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Heparin ha estado en el empleo clnico durante dcadas, prevenir y curar la enfermedad tromboemblica.
Es slo relativamente recientemente que los mecanismos moleculares detrs de los efectos de
anticoagulant/antithrombotic fueron aclarados. Un artculo anterior sobre el sujeto en este series1 destac
algunos avances principales en nuestra comprensin de estos mecanismos, en particular en cuanto al papel
de antithrombin (EN) y su interaccin con el polisacrido. Estas relaciones ahora pueden ser explicadas en
el detalle molecular. El desarrollo ms importante de aos recientes ha sido el cultivar - ing la conciencia de
la distribucin ubicua, la diversidad estructural, y la importancia biolgica de sulfato heparan (HS)
.anteriormente era por lo general un subproducto querido.
Los componentes de monosacrido de heparin/HS, con abreviaturas y smbolos. (a) Uronic residuos cidos.
(b) Glucosamine residuos, con unidades adyacentes uronic cidas. La demostracin de residuos substituidos
de forma diversa GlcN y unidades adyacentes est basada en HexA-GlcN relatado y GlcN-HexA.
Con la comprensin profundizada de estructura de HS y funcin, all ha estado cultivando la perspicacia en los mecanismos
que controlan la formacin de speci? c saccharide secuencias durante la biosntesis de heparin/HS. En la par - ticular, este
progreso ha implicado la reproduccin molecular de las enzimas en - volved en el proceso de biosynthetic y sobre su
caracterizacin en el nivel gnico. Varios aspectos de este desarrollo han sido hablados en revisiones, 2-6 actas de simposio, 7
y un libro 8 las actividades Biolgicas de heparin/HS otro que anticoagulant/antithrombotic tambin extensivamente ha sido
estudiado y reviewed.8-14
El artculo presente dar principalmente con aspectos estructurales y las relaciones de actividad de estructura de heparin/HS,
pero tambin con pertinente? ndings en cuanto a polysaccha-montan la formacin, por procesos de biosynthetic o la sntesis
qumica nuestro modi? catin.
II. BIOSNTESIS:
Aunque heparin y HS a menudo sean descritos en trminos de sus secuencias frecuentes disac-charide, la biosntesis compleja
de estos glycosaminoglycans (MORDAZAS) conduce a varias combinaciones de secuencias que implican nonsulfated y de forma
diversa sulfated al cido de D-glucuronic (GlcA), el cido de L-iduronic (IdoA), N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), N-sulfo-D-
glucosamine (GlcNSO3), y la D-glucosamine (GlcN) unidades (el Higo 1) .All de estos residuos son " un " (1? 4) - unido excepto
GlcA, que es - (1 4) - unido.
Heparin es sintetizado en el tejido conjuntivo, como la parte de los proteoglicanos.HS es producido por la mayora Mamferos
(y muchos otros) de las clulas y est destinados a una variedad de protenas fundamentales, en syndecans particular, glypicans, perlecan, y agrin. La traduccin siguiente en bruto endoplasmic reticulum (la NUEVA R), las protenas principales son
transportadas al aparato Golgi, donde las enzimas responsables de la biosntesis HS/HEPARIN son localizadas. Seleccionado
serine unitsareO-substituido con el GlcA-Gal-Gal-Xyl-" la regin de acoplamiento " que une la cadena de polisacrido apropiada
con la protena principal. La estructura de hidrato de carbono a menudo su regin es la misma para glucosaminoglycan(heparin/HS) y galactosamino-glycan (chondroitin el sulfato, dermatan el sulfato) conteniendo proteoglycans (aunque el
modelo de substituent pueda diferenciarse), y mismo glycosyltransferases aparece estar implicado en su biosntesis,
independientemente de la naturaleza del glycosaminogly-puede (AMORDAZAR) la cadena 24 la Mayor parte de estas enzimas
ahora han sido reproducidas.
La siguiente reaccin, la transferencia de un residuo GlcNAc de UDP-GLCNAC para formar un acoplamiento a C4 de la unidad
GlcA en la regin de acoplamiento, aparece ser el paso de comisin hacia la formacin de HS/HEPARIN ms bien que el sulfato
chondroitin/dermatan. La enzima correspondiente es al parecer capaz de distinguir entre protenas principales diseadas para
HS y el accesorio de sulfato chondroitin, por lo visto por recog-nition del pptido rasgos estructurales antes asociados con la
adicin HS (un racimo de residuos cidos, aminocidos hidrfobos, y un espaciado cercano de gly-cosylation sitios). Un
GlcNAc transferase con las propiedades correspondientes ha sido parcialmente puri? el editor y ms recientemente fue
reproducido. Notablemente, thisenzyme es capaz de transferir una unidad a-GalNAc tambin al mismo aceptador, as dis-tinct
del -GalNAc la transferencia que inicia la formacin 29,30 de sulfato chondroitin el residuo a-GalNAc evidentemente puede
servir como un stop que impide ms lejos GAGf ormation. Formacin de los los reales [-glca-(1? 4)-a-glcnac-(1? 4)] la n
heparin/HS la estructura de precursor es catalizada por un GlcA/GlcNAc copolymerase.31 la Reproduccin de esta enzima
notablemente revel la existencia de dos isoforms que eran idnticos con el tumor presunto suppressionf actores EXT1
andEXT2. Datos intrigantes recientes sugieren que EXT1 Y EXT2 funcionen como un complejo hetero-oligomeric en el Golgi.
La conversin de la estructura de precursor de n (GlcA-GlcNAc) en los productos rec-ognized como heparin/HS ocurre por una
serie de polmero-modi? reacciones de catin, esquemticamente ilustradas en el Higo 2a, 4 cul tambin muestra las
estructuras de la secuencia principal disaccharide 1 del extensivamente modi? editor NS-dominio, y 2 del unmodi? editor NAdominio. Este polmero modi? el catin aparece ser iniciado mientras la cadena es todava bajo la elongacin 36 las
reacciones individuales y su estafa - certed la accin han sido descritas en reviews.3,4 reciente el ? rst modi? paso de catin,
N-deacetylation y N-sulfation de residuos GlcNAc, es catalizado por an otra enzima bifunctional. El resultado grupos de
Sulfato de n el requisito previo es a todo el subse-quent modi? cationes, que incluyen C-5-epimerization de GlcA al cido de Liduronic (IdoA) unidades, 2-o-sulfation de GlcA y unidades IdoA, y de 6 o - y 3-o-sulfation de residuos GlcN. El proceso ocurre
en al menos la manera en parte gradual, tal que los productos de una reaccin dada proporcionarn el sustrato para
reacciones subsecuentes. Sin embargo, la mayor parte de las reacciones no van a la terminacin, como tpicamente una
fraccin de los residuos de sustrato potenciales en cada paso evitar modificacin. Tal parcial
ESTRUCTURA E INTERACCIONES BIOLOGICAS
modificacin del
polmero es una caracterstica fundamental del proceso debiosntesis y la causa directa de la estructura del dominio diversi
ed de cadenas HS.En este contexto la heparina puede considerarse como un producto de la modificacinde polmeros m
enos restringido, esencialmente un extendido NS-dominio (Fig. 2a). Unproducto tpico de la modificacin del
polmero estrictamente regulado es elhexasaccharide 3 (Fig. 2b), que incorpora el mnimo (pentasacrido) secuenciavincula
nte en 4.
Aunque los mecanismos bsicos de modificacin de
la biosntesis del
polmero hansido aclados, la organizacin y regulacin del proceso global siguen
siendo malentendidas. La mayora de las enzimas implicadas son glicoprotenas y se hapresumido que forman uno o ms c
omplejos, Unidos a las membranas de Golgi, queatacan a la cadena de polisacrido de manera procesual (ver modelo en R
ef. 2).Aparente de acuerdo con esta nocin, polmero modi-
cacin es un proceso rpido,una cadena de heparina se completa en menos de 30 s.37 aunque este modelo pareceatractiv
o no est establecido, y no
podemos excluir otros modos de GAG Asamblea.Cualquiera
que
sea la solucin final a este problema, tendr en cuenta para el controlmuy estricto de expresin HS, como revel a
travs de anlisis compositivo de HS dediversos rganos,
38,
39 y, en particular, mediante la aplicacin deinmunohistoqumica de los anLos resultados recientes de la clonacin de
estas enzimas aadir ms complejidad. At-zymes todos (con algunas excepciones) son protenas transmembrana con
topologa de tipo II. Sin embargo, varias especies ocurren como genticamente distintas isoformas, las caractersticas
funcionales de los cuales slo han comenzado a ser revelados, pero claramente implican variaciones en el patrn de
expresin as como sustrato specicity y propiedades catalticas. El modo de expresin y el sustrato specicities de estas
isoformas presumiblemente determinan las propiedades del producto final polisacrido estructurales. Aunque una lista
detallada de las distintas especies de enzima cae fuera del alcance de este captulo, se resaltar algunas caractersticas
llamativas. El trans-ferase GlcNAc que aade el residuo GlcNAc primero en la regin de vinculacin fue encontrado
pertenecen a la misma familia de protenas como la enzymes.28 de copolymerase de EXT1/EXT2 el GlcNAc Ndeacetilasa/N-sulfotransferasa (NDST en la Fig. 2) que cataliza la modificacin inicial del polmero n (iniciativa-GlcNAc) ha
demostrado que se producen en al menos cuatro isoforms.4245 diferentes dos de estas especies, NDST-1 y NDST-2,
ambos muestran expresin ubicua en una variedad de clulas y tejidos. Sobreexpresin experimentos indicaron que la
ltima forma es ms propensa a generar secuencias de N-sulfatada extendidas, del tipo encontrado en heparin.46 notable,
disrup-cin especfica del gen en ratones NDST-2 selectivamente aboli la biosntesis de la heparina en tejido conectivo
tipo mastocitos, pero en cambio no tuvo ningn efecto notable en HS biosynthe-sis, o en el estado de salud aparente de
la animals.47, Ratones knockout NDST-1 sintetiza undersulfated HS y muri antes o durante el perodo neonatal, con
graves defectos mltiples del rgano.ticuerpos monoclonales contra diferentes HSepitopes.40
Fig.2. (a) generacin de la estructura del dominio tpico durante la biosntesis de HS.Para la definicin de smbolos ver Fig.
1 y las unidades del disacrido dos modelo que
se
muestra a continuacin el esquema. Los residuos de destino para cada reaccinenzimtica se indican mediante las puntas
de flecha. NS-dominios estn compuestospor unidades del disacrido de N-sulfatada contiguos, NA/NSdominios por unidadesde N-sulfatada y N-acetilada alternos y NA-dominios por unidades de N-acetiladacontiguas. ATbd: Secuencia de pentasacrido AT-obligatorio. (Modificar desde Ref. 4).(b) detallada estructura de la secuencia en
vinculante (unidades 1-5 entre las lneaspunteadas verticales). Los grupos sulfato en
crculo son esenciales para la interaccincon AT. (Reimpreso con el permiso de ref. 4)
que ocurre en menos de tres formas diferentes. Curiosamente, se han encontrado hasta el momento sola formas de la
iniciativa C-5-epimerase (EPI) 51 y el IdoA 2-O-sulfotransferasa (2-OST) 52,53. IdoA unidades en diferentes contextos
estructurales, tales como la "alternativa-ing" NA/NSdomains y las estructuras contiguas de NS de cadenas HS, o de la
heparina, as pueden ser generadas por la misma enzima. Por otra parte, el 2-OST sulfatos no slo IdoA pero tambin
aumentarn units.5355 de hecho, sobreexpresin de OST-2 recombinante en clulas de rin embrionario humano
condujo a 2-O-sulfatacin selectiva de unidades aumentarn en HS endgeno, 53, sugiriendo que la abundancia relativa
de dichos residuos en HS de ciertas tissues38 puede depender de la disposicin de 2-OST en el sistema de Golgi de las
clulas adecuadas. En el futuro, cada vez ms se correlacionar los aspectos funcionales del HS con anlisis de la estructura
del eptopo y el substrato specicities de at-zymes biosintticas. Como ejemplo para destacar de este desarrollo, residuos
de N-sustituidos GlcN fueron demostrados, mediante un enfoque de inmunohistoqumica, para formar parte de
structures.40 HS nativa aunque se desconoce el mecanismo de formacin de N-sustituidos GlcN unidades, una de las
isoformas NDST recientemente descubiertas, NDST-3, es potencialmente implicado debido a su actividad de N-deacetilasa
relativamente alta y baja actividad N-sulfotransferasa comparado con otros isoenzymes.56 NDST la ocurren-rence de
residuos GlcN N-sustituidos se encontr que se correlaciona con la capacidad de HS para interactuar con L-selectin.57 por
otra parte, una de las isoformas 3-OST pista - cialmente ataca GlcN N-sustituidos los residuos, 15 y la resultante GlcN(3OSO3) estructura es especficamente reconocido por la glicoprotena gD capsular de virus del Herpes simple 1, en un paso
esencial de la penetracin viral de la clula husped.
papel propuesto de 3-O-sulfatacin tambin en la formacin de complexes58 HS-FGFFGFR no es apoyado por los experimentos ms recientes. Identificacin de uncreciente nmero de secuencias de novela H
S subraya la vista que HS no es siempredifferentrasero de heparina por mero anlisis compositivo. Aunque HSs songeneralmente ms
ricas en unidades del disacrido de N-acetilada y contienen menosO-sulfatos (especialmente IdoA2SO3) que las heparinas,
60,
61 un tala
rasa en
el lmiteentre las dos especies no se dibuja fcilmente. Una caracterstica ms distintiva es laorganizacin de dominio tpico
de cadenas HS, dictadas por los patrones de Nsustituyentes y complementa la distribucin diferencial de los diversos grupos O-sulfato.
ANALISIS ESTRUCTURAL
ESTRATEGIAS GENERALES
Aclaracin de la heparina y las estructuras HS se ha ampliado continuamente mediante la optimizacin de los mtodos
clsicos, as como por desarrollar ms eciente de separacin y mtodos espectroscpicos. Aunque en casos favorables
"ngerprints" de los preparados de heparina, proporcionada por espectros de resonancia magntica nuclear (RMN), podr
permitir anlisis composicional y caracterizacin de los patrones de sulfatacin, estructuras de anlisis detallado de la
heparina (y especialmente de los ms complejo HS) requiere en gran medida la caracterizacin de GAG fragmentos
generados por liasas heparina o cido nitroso o ambos. Intercambio aninico HPLC, electroforesis en gel de poliacrilamida
degradado, electroforesis en gel de agarosa, y electroforesis capilar, son ejemplos de metodologas que han contribuido a
aislar oligosacridos de andheparin/HS de heparina fracciones susceptibles de anlisis estructural por una combinacin de
productos qumicos, enzimticos, y espectroscpicas methods.66 espectrometra de masas (MS) tiene denitely
consolidado como una importante herramienta para el anlisis estructural de los oligosacridos sulfatadas, previamente
apenas ac-accesible a este approach.74 analticos estos avances han vuelto posibles mediante el desarrollo de estrategias
para la explotacin del bombardeo rpido tomo (FAB), 75 77 FAB-tandem (FAB-MS-MS), 78, 79 ionizacin por
electrospray (ESI), 80-82 y desorcin secundario lquido (LSI) 83 MS tcnicas. Ms recientemente, matriz asistida por
ionizacin de la desorcin del laser (MALDI) ha aadido una nueva dimensin a la MS, debido a su casi ilimitada, aunque
an inexplotadas en gran medida, poten-tial analizar cantidades subnanogram de sulfatada fragmentos
glucosaminoglicano sobre una amplia gama de weights.84,85 molecular ahora esta tcnica se utiliza en combinacin con
mtodos de degradacin enzimtica productos qumicos y el uso de enzimas at-dolytic (vase la seccin III.3.c), 86,87 y
tambin para la secuencia de la heparina/HS oligosaccharides.88 cada vez que las muestras en la gama de miligramo estn
disponibles, two - dimensional NMR los mtodos pueden proporcionar evaluacin de secuencia y conformacin
molecular.
2.- anlisis conpositivo
Cadenas de heparina/HS no son susceptibles al enfoque clsico para el anlisis de composicin Internacional de
polisacridos, que implican escote con cidos de glucosdicos y perfiles la composicin monosacrido de bbma. De hecho,
tanto la carga negativa de los residuos de cido urnico y la carga positiva en los grupos aminos libres expuestos por Ndesulfatacin de grupos sulfamino estabilizan la mayora de los enlaces glucosdicos de estas garantas. Intentos de eludir
el problema de cido-labilizing el cido urnico glucosamina bonos por reduccin carboxilo han tenido tambin xito
debido a la fcil conversin de residuos Idosa resultante en derivatives.1 anhidro,8 anlisis de metilacin (otro enfoque
comn para com - Anlisis posicional de polisacridos neutros) adems ha tenido poco xito en el anlisis de GAGs
altamente sulfatadas, principalmente debido a la difculties en lograr la completa etherication de grupos hidroxilos libres
y escote posterior a monosacridos metilados sin prdida de grupos sulfato. Los esfuerzos hacia la mejora de la hidrlisis
no destructiva y quantication de metilado monosacridos por cromatografa de gases (GC) y mtodos de GC/MS
permiten perfiles parcial de heparina monosacrido components.90 tambin, determinacin de cidos urnicos total y
total hexosamina, clsicamente por - formado por mtodos colorimtricos, ha perdido popularidad, principalmente
porque se obtienen diferentes respuestas (especialmente para los cidos urnicos) dependiendo de la naturaleza de los
patrones urnico cido y sulfatacin del cido urnico, as como de la hexosamina. Mtodos colorimtricos
cromatogrfico/han sido especficamente desarrollado para las proporciones molares de-termining entre iniciativa e IdoA
en heparina/HS hydrolyzates.91 otra vez, estos mtodos tambin han sido ampliamente reemplazados por la exitosa
devel-sarrollo de mtodos para el anlisis del disacrido, que, adems de quantication de urnico diferentes residuos de
cido y la glucosamina, proporcionan ms estructural en formacin (vase ms adelante). Cuando la cantidad de muestra
no es un factor limitante, residuos individuales (especialmente IdoA, IdoA2SO3, iniciativa, GlcNS, GlcNAc) y el grado de 6O-sulfatacin en el glucosamines pueden confiablemente determinarse mediante Espectroscopia NMR directamente en
unmodied heparins65, 92 y HSs.93 aunque con menos sensibilidad, que el grado de 3-O-sulfatacin de glucosamines
tambin puede estimarse por espectroscopia RMN directa.
4. Otras protenas
Se cree que las protenas pueden interactuar con HS in vivo, todava hay por lo general escasas pruebas para el
papel funcional de dicha unin. Sin embargo, un nmero creciente de la protenas estn implicadas, en el nivel
de clula o tejido, con los fenmenos que parece depender de la unin HS. Ejemplos seleccionados de un
constante crecimiento lista de tales protenas y funciones objetivo, adems de los descritos en ms detalle
anteriormente, incluir el dominio G en supramoleculares del matriz extracelular, lipoprotena lipasa en el
transporte de la enzima, endostatina (La endostatina es derivada de una forma del colgeno, una protena estructural
encontrada en el tejido conectivo) en la inhibicin de la angiognesis, sobre las glicoprotenas virales en la infeccin
viral, crecimiento asociada a la molcula de unin a heparina (HB-GAM) en outgrowth neuritas y la plasticidad
neural, y factores de crecimiento en desarrollo embrionarios. Pocas de estas interacciones se han
caracterizado en detalle molecular. Un particular caracterstica interesante es la organizacin del dominio de
las cadenas de HS, el significado funcional de los cuales es poco conocido. En particular, las protenas
oligomricas pueden unirse a HS cadenas en modo de dominio de diseo, tales que los monmeros de
protenas separadas interactan con NS distintos dominios que estn separados por secuencias N-acetiladas.
como en vivo. Las ltimas propiedades reflejan no slo la actividad biolgica inherente del polisacrido, sino
tambin el tamao la dependencia de la farmacocintica en models305 animales y en humanos.
Proteoglicanos SA atraen creciente inters de los investigadores en muy diferentes disciplinas, y un rpido
progreso es posible prever en varias reas. Mtodos refinados para el anlisis estructural microescala de HS,
con respecto a la composicin, la secuencia, y la conformacin, ser requisito previo a estos avances. En
particular, los mtodos para la secuenciacin eficaz de pequeas cantidades de oligosacridos del SA son
obligatorios.
Para este fin, una variedad de tcnicas / reactivos ser explotado, incluyendo especfica exo-enzimas,
anticuerpos de presentacin en fagos especficos de secuencia, espectrometra de masas, y Espectroscopa de
RMN. Estos mtodos se aplican principalmente para el anlisis de dominios aislados de protena de unin, sino
tambin, en una perspectiva ms amplia, a "mapeo" completa de especies del SA en las superficies celulares y
en diferentes tejidos. La acumulacin de informacin de la secuencia, sin duda, va a generar un complejo foto
de HS como un ligando de protena. Ciertos tipos de funcionalmente importante interacciones, tales como "la
difusin unidimensional" de las protenas en las cadenas de HS, es probable que depender de efectos no
especficos de polielectrolitos en lugar de sequencespecific vinculante. Sin embargo, la aparicin de eptopos
sacridos distintos en tejidos, como se visualiza mediante anticuerpos monoclonales especficos (vase la
Seccin II), claramente apunta a la necesidad de especificidad en una multitud de interacciones. Hasta ahora,
la mayora de los estudios en este sentido se han dirigido a identificar las secuencias del SA afines que
corresponden a las protenas especificadas. La pregunta inversa se debe considerar: Qu protena (s) sirve (n)
como ligando natural (s) para una secuencia HS dado? Otras preguntas que son capaces de atraer mucha
atencin en un futuro prximo se apoyan sobre los papeles funcionales reales de interacciones HS-protena in
vivo. La unin de una protena a la cadena HS de un proteoglicano, en la superficie celular o en la matriz
extracelular, pueden servir a una variedad de propsitos (almacenamiento / proteccin, la presentacin de
protenas para la interaccin con otros ligandos, la activacin de las funciones efectoras de protenas) 0.
Miradas en torno a la potencial funcional in vivo de HS han sido proporcionados por los bilogos del
desarrollo, que han descubierto una serie de genes, en moscas, gusanos y mamferos, con esencial roles en el
desarrollo embrionario. Cabe destacar que, mientras que las estructuras de estos genes han sido bien
establecido, el papel funcional de las protenas correspondientes son slo recientemente comienza a
entenderse. Informacin en muy diversos campos de la investigacin ha revelado que una proporcin
sorprendentemente grande de desarrollo genes importantes son codifican protenas del ncleo, ya sea de HSproteoglicanos, enzimas implicados en la biosntesis de SA cadenas, factores de crecimiento / citoquinas
dependiendo SA para su presentacin / funcionamiento adecuado, o los receptores de tales factors. Esta
fructfera interaccin entre los campos de la biologa del desarrollo y glicobiologa es probable que se
expanda.
Dada la diversidad funcional de las cadenas de HS, y la especificidad de sus interacciones con muchas
protenas, los mecanismos detrs de la biosntesis del polisacrido y su reglamento seguirn atrayendo
inters. Informacin valiosa es obtenida a travs de una variedad de enfoques, incluyendo la formacin
catalizada por GAG enzimas en las preparaciones libres de clulas de la membrana y la clonacin, expresin y
funcional caracterizacin de enzimas biosintticas, as como el anlisis mutacional de la biosntesis de Modelos
process. Han conjeturado para explicar la los datos experimentales (vase, por ejemplo, Ref. 372). Sin
embargo, de forma preocupante todava se sabe poco acerca de varias caractersticas clave del proceso, tales
como el modo de polmero "encendido-apagado" modificacin que es un sello de formacin HS. Nosotros
necesitamos saber ms acerca de la interaccin entre las protenas biosintticas y su organizacin en la
membrana del aparato de Golgi; sobre todo, no tenemos ninguna informacin con respecto a cualquiera de
las protenas auxiliares que actividad cataltica falta, sin embargo, puede ser esencial para la biosntesis de
procesos. Y el ltimo objetivo sera la construccin de maquinarias biosintticas funcionales compuestas de
protenas recombinantes ensamblados en sistemas de membranas artificiales, que pueden ser instruidos para
producir una cadena de HS de estructura predeterminada.
Este ltimo desafo conduce a un aspecto final de la perspectiva de futuro, GAGbiotechnology. La multitud de
procesos fisiolgicamente importantes que estn mediadas a travs de interacciones especficas protena-HS
se presumible desencadenar el desarrollo de sacridos (o glycomimetic), basado medicamentos para uso
clnico, excepto la anticoagulacin de la sangre. Tal desarrollo dependera de nuevo de entrada fuerte de una
variedad de reas de investigacin separadas, incluyendo las interacciones protena-carbohidrato
(Espectroscopa de RMN; cristalografa), la sntesis orgnica y enzimtica, clula biologa y fisiologa.
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