Instituto Tecnolgico de

Morelia

Alumno: Osmar Wilebaldo Sols Morales

Profesor: Juan Carlos Gonzlez Hernndez

Materia: Cintica Qumica Biolgica

Unidad: IV

Trabajo: Inmovilizacin de enzimas

ndice
Introduccin
Contenido
1.-) Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas.
2.-) Ventajas e inconvenientes.
3.-) Mtodos de inmovilizacin.
4.-) Soportes de inmovilizacin.
5.-) Adsorcin.

5.1.-) adsorcin por interaccin hidrofbicas.

5.2.-) adsorcin por interacciones inicas.
5.3.-) adsorcin por afinidad.
5.4.-) adsorcin por coordinacin a un metal.
6.-) Atrapamiento.
7.-) Unin covalente.
7.1.-) Formacin de enlaces diazo.
7.2.-) Formacin de enlaces tipo peptdico.
7.3.-) Formacin de enlaces de Schiff.
7.4.-) mtodo de alquilacin o arilacin.
7.5.-) Reacciones de intercambio tio-disulfuro.
8.-) Entrecruzamiento o Reticulado.
9.-) Comparacin entre los mtodos de inmovilizacin.
10.-) Eleccin del mtodo.
11.-) Propiedades de las enzimas inmovilizadas.
12.-) Actividad cataltica.
13.-) Especificidad por el sustrato.
14.-) Constantes cinticas.
14.1.-) Constante de Michaelis (Km).
14.2.-) Velocidad mxima (Vmax).
15.-) Temperatura y pH.
16.-) Estabilidad.
17.-) Aplicacin de las enzimas inmovilizadas.

Referencias

Introduccin
Las enzimas son biomolculas
especializadas en la catlisis de las
reacciones quimias que tiene lugar
la clula. Son muy eficaces como
catalizadores ya que son capaces
de aumentar la velocidad de las
reacciones qumicas mucho ms
que cualquier catalizador artificial
conocido, y adems son altamente
especficos ya que cada uno de
ellos induce la transformacin de
un solo tipo de sustancia y no de
otras que se pueden encontrar en
el medio de reaccin.
La estabilidad estructural de las
enzimas durante las reacciones
bioqumicas son algunos de los
desafo principales en el estudio de
los
biocatalizadores.
Se
han
desarrollado diferentes tcnicas
con el fin de inmovilizar las
enzimas
que
contengan
un
eficiencia
funcional
y
mayor
reproducibilidad.
De esta manera la inmovilizacin
de enzimas se refiere al hecho de
limitar o retardar el movimiento.
La enzima inmovilizada es aquella
que esta confinada en un espacio
definido, que retiene su actividad
cataltica y puede ser reutilizada
de forma continua.
La inmovilizacin se remonta al
estudio de las biopelculas, las
cuales son una superficie de
conexiones
de
comunidades
microbianas que consisten en
mltiples
capas
de
clula
incrustada en matrices hidratadas.

En 1985 se llev a cabo la

inmovilizacin
de
mltiples
enzimas para su uso, por ejemplo
en la produccin de L-aminocidos
a partir de ceto-cidos a partir de
reactores de membrana.
Los componentes principales de un
sistema
de
inmovilizacin
enzimtico son la enzima, la
matriz o soporte y el mtodo
de fijacin. Alguna de sus
propiedades como la actividad
cataltica o la estabilidad trmica
llegan
a
ser
alteradas,
sin
embargo puede conservar su
funcionalidad durante varios ciclos.

Figura 1. Componentes de un sistema de

inmovilizacin: enzima, soporte y tcnica de
inmovilizacin.
Debe
tener
en
cuenta
el
conocimiento de las propiedades
de los materiales del soporte y los
procesos de inmovilizacin.
1.-) Aspectos generales sobre
la inmovilizacin de enzimas.
Segn IUPAC la inmovilizacin es
una
tcnica
utilizadas
para
conseguir la fijacin fsica o
qumica de clulas, orgnulos,
enzimas u otras protenas en un
soporte slido, una matriz solida o
mediante
retencin
de
una
membrana, con el fin de aumentar
su estabilidad y hacer posible su
uso repetido o continuado

Concretamente
las
enzimas
inmovilizadas pueden ser definidas
como
enzimas
fsicamente
confinadas o localizadas en una
cierta regin definida del espacio
con retencin de su actividad
cataltica y que puede ser usadas
repetidamente
y
de
modo
continuo (Chibata, 1978)

El biocatalizador es ms
caro que la enzima nativa.

2.-) Ventajas e inconvenientes

Como ventajas del empleo de
enzimas inmovilizadas podemos
destacar:

El aumento de la estabilidad
de la enzima.
La posible reutilizacin del
derivado,
por
lo
que
disminuye los costes del
proceso.
La posibilidad de disear un
reactor enzimtico de fcil
manejo y control, adaptado
a la aplicacin de la enzima
inmovilizada.

Como
inconvenientes
proceso de inmovilizacin:

del

La
alteracin
de
la
conformacin de la enzima
respecto de su estado
nativo.
La gran heterogeneidad del
sistema
enzima-soporte
donde
pueden
existir
distintas
fracciones
de
protenas inmovilizadas con
un diferente nmero de
uniones.
Siempre suele haber una
prdida de inactividad de la
enzima
durante
la
inmovilizacin.

Tabla 1. Ventajas e inconvenientes del

sistema de inmovilizacin de enzimas.

3.-) Mtodos de inmovilizacin.

Los
numerosos
mtodos
empleados para llevar a cabo la
inmovilizacin de enzimas se han
clasificado atendiendo a diversos
criterios, como por ejemplo, la
naturaleza fsica o qumica de la
inmovilizacin (arroyo, 1998) o su
carcter reversible o irreversible
(brena y batista-viera, 2006).

Existen cinco mtodos principales

para inmovilizacin de enzimas o
clulas:
adsorcin,
unin
covalente,
entrecruzamiento,
encapsulamiento
y
atrapamiento.

Algunos grupos funcionales de la

enzima pueden dar lugar a fuertes
enlaces covalentes que la unan a
un soporte o a otras molculas de
la
enzima,
la
inmovilizacin
tambin puede ocurrir
por
adsorcin de la enzima a un
soporte. Las enzimas pueden ser
inmovilizadas por atrapamiento,
donde la enzima no da lugar a
ningn tipo de enlace si no que
esta retenida fsicamente. Todos
estos mtodos se detallaran
a
continuacin.

Adsorcin

Los mtodos ms utilizados de

inmovilizacin son:

Figura 2. Mtodo de
adsorcin.
Atrapamiento

Tabla 2. Clasificacin de los distintos mtodos de

inmovilizacin de enzimas.

Figura 3. Mtodo de
Atrapamiento

Unin covalente

Buena resistencia tanto al

pH como a la presin.
Buena disponibilidad.
Bajo coste.

Dependiendo de las caractersticas

fsicas del soporte:

Dimetro de partcula
Resistencia mecnica.
Compresin.

Tambin conociendo el tipo de

reactor:
Figura 4. Mtodo de unin
covalente.
El proceso de inmovilizacin ideal
para una enzima es aquel que le
permite
conservar
una
alta
actividad cataltica en el paso del
tiempo
para
ser
utilizada
continuamente.
Dependiendo de la estructura de la
protena y del material, as como
de las condiciones de reaccin
ser el mtodo de inmovilizacin a
utilizar.
4.-)
Soportes
inmovilizacin.

de

La naturaleza de los soportes de

inmovilizacin y el tipo de unin
de la enzima con estos afecta de
modo
determinante
al
comportamiento de la enzima
inmovilizada.
Algunas
de
las
caractersticas ideales de las que
debera constar un buen soporte
de inmovilizacin son:

Tanque agitado.
Lecho empaquetado.
Tanque
continuo
descontinuo.

Los soportes de inmovilizacin se

pueden clasificar en dos grupos:
soportes orgnicos y soportes
inorgnicos. Los soportes de
inmovilizacin
inorgnicos
presentan una alta estabilidad
mecnica, qumica y frente a los
ataques bacterianos. Mientras que
los soportes orgnicos son mas
verstiles, pueden ser diseados y
sintetizados en el laboratorio para
provocar el tipo de interaccin
enzima-soporte
deseado,
la
mayora de los soportes de
inmovilizacin
empleados
en
aplicaciones industriales son de
este tipo orgnicos.

Buena estabilidad mecnica.

Adecuado
tamao
de
partcula y porosidad.
Tabla 3. Clasificacin de los distintos soportes
de inmovilizacin.

5.-) Adsorcin.
Es el mtodo ms simple de
inmovilizacin, se basa en enlaces
dbiles aunque tiene cierta eficacia
en los procesos. Intervienen las
fuerzas de Van der Waals,
interacciones inicas, y puentes de
hidrogeno.
Esta tcnica es de bajo costo, fcil
preparacin, el soporte se puede
recargar,
pero
uno
de
los
inconvenientes es que el enlace es
reversible
y solo
se
puede
monitorear la reaccin en periodos
cortos.
Otros de los inconvenientes por
mencionar son: hay fuga del
biocatalizador, enlace inestable, no
es posible controlar lo anterior y
por lo tanto tiene un ndice de
reproducibilidad bajo.

Los soportes ms utilizados se

encuentran
la
carboximetilcelulosa,
el
almidn, el colgeno, sepharosa
modificada,
resinas
de
intercambio inico, silica gel,
oxido de aluminio, titanio, tierra
de
diatomeas,
cermica,
hidroxiapatita, cermica, etc.
Todos los soportes dan bajas
cantidades de protenas (1
mg/g de soporte).
5.1.-)
adsorcin
por
interaccin hidrofbicas.
La
adsorcin
mediante
interacciones hidrofbicas tiene
lugar debido a la afinidad que
presenta entre si los grupos no

polares presentes en la enzima

y el soporte. La fortaleza de la
adsorcin ser mayor cuanto
mayor
sea
el
carcter
hidrofbico
de ambos, el
soporte y la enzima.
5.2.-)
adsorcin
interacciones inicas.

por

La adsorcin de una enzima a

un
soporte
mediante
interaccin inica est basada
en los principios que rigen las
interacciones
de
naturaleza
electrosttica. Las cargas de la
enzima interaccin con aquellas
de signo opuesto del soporte,
dando
lugar
as
a
la
inmovilizacin de la enzima.
Cuando los soportes empleados
poseen un gran nmero de
cargas y los sustratos y
productos
de la reaccin
enzimtica
tambin
estn
cargados, la cintica enzimtica
suele verse distorsionada y
pueden
ocurrir
problemas
difusionales.
5.3.-)
afinidad.

adsorcin

por

El principio de afinidad entre

biomolculas complementarias
se ha aplicado tambin a la
inmovilizacin
de
enzimas
(Brena y batista-viera, 2006).
La mayor ventaja de este
mtodo se encuentra en el alto
grado de selectividad de la
interaccin ligando-enzima. Sin

embargo se requiere la unin

covalente al soporte o matriz de
un ligando de afinidad que
suele ser caro. Este ligando
unido al soporte es selectivo y
se une por afinidad a la enzima,
quedando esta inmovilizada.
5.4.-)
adsorcin
por
coordinacin a un metal.
Al depositar sobre un soporte
solido ciertas sales o hidrxidos
de metales de transicin como
mercurio, cobre, nquel, titanio
o zirconio, se puede producir la
coordinacin
del
metal
a
determinados
grupos
nucleofilicos del soporte y
posteriormente a la enzima, a
este tipo de inmovilizacin se le
conoce como inmovilizacin por
unin a un metal.
La precipitacin de estas sales
o hidrxidos de metales al
soporte (celulosa, quitina, cido
algnico, silicatos) suele llevar a
cabo mediante calentamiento o
neutralizacin.
El mtodo es bastante simple y
la actividad especfica de las
enzimas inmovilizadas por este
mtodo
es
bastante
alta.
Adems, se trata de un mtodo
reversible, pues la elucin de
las protenas inmovilizadas se
pueden conseguir fcilmente
por competicin con ligando
solubles o disminuyendo el pH.
Sin embargo, la estabilidad
operacional
alcanzada
es

variable y los resultados no son

fcilmente reproducibles.
6.-) Atrapamiento
Esta tcnica consiste en la
inclusin de la enzima por
unin covalente o no, dentro de
geles, fibras, matrices solidas
porosas
constituidas
por
prepolimeros
fotoentrucruzables o polmeros
del
tipo
poliacrilamida,
colgeno, alginato, carraginato
o resinas de poliuretano.
Adems minimiza la lixiviacin
de la enzima y mejora su
estabilidad, pero con frecuencia
resulta en limitaciones de
transporte de sustrato/analito
al sitio activo de la enzima.
Esta
tcnica
permite
la
posibilidad
de
adaptar
el
material de encapsulacin para
proporcionar el microambiente
ptimo para la enzima.
La encapsulacin eficiente se
ha
realizado
empleando
alginato de calcio, que previene
la perdida de la enzima y
aumenta
la
estabilidad
mecnica.
El proceso de inmovilizacin se
lleva a cabo mediante la
suspensin de la enzima en una
solucin
monmera,
seguidamente
se
inicia
la
polimerizacin por un cambio
de temperatura o mediante la
adicin de reactivo qumico. El

atrapamiento puede ser en

geles o en fibras, que suelen
ser ms resistentes que los
geles. En el primer caso, la
enzima queda atrapada en el
interior de un gel, mientras que
en el segundo caso la enzima
se encuentra ocluida dentro de
las microcavidades de una fibra
sinttica.
Como ventaja adicional, la
enzima
no
sufre
ninguna
alteracin en su estructura.
Pero requiere de un control
riguroso de las condiciones de
polimerizacin, as como la
comprobacin
de
que
la
naturaleza del proceso no altera
los grupos reactivos de la
protena.
El atrapamiento por medio de
nano
materiales
ha
revolucionado
el
rea
de
inmovilizacin de enzimas y ha
ampliado el rango de aplicacin
en el campo de la qumica fina,
biomedicina, biocombustibles,
biosensores y medicina.
6.-1) Atrapamientos en gel o
fibras.
Uno de los mtodos ms
utilizados
para
lograr
la
inmovilizacin de una enzima
es su atrapamiento en n gel
polimrico.
Los
geles
empleados
mayoritariamente
son
geles
de
carragenos,
alginato,
agarosa
y
poliacrilamida. En todos los

casos,
la enzima queda
retenida
en
los
huecos
intersticiales
del
soporte
polimrico. La tcnica consiste
generalmente en disolver estos
polmeros en agua, aadir la
enzima desea en disolucin y
posteriormente
enfriar
la
mezcla.
En caso de los polmeros de
acrilamida, la polimerizacin gel
puede iniciarse a partir de un
reactivo qumico, directamente
en presencia de la enzima.
Tambin se puede llevar a cabo
en el atrapamiento de la
enzima en geles de slice
obtenidos mediante procesos
sol-gel, que consisten en la
hidrolisis en agua de un
alcoxido de silicio y un proceso
posterior de policondensacin
(Gupta y Chaudhury, 2007;
Brady y Jordan, 2009).
6.-2) micro encapsulacin.
La micro encapsulacin consiste
en rodear la enzima con una
membrana semipermeable que
permite el paso de molculas
de sustrato y de producto, pero
no de la propia enzima (Arroyo,
1998).
Estas
membranas
semipermeables pueden ser
permeables o no permeables.
7.-) Unin covalente
La inmovilizacin por unin
covalente, se basa en el
entrecruzamiento de la enzima

y el material del soporte

produciendo un enlace fuerte y
estable. Este enlace covalente
es formado entre el grupo
funcional de la matriz del
soporte y la superficie de la
enzima que contiene residuos
de aminocidos.
Los residuos de aminocidos
que intervienen en la formacin
del enlace, son los grupos
amino (NH2) de la lisina o
arginina, el grupo carboxilo
(COOH) del cido asprtico o
acido glutmico, los grupos
sulfhidrilos de cistena, los
grupos hidroxilos (OH) de la
serina o treonina.
De entre los 20 aminocidos
diferentes que se encuentran
en la estructura de las enzimas,
los ms empleados para la
formacin de enlaces con el
soporte son principalmente la
lisina,
la
arginina,
la
cistena, la tirosina y la
histidina, y en menor medida
la metionina, el triptfano, la
arginina y el cido asprtico
y glutmico. El resto de
aminocidos,
debido
a
su
carcter
hidrfobo,
no
se
encuentran expuestos hacia el
exterior
de
la
superficie
proteica, y no pueden intervenir
en la unin covalente.
Los materiales utilizados en
esta
tcnica
incluyen
la
poliacrilamida, agarosa y silica,
los polmeros de polisacridos,

estos
ltimos
son
muy
populares para la inmovilizacin
de enzimas. La unin covalente
requiere de dos pasos: la
activacin del material de
soporte que se lleva a cabo por
la adicin de un compuesto
reactivo y el segundo es la
modificacin del esqueleto del
polmero para activar la matriz.
Hay
que
prestar
especial
atencin a que estos enlaces
covalentes
que se forman
entre enzima y el soporte no
afecten al centro activo de la
enzima, pues en caso de
hacerlo podra
perder su
actividad
cataltica.
La
presencia de inhibidores u otros
compuestos en el medio de
reaccin puede ayudar a evitar
la prdida de actividad, tambin
son cruciales en el proceso de
inmovilizacin
parmetros
como el tiempo de reaccin, la
temperatura, el pH o tampn
utilizado.
La inmovilizacin de enzimas
mediante unin covalente a un
soporte puede tener lugar
mediante enlaces de distinta
naturaleza
(tipo
diazo,
peptdico,
base
Schiff,
alquilacin,
arilacion
o
disulfuro)
y
la
con
la
intervencin
de
diversos
reactivos, tal y como se
muestra en la siguiente tabla 4.

Alguno de los soportes que se

han empleado para llevar a
cabo este tipo de inmovilizacin
han sido los derivados de
polisacridos
como
paminobencil
celulosa,
maminoanisol
celulosa,
maminobencil-oximetil celulosa.
7.2.-) Formacin de enlaces
tipo peptdico.
Tabla 4. Clasificacin de los distintos tipos de
unin covalente a un soporte

7.1.-) Formacin de enlaces

diazo.
Este mtodo consiste en la
funcionalizacin del soporte con
grupos diazonio capaces de
enlazarse con restos amino,
tirosil o histidil de la enzima. El
soporte debe contener grupos
amino aromtico, que pueden
ser introducidos mediante un
espaciador, de modo que estos
grupos amino se diazotan con
cido nitroso como paso precio
a la inmovilizacin.

Figura 5. Acoplamiento diazo entre el soporte

de inmovilizacin y la enzima

Este mtodo de inmovilizacin

est basado en la formacin de
enlaces
peptdicos
o
de
naturaleza similar entre el
soporte de inmovilizacin y la
enzima. Se trata de unir la
enzima al soporte, mediante el
mismo tipo de enlace que
existe
entre
los
distintos
aminocidos que forman a la
protena.
Para ello, es necesario llevar a
cabo la activacin del soporte
de inmovilizacin, mediante el
uso
de
reactivos
como:
bromuro de ciangeno, carbonil
dimidazol y cloroformiato en el
caso
de
que
le
soporte
contenga grupos hidroxilo, o
reactivos tipo carbodimida si el
soporte
contiene
grupos
carboxilo.
Existen otros reactivos, no tan
empleados
debido
a
su
toxicidad o inestabilidad de los
derivados
generados,
que
tambin permiten la activacin
de determinados soportes que
contienen grupos carboxilos o

amino para dar lugar a la

formacin de enlaces peptdicos
con la enzima.

Figura 6. Diversos mtodos de inmovilizacin enzimtica mediante la

formacin de enlaces tipo peptdicos.

7.3.-) Formacin de enlaces

de Schiff.
Este mtodo de inmovilizacin
est basado en la formacin de
bases de Schiff y posterior
reduccin de los mismos. Para
ellos es necesario activar el
soporte de inmovilizacin de
modo que se obtengan grupos
carbonilo capaces de reaccionar
con
los
grupos
amino
presentes en la estructura de la
enzima.

La activacin del soporte se

puede
conseguir
mediante
oxidacin con peryodato, en el
caso
de
determinados
polisacridos
o
soportes
activados
previamente
con
glicidol. Otro mtodo muy
empleado consiste en utilizar
un dialdehdo, cuando se desea
lograr la inmovilizacin de la
enzima
en
soportes
que
contienen grupos amino
Figura 7. Diversos mtodos de
inmovilizacin enzimtica mediante la
formacin de bases de Schiff y posterior
reduccin. (E= enzima)

7.4.-) mtodo de alquilacin

o arilacin.
Este mtodo se basa en la
inmovilizacin de una enzima
mediante
la
alquilacin
o
arilacin de sus grupos amino,
fenol o sulfhidrilos utilizando
para ello reactivos espaciadores
que se unen al soporte y a la
enzima. Estos reactivos pueden
ser
oxiranos,
divinilsulfona,
haluros de sulfonio y triazina tal
y como se detalla en la
siguiente figura.

Figura 8. Diversos mtodos de inmovilizacin enzimtica mediante el mtodo de

alquilacin o arilacin. (E= enzima)

7.5.-)
Reacciones
de
intercambio tio-disulfuro.
El intercambio tio-disulfuro se
produce
entre
grupos
tiol
presentes en la enzima y los
residuos disulfuro mixtos del
soporte. En primer lugar, se
hace reaccionar un soporte que
contiene grupos tiol con 2,2,dipiridildisulfuro obteniendo asi
un
derivado
con
enlaces
disulfuro.
Posteriormente, la enzima se
enlasa por medio de sus grupos
tiol y ocurre la liberacin de 2tiopiridona. La caracterstica
principal de este enlace es su
reversibilidad, pues a pesar de
su carcter covalente, existen
reactivos
como
ditiotreitol
(DTT) que en condiciones
suaves pueden romper esos
puentes disulfuro establecidos
entre la enzima y el soporte
(Brena y Batista-Viera, 2006).
En este mtodo aporta la
ventaja como la posibilidad de
reutilizar el soporte, una vez
que la actividad enzimtica
haya cado, eliminando la
enzima
agotada
y
sustituyndola
por
enzima
nueva.
Como
soportes
de
inmovilizacin
ha
sido
empleados
la
agarosaglutation-2-piridil
disulfuro
(llamada
sefarosa
tolactivada),
agaraso-

mercaptohidroxipropieter-2pirdil disulfuro y agarosa-cido

adpico
hidracina-N-acetilhomocisteina-2piridil disulfuro.
Entre enzimas inmovilizadas
por enlaces disulfuro podemos
encontrar:
anhidrasa
Carbonica,
-galactosidasa,
penicilina G-acilasa y lipasa.

Figura 9. Inmovilizacin enzimtica mediante

reacciones de intercambio tiol-disulfuro. (E=
enzima)

8.-)
Entrecruzamiento
Reticulado.

La
inmovilizacin
por
entrecruzamiento o reticulado
ocurre en ausencia de un
soporte slido y consiste en la
formacin
de
enlaces
intermoleculares
entre
diferentes molculas de enzima
por medio de reactivos bi-o
multifuncionales.
Estos
reactivos
pueden
ser
glutaraldheido,
bisdiazobenzidina, entre otros
que
dan
lugar
a
entrecruzamiento
mediante
formacin de bases de Schiff,
acoplamientos diazo, alquilacin
o
enlaces
peptdicos
respectivamente. De todos ellos

el
ms
usado
entrecruzamiento
glutaraldhedo.

es
el
mediante

Entre las ventajas de este

mtodo
se
encuentran su
simplicidad, y la disponibilidad
de controlar el tamao de
partcula y las propiedades del
producto
final.
Como
inconvenientes podemos citar
que las reacciones se realizan
en condiciones relativamente
severas,
con
lo
que
la
conformacin del centro activo
de la enzima puede verse
afectada,
provocando
una
importante
prdida
de
actividad.

Figura 10. Inmovilizacin enzimtica por

entrecruzamiento con glutaraldehdo.

9.-) Comparacin entre los

mtodos de inmovilizacin.
Todos
los
mtodos
de
inmovilizacin
presentan
ventajas e inconvenientes con
respecto al resto. No existe un
mtodo ideal y general para la
inmovilizacin
de
cualquier
enzima (Arroyo, 1998). Por lo
tanto, la eleccin del mtodo y
condiciones de inmovilizacin

deber realizarse en base a la

enzima concreta a inmovilizar
y a la aplicacin posterior que
se le va a dar a la preparacin
final obtenida.
Otros
factores
como
la
naturaleza
del
sustrato,
producto o tipo de reactor a
emplear
tambin
son
determinantes en la eleccin
del mtodo de inmovilizacion.
En la siguiente tabla se muestra
un
resumen
de
las
caractersticas generales
de
cada mtodo de inmovilizacin
(fortaleza del enlace, dificultad,
regeneracin
del
soporte,
validez del mtodo y coste del
proceso), as como de las
propiedades generales de las
enzimas
inmovilizadas
por
dicho
mtodo
(actividad
enzimtica y estabilidad).
No obstante pueden existir
excepciones a estas tendencias
generales debido a que un
determinado tipo de enzima con
un determinado tipo de soporte
puede originar la aparicin de
caractersticas
especiales
distintas a las esperadas.

Tabla 5. Comparacin entre los distintos

mtodos de inmovilizacin.

establecida por el Working on

Immobilized Biocatalysis:

10.-) Eleccin del mtodo.

La eleccin a detener en cuenta
las condiciones de la reaccin
biocatalizada, el tipo de reactor
que se vaya a utilizar, el tipo de
sustrato que se tenga que ser
procesado y otros factores.
En general, los mtodos de
preparacin difcil y de mayor
coste
proporcionan
biocatalizadores ms estables y
duraderos; en cambio aquellos
mtodos ms sencillos como el
atrapamiento o la adsorcin,
donde la unin de la enzima
con el soporte es dbil, origina
derivados inmovilizados que
presentan perdidas de actividad
y que deben ser repuestos
continuamente. Una vez elegido
el mtodo ms conveniente, los
derivados
que
preparemos
deben
estar
caracterizados
segn
las
indicaciones

Tabla 6. Caracterizacin de un derivado

inmovilizado.

11.-) Propiedades de
enzimas inmovilizadas.

las

Cuando se inmoviliza una

enzima se producen cambios en
algunas de sus propiedades
como pueden ser la actividad
cataltica o estabilidad trmica
(Brena y Batista-Viera, 2006).
Estas modificaciones pueden
ser debidas a varios factores. Al

interaccionar la enzima con el

soporte
de
inmovilizacin
pueden
producirse
cambios
conformacionales
en
la
estructura tridimensional de la
protena que afectan a su
centro activo.
Adems, las interacciones que
surgen entre el soporte y el
sustrato, ya sean de naturaleza
electrosttica, hidrofbicas o
impedimentos
estricos,
contribuyen a que la interaccin
entre la enzima inmovilizada y
el sustrato tengan lugar en un
microentorno diferente al de la
solucin.
Todos estos factores actan
conjuntamente, dando lugar a
la
modificacin
de
las
propiedades de la enzima
inmovilizada, y resulta difcil
determinar que factor provoca
un determinada cambio.
12.-) Actividad cataltica.
La actividad cataltica de las
enzimas generalmente se ve
afectada tras el proceso de
inmovilizacin (Garca-Glan et
al, 20011). Para que un mtodo
de inmovilizacin sea til la
enzima debe mantener su
actividad cataltica tras la
inmovilizacin,
aunque
a
menudo esta disminuye.
En algunas ocasiones puede
llegar
a
perderse
completamente
la
actividad

enzimtica debido a factores

como que: la enzima al
inmovilizarse lo haga de tal
forma que quede impedido el
paso del sustrato al centro
activo, algn grupo del soporte
reaccione con el aminocido del
centro activo esencial para la
actividad cataltica, ocurra un
cambio conformacional durante
la inmovilizacin que da lugar a
una forma inactiva o las
condiciones
del
proceso
ocasiones la desnaturalizacin
de la enzima (Arroyo, 1998).
Cuando la enzima mantiene su
actividad
despus
de
la
inmovilizacin,
los
cambios
(disminucin o aumento de la
actividad enzimtica) se deber
principalmente
a
efectos
difusionales,
electrostticos,
estricos y/o del microentorno.
13.-) Especificidad
sustrato.

por

el

Cuando se lleva a cabo la

inmovilizacin de una enzima la
especificidad por su sustrato
puede cambiar. En general, al
inmovilizar una enzima sobre
un soporte
polimrico, su
actividad hacia sustratos de
elevado
peso
molecular
disminuye
debido
a
impedimentos
estricos,
especialmente en el caso de
inmovilizacin
por
atrapamientos; mientras que si
el sustrato es de bajo peso
molecular no suele observarse

cambios
en
enzimtica
inmovilizacin .

la
actividad
tras
la

Una solucin para minimizar

estos impedimentos estricos
es la introduccin de un brazo
espaciador o cadena alqulica
de dos a ocho tomos de
carbono
entre
soporte
y
enzima. No obstante, se ha
observado en algunos caso que
la
accin
de
determinas
enzimas inmovilizadas frente a
sustratos
de
levado
peso
molecular
esta
favorecida
respecto a sustratos de bajo
peso molecular, probablemente
debido a fuerzas atractivas
entre sustrato y soporte de
inmovilizacin.
14.-) Constantes cinticas.
Por lo general, las constantes
cinticas se ven alteras cuando
esta es inmovilizada. El estudio
cintico de la enzima tras la
inmovilizacin resulta de vital
importancia para comprender
como le ha afectado dicho
proceso y cules son sus
caractersticas finales.
Hay que tener en cuenta que
las
constantes
cinticas
medidas
con
enzimas
inmovilizadas no son verdades
constantes
cinticas
equivalentes a las obtenidas en
un
medio
de
reaccin
homogneo con enzimas en
disolucin, sino que se trata de

valores aparentes debido a

efectos de difusin y otros
factores fsicos que tiene lugar.
14.1.-)
Constante
Michaelis (Km).

de

En muchos casos, el valor de la

constantes de Michaelis, Km,
aumenta tras la inmovilizacin,
lo que significa que disminuye
la afinidad aparente de la
enzima inmovilizada por el
sustrato. En otras ocasiones, el
cambio producido en el valor de
Km debido a la inmovilizacin es
pequeo o nulo, o incluso
puede
llegar
a
disminuir
ocurriendo aparentemente un
aumento de la afinidad de la
enzima por su sustrato.
Algunas explicaciones dadas a
la modificacin de los valores
de Km hace referencia a
cambios conformacionales de la
enzima,
interacciones
electroestticas entre soporte y
el
sustrato,
adsorcin
del
sustrato
al
soporte
y
limitaciones en la difusin del
sustrato
y/o
producto,
especialmente en el caso de
inmovilizacin
por
atrapamiento.
14.2.-)
(Vmax).

Velocidad

mxima

Dependiendo al mtodo de
inmovilizacin escogido y de la
naturaleza del soporte, la
cantidad
de
enzima

inmovilizada y su conformacin
puede variar afectando as la
velocidad mxima aparente,
Vmax,
que muestra dicha
enzima al actuar sobre su
sustrato. Existen casos en los
que se ha descrito una mejor
de Vmax tras la inmovilizacin y
en otros muchos se ha descrito
una disminucin.
Este parmetro nos da una
informacin
limitada,
pues
cuando ocurre un aumento de
Vmax no se puede saber si se
debe a una mayor cantidad de
enzima inmovilizada o a un
aumento de su actividad, por lo
que
es
difcil
establecer
comparaciones entre distintos
mtodos de inmovilizacin o
diferentes soportes.
15.-) Temperatura y pH.
Cuando se lleva a cabo la
inmovilizacin de una enzima,
estos
valores
ptimos
de
temperatura y pH pueden verse
alterados. Un buen mtodo de
inmovilizacin ser aquel que
permita a la enzima actuar con
una actividad cataltica mxima
durante un mayor rango de
temperaturas y pH.
16.-) Estabilidad.
En muchos casos se observa un
incremento en la estabilidad de
las enzimas despus de su
inmovilizacin. Este fenmeno
puede ser debido a una

estabilizacin
conformacional
de la enzima (ocasionada por
una mayor rigidez de su
estructura y prevencin de la
disociacin
de
sus
subunidades), a la proteccin
que ejerce el soporte frente a
proteasas del medio, a una
disminucin de los problemas
de agregacin intermolecular o
a la creacin artificial de un
microentorno favorable para la
enzima como resultado de la
inmovilizacin. Hay diferentes
estabilidades dependiendo a la
interaccin de algunos factores:

Estabilidad
hacia
reactivos.
Estabilidad hacia enzimas
proteolticas.
Estabilidad Trmica.
Estabilidad operacional.
Estabilidad
durante
el
almacenamiento.
Estabilidad frente al pH

17.-)
Aplicacin
de
enzimas inmovilizadas.

las

La inmovilizacin de enzimas ha
dado lugar principalmente a
aplicacin en los campos del
anlisis,
la
medicina,
la
industria y el medioambiente.
Entre algunas aplicaciones se
encuentran:

biosensores.
Tratamientos con enzimas
inmovilizadas.
Biocatalizadores

Referencias:
http://www.bionova.org.es/biocast
/documentos/tema14.pdf
https://www.google.com.mx/url?s
a=t&rct=j&q=&esrc=s&source=we
b&cd=1&cad=rja&uact=8&sqi=2&
ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2
F%2Fwww.researchgate.net%2Fpr
ofile%2FMiguel_Arroyo%2Fpublica
tion%2F237564145_Inmovilizacin
_de_enzimas._Fundamentos_mtod
os_y_aplicaciones%2Flinks%2F00
b7d524d21ceec982000000.pdf&ei
=fyk8VbOUD8yoNtvygYgC&usg=A
FQjCNEPSChoeJQ8yJP4phr_XJnV8
Xbyqg&sig2=1NjGbOHfbrpfM9usA
d2S7Q&bvm=bv.91665533,d.eXY
http://iqtma.cps.unizar.es//compo
nents/com_docman/dl2.php?archi
ve=0&file=SU5NT1ZJTElaQUNJX05
fREVfRU5aSU1BUy5wZGY=
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/use
rs/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzi
mas.pdf