Fundamentos y

aplicaciones de la
citometra de flujo

Jos M. Prez de la Lastra

Objetivos
Dar a conocer el principio de la tcnica
-Funcionamiento del citmetro
-Ventajas y limitaciones
Mencionar algunas aplicaciones interesantes para
la sanidad animal
-Anlisis de heterogeneidad celular
-Anlisis del ciclo celular
-Linfoproliferacin

Flow ~ cells in motion

Cyto ~ cell
Metry ~ measure
Measuring properties of cells while in a fluid
stream

Muestras biolgicas usadas en citometra de flujo

Genmica

Protemica

Citmica

Citmetro de flujo

Fundamentos de la citometra
Analiza clulas u otras particulas en suspensin.
Procedimiento rpido, objetivo y cuantitativo.
Se basa en la interaccin de las celulas con un haz luminoso, esto
genera una serie de seales que se recogen en unos detectores.
Estas seales son transformadas en impulsos electricos que se pueden
amplificar y convertirse en seales digitales.
Las seales digitales se procesan en un ordenador donde se realiza el
anlisis cualitativo y cuantitativo

Microscopa ptica y citometra de flujo

Laser monocromtico
Las seales se procesan digitalmente
El anlisis es ms objetivo
Realiza medidas cuantitativas

CD4

CD2

10

Microscopy
Localization of antigen
is possible
Poor enumeration of cell
subtypes
Limiting number of
simultaneous
measurements

Flow Cytometry
Cannot tell you where
antigen is.
Can analyze many cells
in a short time frame.
Can look at numerous
parameters at once.

11

Componentes de un citmetro de flujo

Sistema
informtico

Sistema pticoelectrnico

Sistema
de
fluidos

12

El citmetro de flujo
Consta de cuatro componentes: sistema de fludos, sistemas
ptico, electrnico e informtico.
El sistema de fludos permite que las clulas sean analizadas
de una en una.
El sistema ptico analiza las clulas mediante su interaccin
con el haz luminoso (laser).
El sistema electrnico filtra y procesa las seales generadas
por el sistema ptico
El sistema informtico almacena la informacin y permite el
anlisis de los datos de manera interactiva con el operador

13

THE FLOW CELL

Laser focusing and
hydrodynamic
focusing

LASER

Waste
Tank

Sheath
Tank
Vacuum

Sheath
Pressure
(Constant
)

Sample
Pressure

Line Pressure

14

El sistema de fluidos
Constituido por el lquido que contiene la suspensin celular y un fluido
mvil que rodea al lquido que contiene la muestra.
Las clulas son inyectadas a presin variable en el fluido mvil o
lquido envolvente.
El lquido envolvente es impulsado continuamente a salir por un orificio
estrecho y se mantiene a presin constante.
Durante el trayecto, se consigue que las clulas permanezcan en el
centro del caudal del lquido envolvente alineadas y de una en una
(enfoque hidrodinmico).
La presin con la que se introduce la muestra en el fluido influye sobre
la resolucin de la adquisicin de la muestra.

15

Notice how the ink is

focused into a tight
stream as it is drawn
into the tube under
laminar flow conditions.

Notice also how the

position of the inner ink
stream is influenced by
the position of the ink
source.
V. Kachel, H. Fellner-Feldegg & E. Menke - MLM Chapt.
3
16

Presin de la muestra y resolucin

Baja presin (12 l/min)

Alta presin (60 l/min)

Anlisis de contenido en ADN

Inmunofenotipaje

17

Sistema ptico
La luz, al incidir sobre las clulas se dispersa en dos
direcciones: horizontal y verticalmente.
Esta dispersin proporciona informacin relativa sobre el
tamao de las clulas y la granulosidad.
La luz incidente puede, adems, excitar una serie de
fluorocromos presentes en las clulas.
La presencia de fluorocromos proporciona informacin
adicional sobre las clulas.
En principo, el citmetro puede detectar cualquier propiedad
celular o bioqumica que se acople a un fluorocromo.

18

Sistema ptico

19

El sistema ptico
Consta de una fuente luminosa y de dispositivos colectores y
discriminadores de las seales producidas.
La fuente luminosa es un lser azul (488 nm) de 15 mW,
monocromtica y unidireccional.
La seal ptica generada tras la interaccin con las clulas es
filtrada por espejos dicroicos y lentes colectoras que conducen las
seales hacia los detectores.
La seal recogida por los detectores puede ser de dos tipos: luz
dispersa (por la presencia de clulas o partculas) y luz emitida
(por fluorocromos).

20

DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE

(FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)

SSC

FSC

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia

delante en un pulso de voltaje proporcional al tamao
de la clula/particula
21

DETECCION DE LUZ DISPERSADA

LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,
SSC)
SSC

FSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada

lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al
contenido en orgnulos membranosos (granularidad)

22

Fluorescencia

FLFL-2

FLFL-1

FSC

23

Emisin de luz (Fluorescencia)

Los fluorocromos son sustancias que absorben energa luminosa de
una determinada longitud de onda.
Esta absorcin de luz provoca el ascenso de electrones a niveles
energticos superiores.
Los electrones excitados regresan rpidamente a su estado normal
emitiendo un fotn y desprendiendo energa radiante.
La energa consumida en la absorcin de luz es mayor que la
liberada y, por lo tanto, la longitud de onda que se desprende es
mayor que la que se absorbe (salto de Stokes).

E=ch/

24

25

Fluorocromos usados en citometra

Los ms usados deben absorber a una misma longitud de
onda de 488 nm (luz azul).
Para que dos o ms fluorocromos se puedan usar
simultneamente, sus longitudes de onda de emisin deben
ser diferentes.
La intensidad de fluorescencia que se recoge en los detectores
es proporcional al nmero de molculas de fluorocromo
presentes en las clulas.

26

Espectro de longitudes de onda de la luz

27

Espectro de Absorcin
Representacin de la intensidad de absorcin de luz de
distintas las longitudes de onda por una sustancia.

Espectro de Emisin
Representacin de la intensidad de emisin de una sustancia
excitada con luz de una determinada longitud de onda.

excitacin

medida

(nm)
28

29

DETECCIN DE FLUORESCENCIA
TC
PerCP
QR

Fluorocromos

Detectores

FL-1

FL-2

FL-3

Cy5
APC

FL-4

30

Isotiocianato de fluorescena (FITC)

31

Ficoeritrina (PE)

32

La citometra de flujo en biologa

Los citmetros actuales pueden detectar la presencia de hasta 18
fluorocromos en cada clula.
Algunos citmetros pueden incluso separar clulas de inters de
una suspensin heterognea (sorting)El uso del citmetro de flujo no est restringido a ningn rea de la
biologa, aunque su uso est muy extendido en medicina clnica.
La citometra es una tecnologa multidisciplinar, comprende reas
como la ptica, electrnica, qumica e informtica.
Es una tcnica de gran sensibilidad, objetividad y rpidez

33

Ventajas de los fluorocromos

Cuando un fluorocromo se conjuga a un anticuerpo
monoclonal, ste se puede usar para identificar un
determinado tipo de clulas que portan el antgeno
correspondiente.
Combinado con otros parmetros, como FSC (tamao) y
SSC (complejidad) se pueden identificar las clulas
presentes en una muestra y cuantificarse en forma de
porcentaje.
En algunos citmetros incluso pueden separse estas clulas
(sorting)

34

35

Sistema informtico
La informacin sobre cada clula se recoge y se
almacena en un ordenador.
Los resultados de todas las medidas obtenidas se
conservan en forma de listado numrico.
El uso de software adecuados permite el anlisis de las
propiedades de las clulas de modo interactivo, mediante
la combinacin de varios parmetros.

36

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO
DE INFORMACIN
N
1
2
3
4
5
6
7
8
.
.
.
10000

FSC SSC FLFL-1 FLFL-2 FLFL-3 FLFL-4 TIEMPO

2
2
3
4
3
4
2
2
.
.
.

1
1
2
2
1
2
3
8
.
.
.

1
1
3
4
1
1
2
1
.
.
.

1
2
3
1
2
3
1
2
.
.
.

1
3
3
4
1
1
3
4
.
.
.

2
2
3
3
5
5
1
2
.
.
.

1
1
1
1
2
2
2
2
.
.
.

Los pulsos deVoltaje(seales analgicas) son transformadas en

seales digitales
Las seales digitales almacenan en un soporte informtico en
modo listado (almacenamiento multiparamtrico).
37

Sorting

38

Diagramas de representacin
Dot plot o citograma. Representa dos parmetros en los ejes
horizontal y vertical.
Histograma. Un slo parmetro en el eje horizontal frente al
nmero de clulas.
Diagramas de contorno. Dos parmetros, similar al dot plot pero
con lneas de contorno que conienen igual nmero de clulas.
Diagaramas de densidad. Dos parmetros, representa el nmero
de clulas en gradiente de colores.
Diagramas 3-D. Dos parmetros en un plano y nmero de clulas
en vertical.

39

Event
#

Param 1
FSC

Param2
SSC

Param
3
FITC

Param
4
PE

Param
5
APC

100

500

10

650

110

505

700

700

90

480

720

670

10

95

490

15

720

15

0101001000.10000
40

41

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