valores de Kc de distintos orden de magnitud de manera de descartar la posibilidad de
que el valor de Kc corresponde a un mnimo local del ITAE. La comparacin se detalla en la Tabla
6.3.
Tabla 6.3: Valores de ITAE para diferentes valores de Kc . valor ptimo obtenido.
Kc
ITAE
1.362,2 0,08
1.161,3 0,56
929,1
0,53
870,4
0,51
464,5
0,55
23,2
1,8
La nueva respuesta de lazo cerrado de la Figura 6.19 posee un tiempo de respuesta de aproximadamente 17 horas, levemente menor al simulado con Kc igual a 1.362,2 (ver Figura 6.18).
Adems de una reduccin de aproximadamente un 15 % del tiempo de respuesta, tambin se
tiene un mayor overshoot producto de la mayor amplitud de la primera oscilacin de la respuesta,
ste aumenta de aproximadamente 0,0164 a 0,017 lo que corresponde a un aumento de un 3,7 %.
93
Un aumento del overshoot tambin significa un aumento de la razn de decaimiento para el

controlador de Kc igual a 870,4.
Los valores obtenidos de ganancia Kc muestran que para la regulacin de la concentracin de
glucosa se requiere de cambios bruscos para el control del estado metablico, esto se refleja en
las altas tasas de cambio que se necesit en la concentracin de glucosa alimentada para paliar la
perturbacin. Hay que destacar que el perfil de glucosa observado en las respuestas de lazo cerrado
con y sin el lazo de control de crecimiento celular es prcticamente imposible a escala industrial
debido al rango necesario de concentraciones de glucosa y a la precisin de los mismos. Adems, un
planteamiento continuo no es factible de implementar a nivel industrial debido a que en la realidad
no es factible tener una medicin sin tiempos muertos. Lo anterior ser debidamente analizado y
discutido ms adelante.
6.5.
Control avanzado
La variedad de tipos de control avanzado ha aumentado significativamente, lo que ha generado

numerosas tcnicas de control que adoptan estrategias desmarcadas de las metodologas clsicas y
que buscan ser una solucin factible a problemas de control que poseen restricciones operacionales que pueden ser incluidos en los mtodos de ajuste clsico debido a la alta simplicidad de los
mismos. Las no linealidades inherentes de las dinmicas observadas en muchos bio-procesos ha
hecho prescindir de tcnicas de retro alimentacin lineales como los controladores proporcionales
y proporcional integral [53].
El problema de la no linealidad presente en las dinmicas de la gran mayora de los procesos
qumicos y bio-procesos ha generado el estudio de tcnicas avanzadas de control que buscan reducir los problemas tpicos que surgen al controlar dichos procesos, a travs de la construccin
de modelos simplificados del proceso que apoyen las decisiones utilizadas para realizar las acciones de control [54]. Ejemplos de modelos de procesos utilizados son ecuaciones diferenciales
ordinarias acopladas para la descripcin de un cultivo de levadura [55, 56], un modelo dinmico
paramtrico discreto para la descripcin del proceso de fermentacin para la produccin de etanol
para combustible [57], entre otros.
Una de las primeras tcnicas utilizadas para el fin de adaptar el control clsico a problemas de
mayor complejidad fue precisamente eso, generar un esquema de control adaptativo. El principio
94
bsico de disear controladores con parmetros de control que ya no eran estticos sino que se
adaptaban a las condiciones de proceso fue utilizado para sistemas de crecimiento bacteriano en
donde el coeficiente de dilucin es controlado en funcin de la cantidad de sustrato requerido en el
bio-reactor [58].
Entre las tcnicas avanzadas de control destaca tambin el control por lgica difusa que busca
traducir las acciones realizadas por operarios de proceso a un lenguaje de control a travs del uso
de reglas de control que son derivados del valor de las variables de operacin [59]. Su utilizacin
ha sido llevado a mltiples planos como son los procesos de ventilacin y enfriado por medio de
la variacin del flujo de aire dependiendo de la diferencia de temperatura existente con respecto
a un punto de operacin deseado (diferencia grande negativa, pequea negativa, nula, pequea
positiva, y grande positiva) [60], digestin anaerbica, en donde las reglas de control de pH fueron
configuradas en base al pH existente, la concentracin de metano y la tasa especfica de produccin
de gas [61], y neutralizacin que contempla la titulacin de una solucin de acetato de sodio por
medio de la regulacin de un flujo de entrada de cido clorhdrico utilizando una variable auxiliar
que divide la curva de titulacin del acetato de sodio en tres y 5 intervalos de variacin de pH
con respecto a un punto de operacin (variacin grande y negativa, variacin pequea y negativa,
variacin nula, variacin pequea y positiva, y variacin grande y positiva) [62], entre otros.
Otro tipo de controlador avanzado, que es al que se har nfasis en esta tesis es el denominado
control ptimo o control basado en modelo. El gran nmero de aplicaciones que tiene dicho controlador muestra que es un controlador verstil y de buenos resultados, en donde algunas aplicaciones
registradas incluyen lazos de control en la industria de polmeros, de refinacin y de alimentos [10].
6.5.1.
Control ptimo
La base del control ptimo es, tal como dice su nombre, la optimizacin de los valores futuros de una variable manipulable por medio de la minimizacin o la maximizacin de una funcin
objetivo. El control ptimo utiliza un modelo de proceso discreto para realizar predicciones a lo
largo de un horizonte de prediccin de largo N p en base a un nmero Nc de movimientos en la variable manipulable. Con dichas predicciones se encuentra un ptimo basado en la funcin objetivo
utilizada. Dicha optimizacin puede ser con o sin restricciones sobre los valores de las variables
manipulables, variables de salida y/o la tasa de cambio de las mismas [55, 6367].
En su forma general, dicha optimizacin comprende la minimizacin de la funcin objetivo que
95
se presenta en la ecuacin 6.10.
J=
Nc
Np
k=1
k=1
uk u0k + yk Q yk
(6.10)
donde u es un vector, de N p filas y un nmero de columnas igual al nmero total de variables

de entrada que considera el modelo, que contiene las variaciones de la variable manipulable a lo
largo del horizonte N p , y es el vector, de N p filas y un nmero de columnas igual al nmero total de
variables de salida de inters, que contiene las desviaciones de los valores predichos con respecto
al set point. y Q son vectores y corresponden a los pesos asociados a la componente de variables
manipulables y a la variable de salida, respectivamente. es equivalente al costo de generar un
cambio en el valor de la variable manipulable mientras que Q es el costo por operar en un punto
distinto al set point [56].
Visto de forma grfica, la funcin busca minimizar la suma del costo total por manipulacin de
variables de entrada y el error total entre el set point y la prediccin del modelo presentados en la
Figura 6.20.
ysp
Nc
Np
Figura 6.20: Prediccin de modelo de proceso.
La metodologa de control del lazo de control cerrado del controlador basado en un modelo de
96
proceso se muestra la Figura 6.21. En un instante k, se realiza una medicin de la variable de salida
y(k), dicha variable luego es utilizada, junto con las perturbaciones identificadas del sistema d(k) y
a las variables de entrada u(k), para alimentar de informacin el modelo de proceso del controlador
basado en modelo. El controlador basado en modelo optimiza una funcin objetivo, que puede
tener la forma de la ecuacin 6.10, para encontrar el valor u (k + 1). u (k + 1) corresponde al
primer valor del vector u utilizado por el modelo de proceso para predecir los valores y.
De esta
forma el controlador implementa el primero de Nc cambios que el modelo de proceso ha predicho
llevan el sistema a su set point de forma ptima considerando los costos de variacin de la variable
manipulable y los costos de operar fuera del set point. Finalmente, dicho valor u (k + 1) es el que
alimentar al proceso en el instante k+1.
d(k)
PROCESO
y(k)
y(k)
d(k)
MODELO
DE
PROCESO
(k+1)
u(ke)
FUNCION
OBJETIVO
J(,u)
OPTIMIZACION
u*(k+1|ke)
CONTROLADOR PREDICTIVO
Figura 6.21: Lazo de control con controlador basado en modelo.
A pesar de los numerosos parmetros requeridos (N p , Nc , y Q) para la sintonizacin del

controlador basado en modelo, el elemento ms importante del controlador es el modelo de proceso.
El modelo de proceso puede variar desde aproximaciones lineales o no lineales de la dinmica del
proceso a modelos basados en redes neuronales artificiales [6871]. La naturaleza y el grado de
representatividad que posee el modelo de proceso afecta directamente el rendimiento global del
controlador debido a que la capacidad del modelo de proceso de representar el proceso determina
la calidad de la prediccin a realizarse, lo que incide sobre el valor ptimo obtenido para la variable
manipulable. Si bien la variable de salida es medida y dicha medicin posteriormente es utilizado
97
como variable de entrada para el modelo de proceso, se podra considerar que el controlador obtiene
el valor ptimo de la variable manipulable u en paralelo con el proceso generndose un lazo de
control de aparentemente de retro alimentacin pero que en la prctica no es debido a que la variable
medida no es comparada directamente con el set point para realizar la decisin de control.
6.5.2.
Controlador basado en modelo lineal
La utilizacin de modelos lineales va de la mano con la facilidad de uso, la robustez y la estabilidad que presentan algunos modelos [72]. Sin embargo, algunos mtodos de linealizacin dan
como resultado modelos estables dentro de un rango limitado de operacin lo que implica un mal
rendimiento del controlador cuando se encuentra bajo condiciones de operacin que se encuentran
fuera de la vecindad estable del modelo [73].
La primera aproximacin lineal analizada fue la linealizacin del modelo metablico utilizando
un modelo lineal con forma de espacio estado. La obtencin de un modelo lineal con forma de
espacio de estado supone la representacin de un modelo no lineal, cuyo planteamiento general es
el de la ecuacin 6.11 y para la presente tesis es el de la ecuacin 6.12, como la forma lineal de la
ecuacin 6.13 [73].
~x = f (~x) + g(~x) ~u
(6.11)
~
dC
~ ~(C)
~ (Fe , Fs ,Cglc,e )
~ f(C)
= S rmax
dt
(6.12)
~ = A C
~ + B (Fe , Fs ,Cglc,e )
C
(6.13)
donde las matrices A y B son obtenidos por medio de la expansin de Taylor truncada para el
segundo orden en adelante del lado derecho de la ecuacin 6.11, suponiendo variables de desviacin
~ s ) y g(C
~ s ) son iguales a cero.
con lo que f (C

~
f (C)

A=
~ C~ s
C
(6.14)

~
g(C)

B=
~ C~ s
C
(6.15)
98
De esta forma, se tiene que la matriz A corresponde a una matriz cuadrada igual al jacobiano de
~ cuya estabilidad puede ser analizada por medio del anlisis de sus valores propios
la funcin f (C),
tal como se hizo en la seccin 3.7.
Se realiz un anlisis de estabilidad del modelo lineal por medio del anlisis de los valores
propios mencionado en captulos anteriores. Los resultados del anlisis de los valores propios de
la matriz A indicaron que el estado estacionario del modelo lineal obtenido no es estable debido
a que entre los valores propios de la matriz A hay un valor real positivo, lo que significa un comportamiento oscilatorio creciente de la funcin frente a cualquier perturbacin de las variables de
estado desde el estado estacionario.
Identificacin de sistemas lineales
La identificacin de sistemas consiste en la construccin de modelos dinmicos lineales y no
lineales en base a datos experimentales de las variables de entrada y salida de un sistema. Utilizando
series de muestras dinmicas se busca estimar los parmetros de modelos denominados de caja
negra, donde se desconoce completamente la relacin entre variables de entrada y de salida, y
de caja gris donde junto con relaciones dinmicas que se conocen, se buscan estimar un modelo
dinmico ajustado a las muestras experimentales [70, 7476].
Entre las formas lineales ms comunes utilizados se encuentran los modelos diferenciales lineales auto-regresivos de entrada exgena (o ARX). Su utilizacin como modelo de proceso en
controladores de modelo basado en modelo se debe a su facilidad de ajuste dado por el carcter
convexo del problema de ajuste de los parmetros [72], lo que se ve reflejado en su amplio uso en
la industria de la refinera del petrleo [10].
Poseen la forma general discreta de la ecuacin 6.16
y(t) + a1 y(t 1) + + an y(t n) = b1 u(t 1) + + bm u(t m)
(6.16)
donde y(t i), i = 0, , n corresponden a los valores de la variable de salida hasta n intervalos
en el pasado, a j , j = 1, , n corresponden a los ponderadores de cada valor pasado de la variable
de salida, u(t k), k = 1, , m son los valores pasados de las variables manipulables hasta m intervalos en el pasado y bk son sus respectivos ponderadores. Dichos ponderadores son los parmetros
a estimar por medio de ajustes a datos experimentales utilizando el mtodo de minimizacin de la
suma del error cuadrtico. Los modelos diferenciales son aplicables de forma fcil en los contro99
ladores basados en modelos pues al despejar el valor y(t) se tiene una funcin de prediccin que
puede ser utilizada como modelo de proceso.
Para la construccin del lazo de control ptimo de la Figura 6.21 se parti por la parametrizacin de un modelo lineal obtenido por identificacin de sistemas que requiri, tal como se seal
anteriormente, de un conjunto de datos de muestreo para luego realizar el ajuste de los parmetros
del modelo ARX.
Previo a la obtencin de los datos de muestra se estableci que las variables de manipulables
del sistema, de inters para la construccin del modelo lineal, son el coeficiente de dilucin y la
concentracin de glucosa de entrada. Por otra parte, la variable de salida que interesa relacionar
con dichas variables manipulables es la razn L/G. Si bien, en estricto rigor, el modelo debiese
relacionar dichas variables manipulables con las variables de estado que se utilizan para calcular
la razn L/G es mejor utilizar una menor cantidad de variables de manera de estimar la menor
cantidad de parmetros posibles para as resolver de mejor manera el problema de optimizacin que
surge por la minimizacin de la suma de los errores cuadrticos. El exceso de ajuste de parmetros
podra entregar malas aproximaciones de alguna de las curvas de variables de estado lo que incidira
directamente en el posterior calculo de la razn L/G. As, el proceso de obtencin de un modelo
de proceso por identificacin de sistemas se resume en la Figura 6.22.
100
ELECCIN
DE
VARIABLES
CONJUNTO
DE
MUESTRA
AJUSTE
PARMETROS
MODELO
Figura 6.22: Esquema de proceso de identificacin de sistemas.
De esta manera, el conjunto de datos utilizado para la estimacin del modelo fueron los presentados en la Figura 6.23, obtenidos por medio de la simulacin durante 3.600 horas de los valores de
la razn L/G calculados cada 0,1 [hr]. Se simul durante 3.600 horas para obtener un conjunto
de muestra amplio con gran variabilidad de datos. El uso de un intervalo de 0,1 [hr] para cada toma
de datos fue para lograr una discretizacin cercano a operar con un muestreo con tiempos muertos
bajos.
101
Cglc,e
x 10
1
0.14
L/G
0.12
0.5
0.8
0.6
1.5
0.4
0.2
0.1
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.08
0.06
0.04
0.02
0
2.5
0
1000
2000
Tiempo [hr]
3000
0.02
0
1000
2000
Tiempo [hr]
3000
Figura 6.23: Muestreo utilizado para la estimacin de modelo ARX (variables de desviacin).
Los datos de la Figura 6.23 se encuentran en variables desviacin y las perturbaciones sucesivas
que se presentan se escogieron para que el conjunto de muestra comprendiera patrones dinmicos
significativos para un modelo de proceso como son mantener un valor del coeficiente de dilucin
positivo y los efectos que produce una variacin en la concentracin de glucosa (que se observa
en los primeros tres patrones, de 0 a 2500 horas), y la respuesta del sistema frente a variaciones
del coeficiente de dilucin manteniendo constante la concentracin de glucosa de entrada (patrones
entre las 1.800 y las 3.600 horas. Adems, la duracin de los patrones contempla que el sistema
llegue al estado estacionario bajo las condiciones impuestas en cada tramo.
Los parmetros de construccin, n y m, del modelo ARX fueron escogidos como n = 1, m = 1
y se consideraron los vectores ~x y ~u igual a (L/G) y (Cglc,e , D), respectivamente. Valores de n
y m mayores a 1 orientan el modelo a darle mayor nfasis a los valores histricos de las variables
medidas y las variables manipulables pero el objetivo del planteamiento con n = 1 y m = 1 es para
que el modelo de proceso capte correctamente el efecto inmediato sobre L/G de variaciones
en Cglc,e y D. De esta forma, el modelo de proceso ser un modelo lineal simple que describe el
valor de L/G(t) como una funcin dependiente de los valores de L/G(t 1), Cglc,e (t 1) y
D(t 1) de la siguiente forma:
L/G(t) = (b1,1 , b1,2 ) (Cglc,e (t 1), D(t 1))T a1 L/G(t 1)
102
(6.17)
Los parmetros b1,1 , b1,2 y a1 fueron obtenidos por el ajuste por medio de minimizacin de la
suma del error cuadrtico de ajuste a los datos de la Figura 6.23 de manera de resultar lo siguiente:
L/G(t) = (4, 318 106 , 0, 0187) (Cglc,e (t 1), D(t 1))T + 1 L/G(t 1)
(6.18)
La funcin de la ecuacin 6.18 se ajusta con un error cuadrtico medio de 5, 419 108 y con
un coeficiente de correlacin R = 0, 666 a los datos de muestra. Un grfico comparativo de los
resultados de la simulacin con el modelo ARX de la ecuacin 6.18 se presenta en la Figura 6.24.
0.14
L/G Datos
L/G ARX
0.12
0.1
L/G [mol/mol]
0.08
0.06
0.04
0.02
0.02
0.04
0
500
1000
1500
2000
Tiempo [hr]
2500
3000
3500
Figura 6.24: Comparacin de simulacin de L/G con modelo ARX y muestreo.

Diseo de controlador basado en modelo lineal
Con la estimacin del modelo lineal se procedi a la simulacin del sistema con el lazo de
control ptimo para lo cual se sintonizaron los parmetros del controlador que incluyen el horizonte
de prediccin N p , el nmero de movimientos de control Nc , el costo por manipulacin de variable
de entrada , el peso del error del set point y la prediccin Q y el tamao del intervalo de muestreo
Ts .
El ajuste de parmetros de un controlador basado en modelo no tiene una base establecida y
existen numerosas tcnicas, tales como fijar el horizonte de prediccin N p , la cantidad de variaciones de la variable manipulable Nc , los vectores de ponderacin y Q, en funcin del tiempo
103
requerido para alcanzar un 60 %, un 80 %, un 90 % o un 95 % del estado estacionario del sistema,

el tiempo de muestreo Ts , el tiempo de subida del proceso y/o las restricciones sobre las variables
manipulables o de salida, cuya mayora conlinda con la heurstica [77]. Es por esto que se opt por
seguir algunas lneas generales de sintonizacin de parmetros para fijar la mayor cantidad de parmetros posibles. El valor de Ts = 0, 1[hr] fue fijado con la construccin del modelo ARX, se podria
utilizar un tiempo de muestreo mayor y proporcional a Ts pero la discretizacin tiene un intervalo
discreto de 0,1 horas por lo que habra que obviar la dinmica que ocurre entre cada intervalo. El
parmetro Q es un parmetro relevante cuando el objetivo de control busca dar mayor nfasis a
determinados valores de salida que, cuando se tiene una nica salida, puede ser el valor de salida
en un tiempo determinado o, cuando se presentan ms de una variable medida, puede ser una de
las variables de salida consideradas. Tambin puede servir, al igual que el vector para escalar la
magnitud de una parte de la funcin objetivo con respecto a la otra. Debido a los valores que se
espera que adopte L/G, no es necesario un escalamiento de dichos valores ni se requiere de una
mayor relevancia de un tramo del horizonte de prediccin, es por lo anterior que se mantuvo Q =~1.
N p y Nc podran considerarse los parmetros ms difciles de ajustar debido a que no son parmetros que se pueden ajustar de manera independiente. Por razones obvias, Nc debe ser menor
que N p /Ts , es decir que no se puede realizar un nmero de movimientos de la variable manipulable
de manera de superar el horizonte de prediccin. De la literatura, el valor predeterminado de Nc es
1 debido a que se logra una accin de control menos agresiva y se ahorran recursos computacionales de manera significativa [7882]. El horizonte de prediccin N p es el parmetro que designa
la ventana de tiempo en el cual se espera que el controlador induzca una respuesta deseada sobre
las salidas del proceso [77]. A nivel de laboratorio, cuando no existe un lazo de control automtico
para la concentracin de glucosa, se llevan a cabo modificaciones de las variables de entrada y su
respuesta comnmente se analiza y se espera ver un cambio luego de 8 horas de operacin y es por
esto que se fij N p en 8 horas. La complejidad de eleccin del horizonte de prediccin N p yace en
que un valor muy pequeo puede generar problemas de estabilidad del controlador mientras que
valores muy altos repercuten en la accin de control generndose menor rendimiento [80]. Es por
esto que se fij un valor de N p igual a 8 horas como planteamiento inicial para luego analizar y
discutir la respuesta de control generada.
Con lo anterior se redujo el nmero de parmetros a ajustar a uno solo que es el costo de
manipulacin por de variable de entrada, , el cual fue ajustado minimizando el ITAE por un
104
intervalo de 40 horas utilizando el mtodo simplex de Nelder-Mead [32]. As, el valor de ptimo
fue 0,016 que fue corroborado por medio de la comparacin de la Tabla 6.4.
Tabla 6.4: Valores de ITAE para diferentes valores de . valor ptimo obtenido.
ITAE
1
589,4
0,1
122,3
0,01
13,8
0,016 10,3
0,001
19,3
0,0001 19,5
Los valores de ITAE de la Tabla 6.4 muestran que frente a cambios en la magnitud del parmetro vara significativamente el rendimiento del controlador. Los cambios ms notorios son al
aumentar en un orden de magnitud con lo que aumenta en un orden de magnitud tambin el valor
del ITAE. Es muy probable que dicha variacin sea producto de que un aumento de genera un aumento del costo de variacin de la variable manipulable, al nivel de que es ptimo variar en menor
grado la variable manipulable lo que genera una accin de control insuficiente. De otra forma, el
aumento de genera una diferencia de rdenes de magnitud cuando se compara el primer sumando
N
p
c
de la funcin objetivo (N
k=1 uk ) con el segundo (k=1 yk Q yk ) por lo que la optimizacin se
reduce a optimizar con mayor nfasis en el primer sumando. Lo anterior se ve claramente reflejado
al comparar la respuesta simulada de lazo cerrado para = 0, 0158 y = 0, 1, que se muestran en
las Figuras 6.25 y 6.26, respectivamente.
105
5.5
Cglc,e
0.036
0.035
0.03
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4.5
L/G
Ysp
0.025
0.02
0.015
0.032
0.01
0.005
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.25: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con
el lazo de control de crecimiento celular abierto. --: set point 5 % de set point.
5.3
Cglc,e
5.2
0.0345
0.034
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
5.1
0.035
0.0335
4.9
0.033
4.8
0.0325
4.7
0.032
4.6
0.0315
4.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.031
50
0.05
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.045
0.04
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.26: Respuesta del sistema con = 0, 1 frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con
el lazo de control de crecimiento celular abierto. --: set point 5 % de set point.
Se simul la respuesta de lazo cerrado para el mismo intervalo de tiempo utilizado para el controlador P. El lazo de control someti la variable manipulable a cambios cada 0,1 horas por medio
de la minimizacin de la ecuacin 6.10, el cual se realiz utilizando un algoritmo de programacin
106
cuadrtica secuencial y sujeto a restricciones sobre el valor de la concentracin de glucosa [83]. Las
restricciones establecidas fueron un mnimo de 0 y un mximo de 2800 [mM], que corresponde a
la concentracin de saturacin de la glucosa en agua a 25 C [84].
La respuesta de lazo cerrado sin el lazo de control de crecimiento celular presenta una oscilacin leve con un perodo de oscilacin de aproximadamente 15 horas, un overshoot de casi 2,2
producto de la alta amplitud de la primera oscilacin que se puede observar que se encuentra a
aproximadamente 3,3 [mol/mol] del set point estipulado.
Los resultados de la simulacin de la respuesta del lazo de control ptimo hasta alcanzar su
estado estacionario son las curvas de las Figuras 6.27 y 6.28, y la repuesta con la inclusin del lazo
de control del coeficiente de dilucin se muestra en la Figura 6.29.
6
Cglc,e
0.036
0.034
Cglc,e [mM]
2
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.03
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.035
0.032
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0
1000
2000
3000
Tiempo [hr]
4000
0.03
5000
0
0
1000
2000
3000
Tiempo [hr]
4000
5000
Figura 6.27: Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de dilucin con
la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de
control de crecimiento celular abierto.
107
0.35
6
5
0.25
0.3
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
1000
2000
3000
Tiempo [hr]
4000
0
0
5000
1000
2000
3000
Tiempo [hr]
4000
5000

glucosa de entrada.
Se tiene para la simulacin del estado estacionario con el lazo de control cerrado que se tiene un
offset de un 5 % del set point y, como tambin se observ para el caso del controlador proporcional,
se genera una acumulacin de glucosa extra-celular y un lavado de las clulas y del lactato presentes
en el bio-reactor producto de una leve acumulacin de la glucosa residual.
Por otra parte, en la Figura 6.29 se observa una respuesta mucho ms oscilatoria cuyo perodo
de oscilacin rondea las 13 horas y cuya amplitud mxima de oscilacin alcanza los 0,43 [mol/mol]
al utilizar como referencia el set point. Se puede notar tambin que la oscilacin de la respuesta de
la Figura 6.29 es decreciente.
Al comparar la respuesta de la Figura 6.29 con la respuesta de la Figura 6.25 se observa la clara
influencia del lazo de control de crecimiento celular al que se le puede asociar el aumento de la
calidad oscilatoria de la respuesta de lazo cerrado y, por lo mismo, se requiere de un nuevo ajuste
del parmetro .
108
5.5
Cglc,e
0.04
0.045
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.04
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.035
0.03
0.025
0.035
0.02
0.015
0.01
0.005
4.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.29: Respuesta del sistema frente a un escaln de un 10 % de la tasa de crecimiento celular
mxima, max , con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada
con el lazo de control de crecimiento celular cerrado.
Se ajust nuevamente el parmetro por medio de minimizacin del ITAE. El resultado obtenido fue 3, 93 105 y se compar tambin con valores logartmicos cercanos para verificar que no
constituyera un mnimo local del ITAE. Los resultados de la simulacin de la respuesta optimizada
del sistema con todos los lazos cerrados se encuentran en la Figura 6.30.
ITAE
1
533,6
0,1
90,6
0,016
37,2
0,001
21,6
0,0001
20,1
5
3, 93 10
20
5
1 10
68,5
6
1 10
844,8
109
Cglc,e
0.035
0.016
D
0.034
D [hr1]
L/G [mol/mol]
5.5
0.033
4.5
0.032
Cglc,e [mM]
0.018
0.031
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
3.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.30: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del parmetro max
con la inclusin del lazo de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo
de control de crecimiento celular cerrado.
Al comprar la nueva respuesta de la Figura 6.30 con la respuesta no ptima de la Figura 6.30
se observan cambios drsticos, principalmente a nivel de frecuencia de oscilacin. Se tiene una
reduccin del perodo de oscilacin de aproximadamente 15 horas a cerca de 1 hora lo que significa
una reduccin de casi un 93 % que se puede notar a simple vista. Adems de la respuesta con
mayor frecuencia de oscilacin, la respuesta de lazo cerrado posee una menor amplitud mxima
de oscilacin lo que demuestra una accin de control ms agresiva que es probable que se deba a
una mayor importancia del costo de operar fuera del set point debido a una reduccin del costo de
modificacin de la variable manipulable producto de la reduccin de de 0,016 a 3, 93 105 .
Por otra parte, la nueva respuesta optimizada posee una diferencia con el set point de aproximadamente un 12 %. La existencia del offset se debe a que el modelo de proceso del controlador
basado en modelo depende de las variables manipulables (D y Cglc,e ) y de la variable de salida
(L/G). No se consider el valor del parmetro max para el modelo debido a que es considerada
una perturbacin no medible y sera poco prctico ajustar un modelo a partir de una variable que
no se podra medir en linea en el proceso. El efecto de la perturbacin constante sobre la respuesta
de lazo cerrado se puede constatar con la comparacin de las Figuras 6.31 y 6.32; una variacin del
set point genera un offset muy leve y la perturbacin seguida de max genera el offset observado en
la Figura 6.30, y la variacin del set point con una previa perturbacin de max si posee offset.
110
Cglc,e
0.036
0.025
D
0.02
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.015
0.01
0.032
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.005
2
0
20
40
60
Tiempo [hr]
0.03
100
80
0
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
100
Figura 6.31: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 30 % del offset seguido
por un escaln de un 10 % del parmetro max con la inclusin del lazo de control ptimo de la
concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado.
Cglc,e
0.036
0.025
D
0.02
0.034
D [hr1]
L/G [mol/mol]
6
Cglc,e [mM]
0.015
0.01
0.032
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.005
2
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
0.03
100
0
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
100
Figura 6.32: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % del parmetro max
seguido por un escaln de un 10 % del offset con la inclusin del lazo de control ptimo de la
concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular cerrado.
111
6.5.3.
Controlador basado en modelo no lineal
Tal como se plante en la descripcin del controlador ptimo, el modelo de proceso puede ser
una aproximacin no lineal de la dinmica del proceso. Las aproximaciones no lineales incluyen
modelos no lineales construidos como conjuntos de modelos localmente lineales que poseen una
funcin de distribucin gaussiana como el planteado en el algoritmo LoLiMoT [65, 85], modelos
no lineales autoregresivos de entrada exgena (NLARX) como las redes neuronales artificiales
construidos por medio de la identificacin de sistemas en donde se utiliza la relacin de mediciones
de variables de entrada y de salida para ajustar una funcin de activacin no lineal [8689], y
modelos no lineales autoregresivos de promedio variable y de entrada exgena (NARMAX), que
poseen la forma de los modelos NLARX pero adiciona parmetros de ajuste para modelar mejor el
efecto de ruidos y perturbaciones no medibles [76, 90].
La aplicacin de tcnicas de control basado en modelos no lineales incluye, entre otros, el
control de procesos de polimerizacin [68], de formacin de cristales [91], y especial nfasis ha
habido en bio-procesos como el control de produccin de biomasa [92], produccin de penicilina
[65], del proceso de fermentacin de etanol para biocombustibles [57] y de produccin de lipasa
[64].
Redes neuronales artificiales
Dentro de los modelos comnmente utilizados como modelos de proceso no lineal se encuentran las redes neuronales artificiales. La utilizacin reportada de redes neuronales en procesos biotecnolgicos incluye el control de un bio-reactor para la fermentacin de levadura [66, 93] y el
control de un foto bio-reactor para algas [94].
Las redes neuronales artificiales son estructuras de procesamiento de seales cuya estructura
bsica tiene un nmero determinado de entradas, al menos una capa oculta donde el valor de las
variables de entrada sirve de entrada para una funcin de activacin no lineal, y una capa de salida
en donde la informacin de las salidas de la capa de transferencia es alimentada a una funcin de
distribucin para obtener el valor de una o ms variables de salida de la red neuronal completa.
Cada capa, oculta y de salida, tiene un nmero determinado de nodos o neuronas que procesan un
nmero determinado de valores de entrada. Un diagrama explicativo de la estructura bsica de una
red neuronal con su procesamiento se presenta en la Figura 6.33.
112
VARIABLES
DE
ENTRADA
(X1,X2,X3,...XN)
CAPA
DE
SALIDA
(LOUT)
CAPA(S)
OCULTA(S)
(L1,L2,L3,...LN)
VARIABLES
DE
ENTRADA
(X1,X2,X3,...XN)
Figura 6.33: Estructura bsica de una red neuronal.
Dependiendo del tipo de arquitectura las redes pueden catalogarse dentro de diferentes categoras:
Perceptrn multi-capa: El perceptrn es la forma ms bsica de red neuronal cuyo modelo
consiste en una serie de neuronas que poseen un peso de entrada y un sesgo. El peso de
entrada es para dar una ponderacin especfica a cada entrada a la neurona y el sesgo es un
valor constante que busca corregir cualquier offset con respecto al valor objetivo de salida. La
caracterstica principal del perceptrn multi-capa es que el flujo de informacin es secuencial,
es decir que las entradas solamente se conectan con la primera capa oculta y las salidas de
dicha capa oculta se conectan nicamente con una siguiente capa oculta o la capa de salida
de manera que no existen flujos de informacin desviados directamente a una capa posterior.
En la Figura 6.34 se muestra la estructura general de una red multi-capa perceptrn.
Perceptrn multi-capa ligada: Tiene la misma estructura bsica que el perceptrn multi-capa
pero existe la posibilidad de que algunos flujos de informacin entren directamente a capas
posteriores, sin la necesidad de pasar por la capa inmediatamente siguiente. La Figura 6.35
muestra una red perceptrn multi-capa ligada en donde se agregan las lineas punteadas que
van desde las variables de entrada hacia la capa de salida directamente.
Red cascada completamente conectada: El flujo en cascada de la informacin en la red cascada completamente conectada hace pasar la informacin de entrada al total de neuronas de
la red y, adems, cada salida de neurona es entrada de la neuronas siguientes. De manera
grfica, una red cascada completamente conectada se presenta en la Figura 6.36.
113
x1
y
x2
CAPA
OCULTA
CAPA
SALIDA
Figura 6.34: Red perceptrn multi-capa.
x1
y
x2
CAPA
OCULTA
CAPA
SALIDA
Figura 6.35: Red perceptrn multi-capa ligada.
114
x1
x2
y
Figura 6.36: Red cascada completamente conectada.
Cada neurona ya sea de capa oculta o de la capa de salida posee una funcin de activacin f
que recibe la informacin de entrada ~x ponderada por su peso ~w y sumada a su sesgo ~b de manera
que la salida y = f (~w ~x +~b).
El ajuste de los parmetros w y b de cada neurona es por medio de la misma identificacin de
sistemas descrita anteriormente en donde los valores de salida de la red son comparados con las
salidas deseadas por medio de criterios de ajuste como el error cuadrtico medio de la ecuacin
5.2.
A pesar de presentar una metodologa de ajuste muy similar al utilizado para ajustar el modelo
ARX lineal de la seccin anterior, las redes neuronales poseen una estructura ms compleja lo que
requiere de criterios de seleccin de la arquitectura de la red y tambin de la forma en que se ajustan
los parmetros denominado entrenamiento de la red.
En primer lugar, el entrenamiento de una red neuronal est expuesto a someterse a lo que denomina un error de generalizacin en donde, debido al sobre ajuste de los parmetros de la red, la
red es capaz nicamente de retratar la dinmica impuesta por los datos utilizados para la identificacin de sistema y responde de manera pobre ante conjuntos de datos de origen independiente. Para
evitar lo anterior es que se plantea la divisin del conjunto de muestra en tres grupos, un conjunto
de entrenamiento con el cual se ajustan los parmetros, un conjunto de validacin con el cul se
establece un rendimiento de la red frente a un conjunto de datos independientes y un conjunto de
prueba que se utiliza para evaluar la red obtenida en algunos mtodos de diseo de arquitectura. A
fin de evitar el error de generalizacin se entrena la red hasta que el error de validacin alcance un
mnimo lo que coincide con el denominado el error mnimo de validacin cruzada [69].
115
Usualmente se utiliza un gran conjunto de datos y se designa un porcentaje fijo para el tamao
de cada conjunto y se escogen de manera aleatoria las muestras hasta completar el porcentaje
designado.
Por otra parte, la eleccin de la topologa o arquitectura ptima lleva a otro problema de diseo.
Si bien la minimizacin del error de validacin cruzada permite obtener el ajuste ptimo para una
determinada estructura de red neuronal, que dicha estructura contenga adems un nmero ptimo
de neuronas y de capas ocultas requiere de criterios de diseo adicionales.
Un mtodo utilizado para la encontrar la arquitectura ptima de una red neuronal es el mtodo
OMP que entrega reglas heursticas para calcular la cantidad mxima de capas ocultas y de neuronas
que puede tener cada capa, como tambin un ndice de comparacin para establecer la topologa
ptima de red [88, 95].
El mtodo OMP indica que el nmero de pesos de la red Nw debe cumplir con la siguiente
relacin
Nw
1
Nt O
10
donde Nt es el tamao del conjunto de entrenamiento (nmero de muestras) y O es el nmero

de variables de salida de la red neuronal. Por otra parte, el nmero de pesos para una capa oculta es
igual a:
Nw = I Nn + O Nn
donde Nn es el nmero de neuronas de la capa oculta e I es el nmero de variables de entrada
de la red.
En cunto al nmero de capas ocultas, de acuerdo al mtodo OMP no pueden superar el nmero
de variable de entrada y adems se plantea la siguiente relacin entre capas:
Nni 3 Nni+1
donde Nni corresponde al nmero de neuronas de la capa oculta i.
Adems de las reglas relacionadas con la construccin de la red neuronal, se establece un ndice
de rendimiento para comparar la variedad de posibilidades de arquitectura que se presenta en la
116
ecuacin 6.19.
Irend = R (minMSECV + NMSE Prueba )
(6.19)
donde Irend es el ndice de rendimiento de la red neuronal, R corresponde a la constante de

correlacin lineal entre las variables de salida medidas y las simuladas por la red, minMSECV es el
error mnimo de validacin cruzada y NMSE Prueba es el error cuadrtico medio normalizado del
conjunto de prueba que se calcula mediante la ecuacin 6.20.
NMSE Prueba =
MSE Prueba
Var(O)
(6.20)
Estimacin de modelo no lineal

En la Tabla 6.6 se presenta un resumen con los parmetros a utilizar para la bsqueda de la
arquitectura ptima de red y en la Figura 6.37 se presenta un diagrama con las variables y las capas
que formaran parte de la red ptima.
Tabla 6.6: Parmetros de construccin de redes neuronales.
Nombre Parmetro
Valor
Nmero de Entradas
3 (Cglc,e (t 1), D(t 1) y L/G(t 1))
Tamao Vector de Entrenamiento
7.140
Nmero de Salidas
1 (L/G(t))
Nmero de Capas Ocultas
1o2
Nmero Mximo de Neuronas Primera Capa
178
Nmero Mximo de Neuronas Segunda Capa
59
VARIABLES
DE
ENTRADA
L/G(t-1)
D(t-1)
Ce,glc(t-1)
[ ]
CAPA
DE
SALIDA
(LOUT)
CAPA(S)
OCULTA(S)
(L1,L2)
VARIABLES
DE
ENTRADA
L/G(t)
Figura 6.37: Estructura bsica de la red neuronal a construir.

La forma de encontrar la arquitectura ptima fue creando diversas arquitecturas utilizando las
117
restricciones de la Tabla 6.6 y comparndolas. Los datos utilizados para el entrenamiento, validacin y prueba de la red neuronal se presentan en la Figura 6.38 y la forma de construccin del
conjunto de datos fue simulando patrones de una duracin de 45 horas (tiempo requerido para alcanzar un 95 % del estado estacionario) durante 1200 horas, para luego escalar los resultados a fin
de que todos tuvieran una magnitud similar. El escalamiento fue debido a que se ha observado que
el aprendizaje de una red neuronal empeora cuando el conjunto de datos no es de magnitud similar
[88]. El entrenamiento se realiz utilizando el algoritmo de Levenberg-Marquardt que es un tipo
de retropropagacin que es de uso comn en el entrenamiento de redes neuronales [96] y el valor
L/G(t 1) se obtuvo por retro-alimentacin considerando una estructura en serie y paralela que
permiti un planteamiento de alimentacin anticipada (feedforward) [97].
3
Cglc,e
x 10
1
0.7
L/G
0.6
D
0.5
0.5
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2
0
200
400
600
800
Tiempo [hr]
1000
0.1
0
200
400
600
800
Tiempo [hr]
1000
1200
Figura 6.38: Conjunto de datos utilizados para la identificacin de sistemas con red neuronal (datos
no escalados).
Los resultados del ndice de rendimiento de algunas arquitecturas se presentan en la Tablas 6.7
y 6.8, y la simulacin de los datos de entrenamiento con la red de 24 neuronas, cuyo rendimiento
fue el mejor, se muestra en la Figura 6.39.
118
Tabla 6.7: Rendimiento de algunas redes neuronales de una nica capa oculta.
Nmero de Neuronas de Primera Capa
Irend
4
0,9963
24
0,9964
56
0,9962
80
0,996
164
0,982
Tabla 6.8: Rendimiento de algunas redes neuronales con dos capas ocultas.
Nmero de Neuronas de Primera Capa Nmero de Neuronas de Segunda Capa
Irend
12
4
0,9963
117
14
0,9962
117
24
0,9961
162
24
0,9945
3
x 10
L/G Datos
L/G NLARX
L/G [mol/mol]
5
4
3
2
1
0
1
0
2000
4000
6000
Tiempo [hr]
8000
10000
12000
Figura 6.39: Simulacin de conjunto de muestra utilizado para el entrenamiento de la red neuronal
ptima con red neuronal de 1 capa oculta con 24 neuronas (datos escalados).
Se observa de los resultados presentados en las Tablas 6.7 y 6.8 que capas de menor nmero de
neuronas tienen un mayor Irend lo que coincide con que, a mayor complejidad de una red, es ms
fcil para sta incurrir en errores de generalizacin [98]. Lo mismo es aplicable en las redes de dos
capas ocultas, aunque con el efecto especfico de que a mayor nmero de neuronas en la primera
capa oculta hay una baja en Irend , al igual que para un aumento en la segunda capa.
Finalmente, la red ptima resultante tiene la forma presentada en la Figura 6.40.
119
Ce,glc(t-1)
2
L/G(t)
3
D(t-1)
L/G(t-1)
4
..
.
24
CAPA
OCULTA
CAPA
SALIDA
Figura 6.40: Estructura de la red neuronal ptima.

Diseo de controlador basado en modelo no lineal
Con la red definida se procedi a la simulacin del lazo de control ptimo. La metodologa de
diseo utilizado fue el mismo que para el caso del control ptimo lineal de manera que el ajuste de
parmetros del controlador se enfoc en el parmetro , manteniendo el restante de los parmetros
de diseo iguales a los fijados para el modelo basado en modelo lineal.
El ajuste de se hizo, al igual que para el caso lineal, por medio de la minimizacin del ITAE
por un intervalo de 40 horas utilizando el algoritmo de programacin cuadrtica secuencial y sujeto
a restricciones sobre el valor de [83]. Se descart el mtodo simplex de Nelder-Meads porque
como resultado de una estimacin manual, el valor ptimo deba estar muy cerca de zero de manera
que un mtodo sin restricciones podra dar como resultado un valor negativo de .
El resultado de la minimizacin del ITAE con el lazo de control de crecimiento celular abierto
di como resultado = 5, el cual fue comparado con valores de diferente orden de magnitud
constatndose que posee un menor valor de ITAE incluso cuando es comparado con valores de
= 5 muy pequeos. Debido a las magnitudes observadas de variacin de la variable manipulable,
es posible que con un valor de = 5 el componente relacionado con el cambio de la variable
manipulable sea la que tenga mayor relevancia en la optimizacin de la funcin objetivo.
120
ITAE
50
112,021
5
111,659
1
116,222
0,1
125,802
0,01
124,914
0,001 125,194
1 104 125,237
1 105 125,232
Los resultados de la simulacin de la respuesta de control hasta alcanzar el estado estacionario
se muestran en las Figuras 6.41 y 6.42, en donde el sistema controlado no es retenido en un estado
metablico alterado, a pesar de los esfuerzos realizados por el controlador basado en modelo no
lineal, y vuelve a su estado metablico basal. Al igual que su smil lineal, se tiene una acumulacin
de glucosa residual y un lavado de clulas pero no se observa un lavado de lactato extra-celular
puesto que la concentracin de glucosa alimentada no fue reducido lo suficiente por lo que el
cultivo celular no vari sus tasas de consumo de glucosa ni de produccin de lactato resultando en
una tasa de produccin mayor al coeficiente de dilucin, lo que impidi su lavado.
5.3
Cglc,e
5.2
2.5
0.0335
4.9
0.033
4.8
0.0325
4.7
0.032
4.6
0.0315
4.5
0
500
1000
Tiempo [hr]
1500
0.031
2000
L/G [mol/mol]
0.034
Ysp
Ysp +/ 5%
L/G
0.0345
D [hr1]
Cglc,e [mM]
5.1
0.035
1.5
0.5
0
0
500
1000
Tiempo [hr]
1500
2000
Figura 6.41: Respuesta del sistema optimizado frente a un escaln de un 10 % de la concentracin de glucosa de entrada con la inclusin del lazo de control basado en modelo no lineal de la
concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento celular abierto.
121
5.5
5
4.5
7
6
5
4
3
3.5
3
2.5
1
0
0
500
1000
Tiempo [hr]
1500
1.5
0
2000
500
1000
Tiempo [hr]
1500
2000

glucosa de entrada.
La simulacin del lazo de control de la concentracin de glucosa con el lazo de crecimiento

celular abierto y cerrado se muestra en las Figuras 6.43 y 6.45, respectivamente.
5.277
Cglc,e
0.033
0.045
0.04
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.035
5.276
0.03
0.025
0.032
0.02
0.015
0.01
Ysp
Ysp +/ 5%
L/G
0.005
5.275
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.031
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.43: Respuesta optimizada del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de
dilucin.
122
Cglc,e
0.036
0.1
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.12
0.032
L/G
Ysp
Ysp +/ 5%
0.08
0.06
0.04
0.02
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.44: Respuesta de lazo abierto del sistema frente a un escaln de un 10 % del coeficiente
de dilucin.
Como se pudo observar en la Figura 6.41, el cultivo celular vuelve a su estado metablico basal
una vez alcanzado su estado estacionario lo que indicara una muy baja incidencia de la accin de
control en las primeras horas. Sin embargo, la comparacin de la Figura 6.43 con la respuesta del
sistema de lazo abierto frente a la misma perturbacin que se muestra en la Figura 6.44 demuestra
una accin de control leve de parte del controlador basado en modelo no lineal. Es la respuesta a la
accin de control la que permite al sistema mantener una razn L/G menor a 0,045 [mol/mol]
luego de 50 horas de cultivo en vez de casi 0,12 [mol/mol] que se observa para la respuesta de lazo
abierto. El cambio de respuesta mencionado antes se debe a una disminucin de la concentracin
de glucosa promedio alimentada, que en el caso del lazo abierto se mantiene en los 5,276 [mM]
iniciales mientras que para el controlador basado en modelo no lineal dicha concentracin oscila en
torno a un valor cercano a 5,2755 [mM] que, si bien no es gran variacin, genera un efecto notorio
en la variable de salida.
123
5.28
Cglc,e
0.04
0.35
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.3
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
5.275
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
La Figura 6.45, que muestra la respuesta del sistema con los lazos de control de concentracin
de glucosa y de crecimiento celular cerrados presenta una variacin poco esperada en la curva
de concentracin de glucosa de entrada pues posee aumentos en dicha concentracin por sobre
el valor inicial de 5,276 [mM] cuando la curva de la razn L/G se encuentra por sobre el set
point. Los incrementos de la concentracin de glucosa por sobre el valor inicial cuando el sistema
muestra diferencias positivas de la razn L/G frente a su set point debido a que, tal como se ha
observado para los otros controladores, se espera que la accin de control sea variar negativamente
la concentracin de glucosa cuando la razn L/G se encuentra sobre el set point.
Por otra parte, la comparacin de las respuestas con y sin el lazo de control de crecimiento
incorporado muestran la alta incidencia de este lazo sobre la variable de salida L/G. Al comparar
directamente las Figuras 6.43 y 6.45 se tiene que para la curva de L/G, si bien alcanza valores
mayores de la razn L/G dentro del intervalo de tiempo simulado, se estabiliza con L/G
menor a 0,15 [mol/mol] y se puede considerar que no vuelve a su estado metablico basal.
La minimizacin del ITAE con el lazo de control de crecimiento celular cerrado se presenta en
la Figura 6.46 en donde el valor de obtenido fue de 0,00628, acorde con lo corroborado en la
Tabla 6.9.
124
ITAE
1
1.840,3
0,1
1.502
0,01
161,074
0,00628 145,218
0,001
165,043
0,0001
166,336
10
Cglc,e
0.036
0.025
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
D
0.02
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.015
0.01
0.032
0.005
5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Para la Figura 6.46 nuevamente se observa una respuesta que no parece volver al estado metablico basal. Sin embargo, se tiene una respuesta oscilatoria de las curvas de la razn L/G, el
coeficiente de dilucin y la concentracin de glucosa de entrada. Se observa un primer monte que
alcanza aproximadamente 0,23 [mol/mol] que corresponde al efecto inmediato de la perturbacin.
El aumento brusco de L/G hasta 0,23 [mol/mol] es luego controlado y los dems valores de
L/G de la curva poseen valores muy inferiores al set point que oscilan alrededor de los 0,0025
[mol/mol]. Cabe destacar respecto a esto ltimo que se asume altamente improbable lograr razones de L/G que oscilan alrededor de los 0,0025 [mol/mol] debido a que no existe registro en la
literatura de que se hayan alcanzado razones de dicha magnitud.
La comparacin de las Figuras 6.46 y 6.45 muestra que la respuesta simulada con el valor
125
ptimo de aumenta su frecuencia de oscilacin y posee una respuesta inversa. Adems, la comparacin corrobora la optimizacin efectiva de la respuesta de control pues la diferencia de los
valores de la curva de L/G para el caso optimizado efectivamente son menores a los observados
para el caso sin optimizar lo que corrobora lo observado en la Tabla 6.10.
6.6.
Anlisis de robustez de controladores
A fin de analizar la robustez de los controladores proporcional y basado en modelo lineal se

simul la respuesta del sistema, con ambos lazos de control cerrados, frente a perturbaciones de un
5, 15, 20 y 30 % en max .
6.6.1.
Controlador proporcional
5.4
0.033
0.018
0.016
0.014
0.032
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
5.2
0.031
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
Cglc,e
4.8
0
D
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.002
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
126
5.5
Cglc,e
0.038
0.018
D
0.036
0.016
0.014
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.02
0.012
0.034
4.5
0.01
0.008
0.032
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
3.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
6
Cglc,e
0.04
0.02
0.018
0.016
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.014
0.035
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
2
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
127
5.5
0.042
0.04
0.038
0.036
3.5
0.034
0.032
2.5
0
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.02
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
4.5
0.025
Cglc,e
D
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.015
0.01
0.005
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
De las Figuras 6.48, 6.49 y 6.50 se tiene que los resultados de la simulacin para el controlador
proporcional permiten observar una robustez esperable de un controlador clsico en donde un aumento de la perturbacin genera un aumento en el tiempo de respuesta y el rango de variacin de la
variable manipulable sin generar una dinmica diferente al observado para el caso de diseo (10 %
de aumento de max ) a excepcin del tiempo que se demora el controlador en alcanzar el estado
estacionario, que aumenta con una mayor perturbacin de max . Es esperable un mayor tiempo de
respuesta para perturbaciones mayores al 10 % debido a que la carga de la perturbacin es mayor al
utilizado para el ajuste de la ganancia del controlador por lo que el controlador se demora ms en
estabilizar el sistema dentro de la banda establecida, como tambin es esperado un menor tiempo
de respuesta para la perturbacin de un 5 % de la Figura 6.47 debido a la necesidad de un rango
ms acotado de concentraciones para la misma finalidad.
6.6.2.
Controlador basado en modelo lineal
La simulacin de los casos antes sealados para el lazo de control basado en modelo tambin
gener resultados esperables que se muestran en las Figuras 6.51, 6.52 y 6.53. Se observ que a
mayor perturbacin, mayor era el offset de la respuesta regulada siendo dicho offset generado por
la presencia de una perturbacin no medible que el modelo de proceso no es capaz de representar
128
debido a que solamente contempla como variables de entrada L/G(t 1), D(t 1) y Cglc,e (t 1).
5.5
0.034
Cglc,e
0.018
0.016
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.014
0.012
0.01
0.032
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
4.5
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
6
0.036
5.5
0.035
0.018
0.016
0.034
4.5
0.033
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.014
0.032
3.5
0.031
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
3
0
Cglc,e
D
10
20
30
Tiempo [hr]
40
0.002
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
129
0.038
0.018
0.016
0.036
0.014
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
0.012
0.01
0.034
0.008
0.006
0.032
Cglc,e
D
2
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
0.03
50
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Las perturbaciones de 5 %, 15 % y 20 % generan un offset de un 6 %, 16 % y 23 %, respectivamente, con lo que se puede apreciar una proporcionalidad directa entre ambas variables que,
sumado al un 12 % de offset observado para una perturbacin de un 10 %, sigue una tendencia
lineal que se muestra en la Figura 6.54, con un coeficiente de correlacin lineal de 0,9902.
25
Offset
Regresin Lineal (R = 0,9902)
Offset (%)
20
15
10
10
15
20
Perturbacin (%)
Figura 6.54: Dependencia del offset de la magnitud de la perturbacin de la tasa mxima de crecimiento celular max .
130
Adems de observar una dependencia del offset con respecto a la magnitud de la perturbacin
constante, se not que la magnitud de dicha perturbacin no afecta mayormente el tiempo que
demora la respuesta de control en alcanzar el estado estacionario.
6.7.
Anlisis de sensibilidad de controladores
Con la intencin de analizar la versatilidad de los controladores proporcional y basado en modelo lineal se simul la respuesta de control de ambos controladores bajos diferentes contextos. Las
condiciones simuladas fueron las siguientes:
Baja disponibilidad de concentraciones de glucosa: Se simul la respuesta de ambos controladores bajo la premisa de que para regular la concentracin de glucosa de entrada existen
nicamente 5 recipientes con 5 medios con concentraciones diferentes de glucosa: 5,276
[mM], 4,776 [mM], 4,276 [mM], 3,776 [mM], 3,276 [mM] y 0 [mM], que corresponde a contar con adems de la concentracin inicial de 5,276 [mM], utilizado para las simulaciones
anteriores, 4 concentraciones reducidos en 0,5 [mM] respecto a su antecesor partiendo desde dicha concentracin inicial y un medio libre de glucosa (0 [mM]). Adems se supuso la
existencia de todas las mezclas isovolumtricas posibles de las concentraciones anteriores de
manera de tener 4 concentraciones adicionales disponibles: 5,076 [mM], 4,576 [mM], 4,076
[mM] y 3,576 [mM]. La finalidad de la simulacin anterior es analizar la respuesta de los
controladores frente a un montaje experimental comn en donde se cuenta nicamente con
bombas peristlticas (ON/OFF) desde los recipientes al bio-reactor.
Aumento de los intervalos de muestreo: Se simul la respuesta del controlador basado en
modelo lineal frente a un cambio en los intervalos de muestreo. Se simul la respuesta frente
a la variacin del cambio de un intervalo de muestreo de 0,1 [hr] a 1 [hr] sin modificacin de
los parmetros ya ajustados. Tambin se simul la discretizacin del controlador proporcional
utilizando intervalos similares de control.
Aumento de los intervalos de muestreo y restricciones impuestas en las concentraciones de
glucosa de entrada: Se simul la respuesta del controlador basado en modelo lineal frente a un cambio simultneo en los intervalos de muestreo y las concentraciones de glucosa
disponibles.
131
6.7.1.
Restriccin de concentraciones de glucosa
Para la simulacin de las restricciones impuestas sobre la concentracin de glucosa sobre la respuesta del controlador proporcional se procedi a la discretizacin de ste para mantener constante
la concentracin de glucosa durante intervalos de muestreo pequeos.
La accin de control proporcional de la concentracin de glucosa se puede escribir como:
Cglc,e (t) = Kc (L/GSetPoint L/G(t 1)) +Cglc,e (t 1) + cs
(6.21)
Cuando el valor de L/G(t 1) es igual a L/GSetPoint se espera que la accin de control

sea nula, es decir que Cglc,e (t) Cglc,e (t 1) sea igual a cero. De esta manera, cs debe ser igual a
cero para cumplir con esta premisa. Ahora bien, al enfrentarse a un escenario en donde se acota
el nmero de muestreos durante un intervalo de tiempo se debe utilizar una discretizacin del
controlador proporcional que consiste en el mismo planteamiento pero de forma discreta, es decir:
K (L/G
c
SetPoint L/G(t 1)) +Cglc,e ((n 1)T )
Cglc,e (nT ) =
C
(nT 1)
t = nT
glc,e
en donde Cglc,e (nT ) es la concentracin de glucosa de entrada en el instante t = nT , Kc corresponde a la ganancia del controlador proporcional, T es el intervalo de muestreo del controlador
discreto, y n es el nmero del intervalo. El intervalo de muestreo escogido fue de 0,004 [hr] y fue
elegido utilizando como base que el intervalo de muestreo debe ser inferior a un 10 % del tiempo
que demora la respuesta de lazo abierto del sistema, frente a un escaln unitario en la variable manipulable, en alcanzar un 63,2 % de su estado estacionario para captar la respuesta de lazo abierto del
sistema [99]. El sistema se demora 0,05 [hr] en alcanzar el 63,2 % de su estado estacionario frente
a un escaln unitario en la concentracin de glucosa de entrada por lo que el intervalo de muestreo
T debe ser menor que 0,005 [hr]. La discretizacin del controlador proporcional fue con el fin de
evaluar el comportamiento del controlador continuo forzado a tener una respuesta restringida por
los tiempos muertos de muestreo y de clculo de L/G. Debido a que no fue posible simular la
respuesta sin restricciones sobre la concentracin de glucosa alimentada del controlador discreto
debido a que se alcanzaban valores negativos de concentracin de glucosa, producto de la alta ganancia Kc , se simul la respuesta de control con las restricciones impuestas sobre la concentracin
de glucosa de entrada para el controlador basado en modelo de manera de no tener concentracio132
nes negativas ni superiores a la concentracin de saturacin de glucosa en agua. El resultado de

la simulacin de la respuesta de control de la aproximacin discreta comparado con la respuesta
del controlador proporcional continuo frente a un escaln de un 10 % del coeficiente de dilucin se
presenta en la Figura 6.55 y la comparacin de su respuesta con la observada para el controlador
proporcional continuo se muestra en la Figura 6.57.
0.036
Cglc,e
0.018
0.016
0.014
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
10
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.55: Respuesta del controlador proporcional discreto utilizando un intervalo de muestreo
de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max .
20
Cglc,e
0.036
0.016
0.014
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
0.034
10
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
L/G discreto
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
0.002
0
10
10.5
11
Tiempo [hr]
11.5
0.03
12
0
10
10.5
11
Tiempo [hr]
11.5
12
Figura 6.56: Acercamiento de respuesta del controlador proporcional discreto utilizando un intervalo de muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max .
133
En la Figura 6.55 se observa que la respuesta de control discretizado posee una alta frecuencia
de oscilacin. Adems, la concentracin de alimentacin de glucosa toma el valor de 0 en muchos
intervalos lo que significa que es posible que en dichos intervalos el controlador est operando de
manera sub-ptima pues podran tratarse de intervalos en donde la accin de control requiere de
una alimentacin negativa de glucosa, lo que no es factible. En la Figura 6.56 se tiene un acercamiento de la respuesta de la Figura 6.55 que muestra las dos primeras horas de la respuesta a la
perturbacin.
0.018
0.016
L/G [mol/mol]
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
L/G discreto
L/G continuo
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
0.004
0.002
0
0
10
15
20
25
Tiempo [hr]
30
35
40
45
50
Figura 6.57: Comparacin de dinmica de variable de salida del controlador proporcional con su
aproximacin discreta utilizando un intervalo de muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin
de un 10 % de max .
La comparacin de la Figura 6.57 muestra que la respuesta discreta se aleja bastante de la
observada para el caso continuo del controlador proporcional. Adems de la mayor frecuencia de
oscilacin se tiene tambin una mayor amplitud de oscilacin que no decae en todo el intervalo de
tiempo simulado.
En cuanto a la sensibilidad del controlador basado en modelo lineal, la restriccin de las concentraciones de glucosa disponibles gener una respuesta con una mayor oscilacin producto del
carcter sub-ptimo de las concentraciones alimentadas. La gran amplitud de oscilacin que es
producto del carcter binario que puede tener la concentracin en determinados rangos. El carcter
binario se refiere a que en un rango determinado la concentracin de glucosa puede adoptar mximo 2 concentraciones distintas y genera un aumento en la amplitud de oscilacin y una mayor
134
frecuencia de oscilacin debido a que al reactor se alimenta una concentracin de glucosa que no
es la ptima al bio-reactor, ya sea inferior al limite superior o superior al limite inferior del rango
binario, esto provoca que se alimente glucosa en exceso o menor al requerido de manera que la
razn L/G oscila con una mayor amplitud al observado para los casos sin restriccin. Por otra
parte, la respuesta de la Figura 6.58 aparentemente oscila en torno al valor estacionario observado
para la respuesta del sistema sin restricciones sobre la concentracin de glucosa alimentada, el cual
un tiene un offset de aproximadamente un 12 %.
6
Cglc,e
0.035
0.016
D
0.034
D [hr1]
L/G [mol/mol]
5.5
0.033
4.5
0.032
Cglc,e [mM]
0.018
0.031
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.004
0.002
3.5
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
0.03
100
0
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
100
Figura 6.58: Respuesta del controlador basado en modelo lineal frente a una perturbacin de un
10 % de max con una alimentacin de concentraciones restringidas de glucosa.
Para el caso del controlador proporcional, cuya respuesta simulada se muestra en la Figura
6.59 y cuyo acercamiento se puede apreciar en la Figura 6.60, se observa una respuesta tambin
de una alta frecuencia de oscilacin y de una amplitud de oscilacin similar a lo largo de toda la
simulacin. Al comparar la respuesta de la Figura 6.55 con la de la Figura 6.59 se observa una
frecuencia de oscilacin similar con una reduccin de la amplitud de oscilacin para el caso con
restricciones sobre la concentracin de glucosa de entrada. La existencia de una menor amplitud
de oscilacin, que repercute en que la repuesta de control se mantenga en el interior de la banda de
un 5 % del set point, es lo ms destacable y puede considerarse un resultado esperable frente a las
condiciones de operacin; se observ para el caso sin restricciones que la accin de control genera
una alta frecuencia de oscilacin de la variable manipulable, as como una amplitud de oscilacin
135
aparentemente constante, lo que para el caso de la respuesta de control con restricciones sobre la
variable manipulable se repite pero dentro de un rango ms acotado de operacin, esto genera una
restriccin del rango de valores de L/G.
5.5
Cglc,e
0.036
0.018
0.016
0.014
0.034
Cglc,e [mM]
D [hr1]
L/G [mol/mol]
4.5
0.032
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
L/G discreto
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
0.002
4
0
10
20
30
Tiempo [hr]
0.03
50
40
0
0
10
20
30
Tiempo [hr]
40
50
Figura 6.59: Respuesta del controlador proporcional discreto con un intervalo de muestreo de 0,004
[hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max con una alimentacin de concentraciones restringidas de glucosa.
5.5
Cglc,e
0.036
0.016
D [hr1]
4.5
0.032
0.012
L/G [mol/mol]
0.034
Cglc,e [mM]
0.014
0.01
0.008
0.006
0.004
L/G discreto
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
0.002
4
10
10.5
11
Tiempo [hr]
11.5
0.03
12
0
10
10.5
11
Tiempo [hr]
11.5
12
Figura 6.60: Acercamiento de respuesta del controlador proporcional discreto con un intervalo de
muestreo de 0,004 [hr], frente a una perturbacin de un 10 % de max con una alimentacin de
concentraciones restringidas de glucosa.
136
La comparacin de las dinmicas de las respuestas de las Figuras 6.58 y 6.59 muestra un mejor rendimiento del controlador proporcional en comparacin al controlador controlador basado
en modelo lineal al lograrse una estabilizacin ms cercano al set point establecido. Sin embargo,
como se seal antes, ambas respuestas poseen una alta frecuencia de oscilacin lo que sugiere
otro potencial problema de implementacin del controlador, el requerimiento de un actuador robusto y preciso, capaz de realizar de realizar cambios en las condiciones de operacin con una alta
frecuencia.
La simulacin de la aproximacin discreta permiti analizar la dinmica de control de una
solucin prctica implementable que consiste en el uso intermitente del controlador proporcional,
es decir, la adaptacin del controlador por medio de la alimentacin discreta de informacin. Sin
embargo, la necesidad de imponer restricciones para simular y comparar la respuesta de control
frente a la misma perturbacin genera una prdida de representatividad del controlador discreto
de su par continuo. La falta de representatividad se observa claramente luego de la comparacin
expuesta en la Figura 6.57.
6.7.2.
Aumento de intervalo de muestreo
El objetivo de analizar el comportamiento de los controladores proporcional y basado en modelo

lineal frente a un cambio en el intervalo de muestreo es para simular la versatilidad del controlador
basado en modelo lineal bajo condiciones de operacin restringidas que caen fuera de las condiciones simuladas al momento de ajustar los controladores. Para esto se escogi la simulacin de un
aumento del intervalo de muestreo.
Debido a que el controlador proporcional diseado corresponde a un controlador continuo cuya discretizacin requiere de intervalos de muestreo pequeos inferiores a 0,005 [hr] para poder
operar sin variacin de la ganancia, no es factible simular la respuesta de control para un intervalo de muestreo de 1 [hr]. Las razones por las que no se puede simular es por infactibilidades
numricas que se traducen en casos no aplicables a la realidad; al aumentar el tiempo de muestreo
el valor de la concentracin de glucosa de entrada puede adoptar valores negativos debido al alto
valor de la ganancia del controlador lo que, por el planteamiento del sistema, no puede resolverse
numricamente. Esto sumado al hecho de que una concentracin de glucosa negativa significa un
retiro selectivo de concentracin de glucosa lo que es un caso totalmente desapegado de la realidad
experimental. Ahora bien, los equipos de muestreo en lnea de glucosa y lactato como el TRACE
137
C2 de TRACE Analytics, CLS-1322-02 de GlucCell y YSI 2900 Biochemisty Analyzer de YSI

poseen tiempos muertos por anlisis de 0,033, 0,033 y 0,01 [hr], respectivamente, los cuales superan la cota superior del intervalo de muestreo que es de 0,005 [hr] y es por ello que se compar
y analiz la respuesta de lazo cerrado del controlador proporcional discreto, con un intervalo de
muestreo de 0,033 [hr], con la respuesta observada para el controlador proporcional continuo frente a una perturbacin de un 10 % del coeficiente max . A travs de esta comparacin de controlador
proporcional discreto y continuo que se muestra en la Figura 6.61 se observ que un aumento del
intervalo de muestreo, sujeto a las restricciones para evitar que la concentracin de glucosa de entrada sea negativa y que supera su concentracin de saturacin en agua, genera una mayor amplitud
de oscilacin y una baja en el rendimiento observado para su smil continuo.
0.03
L/G [mol/mol]
0.025
0.02
0.015
0.01
L/G discreto
L/G continuo
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
0.005
0
0
10
15
20
25
Tiempo [hr]
30
35
40
45
50
Figura 6.61: Comparacin de dinmica de variable de salida del controlador proporcional con su
aproximacin discreta utilizando un intervalo de muestreo de 0,033 [hr], frente a una perturbacin
de un 10 % del coeficiente de dilucin.
Por otra parte, para el controlador basado en modelo lineal, se aument el intervalo de muestreo
de 0,1 [hr] a 1 [hr] que se puede considerar un caso hipottico factible que se puede asociar con
una restriccin de los tiempos muertos de operacin.
Los resultados de la simulacin de un aumento en el intervalo de muestreo se presentan en la
Figura 6.62 en donde se observa un mayor tiempo tiempo de respuesta, alcanzando aproximadamente 24 horas. Adems, existe una variacin del tamao y el signo del offset; con un intervalo de
muestreo de 0,1 [hr] el offset ronda un 12 % negativo y con un intervalo de muestreo de 1 [hr] este
138
alcanza un offset cercano a un 5 % positivo.

La prolongacin del intervalo de muestreo tambin da cabida a una accin de control menos
agresivo; una menor agresividad de la accin de control gener una menor oscilacin de la concentracin de glucosa residual que tambin incide en la tasa de crecimiento celular que, a su vez,
incide en el coeficiente de dilucin pues una respuesta menos oscilatoria del coeficiente de dilucin depende directamente de la dinmica de la tasa de crecimiento celular. Sin embargo, la menor
agresividad de la respuesta de control tambin incide en la amplitud mxima de oscilacin con respecto a su valor estacionario que se nota claramente en que la mxima razn L/G que se puede
apreciar es 0,0559 [mol/mol] que corresponde a un incremento en casi un 70 % en comparacin a
su respuesta sin ampliacin del intervalo de muestreo.
5.4
Cglc,e
0.038
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.06
0.036
D [hr1]
L/G [mol/mol]
Cglc,e [mM]
5.2
0.07
0.05
0.04
0.034
4.8
0.032
0.03
0.02
0.01
4.6
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
0.03
100
0
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
100
Figura 6.62: Respuesta del controlador basado en modelo lineal de la Figura 6.30, con el intervalo
de muestreo modificado a 1 [hr], frente a un escaln de un 10 % de la tasa de crecimiento celular
6.7.3.
Aumento de intervalo de muestreo y restriccin de concentraciones de

glucosa
A fin de verificar la incidencia de simultneamente restringir las concentraciones de glucosa

disponible y de aumentar el tiempo de muestreo del controlador basado en modelo lineal se simul
la respuesta de control del mismo frente a un escaln de un 10 % de max . El resultado obtenido
139
no presenta la oscilacin que posee la respuesta con un menor tiempo de muestreo y posee una
dinmica similar al observado para el caso en que el intervalo de muestreo es 1 [hr] con una diferencia notoria al comparar el valor del estado estacionario. Como se plante antes, una restriccin
de la concentracin de glucosa da cabida a la alimentacin de concentraciones sub-ptimas, caso
presente en la simulacin de la Figura 6.63. Se puede notar de la Figura 6.62 que, a partir de aproximadamente las 13 horas de simulacin, la concentracin de glucosa alimentada posee una dinmica
creciente que ocurre a concentraciones superiores a 4,8 [mM] y, dado que existe una restriccin sobre las concentraciones disponibles, la dinmica observada en la Figura 6.63 es constante e igual
a 4,776 [mM]. La alimentacin sub-ptima de glucosa es la que genera una diferencia en el signo
y magnitud del off-set principalmente porque una menor concentracin que la ptima requerida
por el cultivo genera una menor disponibilidad de glucosa residual y, por la funcin reguladora,
una menor tasa de produccin de lactato para el consumo de glucosa del cultivo, es decir, menor
L/G.
Cglc,e
D
5.3
Cglc,e [mM]
5.2
0.037
0.07
0.036
0.06
0.035
0.05
D [hr1]
L/G [mol/mol]
5.4
5.1
0.034
0.033
4.9
0.032
0.02
4.8
0.031
0.01
4.7
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
0.03
100
Ysp
Ysp +/ 5%
Ysp +/ 15%
L/G
0.04
0.03
0
0
20
40
60
Tiempo [hr]
80
100
Figura 6.63: Respuesta del controlador basado en modelo lineal de la Figura 6.30, con el intervalo
de muestreo modificado a 1 [hr] y restricciones sobre la concentracin de glucosa disponible, frente
a un escaln de un 10 % de la tasa de crecimiento celular mxima, max , con la inclusin del lazo
de control ptimo de la concentracin de glucosa de entrada con el lazo de control de crecimiento
celular cerrado.
Al igual que para el caso del aumento del tiempo de muestreo, no fue factible simular la aproximacin discreta del controlador proporcional debido a la ganancia de sta.
140
6.8.
Discusiones
Luego de simular las respuestas con lazos de control proporcional y basado en modelo lineal se
observ un tiempo de respuesta del controlador proporcional de aproximadamente 17 horas mientras que el controlador basado en modelo no alcanz un estado estacionario dentro de la banda
estipulada de un 5 % del set point debido a la existencia de un offset negativo de un 12 %. Por
otra parte, el tiempo de estabilizacin (t95 % , tiempo de demora en alcanzar un 95 % del estado estacionario) de los controladores proporcional y basado en modelo son de 17 horas y de 8 horas,
respectivamente, lo que significa una reduccin de ms de un 50 % al utilizar un controlador basado en modelo lineal. De los resultados anteriormente expuestos queda claro que el rendimiento
del controlador proporcional, en lo que concierna al problema de regulacin de control, es muy
superior al controlador basado en modelo lineal. No es posible una comparacin de tiempos de respuesta con el controlador basado en modelo lineal debido a que el controlador de modelo basado
en modelo lineal no alcanza un estado estacionario de L/G dentro de la banda fijada pero cabe
destacar que el tiempo de estabilizacin del controlador basado en modelo lineal es mucho menor al
observado para el controlador proporcional lo que permite suponer que, de lograr una respuesta del
controlador basado en modelo libre de offset, tendra un tiempo de respuesta inferior al controlador
proporcional.
Una posibilidad para superar los problemas de offset del controlador basado en modelo lineal
es la inclusin de la tasa de crecimiento celular, en el modelo de proceso. Sin embargo, al ampliar
el nmero de variables del cual depende el modelo de proceso se hace inevitable una mayor dificultad para rescatar la respuesta metablica, esto porque el modelo se tendra que ajustar a diversos
patrones nuevos debido a que la tasa es una funcin no lineal que depende de la concentracin de
S y KI .
glucosa, de lactato, y de los parmetros max , Kglc
lac
La comparacin de las dinmicas observadas entre los controladores proporcional y basado

en modelo lineal muestra una clara similitud, ambas respuestas de control poseen una dinmica
altamente oscilatoria que sera difcil de lograr a nivel industrial debido a la precisin de los requerimientos de concentracin de glucosa alimentada y a la alta frecuencia de cambio de la variable
manipulable; sobre todo el perfil del controlador basado en modelo lineal, seran difciles de obtener a nivel industrial los perfiles de glucosa de ambos controladores debido a la gran precisin
de los valores y la gran variedad de las concentraciones requeridas. Los perfiles de concentracin
141
de glucosa alimentada simuladas requieren de una fuente capaz de generar medios de alimentacin con cualquier concentracin de glucosa, algo que es improbable de lograr a escala industrial
debido a que comnmente se dispone nicamente de una cantidad finita de medios con diferentes
concentraciones cuya alimentacin es regulada por medio de bombas ON/OFF.
Adems, las respuestas simuladas indican que la implementacin de cualquiera de ambos controladores requerira de un actuador robusto que no sea fcilmente desgastado por la alta frecuencia
de cambios en la variable manipulable y/o de un lazo de control adicional sobre el actuador para
obtener valores precisos de concentraciones de glucosa, dicho actuador tendra mayor exigencia en
el caso del controlador basado en modelo lineal debido a la mayor frecuencia de oscilacin que ste
presenta. Esto bajo la premisa de que a nivel industrial existe un equipo capaz de generar cualquier
dilucin de glucosa.
Ahora bien, el estudio de restricciones sobre la concentracin de glucosa alimentada y el aumento del intervalo de muestreo pone de manifiesto una clara ventaja del controlador basado en
modelo lineal por sobre el controlador proporcional en lo que respecta la implementacin de dichos controladores. Los anlisis que se llevaron a cabo permitieron observar los problemas que
surgen al alimentar un controlador continuo de informacin discreta y la carencia de versatilidad
que poseen stos frente a limitaciones prcticas como la restriccin de las concentraciones de alimentacin disponibles.
Es por los puntos antes sealados que el controlador basado en modelo lineal es un controlador
de mayor viabilidad con miras a la implementacin. Sin embargo, posee una gran debilidad frente a
perturbaciones no medibles constantes pues existe una relacin prcticamente lineal entre el offset
de la respuesta de control y la magnitud de la perturbacin no medible analizada.
En cuanto a la medidas de mitigacin de posibles problemas de implementacin que podran
surgir producto de limitaciones operacionales que pueden existir, las respuestas de las Figuras 6.58
y 6.59 muestran que la alimentacin de una concentracin sub-ptima genera una mayor amplitud
de oscilacin de la respuesta de control lo que, en trminos prcticos, nicamente solucionara
un potencial problema de disponibilidad de concentraciones pero no evita posibles problemas de
desgaste del actuador. Sin embargo, de la simulacin del controlador basado en modelo lineal con
una modificacin del intervalo de muestreo, s se puede lograr una respuesta de control menos
agresiva sin modificacin de los parmetros del controlador, lo que permite suponer que dicha
solucin tiene mejor aplicacin prctica frente a los problemas de oscilacin observados aunque a
142
costa del offset del estado estacionario; para el controlador basado en modelo lineal la restriccin
de las concentraciones de glucosa disponible redujo la frecuencia de oscilacin a 1,4 oscilaciones
por cada hora aproximadamente a 0,02 oscilaciones por hora, se aument el offset de un 12 % a
cerca de un 29 %.
La comparacin del controlador de modelo basado en modelo lineal con su homlogo no lineal
vislumbra una aparente superioridad por parte del controlador lineal para el problema planteado
en la presente tesis. Los resultados obtenidos para el controlador no lineal dejan en evidencia una
gran incidencia del modelo de proceso en la respuesta del controlador lo que correspondera a
un problema de implementacin del controlador y no a una desventaja absoluta del controlador
basado en modelo no lineal frente a su par lineal. El pobre desempeo del modelo de proceso no
lineal utilizado queda al descubierto al hacer la comparacin de ambos controladores basados en
modelo frente a la perturbacin medible del coeficiente de dilucin, variable estipulada en ambos
modelos de proceso.
El pobre desempeo del modelo de proceso no lineal en comparacin al modelo de proceso
lineal sorprende en vista de la gran exactitud con que la red neuronal escogida capta los datos
utilizados para su entrenamiento y validacin (ver Figura 6.39) y ms an al comparar el desempeo
del ajuste del modelo lineal a los datos utilizados para su ajuste (ver Figura 6.24). Sin embargo, es
lo anterior que otorga una alta probabilidad de que ocurri un error de sobre ajuste del modelo no
lineal.
Cabe destacar que existen mltiples factores que inciden en la calidad de la respuesta del controlador basado en modelo no lineal, entre dichos factores estn los parmetros de ajuste del controlador , Q, N p y Nc , los parmetros de construccin de la red neuronal como el intervalo de
muestreo, los datos utilizados para el ajuste de los parmetros de red, la funcin de activacin de la
capa de salida y la arquitectura de la red, y los parmetros propios del controlador como es la funcin objetivo. Si bien la mayora de los parmetros anteriores pueden obtenerse de manera simple
y justificada, el hecho de que exista tal cantidad de parmetros a ajustar aumenta significativamente
las fuentes de error en comparacin con un controlador ms simple como es el controlador proporcional y da cabida para que el controlador basado en modelo no lineal sea un controlador difcil de
ajustar para el caso del problema de regulacin planteado en la presente tesis.
No obstante existe la posibilidad de modificar las metodologas y suposiciones realizadas para
la estimacin de los parmetros del controlador basado en modelo no lineal y lograr resultados
143
diferentes. Ejemplos de lo anterior seran realizar un nuevo ajuste de parmetros de red con la
modificacin de la funcin de activacin de la capa de salida de la red neuronal o utilizar un conjunto diferente de datos con intervalos de muestreo ms largos y/o con una mayor duracin de
los patrones estipulados para que, con la identificacin de sistemas, el modelo de procesos tenga
una precisin enfocada hacia captar el estado estacionario ms que los valores transientes de las
dinmicas incluidas dentro del muestreo.
Por otra parte, los problemas de offset exhibidos producto de una mala implementacin de modelo de proceso permiten suponer que el modelo de proceso del controlador basado en modelo
lineal presentara, con una alta probabilidad, problemas de implementacin a escala industrial. La
prediccin de problemas de implementacin del controlador basado en modelo lineal se debe a
que, si bien las respuestas simuladas utilizan como referencia del proceso real un cultivo celular
simulado por medio del modelo metablico simplificado, que es representativo de datos experimentales provenientes de la literatura, dicho modelo no es exento de errores de ajuste por lo que
podra generarse una propagacin de errores al momento de implementar el controlador basado en
modelo lineal. Sin embargo, sera posible la utilizacin del modelo metablico simplificado para
representar el proceso real como modelo de proceso en un controlador basado en modelo, lo que
factiblemente reducira el error de implementacin del modelo de proceso pues considera todas las
variables de entrada, salida y perturbaciones medibles y no medibles. Ahora bien, la simulacin de
los lazos de control considerando el modelo metablico simplificado como referencia de un cultivo
real permiti estudiar las distintas ventajas y desventajas de los diferentes controladores, as como
los problemas de implementacin que podran existir.
Para el ajuste del parmetro se realizaron los anlisis pertinentes, a travs del clculo y comparacin del ITAE para valores de diferente orden de magnitud cercanos a los ptimos encontrados,
para descartar posibles fuentes de errores de optimizacin producto de la existencia de mnimos locales. Sin embargo, los anlisis realizados solamente sirven como perspectiva de una vecindad del
ptimo encontrado lo que descarta ciertas fuentes de error pero no anulan la probabilidad de la
existencia de un mnimo global del ITAE que difiere del ptimo encontrado.
El anlisis de las respuestas de los diferentes controladores diseados con el lazo de crecimiento
celular cerrado confirma una fuerte incidencia de este ltimo. A pesar de la diferencia clara a nivel
de tiempos de respuesta y de offsets, todos los controladores poseen una respuesta sub-amortiguada
( <1), fcilmente identificable por la existencia de una respuesta oscilatoria. Las altas frecuencia de
144
oscilacin observadas, producto del cierre de todos los lazos de control, permite suponer posibles
problemas de implementacin de cualquiera de los controladores descritos en conjunto con un
control perfecto del crecimiento celular.
Tanto para el controlador proporcional como el basado en modelo lineal se observaron resultados esperables relacionados con la dinmica de la respuesta de control. Para el caso del controlador
proporcional, la comparacin de la respuesta de lazo cerrado para dos ganancias de control diferentes demostr que una mayor ganancia genera una accin de control ms agresiva que repercute
en la oscilacin que presenta la respuesta de control pues si bien se observ una menor amplitud
mxima de oscilacin para el caso de mayor ganancia, ste present un mayor tiempo de estabilizacin producto de una mayor frecuencia de oscilacin. Por otra parte, para el controlador basado
en modelo lineal fue posible apreciar que una reduccin de costo de variacin de la variable manipulable, , genera una mayor frecuencia de oscilacin junto con una disminucin del tiempo de
estabilizacin.
La minimizacin de ITAE fue una eleccin viable al momento de escoger un mtodo matemtica para optimizar la respuesta de control del sistema pero luego del anlisis de los tiempos de
respuesta de los controladores se observa un tramo considerable en que el controlador mantiene
un valor de L/G estable con lo que queda en evidencia la posibilidad de reducir el intervalo de
tiempo utilizado para la minimizacin del ITAE para lograr tiempos de respuesta menores. A pesar de lo anterior, el intervalo de optimizacin se escogi en base a requerimientos experimentales
comunes y por tanto son vlidos para un estudio de comparacin de diferentes controladores.
Ahora bien, el anlisis de las respuestas de lazo cerrado y del criterio de minimizacin del ITAE
tambin permiten suponer que hay una alta probabilidad de que la fuente de tan alta frecuencia
de oscilacin sea producto de la sobre-exigencia al controlador de lograr tiempos de respuesta
acotados, siendo una posible solucin a dicho problema la utilizacin de otras metodologas de
ajuste como el criterio de minimizacin del IAE.
145
Captulo 7
Conclusiones
La complejidad del problema abarcado en la presente tesis posee varias aristas. Por una parte
se encuentra el problema de plantear un modelo matemtico capaz de representar la dinmica de
un cultivo celular bajo diferentes condiciones de cultivo. La tarea de ajustar modelos a curvas
experimentales independientes de las utilizadas originalmente para dichos modelos requiere de la
comprensin del modelo lo que incluye conocer la lnea celular en la cual se bas y las fuentes de
las diferentes cinticas que se recopilan para la construccin del modelo. Encontrar un recopilacin
de cinticas probadas para una misma lnea celular es algo casi imposible por lo que recurrir a
modelos ajustados para diferentes lneas celulares se torna inevitable.
De la simplificacin del modelo inicial, si bien se puede considerar como un enfoque reduccionista del problema que se aborda y que puede provocar prdidas de generalidad, la comprensin de
los criterios tericos asociados permite llegar a buen resultado. En el caso especfico del modelo
simplificado utilizado en la presente tesis, el modelo sin regulacin se valid para los mismos casos
de simulacin que para el modelo inicial y se realizaron los mismos anlisis de estabilidad que culminaron con los mismos resultados. De esta manera puede considerarse que el modelo simplificado
es una fiel representacin del sistema biolgico planteado.
Por otra parte, un modelo metablico de alta complejidad permite analizar el comportamiento
de metabolitos especficos pero, para fines prcticos, como el diseo de controladores, no es un
requerimiento estricto. Un modelo simplificado capaz de relacionar correctamente las variables de
entrada y de salida de un sistema determinado es deseable para el diseo de controladores debido al
significativo ahorro computacional que genera y a que evita problemas de incertidumbre de modelo
que hacen recurrir a modelos de caja negra o generalizaciones burdas.
Los resultados de la simulacin de los cultivos alterados demuestran que el modelo de regula146
cin permiti al modelo metablico captar la respuesta metablica alterada. Los modelos metablicos comnmente se encuentran validados para una nica condicin de operacin lo que requiere
de parmetros dinmicos capaces de adaptarse a diferentes condiciones de cultivo. Esto se pudo
constatar por medio de la estabilidad del sistema frente a perturbaciones en las condiciones de cultivo, el modelo de parmetros estticos planteado inicialmente no fue capaz de alcanzar ms de
un estado estacionario lo que imposibilit la capacidad de retratar la dinmica del fenmeno de la
variacin del estado metablico con un nico juego de parmetros. La correcta interpretacin de
los anlisis del nivel de expresin gnica presentados en [15] permiti suponer que el fenmeno de
regulacin del estado metablico, si bien no es una mutacin gnica del cultivo celular pues posee
es reversible, si puede estar relacionado con una variacin de la concentracin de enzimas. Por otra
parte, los resultados experimentales que revelan la dependencia de la tasa de produccin de lactato
de la concentracin residual de glucosa, sumado a que dicha dependencia es continua, corroboran
experimentalmente que los criterios utilizados para el planteamiento del modelo de regulacin son
vlidos.
De esta manera, se obtuvo como uno de los resultados principales de la presente tesis un modelo metablico capaz de representar la multiplicidad de estados estacionarios del fenmeno de
variacin del estado metablico. La inclusin del modelo de regulacin en el modelo metablico
simplificado permiti representar cualitativamente y cuantitativamente un cultivo celular de estado
metablico alterado, algo indito y de gran utilidad para la simulacin de cultivos celulares animales que presentan variabilidad en sus condiciones de cultivo. La obtencin de un modelo metablico
capaz de simular la respuesta metablica de un cultivo de clulas CHO bajo diferentes condiciones
de cultivo significa adems un importante ahorro en costos asociados a la recopilacin de datos
experimentales y permite estudiar diferentes respuestas simuladas sin la necesidad de un montaje
experimental y personal especializado.
Los principales resultados de las simulaciones de la presente tesis permiten concluir que las
metodologas de ajuste de parmetros, tanto para los modelos metablicos estudiados como para
los controladores diseados, fueron vlidamente escogidos. Los resultados de ajuste obtenidos son
comparables con los marcos tericos establecidos y fueron debidamente corroborados por medio
de estudios estadsticos. Sumado a lo anterior, las metodologas de ajuste presentados en la presente
tesis tambin pueden ser utilizados para ajustar el modelo metablico resultante para simular lneas
celulares animales de diferentes especies, e incluso se puede utilizar el modelo metablico obtenido
147
como base de estudio para otras lneas celulares pues es una fuente asertiva de cinticas enzimticas.
La comparacin de los controladores diseados establecen que el controlador proporcional es
el que mejor se atiene a los criterios de diseo clsicos que integran el tiempo de respuesta y la
capacidad de lograr una estabilizacin dentro de la banda de control establecido en marco al problema de regulacin, as como presentar la robustez necesaria frente a perturbaciones de diferente
magnitud.
El tiempo de respuesta del controlador proporcional fue de cerca de 17 horas mientras que el
controlador basado en modelo lineal no fue capaz de estabilizarse dentro de la banda establecida
con respecto al set point pues posee un offset negativo de un 12 % para una perturbacin de un 10 %
de la tasa mxima de crecimiento celular, . Sin embargo, se observ que el controlador basado en
modelo lineal posee un tiempo de estabilizacin menor al 50 % del tiempo de estabilizacin del
controlador proporcional lo que supone que, de solucionar los problemas de implementacin que
generan offset, el controlador basado en modelo lineal tendra un tiempo de respuesta inferior a las
17 horas del controlador proporcional.
En cuanto a la robustez de los controladores ms destacados, el controlador proporcional mostr
una nula variacin del offset frente a un aumento de magnitud de la perturbacin estudiada mientras
que para el controlador basado en modelo lineal se encontr una relacin lineal, entre la magnitud
de perturbacin y la magnitud del offset, con un coeficiente de correlacin R2 de 0,9902.
De la comparacin de la respuesta de los controladores bajo restricciones factibles se concluye
que el controlador basado en modelo lineal tiene la versatilidad suficiente para adaptarse a posibles
restricciones en la concentracin de glucosa alimentada pues presenta una menor sensibilidad frente a dicha restriccin lo que repercute a nivel de amplitud de oscilacin de la respuesta de control.
Adems, el estudio de factibilidad de un aumento del intervalo de muestreo seala que el controlador basado en modelo puede ser utilizado en conjunto con equipos de medicin que restringen
el intervalo de muestreo a valores al menos 2 veces mayor a la cota mxima aceptable para una
discretizacin del controlador proporcional.
Se puede concluir respecto a las posibles implementaciones de los controladores diseados que
las simulaciones indican una respuesta de control de alta frecuencia de oscilacin producto de la
interaccin de los lazos de control estipulados. Ahora, si bien para el ajuste de los controladores
simulados existe una compensacin entre el tiempo de respuesta y dicha frecuencia de oscilacin,
darle mayor relevancia a una respuesta de menor oscilacin no incurre en tiempos de respuesta
148
fuera de tiempos de cultivo comnmente observados. Por lo tanto, el anlisis del equilibrio entre
el tiempo de respuesta del controlador y la frecuencia de oscilacin que afectar al actuador debe
ser tomado en consideracin y analizado considerando el objetivo operacional del bio-proceso si es
que se implementara uno de los lazos de control descritos en la presente tesis.
De esta manera, se presenta una dualidad en el mbito de la comparacin en donde se pueden
valorar los resultados simulados y su atenencia a los criterios de diseo o la versatilidad requerida
para solucionar los posibles problemas de implementacin que podran existir. En vista de la existencia de la anterior dualidad se considera como resultado favorable el grado de implementacin
del controlador por lo que el controlador basado en modelo lineal sera la mejor opcin frente al
problema especfico de la regulacin del estado metablico de cultivos celulares animales.
Adems de los resultados de la comparacin de los controladores proporcional y basado en
modelo lineal, el mal rendimiento del controlador basado en modelo no lineal mostr fuertes indicadores de los problemas que puede traer una mala implentacin del controlador basado en modelo.
La dependencia de la prediccin de una representacin del proceso a controlar otorga gran importancia a la eleccin de dicha representacin pues el grado de representatividad afectar directamente
el desempeo global del controlador. Por otra parte, puede considerarse inesperado el mal rendimiento del controlador basado en modelo no lineal debido a que se ajusta con un coeficiente R2
sobre 0,99, que es un 50 % superior a lo observado para el controlador basado en modelo lineal.
An as, el ITAE mnimo para la respuesta de lazo cerrado del controlador basado en modelo lineal
es 20, un 13,78 % del valor del ITAE mnimo obtenido para la respuesta de lazo cerrado del controlador basado en modelo no lineal. Son los factores anteriores los que permiten suponer que es muy
factible que el pobre desempeo del controlador basado en modelo no lineal se debe a un error de
generalizacin del modelo de proceso.
Posibles mejoras de los resultados expuestos seran por medio de la modificacin de algunas
metodologas de ajuste, especficamente para el ajuste de los parmetros de los controladores simulados. Si bien las metodologas escogidas fueron adecuadas para el fin de simular y analizar las
respuestas de control, sera posible obtener leves mejoras en los tiempos de estabilizacin de los
controladores de usarse un intervalo ms acotado para la minimizacin del ITAE.
Como recomendacin de lnea de trabajo futuro sera la resolucin de los problemas de rendimiento de los controladores basados en modelos. Por una parte, la solucin de los problemas de
offset que presenta el controlador basado en modelo lineal es algo que podra resolverse conside149
rando un adecuado anlisis del problema y los factores que inciden en ella, antecedentes que han
sido parcialmente expuestos en la presente tesis. Por otra parte, los problemas de rendimiento del
controlador basado en modelo no lineal podran requerir de la construccin de un nuevo modelo de
proceso utilizando un conjunto de datos de entrenamiento de mayor envergadura para poder abarcar
un espectro mayor de condiciones de operacin y su efecto sobre la razn L/G.
150
Glosario
Abreviaciones de enzimas
6PGD: 6-fosfogluconato deshidrogenasa
A: Sistema A de transporte de aminocidos
ACON: Aconitasa
ALDO: Aldolasa
ASC: Sistema ASC de transporte de aminocidos
ATA: Alanina Transaminasa
BSL(N): Biosntesis de lpidos (nucletidos)
CS: Citrato sintasa
EN: Enolasa
EP: Ribulosa fosfato epimerasa
FUMH: Fumarasa
G6PD: Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
GlcTr: Transportador de glucosa
GPI: Gliceraldehido fosfato isomerasa
GSHOX: Oxidacin de glutationa
GSSGR: Glutationa reductasa
HK: Hexoquinasa
IDH: Isocitrato deshidrogenasa
KGDH: -ketoglutarato deshidrogenasa
L: Sistema L de trasporte de aminocidos
LDH: Lactato deshidrogenasa
151
MCT: Transportador monocarboxilato

MDH: Malato deshidrogenasa
N: Transportador neutral de aminocidos
PDHC: Complejo piruvato deshidrogenasa
PFK: Fosfofructoquinasa
PGI: Glucosa 6-fosfato isomerasa
PGK: Fosfoglicerato quinasa
PGM: Fosfoglicerato mutasa
PK: Piruvato quinasa
PRPPS: Fosforibolosilpirofosfato sintetasa
RN: Regeneracin de NAD
RPI: Ribosa fosfato isomerasa
SCS: Succinil CoA Sintetasa
SDH: Succinato deshidrogenasa
TA: Transaldolasa
TCT: Transportador de tricarboxilato
TK1: Tranketolasa 1
TK2: Transketolasa 2
TPI: Triosefosfato Isomerasa
X: Sistema cido X de transporte de aminocidos
Y: Sistema bsico Y+ de transporte de aminocidos
Abreviaciones para especies

1,3P2G: 1,3-bifosfoglicerato
2,3P2G: 2,3-bifosfoglicerato
2PG: 2-fosfoglicerato
3PG: 3-fosfoglicerato
6PGlcL: 6-fosfoglucono-lactona
152
KG: -ketoglutarato
AC: Acetato
AcCoA: Acetyl coenzima A
AcLipAH: Acetil lipoato coenzima A
Acon: Aconitato
ADP: Adenosina difosfato
ALA: Alanina
ALDE: Aldehido
AMP: Adenosina monofosfato
ARG: Arginina
ASN: Asparagina
ASP: cido asprtico
ATP: Adenosina trifosfato
BPG: bi-fosfoglicerato
CIT: Citrato
CO2 : Dixido de carbono
CoA: Coenzima A
CYS: Cistena
DHAP: Dihidroxiacetona-fosfato
E4P: Eritrosa 4-fosfato
ETOH: Etanol
F6P: Fructosa 6-fosfato
FAD(H): Flavina adenina dinucletido (reduced)
FBP: Fructosa bifosfato
FUM: Fumarato
G3P: Glicerol 3-fosfato
G6P: Glucosa 6-fosfato
GAP: Gliceraldehdo 3-fosfato
153
GBP: Glucosa 1,6-bifosfato

GLC: Glucosa
GLN: Glutamina
GLU: cido glutmico
GLY: Glicina
Glyc: Glicerol
GSH(GSSG): Red(ox) glutationa
H+ Protn
HIS: Histidina
ICIT: Isocitrato
ILE: Isoleucina
LAC: Lactato
LEU: Leucina
LipA(H): Lipoato coenzima A (forma reducida)
LYS: Lisina
Mal: Malato
MET: Metionina
Mg: Magnesio
NAD(P): Nicotinamida adenina dinuletido (fosfato)
NAD(P)H: Nicotinamida adenina dinuletido (fosfato), forma reducida
O2 : Oxgeno
OAA: Oxaloacetato
Pi : Fosfato
PEP: Fosfoenol piruvato
PHE: Fenilalanina
PRO: Prolina
PRPP: Fosforibosil pirofosfato
PYR: Piruvato
154
R5P: Ribosa 5-fosfato

Ru5P: Ribulosa 5-fosfato
SER: Serina
SH7P: Sedoheptulosa 7-fosfato
SUC: Succinato
SCoA: Succinil coenzima A
THR: Treonina
TPP(H): Tiamina pirofosfato (forma reducida)
TRP: Triptofan
TYR: Tirosina
VAL: Valina
Xyl5P: Xilulosa 5-fosfato
155
Referencias
[1] B. T. P. Practice, Bio - biotechnology industry organization, in Technology, talent and
capital: State bioscience initiatives 2008, 2008.
[2] K. Aggarwal, F. Jing, L. Maranga, and J. Liu, Bioprocess optimization for cell culture based
influenza vaccineproduction, Vaccine, vol. 29, pp. 33203328, 2011.
[3] C. Conesa, M. Calvo, and L. Snchez, Recombinant human lactoferrin: A valuable protein
for pharmaceuticalproducts and functional foods, Biotechnol. Adv., vol. 28, pp. 831838,
2010.
[4] J. Gao, V. M. Gorenflo, J. M. Scharer, and H. M. Budman, Dynamic metabolic modeling
for a mab bioprocess., Biotechnol. Prog., vol. 23, no. 1, pp. 168181, 2007.
[5] R. Harun, M. Singh, G. M. Forde, and M. K. D. and, Bioprocess engineering of microalgae
to produce a variety of consumer products, Renew. Sust. Energ. Rev., vol. 14, pp. 1037
1047, 2010.
[6] A. Provost, G. Bastin, S. N. Agathos, and Y. Schneider, Metabolic design of macroscopic
bioreaction models: application to chinese hamster ovary cells, Bioprocess Biosyst. Eng.,
vol. 29, pp. 349366, 2006.
[7] C.-F. Mandenius and A. Brundin, Bioprocess optimization using design-of-experiments
methodology, Biotechnol. Progr., vol. 24(6), pp. 11911203, 2008.
[8] J. Strnad, M. Brinc, V. Spudic, N. Jelnikar, L. Mirnik, B. Carman, and Z. Kravanja, Optimization of cultivation conditions in spin tubes for cho cells producing erythropoietin,
Computer Aided Chemical Engineering, vol. 28, pp. 235240, 2010.
[9] W. Zhou and W. Hu, On-line characterization of a hybridoma cell culture process., Biotechnol. Bioeng., vol. 44, pp. 170177, Jun 1994.
156
[10] S. J. Qin and T. A. Badgwell, A survey of industrial model predictive control technology,
Control Eng. Pract., vol. 11, pp. 733764, 2003.
[11] NC-ICBMB and E. C. Webb, eds., Nomenclature 1992: Recomendations of the NCIUBMB
on the nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, 1992.
[12] A. Gambhir, R. Korke, J. Lee, P.-C. Fu, A. Europa, and W.-S. Hu, Analysis of cellular
metabolism of hybridoma cells at distinct physiological states., J. Biosci. Bioeng., vol. 95,
no. 4, pp. 317327, 2003.
[13] H. J. Cruz, J. L. Moreira, and M. J. Carrondo, Metabolic shifts by nutrient manipulation in
continuous cultures of bhk cells., Biotechnol. Bioeng., vol. 66, no. 2, pp. 104113, 1999.
[14] H. R. Zielke, P. T. Ozand, J. T. Tildon, D. A. Sevdalian, and M. Cornblath, Reciprocal
regulation of glucose and glutamine utilization by cultured human diploid fibroblasts., J
Cell Physiol, vol. 95, pp. 4148, Apr 1978.
[15] R. Korke, M. de Leon Gatti, A. L. Y. Lau, J. W. E. Lim, T. K. Seow, M. C. M. Chung, and
W.-S. Hu, Large scale gene expression profiling of metabolic shift of mammalian cells in
culture., J. Biotechnol., vol. 107, pp. 117, Jan 2004.
[16] C. Kontoravdi, D. Wong, C. Lam, Y. Lea, M. Yap, E. Pistikopoulos, and A. Mantalaris,
Modeling amino acid metabolism in mammalian cells - toward the development of a model
library, Biotechnol. Prog., vol. 23, pp. 12611269, 2007.
[17] C. Mechiorsen, N. Jensen, B. Christensen, K. Vaever Jokumsen, and J. Villadsen, Dynamics
of pyruvate metabolism in lactococcus lactis, Biotechnol Bioeng, vol. 74, pp. 271279,
2001.
[18] R. P. Nolan and K. Lee, Dynamic model of cho cell metabolism, Metabolic Engineering,
vol. 13, pp. 108124, 2011.
[19] A. Provost and G. Bastin, Dynamic metabolic modelling under the balanced growth condition, Journal of Process Control, vol. 14, pp. 717728, 2004.
[20] M. J. Herrgard, N. Swainston, P. Dobson, W. B. Dunn, K. Y. Arga, M. Arvas, N. Blthgen,
S. Borger, R. Costenoble, M. Heinemann, M. Hucka, N. L. Novre, P. Li, W. Liebermeister,
157
M. L. Mo, A. P. Oliveira, D. Petranovic, S. Pettifer, E. Simeonidis, K. Smallbone, I. Spasic,

D. Weichart, R. Brent, D. S. Broomhead, H. V. Westerhoff, B. Kirdar, M. Penttil, E. Klipp,
B. o Palsson, U. Sauer, S. G. Oliver, P. Mendes, J. Nielsen, and D. B. Kell, A consensus
yeast metabolic network reconstruction obtained from a community approach to systems
biology, Nat. Biotechnol., vol. 26(10), pp. 11551160, 2008.
[21] Z. P. Gerdtzen, Modeling, analysis and theoretical exploration of the metabolism of mammalian cells in culture. PhD thesis, Department of Chemical Engineering and Materials
Science, University of Minnesota, 2005.
[22] S. Cha, A simple method for derivation of rate equations for enzyme-catalyzed reactions
under the rapid equilibrium assumption or combined assumptions of equilibrium and steady
state., J. Biol. Chem., vol. 243, pp. 820825, Feb 1968.
[23] L. Michaelis and M. Menten, Kinetik der invertinwirkung, Biochem. Z., vol. 49, pp. 333
369, 1913.
[24] H. R. Zielke, C. L. Zielke, and P. T. Ozand, Glutamine: a major energy source for cultured
mammalian cells., Fed Proc, vol. 43, pp. 121125, Jan 1984.
[25] A. F. Europa, A. Gambhir, P. C. Fu, and W. S. Hu, Multiple steady states with distinct
cellular metabolism in continuous culture of mammalian cells., Biotechnol. Bioeng., vol. 67,
pp. 2534, Jan 2000.
[26] W. Hu, Cellular Bioprocess Technology. University of Minnesota, 2009.
[27] P. J. Mulquiney and P. W. Kuchel, Model of 2,3-biphosphoglycerate metabolism in the
human erythrocyte based on detailed enzyme kinetic equations: equations and parameter
refinement, Biochem. J., vol. 342, pp. 581596, 1999.
[28] M. Schauer, R. Heinrich, and S. Rapoport, Mathematical modelling of glycolysis and adenine nucleotide metabolism of human erythrocytes. i. reaction-kinetic statements, analysis
of in vivo state and determination of starting conditions for in vitro experiments, Acta. Biol.
Med. Ger., vol. 40(12), pp. 16591682, 1981.
158
[29] M. Otto, R. Heinrich, B. Khn, and G. Jacobasch, A mathematical model for the influence
of fructose 6-phosphate, atp, potassium, ammonium and magnesium on the phosphofructokinase from rat erythrocytes, Eur. J. Biochem., vol. 49(1), pp. 169178, 1974.
[30] H.-G. Holzhtter, G. Jacobasch, and A. Bisdorff, Mathematical modelling of metabolic
pathways affected by an enzyme deficiency, Eur. J. Biochem., vol. 149(1), pp. 101111,
1985.
[31] D. R. Thorburn and P. W. Kuchel, Regulation of the human-erythrocyte hexosemonophosphate shunt under conditions of oxidative stress, Eur. J. Biochem., vol. 150(2),
pp. 371386, 1985.
[32] J. C. Lagarias, J. A. Reeds, M. H. Wright, and P. E. Wright, Convergence properties of the
nelder-mead simplex method in low dimensions, Siam. J. Optim., vol. 9, pp. 112147, 1998.
[33] H. A. David and J. L. Gunnink, The paired t test under artificial pairing, Am. Stat.,
vol. 51(1), pp. 912, 1997.
[34] R. A. Fisher, J. H. Bennett, and F. Yates, Statistical methods, experimental design, and scientific inference: A re-issue of statistical methods for research workers, the design of experiments, and statistical methods And scientific inference. Oxford University Press, 1990.
[35] C. A. Wilkens, Anlisis comparativo del metabolismo de lactato para clulas cho en glucosa
y galactosa, Masters thesis, Universidad de Chile, 2011.
[36] A. Carruthers, J. DeZutter, A. Ganguly, and S. U. Devaskar, Will the original glucose transporter isoform please stand up!, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., vol. 297, pp. E836
E848, 2009.
[37] M. J. Lambeth and M. J. Kushmerick, A computational model for glycogenolysis in skeletal
muscle, Annals of Biomedical Engineering, vol. 30, pp. 808827, 2002.
[38] R. C. Poole and A. P. Halestrap, Transport of lactate and other monocarboxylates across
mammalian plasma membranes, Am. J. Physiol. Cell Physiol., vol. 264, pp. C761C782,
1993.
159
[39] H. Katagiri, T. Asano, H. Ishihara, K. Tsukuda, J. L. Lin, K. Inukai, M. Kikuchi, Y. Yazaki,

and Y. Oka, Replacement of intracellular c-terminal domain of glut1 glucose transporter
with that of glut2 increases vmax and km of transport activity., J. Biol. Chem., vol. 267,
pp. 2255022555, Nov 1992.
[40] E. Wertheimer, S. Sasson, E. Cerasi, and Y. Ben-Neriah, The ubiquitous glucose transporter
glut-1 belongs to the glucose-regulated protein family of stress-inducible proteins., Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 88, pp. 25252529, Mar 1991.
[41] J. Lee, Manipulation of mammalian cell metabolism via process control and genetic engineering. PhD thesis, Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of
Minnesota, 2005.
[42] U. Alon, An introduction to systems biology: Design principles of biological circuits. Chapman & Hall/CRC, 2007.
[43] J. Neermann and R. Wagner, Comparative analysis of glucose and glutamine metabolism in
transformed mammalian cell lines, insect and primary liver cells, J. Cell. Phys., vol. 166(1),
pp. 152169, 1996.
[44] G. Ackers, A. Johnson, and M. Shea, Quantitative model for gene regulation by lambda
phage repressor, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 79, pp. 1129113, 1982.
[45] T. Akutsu, S. Miyano, and S. Kuhara, Identification of genetic networks from a small number of gene expression patterns under the boolean network model, in Pacific Symposium on
Biocomputing, 1999.
[46] T. Akutsu, S. Miyano, and S. Kuhara, Inferring qualitative relations in genetic networks and
metabolic pathways, Bioinformatics, vol. 16, pp. 727734, 2000.
[47] T. Chen, H. He, and G. Church, Modeling gene expression with equations, in Pacific Symposium on Biocomputing, 1999.
[48] K. Y. Rani and V. R. Rao, Control of fermenters - a review, Bioprocess Eng., vol. 21,
pp. 7788, 1999.
160
[49] P. B. Sistu and B. W. Bequette, A comparison of nonlinear control techniques for continuous
stirred tank reactors, Chem. Eng. Sci., vol. 47, pp. 25532558, 1992.
[50] S. Zulkeflee and N. Aziz, Control implementation in bioprocess system: A review, in Internation Conference on Control, Instrumentation and Mechatronics Engineering, 2007.
[51] B. A. Ogunnaike and W. H. Ray, Process dynamics, modeling, and control. Oxford University Press, USA, 1994.
[52] G. Stephanopoulos, Chemical process control: An introduction to theory and practice. Prent,
1984.
[53] M. A. Henson and D. E. Seborg, Nonlinear control strategies for continuous fermenters,
Chem. Eng. Sci., vol. 47(4), pp. 821835, 1992.
[54] M. A. Henson, Nonlinear model predictive control: current status and future directions,
Comput. Chem. Eng., vol. 23, pp. 187202, 1998.
[55] G.-Y. Zhu, A. Zamamiri, M. A. Henson, and M. A. Hjortso, Model predictive control of
continuous yeast bioreactors using cell population balance models, Chem. Eng. Sci., vol. 55,
pp. 61556167, 2000.
[56] S. Ramaswamy, T. J. Cutright, and H. K. Qammar, Control of a continuous bioreactor using
model predictive control, Process Biochem., vol. 40, pp. 27632770, 2005.
[57] J. Bartee, P. Noll, C. Axelrud, C. Schweiger, and B. Sayyar-Rodsari, Industrial application
of nonlinear model predictive control technology for fuel ethanol fermentation process, in
American control conference, 2009.
[58] D. Dochain and G. Bastin, Adaptive identification and control algorithms for nonlinear
bacterial growth systems, Auto, vol. 20, pp. 621634, 1984.
[59] T. Takagi and M. Sugeno, Fuzzy identification of systems and its applications to modeling
and contol, vol. 15, pp. 01000116, 1985.
[60] S. Soyguder, M. Karakose, and H. Alli, Design and simulation of self-tuning pid-type fuzzy
adaptive control for an expert hvac system, Expert Syst. Appl., vol. 36, pp. 45664573, 2009.
161
[61] P. Scherer, K. Lehmann, O. Schmidt, and B. Demirel, Application of a fuzzy logic control
system for continuous anaerobic digestion of low buffered, acidic energy crops as monosubstrate, Biotechnol. Bioeng., vol. 102, pp. 736748, 2009.
[62] M. J. Fuente, C. Robles, O. Casado, S. Syafiie, and F. Tadeo, Fuzzy control of a neutralization pro, Eng. Appl. Artif. Intel., vol. 19, pp. 905914, 2006.
[63] D. Q. Mayne, J. B. Rawlings, C. V. Rao, and P. O. M. Scokaert, Constrained model predictive control: Stability and optimality, Autom, vol. 36, pp. 789814, 2000.
[64] D. Sendrescu, D. Popescu, E. Petre, E. Bobasu, and D. Selisteanu, Nonlinear model predictive control of a lipase production bioprocess, in Carpathian Control Conference (ICCC),
2011 12th International, 2011.
[65] A. Ashoori, B. Moshiri, A. Khaki-Sedigh, and M. R. Bakhtiari, Optimal control of a nonlinear fed-batch fermentation process using model predictive approach, Journal of Process
Control, vol. 19, pp. 11621173, 2009.
[66] A. U. M. Kiran and A. K. Jana, Control of continuous fed-batch fermentation process
using neural network based model predictive controller, Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 32,
pp. 801808, 2009.
[67] H. Peng, T. Ozaki, Y. Toyoda, H. Shioya, K. Nakano, V. Haggan-Ozaki, and M. Mori, Rbfarx model-based nonlinear system modeling and predictive control with application to a nox
decomposition process, Control Eng. Pract., vol. 12, no. 2, pp. 191203, 2004.
[68] M. A.-H. Ali, B. Betlem, G. Weickert, and B. Roffel, Non-linear model based control of a
propylene polymerization reactor, Chem. Eng. Process., vol. 46, no. 6, pp. 554564, 2007.
[69] J. S. Almeida, Predictive non-linear modeling of complex data by artificial neural networks, Curr. Opin. Biotech., vol. 13, pp. 7276, 2002.
[70] J. C. Atuonwu, Y. Cao, G. P. Rangaiah, and M. O. Tad, Identification and predictive control
of a multistage evaporator, Control Eng. Pract., vol. 18, pp. 14181428, 2010.
[71] K. R. Muske and J. B. Rawlings, Model predictive control with linear models, AICHe J.,
vol. 39, pp. 262287, 1993.
162
[72] J. K. Huusom, N. K. Poulsen, S. B. Jrgensen, and J. B. Jrgensen, 20th European Symposium on Computer Aided Process Engineering. Elsevier, 2010.
[73] J. Yu, A. Jadbabaie, J. Primbs, and Y. Huang, Comparison of nonlinear control design
techniques on a model of the caltech ducted fan, Automatica, vol. 37, pp. 19711978, 2001.
[74] K. Kristinsson and G. A. Dumont, System identification and control using genetic algorithms, IEEE T. Syst. Man Cyb., vol. 22(5), pp. 10331046, 1992.
[75] S. Chen, S. Billings, and P. Grant, Non-linear system identification using neural networks,
Int. J. Control, vol. 51(6), pp. 11911214, 1990.
[76] A. Rahrooh and S. Shepard, Identification of nonlinear systems using narmax model, Nonlinear Anal-Theor., vol. 71(12), pp. e1198e1202, 2009.
[77] J. I. Garriga and M. Soroush, Model predictive control tuning methods: A review, Ind.
Eng. Chem. Res., vol. 49, pp. 35053515, 2010.
[78] A. R. McIntosh, S. L. Shah, and D. G. Fisher, Analysis and tuning of adaptive generalized
predictive control, Can. J. Chem. Eng., vol. 69, pp. 97110, 1991.
[79] K. Y. Rani and H. Unbehauen, Study of predictive controller tuning methods, Automatica,
vol. 33, pp. 22432248, 1997.
[80] P. Banerjee and S. L. Shah, Tuning guidelines for robust generalized predictive control, in
Proceedings of the 31st IEEE conference on decision and control, 1992.
[81] D. W. Clarke, C. Mohtadi, and P. S. Tuffs, Generalized predictive control - part ii. extensions
and interpretations, Automatica, vol. 23, pp. 149160, 1987.
[82] D. W. Clarke and C. Mohtadi, Properties of generalized predictive control, Automatica,
vol. 25, pp. 859875, 1989.
[83] J. Nocedal and S. J. Wright, Numerical optimization. Springer, 1999.
[84] L. A. Alves, J. B. A. e Silva, and M. Giulietti, Solubility of d-glucose in water and ethanol/water mixtures, J. Chem. Eng. Data, vol. 52, pp. 21662170, 2007.
163
[85] B. L. Widjiantoro, T. H. Liong, Y. Y. Nazaruddin, and B. Spa, Lolimot based model predictive control, Jurnal Teknologi, vol. 17(1), pp. 3744, 2003.
[86] J. H. Prez-Cruz, A. Y. Alanis, J. de Jess Rubio, and J. Pacheco, System identification
using multilayer differential neural networks: A new result, Journal of Applied Mathematics, vol. 2012, pp. 120, 2012.
[87] S. Pich, B. Sayyar-Rodsari, D. Johnson, and M. Gerules, Nonlinear model predictive control using neural networks, IEEE Contr. Syst. Mag., vol. 20, pp. 5362, 2000.
[88] S. Curteanu, F. Leon, R. Furtuna, E. N. Dragoi, and Nec, Comparison between different
methods for developing neural network topology applied to a complex polymerization process, in The 2010 International Joint Conference on Neural Networks (IJCNN), 2010.
[89] W.-X. Zhao, H.-F. Chen, and W. X. Zheng, Recursive identification for nonlinear arx systems based on stochastic approximation algorithm, IEEE T. Automat. Contr., vol. 55(6),
pp. 12871299, 2010.
[90] J. S.-H. Tsai, C.-T. Wanga, S.-M. G. Chi-Chieh Kuang a, L.-S. Shieh, and C.-W. Chen, A
narmax model-based state-space self-tuning control for nonlinear stochastic hybrid systems,
Appl. Math. Model., vol. 34, pp. 30303054, 2010.
[91] J. Winkler, Non-linear model-based control of the czochralski process i: Motivation, modeling and feedback controller design, J. Cryst. Growth, vol. 312, pp. 10051018, 2010.
[92] T. K. Radhakrishnan, S. Sundaram, and M. Chidambaran, Non-linear control of continuous
bioreactors, Bioprocess E, vol. 20, pp. 173178, 1999.
[93] Z. K. Nagy, Model based control of a yeast fermentation bioreactor using optimally designed artificial neural networks, Chem. Eng. J., vol. 127, pp. 95109, 2007.
[94] D. Hu, H. Liub, C. Yangb, and E. Hua, The design and optimization for light-algae bioreactor controller based on artificial neural network-model predictive control, Acta Astronaut.,
vol. 63, pp. 10671075, 2008.
[95] R. Furtuna, S. Curteanu, and M. Cazacu, Optimization methodology applied to feedforward artificial neural network parameters, Int. J. Quantum Chem., vol. 111, pp. 539553,
2011.
164
[96] M. T. Hagan and M. B. Menhaj, Training feedforward networks with the marquardt algorithm, IEEE T. Neural Networ., vol. 5, pp. 989993, 1994.
[97] K. S. Narendra, Gradient methods for the optimization of dynamical systems containing
neural networks, IEEE T. Neural Networ., vol. 2, pp. 252262, 1991.
[98] B. M. Wilamowski, Neural network architectures and learning algorithms: How not to be
frustrated with neural networks, IEEE In, vol. 12, pp. 5663, 2009.
[99] R. E. Kalman and J. E. Bertram, General synthesis procedure for computer control of singleloop and multi-loop systems, AIEE Trans., vol. 77 (part 2), p. 602, 1958.
[100] A. Kotyk and A. Kleinzeller, Affinity of the yeast membrane carrier for glucose and its role
in the pasteur effect, Biochim. Biophys. Acta., vol. 135(1), pp. 106111, 1967.
[101] G. I. Bell, C. F. Burant, J. Takeda, and G. W. Gould, Structure and function of mammalian
facilitative sugar transporters., J. Biol. Chem., vol. 268, pp. 1916119164, Sep 1993.
[102] G. Gerber, H. Preissler, R. Heinrich, and S. M. Rapoport, Hexokinase of human erythrocytes, Eur. J. Biochem., vol. 45(1), pp. 3952, 1974.
[103] L. M. McIntyre, D. R. Thorburn, W. A. Bubb, and P. W. Kuchel, Comparison of computer
simulations of the f-type and l-type non-oxidative hexose monophosphate shunts with 31pnmr experimental data from human erythrocytes, Eur. J. Biochem., vol. 180(2), pp. 399
420, 1989.
[104] G. Hammes and P. Schimmel, Rapid reactions and transient states. Academi, 1970.
[105] M. Dixon, Enzymes. Academic Press, 1979.
[106] A. Fersht, Enzyme structure and mechanism. W. H. Freeman and Company, 1985.
[107] G.-G. Chang, S.-M. Huang, and S.-H. Chiou, Kineticmechanism of the endogenous lactate
dehydrogenase activity of duck epsilon-crystallin, Arch. Biochem. Biophys., vol. 284(2),
pp. 285291, 1991.
[108] R. Denton and A. Halestrap, Regulation of pyruvate metabolism in mammalian tissues,
Essays Biochem., vol. 15, pp. 3777, 1979.
165
[109] F. Palmieri, F. Bisaccia, L. Capobianco, V. Dolce, G. Fiermonte, V. Lacobazzi, C. Indiveri,

and P. L., Mitochondrial metabolite transporters, Biochem. Biophy. Acta., vol. 1275(1-2),
pp. 127132, 1996.
[110] J. C. W. Hildyard and A. P. Halestrap, Identification of the mitochondrial pyruvate carrier
in saccharomyces cerevisiae, Biochem. J., vol. 374(Pt 3), pp. 607611, 2003.
[111] X. Wang, A. J. Levi, and A. P. Halestrap, Substrate and inhibitor specificities of the monocarboxylate transporters of single rat heart cells, Am. J. Physiol., vol. 47(10), pp. H476484,
1996.
[112] T. Wood, The pentose phosphate pathway. Academic Press, 1985.
[113] H. Inui, K. Miyatake, Y. Nakano, and S. Kitaoka, Pyruvate: Nadp+oxidoreductase from euglena gracilis: The kinetic properties of the enzyme, Arch. Biochem. Biophys., vol. 274(2),
pp. 434442, 1989.
[114] S. Liu, X. Gong, X. Yan, T. Peng, J. C. Baker, L. Li, P. M. Robben, S. Ravindran, L. A. Andersson, A. B. Cole, and T. E. Roche, Reaction mechanism for mammalian pyruvate dehydrogenase using natural lipoyl domain substrates, Arch. Biochem. Biophys., vol. 386(2),
pp. 123135, 2001.
[115] A.-P. Zeng, J. Modak, and W.-D. Deckwer, Nonlinear dynamics of eucaryotic pyruvate
dehydrogenase multienzyme complex: Decarboxylation rate, oscillations, and multiplicity,
Biotechnol. Prog., vol. 18(6), pp. 12651276, 2002.
[116] S. Cortassa, M. A. Aon, E. Marbn, R. L. Winslow, and B. ORourke, An integrated model
of cardiac mitochondrial energy metabolism and calcium dynamics, Biophys. J., vol. 84(4),
pp. 27342755, 2003.
166
Apndices
A.
Ecuaciones de balances de masa utilizadas para el modelo

metablico de una clula animal en cultivo [21]
A .1.
Gliclisis
Concentracin de glucosa citoplasmtica

c
dCGLC
= r perm rHK
dt
(7.1)
Concentracin de glucosa 6-fosfato citoplasmtica

c
dCG6P
= rHK rPGI rG6PD
dt
(7.2)
Concentracin de fructosa 6-fosfato citoplasmtica

c
dCF6P
= rPGI rPFK + rTA + rT K2
dt
(7.3)
Concentracin de fructosa 1,6-bifosfato citoplasmtica

c
dCFBP
= rPFK rALD
dt
(7.4)
Concentracin de dihdroxiacetona fosfato citoplasmtica

c
dCDHAP
0, 02
= rALD rT PI CLipidos (Vcitoplasma +Vmitocondria )
dt
5
(7.5)
Concentracin de gliceraldehdo 3-fosfato citoplasmtico

c
dCGAP
= rALD + rT PI rGAPD + rT K1 rTA + rT K2
dt
167
(7.6)
Concentracin de 1,3-bifosfoglicerato citoplasmtico

c
dC13P2G
= rGAPD rPGK
dt
(7.7)
Concentracin de 3-fosfoglicerato citoplasmtico

c
dC3PG
0, 02
= rPGK rPGM CLipidos (Vcitoplasma +Vmitocondria )
dt
5
(7.8)
Concentracin de 2-fosfoglicerato citoplasmtico

c
dC2PG
= rPGM rEN
dt
(7.9)
Concentracin de fosfoenol piruvato citoplasmtico

c
dCPEP
= rEN rPK
dt
(7.10)
Concentracin de adenosin trifosfato citoplasmtico

c
dCAT
P
=0
dt
(7.11)
Concentracin de adenosin monofosfato citoplasmtico

c
dCAMP
=0
dt
(7.12)
Concentracin de piruvato citoplasmtico

c
dCPY
R
= rPK rLDH rTCT
dt
(7.13)
Concentracin de lactato citoplasmtico

c
dCLAC
= rLDH rMCT
dt
(7.14)
Concentracin de nicotinamida adenin dinucleotido (fosfato)

c
dCNAD
c
= rLDH rGAPD + 1000CNADH
dt
168
(7.15)
Concentracin de lactato extra-celular

c
dCLAC
= CxRrMCT
dt
A .2.
(7.16)
Pentosa fosfato
Concentracin de 6-fosfogluconato citoplasmtico

c
dC6GP
= rG6PD r6PGD
dt
(7.17)
Concentracin de nicotinamida adenina dinucleotido (fosfato) citoplasmtico

c
dCNADP
=0
dt
(7.18)
Concentracin de glutatin red(ox) citoplasmtico

c
dCGSH
= rGSSGR rGSHOX
dt
(7.19)
Concentracin de ribulosa 5-fosfato citoplasmtico

c
dCRU5P
= r6GPD rEP rRPI
dt
(7.20)
Concentracin de xilulosa 5-fosfato citoplasmtico

c
dCXY
L5P
= rEP rT K1 rT K2
dt
(7.21)
Concentracin de ribosa 5-fosfato citoplasmtico

c
dCR5P
= rRPI rEP rT K1 0.02CNucleotidos (Vcitoplasma +Vmitocondria )
dt
(7.22)
Concentracin de sedoheptulosa 7-fosfato citoplasmtico

c
dCSH7P
= rT K1 rTA
dt
(7.23)
Concentracin de eritrosa 4-fosfato citoplasmtico

c
dCE4P
= rTA rT K2
dt
169
(7.24)
A .3.
Ciclo TCA
Concentracin de piruvato mitocondrial

m
Vcitoplasma
dCPY
R
=
rTCT rPDHC rATA + rSER
dt
Vmitocondria
(7.25)
Concentracin de acetil CoA mitocondrial

m
dCACCOA
0, 06
= rPDHC rCS CLipidos (Vcitoplasma +Vmitocondria )
+ rLY S + rLEU
dt
5
(7.26)
Concentracin de isocitrato mitocondrial

m
dCICIT
= rACON rIDH
dt
(7.27)
Concentracin de alfa-ketoglutarato mitocondrial

m
dCKG
= rIDH rKGDH + rATA + rGLU + rGLN + rARG
dt
(7.28)
Concentracin de succinil coenzima A mitocondrial

m
dCSCOA
= rKGDH rSCS + rT HR
dt
(7.29)
Concentracin de succinato mitocondrial

m
dCSUC
= rSCS rSDH
dt
(7.30)
Concentracin de flavina adenina dinucletido reducida

dCFADH
=0
dt
(7.31)
Concentracin de fumarato mitocondrial

m
dCFUM
= rSDH rFUMH
dt
(7.32)
Concentracin de malato mitocondrial

m
dCMAL
= rFUMH rMDH
dt
170
(7.33)
Concentracin de oaxaloacetato mitocondrial

m
dCOAA
= rMDH rCS + rASN + rASP
dt
A .4.
(7.34)
Transporte y metabolismo de amino cidos
Concentracin de serina citoplasmtica

c
dCSER
Vcitoplasma A
Vcitoplasma ASC
=
rSER +
r
rSER
dt
Vmitocondria
Vmitocondria SER
(7.35)
Concentracin de alanina citoplasmtica

c
Vcitoplasma A
Vcitoplasma ASC
dCALA
=
rALA +
r
rATA
dt
Vmitocondria
Vmitocondria ALA
(7.36)
Concentracin de glutamina citoplasmtica

c
dCGLN
Vcitoplasma A
Vcitoplasma ASC Vcitoplasma N
Vcitoplasma L
=
rGLN +
rGLN +
rGLN +
r
rGLN rATA
dt
Vmitocondria
Vmitocondria
Vmitocondria
Vmitocondria GLN
(7.37)
Concentracin de threonina citoplasmtica

Vcitoplasma ASC
dCTc HR
=
r
rT HR
dt
Vmitocondria T HR
(7.38)
Concentracin de asparagina citoplasmtica

c
dCASN
Vcitoplasma N
rASN
=
r
dt
Vmitocondria ASN
(7.39)
Concentracin de leucina citoplasmtica

c
Vcitoplasma L
dCLEU
rLEU
=
r
dt
Vmitocondria LEU
(7.40)
Concentracin de arginina citoplasmtica

c
dCARG
Vcitoplasma Y
=
r
rARG
dt
Vmitocondria ARG
171
(7.41)
Concentracin de lisina citoplasmtica

c
dCLY
Vcitoplasma Y
S
=
r rLY S
dt
Vmitocondria LY S
(7.42)
Concentracin de cido glutmico citoplasmtica

c
dCGLU
Vcitoplasma X
=
r
rGLU
dt
Vmitocondria GLU
(7.43)
Concentracin de cido asprtico citoplasmtica

c
dCASP
Vcitoplasma X
=
r rASP
dt
Vmitocondria ASP
B.
(7.44)
Velocidades de reaccin y parmetros para el modelo metablico de una clula animal
Transporte de glucosa [39, 100, 101]:
r perm =
e
max
c
(kmax
permCGLC k perm2CGLC )
Ce
Cc
1 + KGLC
+ KGLC
GLC
GLC
kmax
perm = 7, 27[1/hr]
kmax
perm2 = 0, 727[1/hr]
KGLC = 1, 50[mM]
Hexoquinasa [102]:
max
rHK = kHK
c
c
CMgAT
PCGLC
HK
HK
KMgAT
P KMgAT PGLC NHK
c
c
c
c
CMgAT
CMgAT
CGLC
P
PCGLC
NHK = 1 + HK + HK
+ HK
HK
KGLC KMgAT P KMgAT
P KMgAT PGLC
max = 1, 93 102 [mM/hr]
kHK
HK
KMgAT
P = 1, 76[mM]
172
c
c Cc
CG6P
CGLC
G6P
+
HK
HK K HK
KG6P
KGLC
G6P
HK
2
KMgAT
PGLC = 5, 10 10 [mM]
HK = 3, 34 101 [mM]
KG6P
HK = 4, 00 102 [mM]
KGLC
HK
KGLCG6P
= 6, 90 102 [mM]
Glucosa 6-fosfato isomerasa [27, 103]:
kPGI
rPGI =
c
CG6P
1+
Cc
r
F6P
kPGI
Kr
f
KPGI
c
CG6P
f
KPGI
PGI
c
CF6P
r
KPGI
kPGI = 11, 16 102 [mM/hr]

r
kPGI
= 9, 28 102 [mM/hr]
f
KPGI = 1, 82 102 [mM]

r
KPGI
= 7, 14 102 [mM]
Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa [31]:
rG6PD =
c
c
r
c Cc
kG6PDCNADP
CG6P
kG6PD
C6PG
NADPH
DG6PD
1
1
3
5
7
9
NG6PD
= kG6PD
kG6PD
kG6PD
kG6PD
kG6PD
2
2
4
6
8
10
NG6PD
= kG6PD
kG6PD
kG6PD
kG6PD
kG6PD
c
c
c
DG6PD = D1G6PD + D2G6PDCNADP
+ D3G6PDCG6P
+ D4G6PDC6PG
c
c
c
c
c
+ D5G6PDCNADPH
+ D6G6PDCNADP
CG6P
+ D7G6PDCNADP
C6PG
c
c
c
c
+ D8G6PDCG6P
CNADPH
+ D9G6PDC6PG
CNADPH
c
c
c
11
c
c
c
+ D10
G6PDCNADPCG6PC6PG + DG6PDCG6PC6PGCNADPH
kG6PD = 4, 39 1020 [1/mM hr]

r
kG6PD
= 7, 48 1019 [1/mM hr]
173
D1G6PD = 1, 45 1015 []
D2G6PD = 1, 83 1020 [1/mM]
D3G6PD = 4, 29 1019 [1/mM]
D4G6PD = 5, 74 1017 [1/mM]
D5G6PD = 2, 04 1020 [1/mM]
D6G6PD = 6, 84 1024 [1/mM 2 ]
D7G6PD = 7, 26 1022 [1/mM 2 ]
D8G6PD = 6, 01 1024 [1/mM 2 ]
D9G6PD = 5, 01 1024 [1/mM 2 ]
27
3
D10
G6PD = 8, 65 10 [1/mM ]
29
3
D11
G6PD = 1, 10 10 [1/mM ]
Fosfofructoquinasa [29]:
Cc
rPKF =
Cc
max F6P MgAT P

kPFK
K PFK K PFK
F6P
(1 +
c
CF6P
PFK
KF6P
MgAT P
c
CMgAT
P
PFK
KMgAT
P
)(1 +
Cc
NPFK = 1 + LPFK
1
) NPFK
Cc
Mg 4
P 4
(1 + K AT
PFK ) (1 + K PFK )
AT P
(1 +
max = 2, 5 102 [1/mM hr]

kPFK
PFK = 0, 1[mM]
KF6P
PFK
2
KMgAT
P = 6, 8 10 [mM]
LPFK = 1, 07 103 []
PFK = 0, 01[mM]
KAT
P
PFK = 3, 30 102 [mM]
KAMP
PFK = 0, 44[mM]
KMg
Transaldolasa [103]:
174
Mg
c
c
CF6P
4 (1 + CAMP )4
)
PFK
PFK
KF6P
KAMP
r Cc Cc
k Cc Cc kTA
E4P F6P
rTA = TA SH7P GAP
DTA
c
c
c
c
c
c
DTA = D1TACSH7P
+ D2TACGAP
+ D3TACE4P
+ D4TACF6P
+ D5TACSH7P
CGAP
c
c
c
c
c
c
CE4P
CF6P
+ D8TACSH7P
+ D6TACE4P
CF6P
+ D7TACGAP
kTA = 9, 12 1018 [1/mM hr]

r = 2, 51 1019 [1/mM hr]
kTA
D1TA = 3, 40 1016 [1/mM]

D2TA = 2, 39 1016 [1/mM]
D3TA = 1, 64 1017 [1/mM]
D4TA = 1, 36 1016 [1/mM]
D5TA = 4, 41 1017 [1/mM 2 ]
D6TA = 3, 92 1017 [1/mM 2 ]
D7TA = 1, 11 1017 [1/mM 2 ]
D8TA = 2, 11 1018 [1/mM 2 ]
Transketolasa 2 [103]:
rT K2 =
c
c
c Cc
kT K2Cxyl5p
CE4P
kTr K2CGAP
F6P
DT K2
c
c
c
c
c
c
DT K2 = D1T K2Cxyl5p
+ D2T K2CE4P
+ D3T K2CGAP
+ D4T K2CF6P
+ D5T K2Cxyl5p
CE4P
c
c
c
c
c
c
+ D6T K2CGAP
CF6P
+ D7T K2CE4P
CF6P
+ D8T K2Cxyl5p
CGAP
kT K2 = 3, 64 1019 [1/mM hr]

kTr K2 = 1, 23 1018 [1/mM hr]
D1T K2 = 7, 35 1016 [1/mM]
D2T K2 = 3, 01 1017 [1/mM]
175
D3T K2 = 5, 96 1016 [1/mM]

D4T K2 = 1, 25 1016 [1/mM]
D5T K2 = 1, 67 1018 [1/mM 2 ]
D6T K2 = 3, 31 1016 [1/mM 2 ]
D7T K2 = 1, 60 1017 [1/mM 2 ]
D8T K2 = 3, 38 1017 [1/mM 2 ]
Aldolasa [28, 103]:
c
r Cc Cc
kALDCFBP
kALD
GAP DHAP
rALD =
DALD
c
c
c
c
c
c
c
DALD = D1ALD + D2ALDCFBP
+ D3ALDCGAP
+ D4ALDCDHAP
+ D5ALDCFBP
CGAP
+ D6ALDCDHAP
CGAP
kALD = 2, 46 1016 [1/hr]

r
kALD
= 2, 89 1017 [1/mM hr]
D1ALD = 1, 94 1012 []
D2ALD = 2, 73 1014 [1/mM]
D3ALD = 3, 38 1013 [1/mM]
D4ALD = 1, 77 1014 [1/mM]
D5ALD = 1, 55 1015 [1/mM 2 ]
D6ALD = 9, 31 1014 [1/mM 2 ]
Triosefosfato isomerasa [103]:
kT PI
rT PI =
c
CDHAP
1+
kT PI = 59, 96 103 [mM/hr]

kTr PI = 54, 15 102 [mM/hr]
176
Cc
+ kTr PI KGAP
r
f
KT PI
c
CDHAP
f
KT PI
T PI
Cc
+ KGAP
r
T PI
KT PI = 8, 38 101 [mM]
KTr PI = 4, 30 101 [mM]
Gliceraldehido fosfato isomerasa [21]:
c
r
c
c
c
CNADH
kGAPD
C13P2G
CNAD
rGAPD = kGAPD PiCGAP
kGAPD = 1, 1 104 [1/mM hr]

r
kGAPD
= 3, 5 104 [1/mM hr]
Pi = 0, 94[]
Transketolasa 1 [103]:
rT K1 = ET K1
c
c N 2 Cc Cc
NT1 K1Cxyl5p
CR5P
T K1 GAP SH7P
DT K1
c
c
c
c
c
c
DT K1 = D1T K1Cxyl5p
+ D2T K1CR5P
+ D3T K1CGAP
+ D4T K1CSH7P
+ D5T K1Cxyl5p
CR5P
c
c
c
c
c
c
CGAP
CSH7P
+ D7T K1CR5P
CSH7P
+ D8T K1Cxyl5p
+ D6T K1CGAP
kT K1 = 5, 32 1018 [1/mM hr]

kTr K1 = 2, 58 1018 [1/mM hr]
D1T K1 = 7, 35 1016 [1/mM]
D2T K1 = 4, 40 1016 [1/mM]
D3T K1 = 5, 96 1016 [1/mM]
D4T K1 = 2, 63 1016 [1/mM]
D5T K1 = 2, 44 1017 [1/mM 2 ]
D6T K1 = 6, 94 1016 [1/mM 2 ]
D7T K1 = 4, 92 1016 [1/mM 2 ]
D8T K1 = 3, 38 1017 [1/mM 2 ]
177
Fosfoglicerato quinasa [28]:
c
c
r
c
c
rPGK = kPGK C13P2G
CADP
kPGK
C3PG
CAT
P
f
kPGK = 1, 00 105 [1/mM hr]

r
kPGK
= 5, 56 101 [1/mM hr]
Fosfoglicerato mutasa [28]:
r
c
c
)
kPGM
C2PG
rPGM = (kPGMC3PG
f
kPGM = 1, 00 105 [1/hr]

r
kPGM
= 6, 80 105 [1/hr]
Enolasa [28]:
c
r
c
rEN = (kEN C2PG
kEN
CPEP
)
f
kEN = 1, 00 101 [1/hr]

r = 5, 90 104 [1/hr]
kEN
Piruvato quinasa [30]:
c
CPEP
PK
max KPEP
rPK = kPK
Cc
1 + KPEP
PK
PEP
c
CMgADP
PK
KMgADP
1+
Cc
NPK = 1 + LPK
c
CMgADP
PK
KMgADP
1
NPK
Cc
P 4
PEP 4
(1 + KAT
PK ) (1 + K PK )
AT P
Cc
4
(1 + KF6P
PK )
F6P
max = 2, 50 102 [mM/hr]

kPK
PK = 2, 25 101 [mM]
KPEP
PK
KMgADP
= 4, 74 101 [mM]
178
PEP
LPK = 19[]
PK = 3, 39[mM]
KAT
P
PK = 5, 00 103 [mM]
KF6P
Lactato deshidrogenasa [104107]:
rLDH =
c
c
r
c
c
CPY
kLDH CNADH
R kLDH CNADCLAC
DLDH
c
5
c
3
c
4
c
1
2
c
+ kLDH
CPY
DLDH = kLDH
+ kLDH
CNADH
R + kLDH CNADH CPY R + kLDH CLAC
9
c
c
c
8
c
c
6
c
7
c
+ kLDH
CPY
CLAC
+ kLDH
CNADH
CLAC
+ kLDH
CNAD
+ kLDH
CNAD
RCNAD
kLDH = 2, 00 105 [1/mM hr]

r
kLDH
= 1, 85 104 [1/mM hr]
1
kLDH
= 0, 40[mM]
2
kLDH
= 1, 00[mM]
3
kLDH
= 1, 00[mM]
4
kLDH
= 1, 00 102 [mM]
5
kLDH
= 1, 00 102 [mM]
6
kLDH
= 1, 00[mM]
7
kLDH
= 1, 00 102 [mM]
8
kLDH
= 1, 70 104 [mM]
8
kLDH
= 5, 00 101 [mM]
Transportador de tricarboxilato [38, 108110]:
rTCT
c
CPY
= kTCT TCT R c
KPY R +CPY R
kTCT = 19, 62 101 [mM/hr]

TCT = 2, 00 102 [mM]
KPY
R
179
Transportador de monocarboxilato [38, 104, 106, 111]:
kMCT
rMCT =
c
CLAC
1+
Ce
r
LAC
kMCT
Kr
f
KMCT
c
CLAC
f
KMCT
MCT
e
CLAC
r
KMCT
kMCT = 1, 00 102 [mM/hr]

r
kMCT
= 1, 00[mM/hr]
f
KMCT = 5, 00 102 [mM]

r
KMCT
= 5, 00[mM]
6-fosfogluconate deshidrogenasa [31]:
r6PGD =
c
c
r
c Cc
c
k6PGDCNADP
C6PG
k6PGD
CCO2
RU5PCNADPH
D6PGD
c
c
c
D6PGD = D16PGD + D26PGDCNADP
+ D36PGDC6PG
+ D46PGDCCO2
c
c
c
c
c
C6PG
+ D76PGDCNADP
CCO2
+ D56PGDCNADPH
+ D66PGDCNADP
c
c
c
c
+ D86PGDC6PG
CNADPH
+ D96PGDCCO2
CRU5P
c
c
11
c
c
+ D10
6PGDCCO2CNADPH + D6PGDCRU5PCNADPH
c
c
c
13
c
c
c
+ D12
6PGDCNADPH C6PGCCO2 + D6PGDCNADPC6PGCRU5P
c
c
c
15
c
c
c
+ D14
6PGDCNADPCCO2CRU5P + D6PGDC6PGCRU5PCNADPH
c
c
c
17
c
c
c
c
+ D16
6PGDCCO2CRU5PCNADPH + D6PGDCNADPC6PGCCO2CRU5P
c
c
c
c
+ D18
6PGDC6PGCCO2CRU5PCNADPH
k6PGD = 1, 83 1019 [1/mM hr]

r
k6PGD
= 1, 08 1019 [1/mM hr]
D16PGD = 1, 69 1015 []
D26PGD = 4, 95 1018 [1/mM]
D36PGD = 7, 26 1018 [1/mM]
180
D46PGD = 3, 45 1015 [1/mM]

D56PGD = 5, 58 1019 [1/mM]
D66PGD = 2, 44 1023 [1/mM 2 ]
D76PGD = 1, 01 1019 [1/mM 2 ]
D86PGD = 2, 40 1023 [1/mM 2 ]
D96PGD = 5, 18 1018 [1/mM 2 ]
D1 06PGD = 1, 14 1020 [1/mM 2 ]
D1 16PGD = 3, 14 1022 [1/mM 2 ]
D1 26PGD = 1, 01 1024 [1/mM 3 ]
D1 36PGD = 1, 63 1025 [1/mM 3 ]
D1 46PGD = 1, 52 1026 [1/mM 3 ]
D1 56PGD = 1, 35 1026 [1/mM 3 ]
D1 66PGD = 1, 84 1024 [1/mM 3 ]
D1 76PGD = 1, 52 1027 [1/mM 4 ]
D1 86PGD = 1, 25 1028 [1/mM 4 ]
Oxidacin de glutationa [31]:
rGSHOX
c
kGSHOX CGSH
=
2
kGSHOX = 0, 26[1/hr]
Glutationa reductasa [31]:
181
r
c
2Cc
k
Cc
Cc
kGSSGR
CGSH
NADP
rGSSGR = GSSGR NADPH GSSG
DGSSGR
1
1
3
5
7
9
11
NGSSGR
= kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
2
2
4
6
8
10
12
NGSSGR
= kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
kGSSGR
c
c
c
+ D4GSSGRCGSH
+ D3GSSGRCGSSG
DGSSGR = D1GSSGR + D2GSSGRCNADPH
c
c
c
c
c
CGSH
+ D7GSSGRCNADPH
CGSSG
+ D6GSSGRCNADPH
+ D5GSSGRCNADP
c
c
c
2
+ D8GSSGRCGSSG
CNADP
+ D9GSSGRCGSH
c
11
c
c
c
+ D10
GSSGRCGSH CNADP + DGSSGRCGSH CNADP
c
c
c
13
c
c
c
+ D12
GSSGRCNADPH CGSSGCGSH + DGSSGRCNADPH CGSSGCGSH
c
c
2
15
c
c
c
+ D14
GSSGRCNADPH CGSH + DGSSGRCGSSGCGSH CNADP
c
2 c
17
c
c
c
2
+ D16
GSSGRCGSH CNADP + DGSSGRCNADPH CGSSGCGSH
c
c
2 c
+ D18
GSSGRCGSSGCGSH CNADP
kGSSGR = 6, 02 1027 [1/mM hr]

r
kGSSGR
= 1, 15 1026 [1/mM hr]
D1GSSGR = 2, 86 1022 []
D2GSSGR = 4, 77 1027 [1/mM]
D3GSSGR = 5, 67 1026 [1/mM]
D4GSSGR = 1, 29 1021 [1/mM]
D5GSSGR = 4, 09 1026 [1/mM]
D6GSSGR = 6, 65 1031 [1/mM 2 ]
D7GSSGR = 2, 14 1026 [1/mM 2 ]
D8GSSGR = 8, 10 1030 [1/mM 2 ]
D9GSSGR = 9, 18 1024 [1/mM 2 ]
D1 0GSSGR = 1, 84 1025 [1/mM 2 ]
182
D1 1GSSGR = 2, 04 1028 [1/mM 2 ]

D1 2GSSGR = 5, 38 1030 [1/mM 3 ]
D1 3GSSGR = 3, 44 1032 [1/mM 3 ]
D1 4GSSGR = 1, 53 1030 [1/mM 3 ]
D1 5GSSGR = 4, 05 1032 [1/mM 3 ]
D1 6GSSGR = 2, 95 1030 [1/mM 3 ]
D1 7GSSGR = 3, 85 1034 [1/mM 4 ]
D1 8GSSGR = 4, 53 1034 [1/mM 4 ]
Ribulosa fosfato epimerasa [103, 112]:
c
f CRU5P
f
KEP
kEP
rEP =
1+
r
kEP
c
CRU5P
f
KEP
c
Cxyl5p
r
KEP
c
Cxyl5p
r
KEP
kEP = 46, 42 102 [mM/hr]

r = 66, 67 102 [mM/hr]
kEP
f
KEP = 1, 90 101 [mM]

r = 5, 00 101 [mM]
KEP
Ribulosa fosfato isomerasa [103, 112]:
kRPI
rRPI =
c
CRU5P
1+
Cc
r
R5P
kRPI
Kr
f
KRPI
c
CRU5P
f
KRPI
RPI
Cc
+ KR5P
r
RPI
kRPI = 17, 04 102 [mM/hr]

r
kRPI
= 72, 56 101 [mM/hr]
f
KRPI = 7, 80 101 [mM]

r = 2, 20[mM]
KRPI
Complejo de piruvato deshidrogenasa [108, 113115]:
183
Cm
Cc
Cc
citoplasma
CoA
PY R
)( Vmitocondria
( K PDHC
)( citoplasma NADP )
K PDHC Vmitocondria K PDHC
max
rPDHC = kPDHC
PY R
(1 +
CoA
NADP
c
c
m
Vcitoplasma CCoA
Vcitoplasma CNADP
CPY
R
)(1
+
)(1
+
)
PDHC
PDHC
PDHC
V
V
KPY R
mitocondria KCoA
mitocondria KNADP
max = 45[mM/hr]
kPDHC
PDHC = 2, 00 102 [mM]
KPY
R
PDHC = 6, 60 103 [mM]
KCoA
PDHC = 3, 00 102 [mM]
KNADP
Alanina transaminasa [21]:
m
c
rATA = kATA (CPY
RCGLU
m Cc
CKG
ALA
)
ATA
KEq
kATA = 10[1/mM hr]

ATA = 20[mM]
KEq
Transporte de serina [21]:
Vcitoplasma A
(r
+ rASC )
Vmitocondria SER SER
e
CSER
A
= kAmax Ce
rSER
e
e
c
CGLN
CALA
CALA
SER
+
(1
+
+
+
)
A
A
A
K
K
K
KA
rSER =
SER
ASC
max
rSER
= kASC
Ce
SER
ASC
KSER
ALA
Ce
HR
+ (1 + KTASC
T HR
kAmax = 4, 23 102 [1/hr]

A = 0, 73[mM]
KSER
A = 0, 60[mM]
KALA
A
KGLN
= 1, 66[mM]
184
ALA
e
CSER
Ce
+ KALA
ASC
ALA
GLN
Cc
Ce
GLN
+ KALA
ASC + K ASC )
ALA
GLN
max = 1, 11[1/hr]
kASC
ASC = 17, 75 101 [mM]
KSER
ASC = 0, 10[mM]
KALA
KTASC
HR = 0, 22[mM]
ASC = 0, 05[mM]
KGLN
Citrato sintasa [116]:
rCS = kCS
1
KCS
(1 + CACCOA
m
ACCOA
KCS
+ COAA
m
OAA
KCS
KCS
OAA
+ CACCOA
m
Cm )
ACCOA
OAA
kCS = 4, 61 103 [mM/hr]

CS
KACCOA
= 1, 26 102 [mM/hr]
CS = 6, 40 104 [mM/hr]
KOAA
Transporte de lisina [21]:
rLY S = kYmax
Vcitoplasma
Vmitocondria
e
CLY
S
e
CLY
S
Y
KLY
S
Ce
+ (1 + KARG
)
Y
ARG
kYmax = 31, 92 102 [1/hr]

Y = 0, 21[mM]
KLY
S
Y
KARG
= 1, 12[mM]
Transporte de leusina [21]:
rLEU = kLmax
Vcitoplasma
Vmitocondria
kLmax = 19, 56 102 [1/hr]
185
e
CLEU
e
CLEU
L
KLEU
Ce
+ (1 + KGLN
)
L
GLN
L
= 0, 77[mM]
KLEU
L
KGLN
= 16, 54 101 [mM]
Acontinasa [116]:
rACON =
kACON
Cm
m ICIT
CCIT
KE
ACON
kACON = 4, 50 104 [1/hr]

E
KACON
= 2, 22[mM]
Isocitrato deshidrogenasa [116]:
rIDH =
kIDH
DIDH
K IDH
DIDH
IDH
( CICIT
)3
m
KH2
CHm
ICIT
= (1 + IDH + m ) +
Vcitoplasma
Cc
CH
KH1
(1 + ADP
)(1 +
IDH
KADP
IDH
KNAD
Vcitoplasma
m
CNAD
Vmitocondria
m
CNADH
(1 + IDH
KNADH
)3
( CICIT
m
IDH
KNAD
ICIT
Cc
Cm
citoplasma
citoplasma
AM C m
(1 + KADP
)(1 + K IDH
) NAD Vmitocondria
IDH V
mitocondria
ADP
m
CAM
)
IDH
KACA
Vcitoplasma
)
Vmitocondria
K IDH
Vmitocondria
ACA
kIDH = 63, 96 102 [mM/hr]

IDH = 8, 10 105 [mM]
KH1
IDH = 1, 52[mM]
KICIT
IDH = 1, 41 103 [mM]
KACA
IDH = 6, 20 102 [mM]
KADP
IDH = 9, 23 101 [mM]
KNAD
IDH = 0, 19[mM]
KNADH
Alfa-ketoglutarato deshidrogenasa [116]:
186
(1 +
c
CNADH
Vcitoplasma
)
IDH
KNADH Vmitocondria
rKGDH =
kKGDH
DKGDH
(
DKGDH = 1 +
KGDH
KKG
)3
m
CKG
KGDH
KNAD
m
CNAD
Cm
Cm
Mg
ACA
Mg
AM
)(1 + K KGDH
)
(1 + K KGDH
Cm
Mg
kKGDH = 0, 9 104 [mM/hr]

KGDH = 1, 94[mM]
KKG
KGDH = 3, 08 102 [mM]
KMg
KGDH = 1, 27 103 [mM]
KACA
KGDH = 3, 87 101 [mM]
KNAD
Alanina transaminasa [21]:
m
c
rATA = kATA (CPY
RCGLU
m Cc
CKG
ALA
ATA
KEq
kATA = 10[mM/hr]
ATA = 20[mM]
KEq
Transporte de cido glutmico [21]:
rGLU = kXmax
Vcitoplasma
Vmitocondria
kXmax = 24, 43 102 [1/hr]

X
KGLU
= 1, 05[mM]
X = 3, 45 102 [mM]
KASP
187
e
CGLU
e
CGLU
X
KGLU
Cm
Mg
AM
)(1 + K IDH
)
(1 + K KGDH
Ce
+ (1 + KASP
X )
ASP
ACA
Transporte de glutamina [21]:
rGLN =
e
CGLN
Vcitoplasma max
(kA Ce
Ce
Ce
Cc
GLN
Vmitocondria
+ (1 + KALA
+ KALA
+ KSER
A
A
A )
KA
GLN
max
+ kASC
Ce
GLN
ASC
KGLN
+ kNmax Ce
GLN
N
KGLN
+ kLmax Ce
GLN
L
KGLN
e
CGLN
Ce
Ce HR
+ KALA
+ (1 + KTASC
ASC
T HR
ALA
ALA
ALA
Cc
Ce
SER
+ KALA
ASC + K ASC )
ALA
SER
e
CGLN
Ce
+ (1 + KASN
N )
ASN
e
CGLN
Ce
+ (1 + KLEU
)
L
LEU
kAmax = 4, 23 102 [1/hr]

A
KGLN
= 1, 66[mM]
A = 0, 60[mM]
KALA
A = 0, 73[mM]
KSER
max = 1, 11[1/hr]
kASC
KTASC
HR = 0, 22[mM]
ASC = 0, 05[mM]
KGLN
ASC = 17, 75 101 [mM]
KSER
ASC = 0, 10[mM]
KALA
kNmax = 8, 98 102 [1/hr]

N
KGLN
= 9, 25[mM]
N = 8[mM]
KASN
Transporte de arginina [21]:
rARG = kYmax
Vcitoplasma
Vmitocondria
kYmax = 31, 92 102 [1/hr]

188
e
CARG
e
CARG
Y
KARG
Ce
S
+ (1 + KLY
Y )
LY S
SER
Y
KARG
= 1, 12[mM]
Y = 0, 21[mM]
KLY
S
Succinil CoA sintetasa [116]:
c
m
CADP
rSCS = kSCS (CSCOA
c
Vcitoplasma
Vcitoplasma CCoA
c
m
CAT
CSUC
P
e )
Vmitocondria
Vmitocondria KSCS
kSCS = 45, 72 101 [1/mM hr]

e = 31, 15 101 [1/mM]
KSCS
Transporte de treonina [21]:
max
rT HR = kASC
CTe HR
KTASC
HR
CTe HR
Ce
Ce
Cc
SER
GLN
+ (1 + KALA
ASC + K ASC + K ASC )
ALA
SER
GLN
max = 1, 11[1/hr]
kASC
KTASC
HR = 0, 22[mM]
ASC = 0, 05[mM]
KGLN
ASC = 17, 75 101 [mM]
KSER
ASC = 0, 10[mM]
KALA
Succinato deshidrogenasa [116]:
rSDH =
(1 +
kSDH
SDH
m
KSUC
Cm
CFUM
(1 + K OAA
m
SDH )(1 + K SDH ))
CSUC
FUM
OAA
kSDH = 1, 80 105 [mM/hr]

SDH = 3, 00 102 [mM]
KSUC
SDH = 1, 50 101 [mM]
KOAA
SDH = 1, 30[mM]
KFUM
Fumarasa [116]:
189
m
rFUMH = kFUMH (CFUM
m
CMAL
)
e
KFUMH
kFUMH = 3, 60 103 [1/hr]

e
KFUMH
= 0, 5[mM]
Malato deshidrogenasa [116]:
kMDH faMDH fiMDH
rMDH =
(1 +
m
MDH
MDH
KNAD
COAA
KMAL
)
+
(1
+
m
MDH
V
CMAL
citoplasma
KOAA
Cm
NAD Vmitocondria
faMDH =
1
m
CH
(1 + kMDH +
1
m
CH
)
MDH
k1
k2MDH
(1 +
k3MDH
m
CH
NAD Vmitocondria
MDH
+ kO
f f set
fiMDH = (
m
MDH
MDH
KNAD
COAA
KMAL
)
(1
+
m
MDH
V
CMAL
citoplasma
KOAsA Cm
k3MDH k4MDH 2
)
m2
CH
kMDH = 1, 54 104 [mM/hr]

MDH = 14, 93 101 [mM]
KMAL
MDH = 3, 10 103 [mM]
KOAA
MDH = 22, 44 102 [mM]
KNAD
k1MDH = 11, 31 106 [mM]

k2MDH = 26, 70[mM]
MDH = 3, 99 102 [mM]
kO
f f set
k3MDH = 6, 68 109 [mM]

k4MDH = 5, 62 106 [mM]
Transporte de asparagina [21]:
rASN =
e
CASN
Vcitoplasma max
kN Ce
Ce
Vmitocondria
( KASN
+ (1 + KGLN
N
N ))
ASN
190
GLN
kNmax = 8, 98 102 [1/hr]

N = 9, 25[mM]
KASN
N
KGLN
= 8[mM]
Transporte de cido asprtico [21]:
rASP =
e
CASP
Vcitoplasma max
kX Ce
e
CGLU
Vmitocondria
))
( ASP
X + (1 + X
KASP
KGLU
kXmax = 24, 43 102 [1/hr]

X = 3, 45 102 [mM]
KASP
X
KGLU
= 1, 05[mM]
Transporte de alanina [21]:
A
rALA
= kAmax
max
ASC
= kASC
rALA
e
c
CALA
CALA
((
e
CALA
A
KALA
Ce
(( KALA
ASC +
ALA
c
CALA
A
KALA
Ce
Ce
) + (1 + KSER
+ KGLN
))
A
A
SER
GLN
e
c
CALA
CALA
e
c
CSER
CALA
CTe HR
)
+
(1
+
+
ASC
ASC
ASC
KALA
KT HR
KSER
kAmax = 4, 23 102 [1/hr]

A
KGLN
= 1, 66[mM]
A = 0, 60[mM]
KALA
A = 0, 73[mM]
KSER
max = 1, 11[1/hr]
kASC
KTASC
HR = 0, 22[mM]
ASC = 0, 05[mM]
KGLN
ASC = 17, 75 101 [mM]
KSER
ASC = 0, 10[mM]
KALA
kNmax = 8, 98 102 [1/hr]
191
Ce
+ KGLN
ASC ))
GLN
N = 9, 25[mM]
KASN
N
KGLN
= 8[mM]
Transporte de glutamina [21]:
Vcitoplasma Vcitoplasma A
ASC
N
L
r
+ rGLN
+ rGLN
+ rGLN
)
Vmitocondria Vmitocondria GLN
e
CGLN
= kAmax Ce
e
e
c
CSER
CALA
CALA
GLN
+
(1
+
+
+
)
A
A
A
K
K
K
KA
rGLN =
A
rGLN
GLN
ASC
max
rGLN
= kASC
Ce
GLN
ASC
KGLN
N
rGLN
= kNmax Ce
GLN
N
KGLN
L
rGLN
= kLmax Ce
GLN
L
KGLN
ALA
ALA
e
CGLN
e
Ce
C HR
+ KALA
+ (1 + KTASC
ASC
T HR
ALA
e
CGLN
Ce
+ (1 + KASN
N )
ASN
e
CGLN
Ce
+ (1 + KLEU
)
L
LEU
kAmax = 4, 23 102 [1/hr]

A
KGLN
= 1, 66[mM]
A = 0, 60[mM]
KALA
A = 0, 73[mM]
KSER
max = 1, 11[1/hr]
kASC
KTASC
HR = 0, 22[mM]
ASC = 0, 05[mM]
KGLN
ASC = 17, 75 101 [mM]
KSER
ASC = 0, 10[mM]
KALA
kNmax = 8, 98 102 [1/hr]

N = 9, 25[mM]
KASN
N
KGLN
= 8[mM]
kLmax = 19, 56 102 [1/hr]
192
SER
Cc
Ce
SER
+ KALA
ASC + K ASC )
ALA
SER
L
= 0, 77[mM]
KLEU
L
KGLN
= 16, 54 101 [mM]
C.
Parmetros de simulacin
Modelo completo
Concentracin de cofactores y restricciones impuestas [21]
Concentracin de magnesio intra-celular
CMg = 0, 7[mM]
Concentracin de fosfato intra-celular
CPi = 0, 94[mM]
Concentracin de dixido de carbono intra-celular
CCO2 = 0, 2[mM]
Concentracin de flavina adenina dinucletido intra-celular
CFAD = 5, 83 102 CFADH [mM]
Concentracin de flavina adenina dinucletido (reducida) intra-celular
CFADH = 4, 83 102 [mM]
Concentracin de nicotinamida adenina dinucletido (reducida) citoplasmtica
c
CNADH
= 5, 9 102 CNAD [mM]
Concentracin de nicotinamida adenina dinucletido (reducida) mitocondrial

m
CNADH
= 3 104 [mM]
193
Concentracin de nicotinamida adenina dinucletido mitocondrial

m
m
[mM]
= 5, 83 102 CNADH
CNAD
Concentracin de nicotinamida adenina dinucletido fosfato (reducida) intra-celular

CNADPH = 5 104 CNADP [mM]
Concentracin de nicotinamida adenina dinucletido fosfato intra-celular
CNADPH = 3 104 [mM]
Concentracin de glutationa oxidada intra-celular
c
CGSSG = 3, 15 CGSH
[mM]
Concentracin de adenosin difosfato citoplasmtica

c
c
c
CADP
= 2 CAT
P CAMP [mM]
Concentracin de magnesio presente en la produccin de ATP

c
CMgAT
P=
c
CMgCAT
P
[mM]
0, 081
Concentracin de magnesio presente en la produccin de ADP

c
CMgADP
=
c
CMgCADP
[mM]
0, 81
Concentracin de coenzima A intra-celular

CCoA = 0, 2[mM]
Concentracin de citrato mitocondrial
m
m
m
m
m
m
m
m
CCIT
= 10 CICIT
CAKG
CSCOA
CSUC
CFUM
CMAL
COAA
[mM]
Concentracin de calcio mitocondrial

m
CCa
= 1 104 [mM]
194
Concentracin intra-celular de protones

CH + = 2, 5 105 [mM]
Propiedades celulares
Parmetros de crecimiento Coeficiente mximo de crecimiento celular
max = 0, 073[hr1 ]
Coeficiente de inhibicin de crecimiento por lactato [26]
I
Kglc
= 14[mM]
Parmetros de volumen Volumen celular [26]

Vcelula = 4, 189 1015 [L]
Razn volumen citoplasmtico y mitocondrial [21]
Vcitoplasma
= 3.998[]
Vmitocondria
Modelo simplificado
Concentracin de cofactores y restricciones impuestas [35]
Concentracin de adenosin trifosfato citoplasmtico
c
CAT
P = 0, 8[mM]
Concentracin de adenosin monofosfato citoplasmtico

c
CAT
P = 0, 4[mM]
Concentracin de adenosin difosfato citoplasmtico

c
c
c
CADP
= 2 CAT
P CAMP [mM]
195
Concentracin de glutamato citoplasmtico

c
= 0, 15[mM]
CGLU
Concentracin de -ketoglutamato citoplasmtico

c
CKG
= 0, 03[mM]
Concentracin de nicotinamida adenin dinucletido citoplasmtico

c
= 3, 2 104 [mM]
CNAD
Concentracin de nicotinamida adenin dinucletido (reducido) citoplasmtico

c
CNADH
= 6, 1 101 [mM]
Propiedades celulares
Parmetros de crecimiento Coeficiente mximo de crecimiento celular
max = 0, 075[hr1 ]
Coeficiente de inhibicin de crecimiento por lactato [26]
I
Kglc
= 14[mM]
Parmetros de volumen Volumen celular [26]

Vcelula = 4, 189 1015 [L]
Volumen citoplasmtico [35]
Vcitoplasma = 0, 75 Vcelula [L]
196
D.
Cdigos MATLAB
Sistema bio-reactor
Sistema global
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
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15
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21
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25
26
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28
29
30
function dCCdt = sistema10 (t ,CC ,P)

% Modelo diferencial para sistema bioquimico reactor - celula
%
% SUPUESTOS
% =========
% 0. - Reactor CSTR con mezclado perfecto.
% 1. - Volumen de lquido en el reactor se mantiene constante mediante
% control sobre los flujos de salida y entrada.
% 2. - Volumen de las clulas es despreciable y no afecta el volumen de
% lquido en el reactor.
% 3. - Sin crecimiento celular.
%
% ARGUMENTOS Y SALIDA
% ===================
% t
: tiempo [ hr ]
% CC
: Vector de variables [ concentraciones celulares ] [ mM ] [ volumen
% del reactor ] [ lt ] [ concentraciones reactor ] [ mM ] [ concentracion celular ]
% [ No. de celulas ]
% P
: Parametros ( constantes cinticas , volumen de la clula ...
[ Vcell ], constante cintica de reaccin metablica [k], flujo de ...
entrada [ Fin ], flujo de salida [ Fout ], concentracin de entrada ...
[ Cglcin ])
%
% dCCdt : Vector de diferenciales de salida [ mM / hr ]
%
% CHANGELOG
% ==========
% Version 1 .0 [2010/07/12]
%
Modelo inicial
%
% Damin Baeza F.
% damian.baeza@gmail.com
%% Variables del sistema
31
32
global dLdGt dCCdT suma suma1 old_CC oldtie
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Ccglc = CC (1) ;
Ccg6p = CC (2) ;
Ccpyr = CC (3) ;
Cclac = CC (4) ;
Ccala = CC (5) ;
Cglcin = CC (6) ;
Ceglc = CC (7) ;
Celac = CC (8) ;
Ceala = CC (9) ;
V = CC (10) ;
XV = CC (11) ;
197
45
46
47
48
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50
51
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54
55
56
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58
59
60
61
62
63
if isempty ( suma )
suma = 0;
end
if isempty ( suma1 )
suma1 = 0;
end
if isempty ( dLdGt )
dLdGt = 0;
end
if isempty ( dCCdT )
dCCdT = [ zeros (1 ,12) ];
end
if isempty ( old_CC )
old_CC = CC ;
end
if isempty ( oldtie )
oldtie = 0;
end
64
65
fldh = Ponderator ( Ceglc , P.nglc );
66
67
P.LDH = fldh ;
68
69
%% Ecuaciones diferenciales
70
71
72
73
74
dcelldt = diffCC_2 (t ,CC ,P);

dreactordt = creactor10 (t ,CC ,P);
dVdt = vreactor10 (t ,CC ,P);
dXdt = xcelula10 (t ,CC ,P);
75
76
dCCdt = [ dcelldt ; dreactordt ; dVdt ; dXdt ];
77
78
DCCDt = [ dcelldt (1) ; dcelldt (3:4) ; dreactordt (2:3) ; dVdt ; dXdt ];
79
80
%% Estado estacionario
81
82
83
84
85
if norm ( DCCDt ) < 1e -4

suma = suma + 1;
else suma = 0;
end
86
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88
89
90
91
92
93
94
95
if oldtie < t
Var_CC = norm ( abs ( CC - old_CC ));
oldtie = t;
old_CC = CC ;
if Var_CC < 1e -4
suma1 = suma1 + 1;
else suma1 = 0;
end
end
96
97
98
99
100
if suma == 10 || suma1 == 10
disp ('Estado estacionario alcanzado')
t
end
198
101
102
103
104
clc
disp ('completado ( %):')
disp (t/ P.tfin *100)
105
106
dCCdT = [ dCCdT ;t dCCdt '];
Metabolismo celular
function dCCdt = diffCC_2 (t ,CC ,P)
2
3
%% Variables
4
5
global RR DLDG CumGlc CumLac Glucosa Lactato conta Gluc dLdGt tiempo ...
old_t i intcount suma old_Celac old_cum_glc old_cum_lac cum_glc ...
cum_lac old_V old_X oldt old_Ceglc newCeglc new_Celac new_XV GlcIn ...
GlcIn2 old_Fin old_Fin2 old_Fout
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Ccglc = CC (1) ;
Ccg6p = CC (2) ;
Ccpyr = CC (3) ;
Cclac = CC (4) ;
Ccala = CC (5) ;
Cglcin = CC (6) ;
Ceglc = CC (7) ;
Celac = CC (8) ;
Ceala = CC (9) ;
V = CC (10) ;
XV = CC (11) ;
18
19
20
21
if isempty ( RR )
RR = [];
end
22
23
%% Variables persistentes
24
25
26
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28
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31
32
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39
40
if isempty ( old_t )
old_t = 0;
end
if isempty ( Gluc )
Gluc = 0;
end
if isempty ( tiempo )
tiempo = 0;
end
if isempty ( old_Ceglc )
old_Ceglc = Ceglc ;
end
if isempty ( old_V )
old_V = V;
end
if isempty (i)
199
41
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43
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45
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90
91
92
93
94
95
96
i = [];
end
if isempty ( intcount )
intcount = 0;
end
if isempty ( suma )
suma = 0;
end
if isempty ( newCeglc )
newCeglc = Ceglc ;
end
if isempty ( old_Celac )
old_Celac = 0;
end
if isempty ( new_Celac )
new_Celac = 0;
end
if isempty ( old_X )
old_X = XV / P.Vcell /10^9;
end
if isempty ( new_XV )
new_XV = XV ;
end
if isempty ( old_cum_lac )
old_cum_lac = 0;
end
if isempty ( old_cum_glc )
old_cum_glc = 0;
end
if isempty ( cum_lac )
cum_lac = 0;
end
if isempty ( cum_glc )
cum_glc = 0;
end
if isempty ( old_Fin )
old_Fin = 0;
end
if isempty ( old_Fin2 )
old_Fin2 = 0;
end
if isempty ( old_Fout )
old_Fout = 0;
end
if isempty ( CumLac )
CumLac = [t cum_lac ];
end
if isempty ( CumGlc )
CumGlc = [t cum_glc ];
end
if isempty ( Lactato )
Lactato = [t Celac ];
end
if isempty ( Glucosa )
Glucosa = [t Ceglc ];
end
200
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
if isempty ( oldt )
oldt = t;
end
if isempty ( DLDG )
DLDG = [0 0];
end
if isempty ( conta )
conta = t;
end
if isempty ( GlcIn )
GlcIn = 0;
end
if isempty ( GlcIn2 )
GlcIn2 = 0;
end
112
113
114
%% Supuestos
Vsn = V;
115
116
%% Velocidades
117
118
119
%Alanina Transaminasa
rata = P.ATA. *( P.kalatr. *( Ceala - Ccala ). /(1 + Ceala / P.Kala + ...
Ccala / P.Kala ));
120
121
122
123
%Glicolisis
%Transporte de Glucosa ( SC mod )
rperm = P.Glc. *(( P.kfperm. * Ceglc - P.krperm. * Ccglc ). /(1 + Ceglc. / P.Kglc ...
+ Ccglc. / P.Kglc ));
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
%Hexoquinasa (E)
E0hk = 0 .0722 ; % [ mM ]
vfmaxhk = 72 E5 ; % [1/ hr ]
vrmaxhk = 60; % [1/ hr ]
KhkMgATP = 6 .3 *10^ -2; % [ mM ]
KihkMgATP = 6 .3 *10^ -2; % [ mM ]
KhkMgADP = 2 .3 *10^ -1; % [ mM ]
KihkMgADP = 2 .3 *10^ -1; % [ mM ]
Khkg6p = 4*10^ -2; % [ mM ]
Kihkg6p = 6 .7 ; % [ mM ]
Khkglc = 1*10^ -1; % [ mM ]
Kihkglc = 1*10^ -1; % [ mM ]
137
138
rhk = P.HK. *( E0hk. *(( vfmaxhk. * P.CcATP. * Ccglc /( Kihkglc * KhkMgATP ) - ...
vrmaxhk. * P.CcADP. * Ccg6p /( Khkg6p * KihkMgADP )). /(1 + Ccglc / Kihkglc + ...
P.CcATP / KihkMgATP + Ccg6p / Kihkg6p + ...
( P.CcATP / Kihkglc ). *( Ccglc / KhkMgATP ) + ...
( P.CcATP / Khkg6p ). *( Ccg6p / KihkMgATP ))));
139
140
141
142
143
144
145
146
%fosfofructo quinasa (E)

kfpfk = 6 .7514e +004; % [ mM ]
Kpfkf6p = 0 .18 ; % [ mM ]
Kpfkf6p2 = 20; % [ mM ]
Kpfkatp = 0 .08 ; % [ mM ]
Kpfkatp2 = 0 .25 ; % [ mM ]
Kpfkfbp = 4 .02 ; % [ mM ]
201
147
148
149
150
151
152
153
154
Kpfkfbp2 = 4 .02 ; % [ mM ]
Kpfkadp = 2 .71 ; % [ mM ]
Kpfkadp2 = 2 .71 ; % [ mM ]
Kpfkiatp = 0 .87 ; % [ mM ]
Kpfkaamp = 0 .06 ; % [ mM ]
d = 0 .01 ; % []
e = 0 .01 ; % []
L0 = 13; % []
155
156
157
158
159
160
Delta = (1 + Ccg6p / Kpfkf6p ). *(1 + P.CcATP / Kpfkatp ) + P.CcADP / Kpfkadp + ...

(( Ccpyr /2) / Kpfkfbp ). *(1 + P.CcADP / Kpfkadp );
Delta2 = (1 + Ccg6p / Kpfkf6p2 ). *(1 + P.CcATP / Kpfkatp2 ) + P.CcADP / Kpfkadp2 ...
+ (( Ccpyr /2) / Kpfkfbp2 ). *(1 + P.CcADP / Kpfkadp2 );
alfa = ( Kpfkf6p * Kpfkatp ). /( Kpfkf6p2 * Kpfkatp2 );
L = L0 *(((1 + P.CcATP. / Kpfkiatp ) /(1 + d. * P.CcATP. / Kpfkiatp )). *((1 + ...
e. * P.CcAMP. / Kpfkaamp ). /(1 + P.CcAMP. / Kpfkaamp ))) ^4;
krpfk = (( kfpfk. * Kpfkadp. * Kpfkfbp ). /( Kpfkatp. * Kpfkf6p ));
161
162
rpfk = P.PFK. *((( kfpfk. *( P.CcATP. * Ccg6p ). /( Kpfkatp. * Kpfkf6p ) - ...

krpfk. *( P.CcADP. * Ccpyr /2) . /( Kpfkadp. * Kpfkfbp )). /( Delta )). *((1 + ...
alfa. * L. *( Delta2 / Delta ) ^3) . /(1 + L. *( Delta2 / Delta ) ^4) ));
163
164
165
166
167
168
169
170
%Lactato dehidrogenasa ( Em )
vfmaxldh = 5 .1036e +008; % [ mM / hr ]
Kldhpyr = 0 .6 ; % [ mM ]
Kldhnadh = 0 .008 ; % [ mM ]
Kldhlac = 17; % [ mM ]
Kldhnad = 0 .253 ; % [ mM ]
Kldheq = 2;
171
172
vrmaxldh = (( vfmaxldh. * Kldhlac. * Kldhnad ). /( Kldhpyr. * Kldhnadh. * Kldheq ));
173
174
rldh = P.kldh. * P.LDH. *(( vfmaxldh. * P.CcNADH. * Ccpyr. /( Kldhpyr. * Kldhnadh ) - ...
vrmaxldh. * P.CcNAD. * Cclac. /( Kldhlac. * Kldhnad )). /(1 + Ccpyr. / Kldhpyr + ...
P.CcNADH / Kldhpyr + Ccpyr. * P.CcNADH. /( Kldhpyr. * Kldhpyr ) + ...
Cclac / Kldhlac + P.CcNAD. / Kldhnad + ...
Cclac. * P.CcNAD. /( Kldhlac. * Kldhnad )));
175
176
177
%Transportador de Monocarboxilato ( LO )
rmct = P.MCT. *(( P.kfmct. * Cclac. / P.Kfmct - P.krmct. * Celac. / P.Krmct ). /(1 + ...
Cclac. / P.Kfmct + Celac. / P.Krmct ));
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
%Alanina aminotransferasa
kfalaat = 0 .0341 *10^9/ P.Vcito ; % [ mM / hr ]*1000*1000
Keq = 1/6 .5 ; % []
Kalaatakg = 0 .4 ; % [ mM ]
Kalaatiakg = 0 .4 ; % [ mM ]
Kalaatala = 2 .80 *10; % [ mM ]
Kalaatiala = 2 .80 *10; % [ mM ]
Kalaatglu = 2 .50 *10; % [ mM ]
Kalaatiglu = 2 .50 *10; % [ mM ]
Kalaatipyr = 3 .00 *10^ -1; % [ mM ]
189
190
rf = kfalaat. * Ccala. * P.Ccakg. /( Kalaatakg. * Ccala + Kalaatala. * P.Ccakg + ...

Kalaatiala. * Kalaatakg. * P.Ccglu. / Kalaatiglu + ...
Kalaatala. * Kalaatiakg. * Ccpyr. / Kalaatipyr + Ccala. * P.Ccakg + ...
202
191
Kalaatala. * P.Ccakg. * Ccpyr. / Kalaatipyr + ...

Kalaatglu. * Ccala. * P.Ccglu. / Kalaatiglu );
Tau = Ccpyr. * P.Ccglu. /( P.Ccakg. * Ccala );
192
193
ralaat = P.ALAAT. * rf. *(1 - Tau. / Keq );
194
195
%Ciclo TCA
196
197
198
199
TCA = 19 .76E -2; % [ mM / hr ]

Ktct = P.TCT. *0 .02 ;
ktct = P.TCT. *1 .962. *10^0;
200
201
rtca = ktct. *( Ccpyr /( Ktct + Ccpyr )); %P.TCT. * TCA. * Vsn. /(3* P.Vcito );
202
203
204
%% Ecuaciones
205
206
207
208
209
210
dCcglc_dt
dCcg6p_dt
dCcpyr_dt
dCclac_dt
dCcala_dt
=
=
=
=
=
P.perm. * rperm - rhk ;

rhk - rpfk ;
2* rpfk - rldh + ralaat - rtca ;
rldh - rmct ;
- ralaat + rata ;
211
212
dCCdt = [ dCcglc_dt dCcg6p_dt dCcpyr_dt dCclac_dt dCcala_dt ]';
213
214
%% dL / dG
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
if oldt < t
cum_glc = old_cum_glc + ( old_Ceglc * old_V - Ceglc *V)
old_Fin * GlcIn *( t - oldt ) + old_Fin2 * GlcIn2 *( t old_Fout * old_Ceglc *( t - oldt );
cum_lac = old_cum_lac + ( Celac *V - old_Celac * old_V )
old_Fout * old_Celac *( t - oldt );
CumGlc = [ CumGlc ; t cum_glc ];
CumLac = [ CumLac ; t cum_lac ];
Gluc = vectorspace ( CumGlc (: ,1) , CumGlc (: ,2) , P.spa ,
Lact = vectorspace ( CumLac (: ,1) , CumLac (: ,2) , P.spa ,
if Gluc 6= 0
qglc = dNaturalSPLINE ( Gluc (: ,1) , Gluc (: ,2) , t);
qlac = dNaturalSPLINE ( Lact (: ,1) , Lact (: ,2) , t);
dLdGt = qlac / qglc ;
DLDG = [ DLDG ;t dLdGt ];
end
old_Ceglc = Ceglc ;
old_Celac = Celac ;
old_cum_glc = cum_glc ;
old_cum_lac = cum_lac ;
old_V = V;
oldt = t;
GlcIn = Cglcin ;
GlcIn2 = P.Cglcin2 ;
old_Fin = P.Fin ;
old_Fin2 = P.Fin2 ;
old_Fout = P.Fout ;
end
241
203
+ ...
oldt ) - ...
+ ...
P.ns );
P.ns );
242
%% cambio de variables persistentes
243
244
245
246
Glucosa = [ Glucosa ; t Ceglc ];

Lactato = [ Lactato ; t Celac ];
conta = [ conta ; t ];
247
248
249
%%
RR = [ RR ; t rperm rhk rpfk rldh ralaat rtca rmct rata ];
Volumen reactor
1
2
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28
29
function dCCdt = vreactor10 (t ,CC ,P)

%
% SUPUESTOS
% =========
%
% ===================
% t
: tiempo [ hr ]
% CC
% P
[ Cglcin ])
%
%
% CHANGELOG
% ==========
% Version 1 .0 [2010/07/12]
%
Modelo inicial
%
% Damin Baeza F.
30
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35
36
37
38
Ccglc = CC (1) ;
Ccg6p = CC (2) ;
Ccpyr = CC (3) ;
Cclac = CC (4) ;
Ccala = CC (5) ;
Cglcin = CC (6) ;
Ceglc = CC (7) ;
Celac = CC (8) ;
204
39
40
41
Ceala = CC (9) ;
V = CC (10) ;
XV = CC (11) ;
42
43
44
45
46
fS = Ceglc /( P.Kxglc + Ceglc );
fI = P.Kxlac /( Celac + P.Kxlac );
D = P.Fout /V;
47
48
dVdt = P.Fin + P.Fin2 - P.Fout ;
49
50
dCCdt = [ dVdt ]';
Densidad celular del cultivo
1
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30
function dCCdt = xcelula10 (t ,CC ,P)

%
% SUPUESTOS
% =========
%
% ===================
% t
: tiempo [ hr ]
% CC
% P
[ Cglcin ])
%
%
% CHANGELOG
% ==========
% Version 1 .0 [2010/07/12]
%
Modelo inicial
%
% Damin Baeza F.
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global MU oldti
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Ccglc = CC (1) ;
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Ccg6p = CC (2) ;
Ccpyr = CC (3) ;
Cclac = CC (4) ;
Ccala = CC (5) ;
Cglcin = CC (6) ;
Ceglc = CC (7) ;
Celac = CC (8) ;
Ceala = CC (9) ;
V = CC (10) ;
XV = CC (11) ;
45
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if isempty ( MU )
MU = [t 0 .031 ];
end
if isempty ( oldti )
oldti = t;
end
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fS = Ceglc /( P.Kxglc + Ceglc );

fI = P.Kxlac /( Celac + P.Kxlac );
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61
if oldti < t
MU = [ MU ; t P.mumax. * fS. * fI ];
oldti = t;
end
62
63
dXVdt = ( P.mumax. * fS. * fI - P.Fout /V).* XV ;
64
65
dCCdt = [ dXVdt ]';
Concentracin de glucosa/lactato/alanina extracelular
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function dCCdt = creactor10 (t ,CC ,P)

% Modelo diferencial para un reactor continuo
%
% SUPUESTOS
% =========
%
% ===================
% t
: tiempo [ hr ]
% CC
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% P
20
%
%
% CHANGELOG
% ==========
% Version 1 .0 [2010/07/12]
%
Modelo inicial
%
% Damin Baeza F.
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[ Cglcin ])
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global dLdGt
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Ccglc = CC (1) ;
Ccg6p = CC (2) ;
Ccpyr = CC (3) ;
Cclac = CC (4) ;
Ccala = CC (5) ;
Cglcin = CC (6) ;
Ceglc = CC (7) ;
Celac = CC (8) ;
Ceala = CC (9) ;
V = CC (10) ;
XV = CC (11) ;
45
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52
%% velocidades de transporte de glucosa y lactato

% Velocidad de transporte de glucosa [ mM / hr ]
rperm = P.Glc. *(( P.kfperm. * Ceglc - P.krperm. * Ccglc ). /(1 + Ceglc. / P.Kglc ...
+ Ccglc. / P.Kglc ));
% Velocidad de transporte de lactato [ mM / hr ]
rmct = P.MCT. *(( P.kfmct. * Cclac. / P.Kfmct - P.krmct. * Celac. / P.Krmct ). /(1 ...
+ Cclac. / P.Kfmct + Celac. / P.Krmct ));
% Velocidad de transporte de alanina [ mM / hr ]
rata = P.ATA. *( P.kalatr. *( Ceala - Ccala ). /(1 + Ceala / P.Kala + ...
Ccala / P.Kala ));
53
54
%% Balances de masa para el reactor
55
56
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58
SetPoint = P.Ysp ;
c = controladorglc (t , dLdGt , SetPoint ,P);
dCglcin_dt = c;
59
60
dCeglc_dt = P.Fin. / V. * Cglcin + P.Fin2. / V. * P.Cglcin2 - P.Fout. / V. * Ceglc - ...

P.perm. * rperm. * XV ; %
61
62
dCelac_dt = - P.Fout. / V. * Celac + rmct. * XV ; %
63
64
dCeala_dt = - P.Fout. / V. * Ceala - rata. * XV ; %
65
66
67
%% Vector diferencial
dCCdt = [ dCglcin_dt dCeglc_dt dCelac_dt dCeala_dt ]';
207
Funciones adicionales
Funcin de regulacin
function fldh = Ponderator ( Ceglc , nglc )
2
3
%% Funcion de Hill
4
5
6
7
%ldh
beta = 1;
Kglc = 1 .24 ;
8
9
10
%% Calculo estimador
fldh = ( beta *(( Ceglc )^ nglc /( Kglc ^ nglc + ( Ceglc )^ nglc )));
Funcin dNaturalSPLINE.mat
1
2
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4
5
6
7
8
9
10
function dyi = dNaturalSPLINE (x , y , xi )

% NATURALSPLINE One dimensional interpolation
%
% YI = NATURALSPLINE (X , Y , XI ) applies the natural spline
% interpolation to find YI , the values of the underlying
% function Y at the points in the vector XI. The vector
% X specifies the points at which the data Y is given.
%
% (c) by N. Mostoufi & A. Constantinides
% January 1, 1999
11
12
13
14
15
16
% Initialization
% nargin : number of inputs supplied
if nargin < 3
error ('Invalid number of inputs.')
end
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19
20
21
22
23
24
25
x = (x (:).');
% Make
y = (y (:).');
% Make
xi = ( xi (:).');
% Make
nx = length (x);
ny = length (y);
if nx 6= ny
error ('X and Y vectors
end
sure it's a file vector

are not the same size.');
26
27
28
29
30
31
32
33
lxi = length ( xi );
% Location the required number of base points
for m = 1 : lxi
d = xi (m) - x;
% Locating xi
[dm , loc (m)] = min ( abs (d));
% locating the first base point
208
if d( loc (m)) < 0 || loc (m) == nx

loc (m) = loc (m) - 1;
end
if loc (m) < 1;
loc (m) = 1;
end
34
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38
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end
41
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55
dx = diff (x);
dy = diff (y);
yox = dy. / dx ;
% Matrix of coefficients
A = 2* diag (x (3: nx ) -x (1: nx -2) ) + ...
[ zeros (nx -2 ,1) [ diag ( dx (2: nx -2) ); zeros (1 ,nx -3) ]] + ...
[ zeros (1 ,nx -2) ; [ diag ( dx (2: nx -2) ) zeros (nx -3 ,1) ]];
% Vector of constants
c = 6*( yox (2: nx -1) - yox (1: nx -2) );
% Solution of the set of linear equations
y2 = [0; inv (A)*c'; 0]; % interpolation
dyi = (1/2) *(( xi - x( loc +1) ). ^2 . /( x( loc ) - x( loc +1) )).* y2 ( loc )' ...
+ (1/2) *(( xi - x( loc )). ^2 . /( x( loc +1) - x( loc ))).* y2 ( loc +1)' ...
- (1/6) *(( x( loc ) - x( loc +1) ). *( y2 ( loc )'- y2 ( loc +1) ')) + (y( loc ) - ...
y( loc +1) ). /( x( loc ) - x( loc +1) );
Funcin de creacin de vector para dNaturalSPLINE.mat
function VS = vectorspace (x , y , SPA , NS )
2
3
4
m = numel (x);
n = numel (y);
5
6
if m
7
8
6= n
disp ('vectores x e y no son del mismo largo')
end
9
10
VS = zeros (NS ,2) ;
11
12
j = 1;
13
14
15
16
17
mini = min (x);

maxi = max (x);
lastin = maxi ;
dista = lastin - SPA ;
18
19
20
21
22
23
24
25
26
if ( maxi - mini ) < NS * SPA

VS = 0;
%
disp('vector de largo insuficiente ')
else
VS (1 ,:) = [x(m) y(m) ];
for i = 1: m
if j == NS
break
209
elseif abs (x(m+1 -i) - dista ) < 1e -3

VS (j +1 ,:) = [x(m+1 -i) y(m+1 -i) ];
j = j + 1;
lastin = x(m+1 -i);
elseif dista > x(m+1 -i)
VS (j +1 ,:) = [x(m+1 -i) y(m+1 -i) ];
j = j + 1;
lastin = x(m+1 -i);
end
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34
35
36
37
end
38
39
end
40
41
return
210

Diseño y Simulación de Un Sistema para El Control Del Estado Metabólico de Células Animales en Cultivo

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FSICAS Y MATEMTICAS

DISEO Y SIMULACIN DE UN SISTEMA PARA EL CONTROL DEL

MEMORIA PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO CIVIL QUMICO Y

DAMIN FRANCISCO BAEZA FERNNDEZ

1.1. Organizacin de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2. Objetivo de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3. Objetivos especficos de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1. Metabolismo en clulas animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2. Antecedentes biolgicos de la alteracin del estado metablico en clulas animales

3. Modelo metablico celular animal

3.2. Descripcin matemtica de metabolismo celular animal . . . . . . . . . . . . . . .

3.3. Modelacin de sistema bio-reactor-cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.4. Condiciones de simulacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5. Ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5.1. Metodologa de ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5.2. Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados

3.6. Anlisis estadstico de parmetros ajustados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.1. Prueba de t de Student . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.6.2. Resumen de parmetros ajustados y resultados de anlisis estadstico . . .

3.7. Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema . . . . . . . . . . . . . .

3.7.1. Anlisis de estabilidad por medio de valores propios . . . . . . . . . . . .

3.7.2. Anlisis de estabilidad por medio de diagrama de fases . . . . . . . . . . .

3.8. Discusin de resultados de la simulacin del modelo ajustado . . . . . . . . . . . .

4. Simplificacin del modelo metablico

4.2. Descripcin del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.2.1. Vas metablicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.2.2. Cinticas enzimticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.3. Ajuste de parmetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.3.1. Resultados de ajuste de parmetros y simulacin con parmetros ajustados

4.3.2. Anlisis estadstico de parmetros ajustados . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4. Anlisis de estabilidad del estado estacionario del sistema . . . . . . . . . . . . . .

4.5. Discusin de resultados de simplificacin de modelo . . . . . . . . . . . . . . . .

5.2. Anlisis de sensibilidad del modelo metablico inicial . . . . . . . . . . . . . . . .

5.3. Planteamiento de modelo de regulacin gnica inicial . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4. Modelo de regulacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.1. Funcin de Hill . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.4.2. Ajuste de parmetros de modelo de regulacin . . . . . . . . . . . . . . .

5.5. Validacin de modelo de regulacin gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.5.1. Comparacin con datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.5.2. Clculo de razn estequiomtrica L/G . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.5.3. Reversibilidad de estado metablico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5.6. Discusin de resultados de simulacin con modelo de regulacin . . . . . . . . . .

6. Control del estado metablico

6.2.1. Caractersticas del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.2.2. Objetivo de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.2.3. Anlisis de respuesta de lazo abierto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.3. Criterios de diseo de controladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.4. Control clsico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.4.1. Diseo de controlador proporcional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.4.2. Resultados de ajuste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.5. Control avanzado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.5.1. Control ptimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.5.2. Controlador basado en modelo lineal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.5.3. Controlador basado en modelo no lineal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

A . Ecuaciones de balances de masa utilizadas para el modelo metablico de una clula

A .1. Gliclisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

3.3. Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo de control. 15

3.5. Concentraciones experimentales de glucosa, lactato y de clulas del cultivo alterado. 17

3.7. Simulacin de cultivo de control con modelo sin ajustes. . . . . . . . . . . . . . .

3.8. Simulacin de cultivo de control con modelo ajustado. . . . . . . . . . . . . . . .

3.9. Simulacin de cultivo alterado con modelo ajustado. . . . . . . . . . . . . . . . .

4.1. Modelo metablico simplificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .