Coloraciones bacterianas

Objetivo
Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin deGram
Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos.
Identificar la morfologa (coco, bacilo, etc) y tipo de tincin (Gram
positiva o Gram negativa) de las cepas proporcionadas.

Fundamentos de la prctica
La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX
y puede utilizarse para separar la mayora de las especies bacterianas en
dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante bsico, cristal
violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese
colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las
bacterias gram negativas).
TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.
Preparacin del extendido:
Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del
paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de
los microorganismos en cultivos.
Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo
que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se
encuentra la muestra de lquido aspirado. El material que se va a teir se
coloca en forma de una gota (si la muestra es liquida) o se rota (si la esta e
un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.
Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto,
una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no
debe utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo.
Para la tincin de los microorganismos que crecen en cultivos puede
utilizarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad del cultivo
desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este
material se emulsiona en una gota de agua o solucin salina 0.9% estril
sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeas que puedan perderse
incluso en una gota de solucin fisiolgica se puede utilizar n aplicador de
madera estril para obtener el material; luego este material se frota
directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se deja secar y se fija
al portaobjeto mediante su colocacin sobre una platina caliente (a 60C)
durante por lo menos 10 minutos o cubrindolo con metanol al 95% durante
1 minuto.

Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido se aplica

una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y
se fija antes de la tincin.
La preparacin de los frotis vara de acuerdo con el tipo de muestra que se
va a procesar y con los mtodos de tincin que se van a utilizar. No obstante
la regla general para la preparacin de frotis es que debe aplicarse una
cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las
posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por ltimo, el
mtodo de tincin que se debe utilizar esta determinado por el tipo de
microorganismo buscado.

TINCION DE GRAM
La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen
microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia
clnica pueden detectarse con este mtodo.
Las nicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de
las clulas husped (p. ej., clamidias).
Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el
microscopio ptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los
colorantes (p. ej., mycobacterias).
Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas
moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa
la afinidad del colorante primario con la clula, formando complejos
insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el
color del tenido.
Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble
funcin: deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol disuelve
los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo
la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es
removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gramnegativas,
mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en
su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las
clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

Metodos y Procedimientos
Materiales
Materiales:
Mechero de Bunsen

Portaobjetos

Pizeta

Hisopos

Equipo:
Microscopio ptico

Reactivos:
Cristal violeta
Solucin de lugol
Alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersin

Muestra:
Proporcionada por el alumno(a).

Procedimiento
Extensin: primeramente se agarro un portaobjetos y luego se coloc una
pequea cantidad de la saliva que se obtuvo del hisopo y se extendi sobre
el portaobjeto, luego se flamea la muestra para fijarlo con ayuda del
mechero.
Coloracin: Se aplic a la muestra fijada anteriormente una cantidad del
colorante cristal violeta de Hucker suficiente para cubrir la superficie del
extendido durante un minuto y se lav con agua destilada la muestra fijada,
seguidamente se aplic lugol (mordiente) sobre toda la superficie del
extendido durante un minuto, luego se agreg alcohol acetona para retirar

el exceso de colorante (decolorante) y se lav con agua destilada, despus

se aplic safranina (colorante de contraste) durante un minuto y
nuevamente se la se lav la muestra pero esta vez con agua corriente,
luego se dej secar la muestra, colocndola invertida sobre papel, una vez
que la preparacin estuvo totalmente seca, se puso una gota muy pequea
de aceite de inmersin y se observ al microscopio con el objetivo de
inmersin. (Este procedimiento se repito una vez ms, para observar otro
tipo de bacterias

Resultados
Se pudo observar cocos, diplococos y algunos bacilos en las muestras
obtenidos al verlas por el microscopio.

Conclusiones

El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso

la tincin de estas en la microbiologa es un tema sumamente
trascendente.
La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto
por su aplicacin clnica para hacer una identificacin preliminar de la
bacteria causal de la infeccin y por su practicidad, es la tincin de
Gram.
El estudio de la literatura acerca de la tincin de Gram nos permite
tener un prembulo para poder diferenciar frente al microscopio los
diferentes tipos de microorganismos, sin embargo, no hay que pasar
por alto que es de suma importancia tener un completo estudio
previo de los organismos y su reaccin a la tincin para poder dar una
respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un
microorganismo.

Bibliografa
1.Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana,
2.Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual
moderno, Mxico, Mxico 2002.
3.Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial
Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2 004.

4.Salazar Wilson, Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa, Depart.

de publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito Ecuador,
2007.