TALLER # 2

IDENTIFICACIN BACTERIANA: COCOS GRAM POSITIVOS

ESQUEMAS PARA IDENTIFICAR ESTAFILOCOCOS

ESPECIE

Gram

Catalasa

Coagulasa

Fermenta
manitol

DNasa

Novobiocin
a

S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

1: Color azul oscuro o violeta: G +

2. Prueba de catalasa: La catalasa es una

enzima que descompone al perxido de
hidrgeno en oxgeno y agua, esta enzima es
similar a la estructura de la hemoglobina.
Excluyendo al gnero Streptococcus y
algunos otros la mayora de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas tienen
catalasa.
La base de esta prueba es demostrar la
presencia de la enzima catalasa, colocando 2
o 3 gotas al cultivo.
El resultado es positivo si en la colonia hay
efervescencia.

3. La coagulasa es un enzima
capaz de desnaturalizar la fibrina
del plasma. Los Staphylococcus
aureus patgenos dan una reaccin
postiva y los no patgenos negativa
Se aade una suspensin densa de
bacterias a un tubo pequea con
plasma y se incuba a 37 oC. Se
observa la coagulacin a las 4 y 24
h sin sacarlos de la estufa.

para

el

aislamiento

identificacin

de Staphylococcus aureus. NaCl 7,5% le

proporciona lo selectivo ya que slo estos
microorganismos
osmfilos

pueden

osmotolerantes

multiplicarse

en

l. Manitol es el nico azcar fermentado

Rojo -

por las cepas patgenas de este gnero

Amarillo +

La produccin de cidos proveniente de la

bacteriano.
fermentacin del manitol es detectada por
el viraje del indicador de pH presente en el
medio

(rojo

fenol)

a amarillo.

Staphylococcus

epidermidis no

fermenta

dar

el

manitol,

lugar

colonias pequeas rodeadas de un halo

prpura.

Prueba de DNasa

Con halo de inhibicin +

la
prueba
de
la
DNasa
desoxirribonucleasa.
La prueba de la DNasa se basa en la

Sin el

capacidad que tienen ciertas bacterias para hidrolizar enzimaticamente en ADN,

producindose una mezcla de mono y polinucletidos. El medio que se usa es el Agar
DNasa y como reactivo se usa Clorhdrico 1N.
TCNICA: Consiste en:
1. Hacer una estra o bien poner un pegote de la colonia.
2. Despus metemos en la estufa 37C durante 24 horas.
3. secar y echar bastante clorhdrico 1N.
LECTURA:
La aparicin de un halo blanco alrededor de estras de siembra indica que la prueba es
positiva. El microorganismo es producto de la desoxirribonucleasa. Son DNasa positiva:
S.Aureus, Serratia, Pseudomona y Bacillus.
-.
IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS Y ENTEROCOCOS

Prueba de laboratorio

Gram

Catalasa

Serogrupo

Bacitracina

Lancefield

Nombre Bacteria

Streptococos
pyogenes

Optoquina

CAMP Agar Bilis Agar con

Esculina NaCl
6.5%

S. pneumonia

S. agalactiae

S. bovis

Enterococcus

1. Prueba Gram +

2. Prueba catalasa

3. Prueba Bacitracina
S.pyogenes

Prueba utilizada para la diferenciacin

de estreptococos beta hemolticos del

grupo A de otros estreptococos beta

hemolticos..
FundamentoLa
bacitracina
es
un
antibitico que inhibe la sntesis de
pared celular bacteriana, y a la

concentracin que se encuentra en los

discos (0.04 U) inhibe el crecimiento de
los estreptococos beta hemolticos del
grupo A de Lancefield pero no inhibe el
desarrollo de otros estreptococos beta
hemolticos.

4. Prueba optoquina
Prueba para Streptococcus alfa
hemolticos, S. pneumoniae
+

5. Prueba de CAMP
agalactiae beta

+ S.

Los estreptococos del grupo B (S.

agalactiae) producen

una

protena

difusible y termoestable (factor CAMP)

que aumenta la beta-hemlisis de
Staphylococcus
6. Prueba

CAMP

esculina para S. bovis

agar

bilis

aureus.

S. aureus (sembrado desde la parte

superior hasta la parte inferior de la
placa)

produce esfingomielinasa

C que se puede unir a las membranas

de

los

eritrocitos.

Cuando

son

expuestas al factor CAMP del grupo B,

las clulas sufren hemlisis.

Medio utilizado para el aislamiento e

identificacin
presuntiva
de
estreptococos del grupo D.

presentes inhiben el desarrollo de la

flora acompaante.

Fundamento
Los estreptococos del grupo D
crecen rpidamente en el agar bilis
esculina e hidrolizan la esculina, que
en presencia de iones hierro forman
un compuesto de color verde oliva
hasta negro. Las sales biliares
7. Prueba agar bilis esculina y agar con NaCl 6,5 %

Identificacin bacteriana. La mayora de los laboratorios slo necesitan

diferenciar entre Enterococcus faecalis y E. faecium, cobrando especial
relevancia su distincin de las otras especies del gnero, frente a una cepa
resistente a vancomicina
Se observa cultivo de Enterococcus faecalis en agar telurito. Las colonias
adoptan una pigmentacin negra, indicando la metabolizacin del telurito.

TALLER # 3
IDENTIFICACIN BACTERIANA: BACILOS GRAM NEGATIVOS
1. Tincin Gram

2. Prueba oxidasa

La prueba de oxidasa es una prueba usada en microbiologa para determinar si una bacteria produce
alguna de las citocromo c oxidasas.1 La prueba hace uso de discos impregnados con el reactivo N,n,n,ntetrametil-p-fenilendiamina (o TMFD) o N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (o DMFD), el cual tambin es un
indicador redox. El reactivo pasa de azul oscuro a granate al ser oxidado, y se vuelve transparente al ser
reducido. Las bacterias oxidasa positiva poseen citocromo oxidasa o indofenol oxidasa (una

hemoprotena).Ambas catalizan el transporte de electrones de compuestos donantes (NADH) a

receptores de electrones (por lo general el oxigeno).
Positiva: BGNNFG
Negativa: BGNFG Enterobacterias

Si es oxidasa Negativa: BGNFG Enterobacteriaceae

1.

Agar MacConkey + para enterobac.

MacConkey o Agar MacConkey es un medio de cultivo especfico para bacterias gram

negativas y cepas que fermenten lalactosa.

+
--

2.

Prueba agar TSI

El Agar-hierro-triple azcar es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los medios de

cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn:
1.

Fermenten o no glucosa.

2.

Fermenten o no lactosa o sacarosa.

3.

Produzcan o no cido sulfhdrico.

4.

Produzcan o no gas.

Si no hay fermentacin k/k rojo/rojo

Si fermenta un azcar k/A rojo/amarillo
Si fermenta los tres A/A amarillo/amarillo

3.

Prueba LIA

Prueba consiste en que si el microorganismo posee o no le enzima lisina

descarboxilasa o lisina desaminasa.
Si no hay ninguna K/K
Si hay lisina descarboxilasa A/K
Si hay lisina desaminasa R/K

4.

Prueba de SIM
Sulfuro: se torna negra +
indol: se mide con reactivo de corvax _ anillo rojo +
Movilidad: se vuelve turbulento +

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente
de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el
proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se
combina con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un
compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas
cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro
de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH
mayor a 7.2.

Prueba de urea Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa,

para degradar la urea en dos molculas de amoniaco. El medio lleva
como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y

rosa cuando es positivo. Hay que tener precaucin por que tambin
puede ocurrir que no se produzca cambio de coloracin, en este caso es
negativo. el medio posee un color rosceo (mucho menos intenso que
los verdaderos positivos) lo que puede llevarnos a error (considerar
falsos positivos).

Prueba de agar citrato

Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono y compuesto amoniacales como nica fuente de
nitrgeno. Es ms espeso
Positivo
negativo

5.

Prueba de caldo malonato

Se hace para determinar la capacidad de utilizar malonato de sodio como fuente de carbono.
El caldo de malonato tiene azul de bromotimol como indicador de pH. Las bacterias que
usan malonato tambin sulfato de amonio como fuente de N2 Positivo por aumento en
alcalinidad al usar sulfato de amonio, cambia indicador de verde a azu

Positivo

.---------------------

Si es oxidasa Positiva: BGNNFG

1. Agar MacConkey -- para BGNNFG
MacConkey o Agar MacConkey es un medio de cultivo especfico para bacterias gram
negativas y cepas que fermenten lalactosa.

negativo

2. Prueba OF oxidacin-fermentacin
Dos pruebas:
1. Con atmosfera anaerobia vertiendo aceite mineral: si cambia a amarillo es
anaerobio
2. Con atmosfera libre: si cambia a amarillo es aerobio
Si es facultativo cambia a amarillo los dos

3. Prueba agar TSI

El Agar-hierro-triple azcar es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los medios de
cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn:

Fermenten o no glucosa.

Fermenten o no lactosa o

Produzcan o no gas.

sacarosa.

Si no hay fermentacin k/k rojo/rojo

Produzcan o no cido sulfhdrico.

Si fermenta un azcar k/A rojo/amarillo

Si fermenta los tres A/A amarillo/amarillo

4. Crecimiento de mueller hinton

Crecen todas las bacterias permite determinar el pigmento: piacinina= azul
verdosa
Para pseudomonas aeroginosa es la nica que pigmenta

Taller # 4

Bacterias anaerobias

Cultivo para bacterias anaerobias: atmosfera anaerobia en, jarra, cmara o

bolsa. En j o b se coloca un sobre generador de atmosfera anaerobia
generando N, CO2, H, se agrega un indicador de anaerobiosis cinta con un
color azul el cual se torna blanco cuando la atmosfera es la adecuada luego se
lleva a la incubadora y se deja el tiempo adecuado, 96 h en adelante T 37 *C

Prueba de Aero tolerancia. Se toma muestra del cultivo y se lleva a agar

sangre, se incuba 24 h en atmosfera aerobia: se observa si hay crecimiento de
las colonias.
Si crece es un anaerobio facultativo: se contina con las pruebas tincin Gram,
si es coco, bacilo.

Si no crece es un anaerobio estricto o Aero tolerante: se habla de anaerobio: se

identifica FASE I tincin Gram: morfologa y tincin, FASE II pruebas bioqumicas
sensibilidad y resistencia a los antimicrobianos halo de inhibicin genero,
FASE III pruebas sofisticadas *cromatografas *reaccin en cadena de la
polimerasa gnero y especie.