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Coliformes a 35C (Coliformes totais)

Introduo
Coliformes: so microrganismos
indicadores
ocorrncia de contaminao
deteriorao do alimento
presena de patgenos
condies inadequadas durante
processamento, manipulao ou
armazenamento.

O grupo coliformes inclui bactrias aerbias e anaerbias facultativas, na forma de bastonetes gram
negativos, no formadores de esporos (no sobrevivem pasteurizao)
Coliformes totais: capazes de fermentar a lactose a 30-35C (por isso, atualmente vem sendo
chamados de coliformes a 35C e no mais coliformes totais). O grupo inclui os seguintes gneros:
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.
Coliformes termotolerantes ou a 45C: capazesde promover a fermentao a 45C. O principal
componente deste grupo Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gnero Klebsiella e
Citrobacter tambm apresentam essa capacidade.

Coliformes Totais (a 35): Avaliar as condies higinicas


o altas contagens: contaminao ps-processamento, limpezas e sanificaes deficientes, tratamento
trmicos ineficientes ou multiplicao durante o processamento ou estocagem.

Coliformes Termotolerantes (a 45C): Indicador de condies higinico-sanitrias


(contaminao de origem fecal)
o Principal representante: E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro
animais.
o Indicar possibilidade de presena de outros patgenos entricos.

Devido ao fato de serem destrudos com certa facilidade pelo calor, sua
contagem pode ser til em testes de contaminaes ps-processamento.
Importante: Destrudos pela pasteurizao, porm quanto maior a
contaminao microbiana antes do processamento, maior ser sua
microbiota residual

Os coliformes metabolizam a
lactose, produzindo, entre outras
substncias, cido ltico e CO2.
cido ltico: aumento da acidez
CO2 retido na massa dos queijos, dando
lugar a pequenos buracos. Em excesso:
estufamento precoce

Teste presuntivo para coliformes totais: indica a presena


consiste na semeadura de volumes
determinados da amostra em tubos de
caldo lactado ou com caldo Lauril
Sulfato Triptose

Teste Confirmativo para coliformes totais


A partir do presuntivo: transferncia de cultura de todos os tubos positivos para tubos contendo
caldo Verde Brilhante.

Teste de diferenciao: confirmao da presena de E. coli, em caldo EC e


meio EMB

Pode-se utilizar 2 mtodos:


mtodo em placas
Mtodo em tubos (NMP- Nmero mais
provvel ).

A escolha do mtodo:
nmero de microrganismos
disponibilidade de efetuar os mtodos.

Mtodo em placas: mais preciso


Mtodo em tubos: mais utilizado,
mais simples

Esta tcnica consiste na inoculao de volumes decrescentes da amostra em


meio de cultura VBB (Caldo Verde Brilhante Bile), sendo cada volume
inoculado em uma srie de tubos.
Positivos: turvao do meio e produo de gs.

A combinao de resultados positivos e negativos


permite a obteno de uma estimativa da
densidade das bactrias pesquisadas,
atravs de clculos de probabilidade.

Vantagens em relao a contagem


em placas:
possibilidade de inocular quantidades
maiores da amostra, aumentando-se
proporcionalmente o volume de meio de
cultura
sensibilidade maior
Permite introduo de etapas de
recuperao de clulas injuriadas.
uma tcnica verstil, permite a
enumerao de diferentes grupos ou
espcies de microrganismos, apenas
variando os meios de cultura utilizados e
as condies de incubao.

Os volumes podem ser


ajustados de acordo com
a contaminao na
amostra

10mL

1mL

0,1mL

Incubar a
30C por
24- 48h

A determinao em placas consiste


em adicionar amostras ou diluies
em placas, em profundidade, com
gar VRB (Violeta vermelho bile)
observar o crescimento de colnias
Vermelho purpura, circundada por uma
zona roseada.

Coliformes a 35C Metodologia


segundo Standart Methods
- Tranferir 1mL das diluies em
placas de petri esterilizadas;
- Adicionar, aprox., 15 mL de gar
VRB fundido, homogeneizar com
movimentos em forma de 8;
- Aps a solidificao, colocar cerca
de 4mL de VRB, sobrecamada;
- Aps a solidificao, incubar
invertidas a 32C/24h.
- Selecionar placas com 25 a 250
colnias e efetuar a contagem;
Colnias tpicas: vermelho-purpuras,
circundada com zona roseada.
- Calcular o nmero de unidades
formadoras de colnias por mililitro,
(UFC/mL),
multiplicando-se
o
numero de colnias pela diluio
inoculada.

Coliformes a 35C Metodologia


do NMP segundo Norma FIL-73A:
1985
- Inocular 1, 0,1 e 0,01 mL de leite
em 3 sries de tubos, contendo
cada tubo,10 mL de caldo VBB e
um
tubinho
de
Durhan
esterilizados*;
- Homogeneizar e incubar os tubos a
30C/24-48h;
- Calcular o NMP atravs da tabela, a
partir do nmero de tubos positivos
em cada srie. So positivos aqueles
tubos onde se observa turvao e
produo de gs.

Grupo 1
Leite cru

Grupo 2
Leite pasteurizado

Grupo 3

10mL para 90mL de diluente


Homogeneizar
Diluies

Iogurte

Grupo 4
Doce de leite

Pesar 10g para 90mL de diluente


Homogeneizar
Diluies

Leite

1mL

1mL

Incubar a 35C/24-48h
Teste positivo: turvao e produo de gs

Tubos positivos com VBB: passar


para caldo EC

Incubar em banho-maria a 45,5C/24h


Teste positivo: turvao e produo de gs
Meio VRB

Incubar:
- Tubos de VBB: 35C/ 24h
- Placas VRB: 32C/ 24h

Tubos positivos no EC:


passar para meio EMB
Incubar em banho-maria a 35C/24h
Colnias tpicas: negras com brilho metlico

Provas confirmativas: Testes bioqumicos