Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

Castaeda, David. Y Lpez, Mayra.

Universidad de La Sabana
Resumen En la sesin de laboratorio se realiz el espectro de absorcin UV-Vis para clorofila en diferentes

concentraciones para determinar su mx., aplicando la ley de Lambert-Beer, calculando grficamente el valor del coeficiente
de extincin molar, para ello se utiliz una solucin patrn y clorofila comercial para as implementar la espectrofotometra
como mtodo de anlisis del cual se obtuvo 0.580 de absorbancia por parte de la clorofila comercial y (0.008, 0.009, 0.014,
0.021) para las concentraciones (2,4,8,16,20) respectivamente a partir de la solucin patrn, este estudio permito la
realizacin de una curva de calibracin, de esta se determin que Utilizando la ley de Lambert- Beer se realiz una regresion
lineal de calibrado para la clorofila la cual no quedo recta por variaciones en la toma de la absorbancia de las diluciones.

Abstract In the laboratory session spectrum UV -Vis absorption was performed to chlorophyll in different
concentrations to determine their max. , Applying the law of Lambert -Beer , graphically calculating the value of the
molar extinction coefficient , for this solution was used pattern and implement commercial chlorophyll so
spectrophotometry as a method of analysis which 0.580 absorbance was obtained by the commercial chlorophyll
(0.008 , 0.009 , 0.014 , 0.021 ) for the concentrations ( 2,4,8,16,20 ) respectively from the standard solution , this
study allow the realization of a calibration curve , this is determined using the Lambert-Beer law linear regression
calibration for chlorophyll which not stay straight performed by variations in the absorbance making dilutions .

ndice de Trminos Ley de Lambert-Beer, Espectrofotomtria, Absorbancia y Transmitancia.

Espectrofotometra: Espectros de absorcin y cuantificacin espectrofotomtrica de

Biomolculas

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

(Cordoba, 2010)

La clorofila es el pigmento que hace que las

plantas sean verdes, la clorofila absorbe la luz
en el espectro violeta, azul y rojo, pero
transmite y refleja la luz verde.
Existen varios tipos de clorofila que varan en
su estructura, Las ms importantes en las
plantas son, la clorofila tipo A que es el
pigmento
ligado
directamente
en
la
transformacin de la energa de la luz en
energa qumica, y la otra es la clorofila B que
las clulas fotosintticas casi siempre contienen
que es la clorofila b y otro grupo de pigmentos
llamados carotenoides.
(Cordoba, 2010)
Los carotenoides pueden absorber luz de
longitudes de onda diferentes de las que
absorbe la clorofila. Estos pigmentos operan
como pantallas que transfieren la energa a la
clorofila A, desarrollando as la gama de luz
utilizable para la fotosntesis. (Berjio, 2006)
La clorofila B se diferencia de la clorofila A por
estar sustituido el grupo metilo (--CH) del
carbono 3 en el segundo anillo, por un grupo
aldehdo (--CHO). Esta diferencia es suficiente
para generar un cambio en la coloracin y
tambin en el espectro de absorcin de la
molcula.
Figura 1. Estructura de la clorofila A Y B

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

En el espectro de absorcin se revelan las partes

de la radiacin visible absorbidas por las
clorofilas, las clorofilas A y B tienen puntos de
mxima absorcin en la radiacin roja y azul,
mientras que la verde o la roja oscura son poco
absorbidas.
La clorofila A es de color verde azulada y la
clorofila B es de color verde amarillento. Esta
diferencia se manifiesta en el espectro de
absorcin como se haba mencionado
anteriormente, en la B, ambos mximos de
absorcin muestran una tendencia hacia la parte
verde, es decir, el mximo en la parte roja es
desalojado hacia ondas ms cortas y el mximo
en la parte azul hacia ondas ms largas.
Tambin se evidencia la diferencia en los
mximos de absorcin los cuales cambian entre
las diferentes clorofilas.
(UNAL, 2011)

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

Imagen 1. Espectro de absorcin a partir de

clorofila. (Biologicos, 2008)

(Cordoba, 2010)
Transmitancia y Absorbancia

Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert es una relacin prctica que
relaciona la absorcin de luz con las
propiedades del material, y se define por medio
de la siguiente formula:
A = log I/Io = cl
La absorbancia de una solucin es directamente
proporcional a su concentracin es decir a
mayor nmero de molculas mayor interaccin
de la luz entre ellas, depende de la distancia que
recorre la luz por la solucin, a igual
concentracin entre ms distancia recorre la luz
por la muestra ms molculas se encontrar; y
tambin depende de que es una constante de
proporcionalidad denominada coeficiente de
extincin .Como A es adimensional, las
dimensiones de dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se formula siempre en cm
mientras que la primera (c) se hace, siempre
que sea posible, en m con lo que las
dimensiones de resultan ser m-1cm-1 llamado
coeficiente de extincin molar (m). Cuando se
desconoce el peso molecular del soluto, la
concentracin de la disolucin se expresa en
otras unidades distintas de m, por ejemplo g/L,
y las dimensiones de son distintas, por
ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente as
expresado se denomina coeficiente de extincin
especfico (s).
(Cordoba, 2010)
La ley de Lambert-Beer se cumple para
soluciones diluidas; que tienen valores de c
altos, y donde vara con la concentracin
debido a fenmenos de dispersin de la luz,
agregacin de molculas, cambios del medio,
etc.
Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

La transmitancia es una magnitud que enuncia

la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo
en unidad de tiempo.
La transmitancia (T) de una sustancia en
solucin es la relacin entre la cantidad de luz
transmitida que llega al detector una vez que ha
atravesado la muestra, y la cantidad de luz que
incidi sobre ella, y se representa normalmente
en por ciento: % T = It/Io x 100. (Brown T. ,
2011)
La transmitancia da una medida fsica de la
relacin de intensidad incidente y transmitida al
pasar por la muestra. La relacin entre %T y la
concentracin no es lineal, pero asume una
relacin logartmica inversa. (Brown T. , 2011)
La absorbancia (A) es un concepto relacionado
con una muestra, y es conocida como la
densidad ptica, que es una relacin
logartmica entre la intensidad de la luz que
incurre sobre una muestra y la intensidad de esa
misma luz que es transmitida a travs de esa
muestra. Cuando una luz de una longitud de
onda determinada, seleccionada por un filtro,
incide sobre una muestra, parte de esa luz es
absorbida, y la luz no absorbida pasa a travs de
la muestra y es recogida por un detector frente a
la fuente de luz. Y se define como el logaritmo
de 1/T, lo que quiere decir que: A = log 1/T =
-log T = -log It/Io
Cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales, la transmitancia debe ser del 100%
lo que nos indica que la muestra no absorbe una
longitud de onda determinada, y por lo tanto A
es igual a log 1 = 0, y la a cantidad de luz
absorbida depender de la distancia que
atraviesa la luz a travs de una solucin y de la
concentracin.

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

(Cordoba, 2010)
Documento tomado de informe de la
universidad nacional de ingeniera. 15-092009, Raul LLantoy. Curva spectral y ley de
beer.
II MATERIALES Y REACTIVOS

Espectrofotmetro.
Agitador de tubos de ensayo.
Balanza.
Gradillas con 12 tubos de ensayo.
Juego de pipetas graduadas (0.5, 1.0,
2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 ml).
Juego de micro pipetas
Probetas 100 ml
Vaso de precipitado 100 mL
7 Balones aforados de 25 mL
Agitador de vidrio
Mortero
Celdas de cuarzo para medir en el
espectrofotmetro.
etanol 90%, ter de etlico 10%.

Los materiales fueron otorgados por el

laboratorio de Bioqumica de la Universidad
de la Sabana.
IV PROCEDIMIENTO
Se tom el patrn de clorofila (pastilla) y se
macer con la ayuda del mortero finamente.
Luego se prepar una solucin patrn de
clorofila de 5 mg/mL en una mezcla de etanol
y ter etlico.
Si no se disuelve completamente el slido
llevar a cabo una filtracin.
Con el patrn se mont una alcuota en una
celda de cuarzo y se llev a cabo un barrido
del espectro UV-Vis con ayuda del
espectrofotmetro se determin la max y se
realiz la curva de calibracin
Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

Curva de calibracin para clorofila

Con el patrn preparado en la primera parte
preparamos diluciones de 25 mL de 2, 4, 8,
12, 16 y 20 g/mL determinamos la
absorbancia en el espectrofotmetro, y
realizamos la curva de calibracin.
Determinacin de Clorofila en la muestra
problema
Se pesaron 200 g de pasto fresco
Se cortaron en trozos muy pequeos, y se
dejaron en la estufa a 40C. Luego se pes
el pasto y se determin la humedad
posteriormente a esto se coloc el material
seco dentro de los dedales de soxhlet y se
llev a cabo la extraccin con una mezcla
de etanol y ter etlico (9:1) durante un
tiempo. Colocar el material seco dentro de
los dedales de, se sec completamente y se
prepar una solucin de 1 mg/mL para
hacer la determinacin de la clorofila en las
condiciones que se realiz la curva de
calibracin.
V RESULTADOS Y DISCUSIN
Para la curva de calibracin de la clorofila, con
la solucin patrn se prepar diluciones de 25
mL de 2, 4, 8, 12 , 16 20 g/mL en los balones
aforados, se llevaron a l espectrofotmetro y se
determin la absorbancia en para cada una de
las diluciones. Los resultados de la toma en el
espectrofotmetro fue la siguiente:
Concentraci Absorbanci
n[]
a
2
0,008
4
0
8
0,009
12
0,003
16
0,014
20
0,021
Tabla 1. Datos tomados durante la practica de
laboratorio.

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

Como se puede observar en el cuadro, la

absorbancia de cada una de las diluciones no
fueron las mejores ya que tiene una
inconsistencia y no tienen una secuencia si no
que varan mucho. Esto se puede ser debido
principalmente a la hora de la preparacin de
las disoluciones ya que como fueron preparadas
por diferentes personas hubo variaciones en las
condiciones de cada una, lo que causa que al
tomar la absorbancia no saliera de la forma
correcta. Por esta razn para la realizacin de la
curva se decidi tomar solamente las
concentraciones 2, 8, 16 y 20 que son las que
llevan una secuencia entre ellas.

Tabla 2. Datos utilizados para la realizacin de

la curva de calibracin.
La curva de calibracin se defini con una
regresin lineal para determinar la ecuacin
de la recta el rango de error que se presenta
en esta es aproximadamente de 14% entre
los valores utilizados para esta.
Al realizar la curva de calibracin se observa
que no da una curva adecuada no da
exactamente una recta como debera dar,
debido a que la preparacin y toma de cada
una de las diluciones fueron incorrectas. Para
la preparacin de cada una de las diluciones
se utiliz una sencilla formula:

Absorbancia vs Concentracion
Absorbancia vs
Concentracion

0.03
0.02
Absorbancia

0.02
0.01

Linear
f(x) = 0x + 0.01
(Absorbancia vs
R = 0.87 Concentracion)

0.01
0

Grafica 1. Curva de calibracin Absorbancia vs Concentracin

Para la realizacin de la curva se tomaron en

cuenta los datos de la siguiente tabla:
Concentraci Absorbanci
n[]
a
2
0,008
8
0,009
16
0,014
20
0,021

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

C1 V1=C2 V2
En donde en el caso de la primera dilucin que
es 2mg/mL se desarroll de la siguiente forma,
la C1= 2 mg/mL, el V1= 10 mL, C2= 5000.
Por lo que la formula queda al despejar el
volumen 2 que es lo que se necesita saber para
poder preparar la nueva disolucin as :
2mg/mL * 10 mL / 5000 mg/mL
= 0,04 *1000 = 4mL

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

(Se multiplica por 1000 para pasar los 5000

mg a g). Despus de realizar estos clculos
se toman 4ml de la solucin patrn se ponen
en el baln aforado de 10 ml y se llena con
etanol, y as se prepara cada una de las
diluciones
con
las
concentraciones
correspondientes. En medio de este
procedimiento pudieron haber variaciones de
la toma de clculos en los diferentes grupos
lo cual causo que las diluciones y sus
concentraciones quedaran mal tomadas y
afectaran al final en el resultado de la
absorbancia y por lo tanto de la curva.

Se utiliz la ecuacin de la recta para

determinar el coeficiente de extincin molar
en las diluciones correspondientemente para
la (tabla 2 pagina 5):
Y = mx+b
Y b
X=
m

4.142
5.571
12.714
22.714

Simultneamente la realizacin de la muestra

con clorofila comercial se desarroll para la
comparacin de los datos obtenidos a partir de
la solucin patrn, los resultados arrojados
fueron:
Absorbancia
Coeficiente de extincin
molar

0.580
1642.5

Tabla 3. Resultados para clorofila comercial.

Para determinar el coeficiente de extincin
molar de los datos se expresa el siguiente
despeje de la ecuacin de la recta:
Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

Y b
X=
m
X=

Y = mx+b

0.5800.0051
2
0.0007

X = 1642.5
El coeficiente de extincin molar determinado
para la clorofila comercial a partir de la
ecuacin de la recta arrojo 1642.5 esto permite
inferir que las diluciones tomadas de la solucin
patrn son mucho ms concentradas que la
clorofila expendida en los establecimientos
comerciales, demostrando as las diferencias en
la absorbancia por parte de la clorofila de las
sustancias estudiadas, es claro afirmar que
todos los datos obtenidos cumplen la ley de
lambert-beer ya que esta dice que la
absorbancia de una sustancia no puede ser
mayor a 1, por esta razn el margen de error
que se obtiene de la grfica con respecto a la
regresin es completamente dependienta de
esta, esto quiere decir que el error arrojado
puede variar si la absorbancia tomada de las
diluciones demuestra otros datos.
Por otra parte la grfica permite determinar la
distancia o max de las absorbancias obtenidas
las cuales se pueden hallar por la ley de
lambert-beer respectivamente (tabla 2 pgina
5):
A = dc
A
d=
c

9.6*10-4
2.19*10-4
6.88*10-5
4.62*10-5

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Como es posible observar los son muy

amplios en comparacin al de la clorofila
comercial la cual es mucho menor por su alto
Coeficiente de extincin molar.
El anlisis de la clorofila permite determinar la
cantidad de pigmentos fotosintticos en la
planta de acelga sin embargo la exactitud de los
clculos depende de la calibracin previa del
aparato y de los patrones especficos tomados.
Para complementar el estudio de la clorofila se
decidi pesar pasto y determinar la humedad de
este los datos obtenidos se observan en la
siguiente tabla:
Peso
capsula
sola (g)
58,6541
53,4781
56,0701
44,0728

Peso
muestra
(g)
7,3118
8,1658
6,160
4,3972

Peso con
muestra
seca (g)
59,5376
54,5349
56,8985
44,6451

%
Humedad
87,92
87,01
86,62
86,97

VII CONCLUCIONES

Se estableci el espectro de absorcin

UV-Vis para la clorofila y as mismo su
mx el cual es posible determinarlo como
la maxima distancia = 9.6*10-4.

Utilizando la ley de Lambert- Beer se realiz

una regresion lineal de calibrado para la
clorofila la cual no quedo recta por variaciones
en la toma de la absorbancia de las diluciones.
Se calcul grficamente el valor del coeficiente
de extincin molar siendo x= 1642.5.
La determinacin
cuantitativa de
clorofila de la muestra problema fue de:
(0.008, 0.009, 0.014, 0.021) para la
absorbancia, (4.142, 5.571, 12.714,
22.714) para el coeficiente de extincin
molar y (9.6*10-4 ,2.19*10-4 ,6.88*10-5 ,
4.62*10-5) para el .

Tabla 4. Porcentaje de humedad en la muestra

de pasto seco.
VIII ANEXOS
CUESTIONARIO
1. La absortividad molar de cierto soluto es
de 2.1x104. Calcular la transmitancia
para una solucin 2.00x10-6 M.
utilizando una cubeta de 5.00 cm.
Ley de Lambert-Beer
A = dc

Grafica 2. Grafica de la solucin patrn Absorbancia

Vs longitud de Onda.

En esta grafica podeos observar la longitud de

onda de acuerdo a la Absorbancia de la solucin
patrn preparada para poder realizar las
diluciones con las que se realiz l curva de
calibracin que se muestra en la figura 1.

A=absorbancia
=absortividad molar
d =camino ptico
c =concentracin
T =10dc
4

T =10(2.1 10 )(5.00)(2.00 10
Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

T =0.6165
2. Se sabe que una sustancia tiene una
absortividad molar de 14 000 a su
longitud de onda de mxima absorcin.
Calcular que molaridad de esta sustancia
podr medirse en un espectrofotmetro,
si se desea que la lectura de absorbancia
sea de 0.850, en una cubeta de 1.00 cm.
A = dc

4.
Una solucin de concentracin C
de una sustancia coloreada tiene un %T
de 82.0 si la concentracin se
cuadriplica en %T es de 45.2. Demostrar
que la solucin obedece la ley de
Lambert-Beer y calcular el %T para una
concentracin 2C.
T =10 A
T=10-edc=0,820
T=10-4edc=(10-edc)4=(0,820)4=0,452
T=10-2edc=(10-edc)2=(0,820)2=0,672=67,4 %

C=

A
d

C=

0.850
( 14000 )( 1.00 )
5

C=6.0714 10 M
3. El porcentaje de transmitancia de una
solucin acuosa de fumarato de sodio a
250 nm y 25C, es de 19.2% para una
solucin 5x10-4 M. en una celda de
1.00 cm. Calcular la absorbancia y la
absortividad molar correspondiente.

5.
Cuando se analiza una muestra
que contiene hierro (II) por el mtodo
del - bipiridilo se obtiene una
transmitancia de 57.5% contra un blanco
de reactivos, en una cubeta de 1.00cm.
Si la absortividad molar del -
bipiridilo ferroso es de 8.650. cul ser
la concentracin del hierro en la
muestra, en moles/litro?

A=log 10 ( T )
I = 250 nm
d = 1.00 cm
C = 5x10-4 M
A=log 10 ( T )
A=log 10 ( 0.192 )
A=0,7166
=

A
dc

0,7166
4
(1.00)(5 10 )
=1433.2

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

T = 0.575
d = 1.00 cm
= 8650
A=log 10 ( T )
A=log 10 ( 0.575 )
A=0.2403
A
C=
d
0.2403
(8650)(1.00)
C=0.02778 M
C=

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

6. Utilizando una cubeta de absorcin de

1.00 cm, se determin la transmitancia
de la luz de 436 nm (436 A) para una
solucin de bromo en tetracloruro de
carbono, encontrndose los siguientes
resultados:

Calcular la absortividad molar, .

C,
moles/L

5.46
x 103

%
transmit.
Absorban
cia

1.0
2
366.3

3.5
x1
0-3
3.0
1.5
2
434
.28

2.1
x1
0-3
16.
0
0.7
96
379
.04

1.25
x10-

0.64
x10-3

34.3

57.0

0.465

0.244

372

381.2
5

A
dc

7. Se sabe que las sales de VO+2 tienen

una absortividad molar de 12.000 a su
longitud de onda de mxima absorcin.
Si se utiliza celda de 10.00 cm, calcular
cuntos mg/ml de VO+2 debern estar
presentes para producir una absorbancia
de 0.573. (Pm VO+2 = 91.942).
=12000
d = 10.00 cm
A = 0.573
A
C=
d
0.573
C=
( 12000 )( 10.00 )

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

106 mol 91.942 g

1000 mg

L
1 mol
1g
1
4
4.3902 10 mg/ml
C=4.775

)(

)(

8. La absortividad molar () del cido

benzoico
en
metanol
es
aproximadamente 1950 a 275nm. cul
ser la mxima concentracin de cido
benzoico, en g/ml que puede usarse en
una celda de 1.00 cm para que la
absorbancia no exceda de 0.013?
=1950
d = 1.00cm
A = 0.013
C=

A
d

0.013
( 1950 )( 1.00 )
C=6.666 106
106 mol 122,12 g
1l
C=6.666

L
1 mol
1000 ml
7
C=8.1405 10 M
C=

)(

9. Una solucin de permanganato de

potasio de concentracin C tiene una
transmitancia de 60.0 % en una celda de
1.00 cm., a una determinada longitud de
onda. Si se dobla la concentracin,
calcular. a. El % de T b. La absorbancia
y la concentracin de KMnO4 para dar
60.0 % de T en una celda de 10.00 cm
de paso de luz.
T1 = 60%
T=0,6
A=log 1/0,60 = 0,22
Ya que la absorbancia es
directamente proporcional a la
concentracin.

Universidad de La Sabana. Castaeda David, Lpez Mayra. Espectrofotometra de biomoleculas.

Para que haya un 60% de

transmitancia se sabe que la
absorbancia debe ser de 0,22 y
podemos generar un sistema de dos
ecuaciones con dos incgnitas para
determinar el valor de la
concentracin de KMnO4 y el
coeficiente de extincin molar
1) 0,22= 1cm *e*c
2) 0,22=10cm *e*c
10. Una muestra de 1.000 g que contiene
manganeso
se
determin
por
espectrofotometra,
se prepar
un
extracto de 250 ml de la solucin de
concentracin desconocida, se tom una
alcuota de 5 ml y se diluy en un baln
aforado de 50 ml. Luego, para poder
interpolar la curva estndar de
manganeso a 535 nm de la ltima
solucin, se tom una alcuota y se
diluy en una solucin 1:2. La
transmitancia de la solucin medida en
un espesor de 1 cm es de 40 %. Si la
absortividad molar es 2300 L/mol.cm,
determine: a) % de Mn en la muestra b)
mg/Kg de Mn en la muestra.

Moles= 4X10-3M (0,250 L)=1X10-3 moles Mn

Masa=1X10-3 (54,9)= 0,0549 g
A) % Mn= (0,0549 g /1,000 g )*100 = 5,5 %
B) Mg/kg= 54,9mg / 1X10-3kg = 54900
mg/kg.
IX BIBLIOGRAFIA

A= log T= log (0,40) A= 0,4

C= A/ ed =0,4/(1,00)(2300)
Ccon / Vdil = Cdil /Vcon
Ccon1= (Cdil*Vcon1)/Vdil
Ccon1= (2X10 -4 M) (2) /1 = 4X10-4 M
Ccon2= (4X10-4M) (50)/5= 4X10-3 M

Laboratorio de Bioqumica, Felipe Arroyave.

10

Brown, Ch. 2000. Utraviolet, visible,

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