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NORMAS E ROTINAS OPERACIONAIS

DO LABORATORIO DE NALISES CLNICAS


Setor de Coleta e Recepo
Procedimento Operacionais Padres (POP)
1. CADASTRO E INFORMAES
1.1 Identificar o paciente
A chegar a recepcao do laboratorio, o paciente devera estar portanto
requisicao medica com os exames solicitados pelo seu medico, a
recepcionista entao ira cadastra-lo, dando enfase ao nome, idade, sexo,
endereco e/ou telefone. O cadastro do paciente acompanha a
identificacao numerico controle do laboratorio.
1.2 Identificao de amostra
Cada cadastrado possui um numero de identificacao, utilizando para
etiquetas
os recipientes de coleta.
E importante identificar sempre a parte lateral do frasco, e nunca a
tampa, principalmente em frascos de urina e fezes para evitar trocas de
material.
1.3 Identificaes dos exames a serem realizados
No laboratorio as amostras sao registradas em fichas internas de
seus respectivos setores, nestas fichas constam a identificao
numrica, o nome e a idade do paciente; em seguida as amostras e
as fichas serao encaminhadas para os devidos setores.
1.4 Informaes ao paciente
Na recepcao do laboratorio o paciente ira receber as instrucoes de
como deve
proceder para coleta das amostras. Para dosagem bioquimica e o
paciente e orientado sobre o periodo de jejum, sendo tambem
necessario o conhecimento dos
medicamentos que o paciente possivelmente esteja tomando.
Quando a coleta de sangue, orienta-se o paciente quanto ao esforco
fisico, o paciente deve vir ao laboratorio totalmente descansado para
evitar qualquer alteracoes nos resultados de seus exames.
2 COLETA DE SANGUE
O sangue colhido com o objetivo de estudar as frequencias
alteracoes dos seus componentes quando o organismo e acometido por

doencas. No laboratorio sao executados exames de varios paciente ao


mesmo tempo, torna-se imprescindivel que uma sistematizacao bem
organizada de trabalho seja seguida, evitando-se os erros de um modo
geral, a perda de tempo e, especialmente, a troca dos resultados.
Cuidados tecnicos e de assepsia sao tambem necessarios a fim de
evitar a contaminacao do paciente, do operador e do sangue colhido. A
coleta e feita de preferencia pela manha, com o paciente em jejum.
Muitos sao os meios para obtencao do sangue usado para o exame
hematologico, como por exemplo, sangue o veneno, capilar, arterial,
puncao da medula ossea de ossos como o externo, tibia, iliaco e usado
na maioria das vezes o venoso e o capilar.
2.1 Sangue Venoso
A sua obtencao e feita pela funcao das veias mais acessiveis. As que
sao mais facilmente funcionadas localizam-se nas regioes do antebraco
(veia mediana, cefalica e basilica), do pescoco (jugulares internas e
externas) e inguinais (femural). Na crianca, tambem se realiza na regiao
da fontanela frontal (seio longitudinal). A veia e a preferida nos exames
rotineiros, pois apresenta frequentemente bom calibre e sua funcao e
pouco dolorosa. Antes da puncao, avalia-se a orientacao do vaso pela
visualizacao ou pela palpacao digital e fazer a agulha penetrar e
aprofundar nessa direcao.
2.2 Sangue capilar
E frequente usado em criancas quando se empregam micrometodos
ou em adultos para alguns exames como estudos de plaquetas, citologia
e citoquimica celular. A coleta se faz apos puncao da polpa digital dos
dedos ou dos grandes artelho, na crianca. Pode-se ainda utilizar a
regioes laterais do calcanhar, nos recem nascidos.
3. RECEPO AO PACIENTE
O paciente e recebido com cortesia e cordialidade; explicando os
procedimentos aos quais ele vai ser submetido, de modo a transmitir-lhe
tranquilidade e seguranca.
A coleta chama o paciente para a coleta de sangue, e de acordo com
seu cadastro, confirma o nome, a idade e os exames a sem realizados
pelo paciente. A mesma separa e identifica, na frente do paciente os
tubos que serao utilizados para o material.
3.1 Condies para a coleta
Sala bem iluminada e ventilada;
Pia;
Cadeira reta com bracadeira regulavel ou maca;

Garrote;
Algodao hidrofilo;
Alcool etilico a 70% ou alcool iodado a 1%;
Agulhas e lancetas descartaveis;
Sistemas a vacuo: suporte, tubo e agulhas descartaveis;
Tubo de ensaio com tampa;
Etiquetas para identificacao de amostras;
Caneta;
Caixa descarpack;
Jaleco e mascara;
Luvas descartaveis;
Estantes para tubos.
3.2 Identificao da amostra
Identificam-se os tubos para colocacao da amostra. Escreva na
etiqueta os dados do paciente: nome, numero do registro, data da
coleta.
3.3 Tecnica para Coleta de Amostra do Sangue Venoso
Coloca-se a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. Nao
tocando naparte inferior da agulha;
Movimenta o embolo e pressione-o para retirar o ar;
Ajusta o garrote e escolha a veia;
Faz a anti-sepsia do local da coleta com algodao umedecido em
alcool a 70% ou alcool iodatdo a 1%. Nao tocando mais o local
desinfetado;
Retira a capa da agulha e faz a puncao;
Introduz a agulha na veia mediana, basilica ou cefalica, atingida a
veia, aspira osangue;
Coleta-se aproximadamente 10 ml de sangue. Em criancas coleta 2
A 5 ML;
Retira o garote e em seguida a agulha;
Comprime o local puncionado com algodao embebido em alcool;
Retira a agulha da seringa e transfere o sangue para os tubos,
quando for transferido para um tubo contendo anticoagulante. Agita
suavemente para facilitar amistura do sangue como anticoagulante;
Ao transferir o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante.
Escorrer delicadamente o sangue pela parede do tubo. Este
procedimento evita a hemolise da amostra. Descarta as agulhas e
seringas nas caixas de descarpack;
Orienta o paciente a pressionar com algodao a parte puncionada,
mantendo o

braco estendido, sem dobra-lo;


3.4Tecnica para coleta de amostra do sangue capilar
Faz assepsia da poupa digital com alcool iodado.
Deixar secar.
Puncionar com lanceta ou agulha descartavel, desprezando-se a
primeira gotade sangue e absorvendo-a com papel de filtro ou algodao
seco;
Sangue deve fluir espontaneamente, exercendo-se leve pressao
somentequando necessario;
Direciona o tubo de capilar na gota para que o sangue flua pos
capilaridade;
Limpar o dedo com algodao e aplicar anti-septico.
Anticoagulantes.
O sangue e coletado com a proporcao correta de Anticoagulantes
utilizados.
EDTA; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.
Heparina; 1 gota (5.000 U/ml) para cada ml de sangue.
Oxalato de K; 1 a 2 mg para cada ml de sangue.
Citrato de sodio; 0,5 ml para 4,5 ml de sangue.
3.6 Biossegurana na coleta
Todo cuidado e pouco na manipulacao de materiais biologicos, tais
como soro, sangue, secrecoes, fluidos organicos, tecidos, etc. Redobrase as precaucoes, pois esses materiais sao potencialmente infectantes e
muitas vezes estao contaminados com agentes estiologicos diferentes
do que se esta pesquisando, ou ainda desconhecidos.
Usa-se sempre Equipamento de Protecao Individual (EPI): jaleco
longo de mangas compridas e punho retratil, luvas descartaveis evita a
formacao e dispersoes de aerossois sao micro particulas solidas e
liquidas com dimensoes aproximadas entre 0,1 e 0,5 micra que podem,
no caso de conter microorganismos, permanecer em suspensao e
plenamente viaveis por varias horas.
Jamais reencapa-se agulhas. Esse procedimento e uma das principais
causas da contaminacao de profissionais de saude por microorganismos,
existentes no sangue e em outros fluidos organicos, como por exemplo,
o virus da Hepatite B e o HIV. Apos a coleta e descartado esse material
diretamente em caixas descarpack.
Reduz ao maximo o manuseio de residuos, em especial os
pefurocortantes. Descarta o rejeito perfurocortante diretamente em
caixas descarpack.

4. EMISSAO DOS LAUDOS DOS EXAMES LABORATORIAIS


Os laudos estao disponiveis no prazo acertado com o paciente, se
por algum motivo isto nao for possivel, ha uma justificativa e, sempre
que possivel, o paciente e informado no mais curto prazo possivel.
Em caso de laudo que possa oferecer perigo iminente a vida do
paciente, o laboratorio informa ao medico assistente e/ou ao
responsavel pelo paciente.
O laudo e datado e assinado por profissional legalmente habilitado
com o seu nome completo e legivel, e o numero do registro no conselho
profissional.
4.1 Exames
Nome do exame;
Material utilizado;
Metodo;
Intervalo de referencia com as respectivas unidades e valores de
alerta;
Informacoes necessarias a interpretacao dos resultados, quando
indicada;
Conclusoes, quando indicadas.
EXAMES DE SANGUE
Acido urico
Capac. Total de lig. do ferro
Albumina
Cetonemia
Colesterol fracionado:
HDL
LDL
VLDL
Aldolase
Cloretos
Ferro colher pela amanha
Amilase
Creatinina
Triglicerides
Bilirrubinas
Eletroforese de proteinas
Ureia
Calcio
Fosfatase acida
Colesterol ( sem fracionamento)
Fosfatase alcalina

CPK total
Fosforo
CK MB
Frutosamina
Gama GT
Glicose
Hemoglobina glicosilada
Lipase
Potassio
Magnesio
Sodio
Mucoproteinas
Transaminases: TGO/AST; TGP/ALT
Velocidade de hemossedimentacao (VHS)
Hemograma
Curva de fragilidade osmotica
Plaquetas
Tempo de protrombina
Tempo de tromboplastina parcial ativada PTTa
Reticulocitos
Eletroforese de hemoglobina
Pesquisa de drepanocitos
Alfa 1 Glicoproteina acida
Fator reumatoide
Grupo sanguineo e fator Rh
VDRL
Proteinas C reativa
Anti HBs
Anticorpos antireoidianos:
- antireoglobulina
- antimicrossomal
Antiestreptolisina O
- Monoteste
- Paul Bunnell Davidsohn
- Epstein Baar (IFI ou ELISA)
- Anti VCA IgG e/ou IgM
Fan
HbeAg
Toxoplasmose IgG/IgM - ELISA - IFI HAI
HbsAg (Antigeno australia)
Chagas (T. Cruzii): - IFI HAI ELISA
HAV IgG/ IgM
Anti Hbe
Citomegalovirus IgG/IgM
HIV 1 e 2

Setor de Lavagem e Esterilizao


PROCEDIMENTO OPERACIONAIS PADRES (POP)
A importancia de uma boa descontaminacao de materiais
(ESTERILIZAO) e pea imprescindivel para um melhor desempenho
dos trabalhos a serem executados em um laboratorio de analises
clinicas. O processo de esterilizacao o comeco de tudo, sem a mesma os
resultados nao serao satisfatorios. Faremos uma descricao dos metodos
que sao utilizados para a esetrilizacao dos materiais do laboratorio.
1 OBJETIVOS
1.1 Gerais
Tomar conhecimento dos cuidados na manipulacao de materiais
contaminados.
Devemos tambem ter o conhecimeto de lavagem, secagem
empacotamento e esterilizacao de materiais reaproveitaveis.
1.2 Especificos
Uns dos objetivos mais importantes, e o conhecimento de como se
deve usar as maquinas, como: AUTOCLAVE, ESTUFA DE SECAGEM E
ESTERILIZAO E TAMBM O DEIONIZADOR.
2. EQUIPAMENTO BSICOS
Autoclave
Estufa de secagem
Estufa de esterilizacao
Deionizador
OBS: Ha de se destacar tambem os materiais usados no processo de
lavagem.
So estes:
Sabao
Hipoclorito 1%
3. METODO PARA ESTERILIZAR MATERIAIS:
1. O 1o passo e colocar o material contaminado (coagulos e urina)
sao colocados em frascos plasticos contendo hipoclorito a 1%, por duas
horas vida media do hipoclorito.
2. 2o passo os materiais reutilizaveis ex: vidrarias sao colocados no
hipoclorito a 1% por 30 minutos,
3. 3o passo sabao dextran por mais 30 minutos,
4. 4o passo lava-se em agua corrente por 30 minutos,
5. 5o passo mais 30 minutos de molho em agua deionizada,
6. 6o passo sao colocados na estufa de secagem.

Matrias da microbiologia
1. Os materiais contaminados sao colocados na autoclave por 45
minutos a 121oC.
2. Depois que sair do autoclave, devemos seguir os mesmos passos
a partir do 3o descrito acima;
3. Apos a secagem, leva o material para o balcao de empacotamento
e la, definitivamente separado. Ex: plastico, vidro, etc.
4. Depois de separado, o material e colocado na estufa de auto
precisao para esterilizacao com fita teste. Deve-se salientar que
materiais plasticos nao devem ir para a estufa de esterilizacao, pois a
mesma os danificara, devido sua alta temperatura que gira em torno de
180oC. O temo que o material deve ficar na estufa de esterilizacao e de
2 hs. E com relacao ao material plastico este e embalado e colocado na
autoclave de 15 a 20 minutos.
OBS: Para identificarmos um material autoclavado devemos
verificar a fita teste, esta deve estar com listras queimadas. Com todos
esses passos, nos faremos uma boa esterilizacao, pois a mesma os
danificara, devido sua alta temperatura que girar em torno de 180oC. O
tempo que o material deve ficar na estufa de esterilizacao e de 2 hs. E
com relacao ao material plastico este e embalado e colocado na
autoclave de 15 a 20 minutos.
importante compreender a importancia da esterilizacao em todo o
processo
de trabalho em Laboratorio, bem como o uso de equipamentos
essenciais(AUTOCLAVE, ESTUFA DE ESTERILIZAO E SECAGEM E
DEIONIZADOR), e
procedimentos de lavagem e descontaminacao de materiais.
4. DESCARTE DE MATERIAL CONTAMINADO
Deve haver POP para o descarte de material contaminado gerado no
laboratorio, que sao aqueles despejos em estado solido, semi-solido,
liquido ou pastoso, apresentando caracteristicas de toxidade e/ou
atividade biologica, que podem afetar direta ou indiretamente os seres
vivos ou causar contaminacao das aguas, do ar e do solo.
Procedimento para com os materiais.
Agulhas (e capilares de hematcrito): Uma vez terminada a coleta
do sangue-amostra sao desprezadas em caixas descarpack
Seringas: Apos o termino da coleta do material, tambem sao
descartaveis em
caixas escarpack.
Algodao, gaze, papeis e material afins: Apos o uso devem ser
descartados em sacos de lixo branco e reforcados para posterior coleta
por servico especializados.

Swabs, especulos, espatulas, abaixadores de lingua, etc.:


Proceder da forma descrita acima.
Urina: Acrescentar uma parte de solucao de hipoclotito de sodio a
1%. Deixa em contatoo por 2 horas descarta no esgoto sanitario. Os
frascos devem ser descaratados em sacos de lixo brancos reforcados
para posterior coleta por servicos especializados.
Fezes: descarta em saco de lixo reforcados.
Sangue, coagulos e semelhantes: colocar todo o sangue e seus
derivados
em um recipiente de plastico resistente. Adicionar solucao de hipoclorito
de sodio. Deixar em contato por 2 horas. Devido a decomposicao do
hipoclorito em contato com o sangue, deve-se adicionar mais
hipoclorito, ate nao haver qualquer formacao de espuma.
Meios de cultura e despejos e bactriologicos: Dispensa o
material o, a
esterilizacao em autoclave e descartar em lixo especial.
Lminas e lamnulas: Nao sao descartas. Ao recupera-las sao
submetidas a
um tratamento hipoclorito de sodio a 1% por 30 minutos. Apos o
processo, proceder a lavagem e recuperacao.

PROCEDIMENTO DE ROTINA
HEMATOLOGIA MANUAL

HEMATOLOGIA
A hematologia compreende o estudo das celulas sanguineas e
coagulacao.
Normalmente, os constituintes do sangue (hemacias, leucocitos e
plaquetas) permanecem em equilibrio sempre constante devido ao
sistema hematopoietico, com funcao de formacao hemolitica ou de
destruicao das celulas sanguineas. (O. LIMA, 1992)
OBJETIVOS
O estudo no Laboratorio de hematologia consiste em analisar celulas
sanguineas e a coagulacao atraves de exames hematologicos, podendo
assim qualificar e diferenciar as celulas sanguineas.
Esses testes realizados possibiltam um diagnostico mais conclusivo,
auxiliando clinico no tratamento de uma patologia pr deficiencia

hematologica.
HEMATCRITO
Consiste em determinar em porcentagem a concentracao de
eritrocitos em dados volume de sangue nao coagula. E a razao entr o
voluem deeritrocitos em relacaoao volume do sangue total. (O. LIMA,
1992)
MATERIAIS E MTODOS
Tubo capilar
Bico de bunsen
Centrifuga para microhematocrito
Tabela para microhematocrito
O tubo de microhematocrito e preenchido por capilaridade ate . da
capacidade docapilar. A extremidade vaziae vedada pela chama do bico
de bunsen. Colocar os capilares na centrifuga para microhematcrito,
com o cuidado de coloca a parte abertacontra o apoio de borracha para
evitar quebras e extravasamentos. A ponta selada ficavoltada para fora.
E recomendavel um centrifugacao a 3.000 RPM/5 minutos. Apos a
centrifugacao, o tubo apresenta uma coluna de sangue, incluindo o
plasma e uma coluna de eritrocitos. Devem ser medidos com o auxilio
da tabela.
HEMOGLOBINA (Hb)
E o principal componente dos eritrocitos. E um conjugado de
proteinas que serve como transporte de O2 e CO2. (O. LIMA, 1992)
MATERIAIS E MTODOS
Tubos para centrifuga
Padrao (HiCN Cianetohemoglobina)
Reagente de Drabkin

Tomar 3 tubos e proceder da seguinte maneira:

B P A
Padrao- 20uL Amostra- - 20 uL
Reag. de Drabkin 5.0uL 5.0uL 5.0uL
Hogenizar. Descansar em temperatura ambiente por 5 minutos.
Leitura a 540nm no espectrfotometro. Zerar com o Branco.

ESFREGAO
O exame de esfregaco sanguineo e uma parte importante da
avaliacao hematologica. Para obter esfregacos satisfatorio, e
indispensavel que se tome certas precaucoes:
- laminas devem estar limpas e desengorduradas;
- a gota de sangue nao deve ser muito grande. Quanto maior a gota,
mais espesso o esfregaco. O ideal e uma gota de 20uL;
- O esfregaco deve ser feito rapidamente, antes que ocorre a
coagulacao. (O. LIMA, 1992)
MATERIAIS E MTODOS
Laminas limpas e desengorduradas
Laminas de extensao (extensora)
Colocar uma gota de sangue no final de uma lamina apoiada em uma
superficie plana. Com o polegar e o indicador, segura-se o final da
lamina de extensao contra asuperficie da primeira laminas. Empurra-se
a lamina de extensao a uma velocidademoderada para frente ate que o
sangue tenha sido espelhado em um esfregaco moderadamente
delgado. As laminas devem ser secas a temperatura ambiente edepois
corada para analise ao microscopio.
E conveniente confeccionar varios esfregacos ao mesmo tempo.
Marcarsempre os esfregacos usando agulha ou lapis dermografico com
o nome do paciente ea data sobre a superficie do mesmo.
COLORAO
Os corantes de anilina usados em esfregacos sanguineos sao de
duas classes
gerais:
corantes basicos, como o azul de metileno;
corantes acidos, como a eosina.
O nucleo das celulas toma as cores basicas, como o azul de
metileno, enquanto que os corantes basicos agem sobre os elementos
citoplasmaticos. Pertencem a este grupo os corantes de Romanowsky.
Os derivados mais usados do corante primitivo de Romanowsky sao:
Giemsa. Leishman, Wrigth entre outros. Nesse setor foi usado o corante
Leishman. (O. LIMA, 1992)

MATERIAL E MTODOS
Suporte para laminas
- Corante de Leishman
Colocar a lamina sobre o suporte. Verter 20 gotas do corante sobre a

lamina ou o suficiente para cobri-la. O alcool metilico (metanol) da


solucao corante fixa o
esfregaco.
Deixar corar durante 15-20 minutos. Lavar em agua corrente e
deixar secar. Observar ao microscopio com objetiva de imersao.
CONTAGEM GLOBAL
A contagem dos elementos morfologicos do sangue (eritrocitos,
leucocitos e plaquetas deve ser efetuado pala manha. Consiste em
trabalhar com material aferido com a finalidade de determinar o numero
dos elementos morfologicos. Para isso, e necessario diluir volume
conhecido de sangue com determinada quantidade de liquidodiluidor.
Conta-se as celulas na area reticulada da camara destinada para cada
tipo de celulas (ver Anexos) (O. LIMA, 1992)
MATERIAL E MTODOS
Camara de Contagem (Camara de Neubauer)
Liquidos diluidores (hayem, Turk, Oxalato de Amonia 1%)
Pipetas graduadas e automaticas
Laminulas
Contagem Global de Leuccitos
Valores de Referencia:
5.000 10.000 mm3
-

0.38 mL do liquido de Turk


20uL sangue
Diluicao = 1/20

Depois de homogeneizar o liquido de Turk com o sangue, umedecer a


camara deliquido de Turk com o sangue, baixo da laminula, inserir com
auxilio da pipeta automatica pequena quantidade da solucao diluida.
Cuidado para evitar presencadebolhas. Esperar 5 minutos a fim de que
os globulos se depositem. Observar ao microscopio primeiramente com
a objetiva de menor aumento e em seguida numaobjetiva de 40X. Fazer
a contagem nos quadrantes destinados a leucocitos.
Contagem Global de Plaquetas
Valores de Referencisa:
150.000 400.000 mm3

0.38 mL oxalato de amoni 1%


20uL sangue
Diluicao = 1:20

Depois de homogeneizar o oxalato de amonia 1% com o sangue,


umedecer a camara de Neubauer e cobri-la com laminula. Por baixo da
laminula, inserir com oauxilio da pipeta automatica pequena quantidade
da solucao diluida. Cuidado para
evitar presenca de bolhas. Esperar 10 minutos a fim de que as plaquetas
se depositem. Esperar em camara umida. Observar ao microscopio
primeiramente com a objetiva de menor aumento e em seguida numa
objetiva de 40X. Fazer a contagem nos quadrantes destinados a
plaquetas, que sao os mesmo para contagem de eritrocitos.
VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAO (VHS)
E a velocidade com o qual os globulos vermelhos vao para o fundo
do tubo. Os
globulos vermelhos que sedimentam e porque a sua densidade e maior
que a do plasma. A velocidade com que eles sedimentam e porque a sua
densidade e maior que a do plasma. A velocidade com que eles
sedimentam varia, direta ou indiretamente com varios fatores. (O. LIMA,
1992)
MATERIAIS E MTODOS
- Tubo de Westergren
- Estante de westergren
O metodo de Westergren modificado produz os mesmos resultados
que o metodo de Westergren original, mas emprega sangues nao
coagulado com EDTA ao inves de citrato. Isso permite que o VHS seja
realizado com a mesma amostra de sangue que os outros estudos
hematologicos
2 mL de sangue com EDTA bem misturados sao diluidos em 0.5 mL de
cloreto desodio a 0.85% ou 0.5 mL de citrato de sodio a 3.8%. Uma
pipeta de Westergren ecompletada ate a marca 0 (zero) e colocada
exatamente na vertical na estante atemperatura ambientem, sem
vibracoes ou exposicao direta a luz solar. Aposexatamente 60 minutos,
a distancia do topoo da coluna e registrda em molimetros comoo valor
da VHS. Se a demarcacao entre o plasma e a coluna de celulas
vermelhas edistinta, o nivel e lido onde a densidade total aparece
primeiro.
Valores de Referncia:
Homens: 3-15 mm

Mulheres: 3-20 mm
Criancas: 3-12 mm

CLULAS LE (Lupus Eritematoso)


Um anticorpo presente na fracao globulina gama do soro dos
pacientes de LES, o chamado fator LE, reage com a nucleoproteina dos
nucleos dos leucocitos. O nucleo do fagocito acha-se comprimido na
periferia da celula. A maior parte da regiao protoplasmatica e ocupada
pela massa nuclear transformada. O citoplasma reduz-se a estreita faixa
na periferia do leucocitos. Na celulas LE, a estrutura da cromatina e
substituida por massa arredondada, homogenea, de coloracao purpura,
de tamanho variavel, mas usualmente maior que a hemacia. O fagocito
pode englobar mais de nucleo. (O. LIMA, 1992).
MATERIAL E MTODOS
- Banho Maria a 37oC
- Toma-se o sangue sem anticoagulante e coloca-se em Banho Maria a
37oC/2hs.
Depois realiza-se o esfregaco e observa-se ao microscopio. Deve-se
sempre realizar o exame FAN junto com o exame de celulas LE.
CONTAGEM DE RETICULCITOS
Os reticulocitos sao celulas vermelhas imaturas nao nucleadas que
contem RNA e continuam a sintetizar hemoglobina apos a perda do
nucleo. O sangue incubado rapidamente em uma solucao de azul cresil
brilhante ou azul metileno. No RNA e precipitado como um complexo
corante ribonucleoproteinas. O complexo aparece microscopicamente
como uma rede azul escura ou granulos azuis escuros que permitem a
identificacao e contagem de reticulocitos. (O. LIMA, 1992)
MATERAIS E MTODOS
- Esfregaco sanguineo
Conta-se o numero de reticulocitos em 10 campos diferentes. O
esfregaco e feito a partir de 100uL de sangue + 1 gota de azul cresil
brilhante.
Valores de Referencias:
0.5 - 2.0%
10 campos = total / 10 = numero %
COAGULOGRAMA

Tempo de Sangria (TS)


o tempo necessario para a cessacao da hemorragia, ocasionando
por
pequena
incisao,
de
dimensao
padronizada,
praticada
artificialmente. (O. LIMA, 1992)
MATERIAL E MTODOS
- Equipamento para puncao digital
- Papel de filtro
- Cronometro
Faz-se a assepsia da polpa digital ou do lobulo da orelha com a lanceta,
fazer a incisao e deixar o sangue fluir espontaneamente. Marcar no
cronometro o inicio nomomento do aparecimento da primeira gota. Com
o papel de filtro absorver de 30 em 30 segundos a gota de sangue
formada sem tocar a incisao. Quando cessar ofluxo de sangue, parar o
cronometro. Quando cessar o fluxo de sangue, parar cronometro. O
intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira e da ultima gota
representa do tempo de sangria.
Valores de referencia:
1 6 minutos
Tempo de Protrombina Ativada (TAP)
a prova de escolha para investigacao do sistema extrinseco da
coagulacao sanguinea. E uma prova de grande valor na demonstracao
de deficiencia dos fatores de coagulacao I, II, V, VII, X. (O. LIMA, 1992)
MATERIAL E MTODOS
- Plasma citratado do paciente
- Solucao de tromboplastina
- Banho Maria a 37C
- Tubos de ensaio
- Solucao de cloreto de calcio a 0.025M
Coloca-se 100uL do plasma citratado do paciente + 100uL da
suspensao detromboplastina no tubo de ensaio. Homogeneiza, adicionar
rapidamente 100uL da solucao de cloreto de calcio. Neste instante,
acionar o cronometro. Retirar o tubo doBM e agita-lo suavemente, de 2
em 2 segundos, ate o aparecimento do coagulo, parando
simultaneamente o cronometro. O tempo consumido em segundos
constituio TAP.
Valores de Referencia:

11 13 segundos
Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)
E a melhor prova para investigar as alteracoes do mecanismo da
coagulacao
sanguinea. Fatores que participam do sistema intrinseco estao
envolvidos, com excecao das plaquetas e do fator XIII, bem como do
fator VII, do sistema extrinseco. (O. LIMA, 1992).
MATERIAL E MTODOS
- Plasma citratado do paciente
- Solucao de tromboplastina parcial
- Banho Maria a 37C
- Cronometro
- Tubos de ensaio
- Solucao de cloreto de calcio a 0.025 M
Coloca-se 100uL de cefalina + 100uL plasma citratado do paciente.
Homogeneizaeencuba em Banho Maria a 37C/3 min. Apos esse tempo,
adicionar rapidamente 100uL da solucao de cloreto de calcio. Neste
instante, acionar o cronometro. Agitalo suavemente, de 5 em 5
segundos. Ao fim de 30 segundos, retirar o tubo do BM e agita-lo
suavemente, observando o aparecimento do coagulo, parando
simultaneamente o cronometro. O tempo consumido em segundos
constitui oTTPA.
Valores de Referencia:
35 45 segundos
CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOS
Consiste em determinar a proporcao existente entre as distintas
variedades de leucocitos. A contagem diferencial de leucocitos e dos
mais valiosos metodos entre os exames citologicos do sangue. (O. LIMA,
1992)

MATERIAL E MTODOS
- Esfregacos corados
Deve-se observar a lamina proximo a cauda o esfegaco onde quase
nao se
encontra roleaux e facilita a contagem. Total de 100 celulas.

FIBRINOGNIO
MATERIAIS E MTODOS
- Tubo capilar
- Plasma
- Microcentrifuga
- Tabela de Hct
- Banho Maria a 56
Aspira-se o plasma no tubo capilar e encuba-se em Banho Maria a
56oC/15 minutos.
Leva-se a centrifuga para microhematocrito por 5 minutos / 3000 RPM.
Faz-se a leiturana tabela para Hct e multiplica o resultado por 92.
Valores de Referencia:
200 400 mg/dL
INDCES HEMATIMTRICOS
VCM = Hct / Hem x 100 u3
HCM = Hb/ Hem x 100 pg
CHCM = Hb / 100%

PROCEDIMENTO DE ROTINA SOROLOGIA


MANUAL
SOROLOGIA
O melhor diagnostico de um processo infeccioso e a demonstracao
do patogeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos biologicos do
hospedeiro. Nem sempre e possivel essa pratica pela ausencia do
agente infeccioso ou pela pocua sensibilidade dos metodos ou por
longos periodos exigidos para uma resposta laboratorial.
Metodos parasitologicos ou microbiologicos sao deficientes para
diagnostico
de
algumas
patologias.
Sao
utilizados
metodos
imunologicos, sorologicos ou imunoensaios. Sao tecnicas para a
deteccao e quantificacao de Ag ou Ac, podendo utiliza-se de reagentes
marcados ou nao. Comumente sao utilizados marcadores radiotaivos,

enzimpaticos, fluorescentes e quimioluminescentes.


Os testes sorologicos sao feitos atraves de pesquisas de anticorpos
pu antigenos, sendo a reacao Ag Ac, visualizada por alguns metodos
como aglutinacao, precipitacao, floculacao e outros. Esses testes de
pesquisa de Ag Ac desempenham uma importante funcao de
diagnostico laboratorial clinico como complemento de outros testes e
provas, desde que sejam respeitadas suas indicacoes e limitacoes.
OBJETIVO
No setor de sorologia, o principal e demonstrar aos estagiarios os
principios das tecnicas mais usadas nos testes sorologicos, assim sua
importancia e identificacao.
A alta sensibilidade dos testes utilizados garante um importancia no
setor de triagem sorologica para selecao de pacientes que podem vir a
ser doadores e recptores de orgaos, evitando transtornos postransfusionais.
A Ciencia Sorologia tem como principal objetivo pesquisar anticorpos
especificos auxiliando, assim, no diagnostico individual de determinadas
patologias com tambem diferenciando as fases da doenca.
v Imunodifuso Radial Simples
- Prncipio Antigeno ou Anticorpo permanecem fixados ao suporte e o
outro se
difunde, ate haver um halo de precipitacao formado por reacao de Ag
com o Ac ao
redor da inoculacao.
- Materiais e Mtodos Toma-se uma placa com gel (agar misturado
com a diluicao
apropriada de Ag especifico para Ac determinado) contendo orificios
onde, com ajuda
da micropipeta, sera adicionado 5uL do soro. Fecha a placa e guarda em
forma
invertida em camara umida, para que mantenha o meio umida, por 48h
a 72h.
Valores de Referencia:
IgG: 710 1520 mg/dL
IgM: 90 310 mg/dL
AGLUTINAO
A reacao de aglutinacao e caracterizada pela formacao de agregados
visiveis como resultado da interacao de anticorpos especificos e
particulas insoluveis que contem determinantes antigenicos em sua
superficie.

A aglutinacao pode ocorrer tanto com particulas que apresentam


determinadas antigenicos naturais em sua superficie (hemacias,
bacterias, protozoarios, etc.) como com particulas inertes (latex,
poliestireno, etc.), ou mesmo com celulas antigenicamente nao
relacionadas (hemacias, bacterias) as quais se absorvem ou se fixam
antigenos soluveis.
As reacoes podem ser de aglutinacao direta ou indireta.
A) TESTE DA AGLUTINAO DIRETA - Principio Aglutinacao de
particulas antigenicas insoluveis, em sua forma integra ou fragmentada,
na deteccao de anticorpos especificos. Teste bastante utilizado para
classificacao sanguinea, mononucleose infecciosa e brucelose.
- Materiais e Mtodos
v Bruceloso (Antgeno Rosa Bengala): e uma suspensao de
bacilozs em
coloracao rosa, mistura o bacilo com amostras de pacientes e complexo
Ag Ac se
aglutina.
v Mononucleose: Toma-se uma placa de vidro e mistura-se uma gota
do soro do paciente com o reagente que contem hemacias de cavalo (ag
para mononucleose mais Ac heterofilos).
Observa-se a presenca de aglutinacao. Como os anticorpos
heterofilos, que nao sao especificos para o virus Epstein-Barr, podem
aglutinar as hemacias de cavalo, para o teste positivo realiza-se uma
Segunda etapa. Nesta, mistura o soro com celulas renais de cobaia, as
quais removam quase todos os anticorpos heterofilos da mononucleose
infecciosa.
B) TESTE DA AGLUTINAO INDIRETA
- Princpio As hemacias e as particulas inertes podem ser
sensibilizadas por adsorsao passiva, devida aos contatos direto com os
Ag soluveis. Sao utilizados como suportes na adsorcao de proteina
soluvel e Ag polissacarideos, funcionando como
sistema indicador da reacao Ag-Ac.
AGLUTINAO DO LTEX
v PCR (Protena C Reativa): reacao de aglutinacao em laminas, a
qual particulas de latex sensibilizadas com Ac anti-PCR estabilizadas sao
aglutinadas em presenca da Proteina C Reativa.
- Materiais e Mtodos a) Determinacao Qualitativa: Numa lamina de vidro, com areas para
diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisoes, 1 gota de
soro positivo, 1 gota de soro negativo e 1 soro do soro a testar. Adicionar
a cada uma delas 1 gota do reativo latex anti-PCR. Homogeneizar. Fazer
movimentos suaves de rotacao procedendo a leitura apos cinco minutos.
b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em casode amostra positiva,

realizar sucessivas diluicao do soro ate que se encontre a maior diluicao


que ainda fornece
aglutinacao. O procedimento da analise e o mesmo do teste qualitativo,
porem, utilizase as amostras diluidas. Sendo a sensibilidade do teste de
7UI/mL, o calculo semi quantitativo e realizado da seguinte forma:
[ ] = 7 x (maior diluicao positiva)
v FR (Fator Reumatide)
- Materiais e Mtodos
a) Determinacao Qualitativa: Pipetar 1 gota do soro do paciente em
uma area da lamina e , sobre ela, 1 gota da suspensao de latex
sensibilizado com IgG humana altamente purificada e estabilizada e
suspensa em tampao glicina. Proceder da mesma forma com os soros
controle positivo e negativo. Fazer movimentos suaves de rotacao, sob
uma boa fonte de luz, durante 2 minutos. Observar a formacao de
aglutinacao.
b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva,
realizar sucessivas diluicoes do soro ate que se encontre a maior diluicao
positiva. O calculo semi quantitativo e realizado da seguinte forma:
[ ] = 25 x (maior diluicao positiva)
v ASLO (Anti-Estreptolisina O): Reacao de aglutinacao em laminas,
a qual particulas de latex sensibiladade com estreptolisina O
estabilizada sao aglutinadas em presenca de anti-estreptolisina. O
reativo e padronizado por comparacao com o padrao da OMS.
- Materiais e Mtodos
a) Determinacao Qualitativa: Numa lamina de vidro, com areas para
diferentes testes, depositar sucessivamente em 3 subdivisoes, 1 gota de
controle positivo, 1 gota de controle negativo e1 gota do soro a testar.
Adicionar a cada uma delas 1 gota do latex sensibilidade com ASO.
Homogeneizar. Fazer movimentos suaves de rotacao. Proceder a leitura
em exatamente 2 minutos.
b) Determinacao Semi-Quantitativa: Em caso de amostra positiva, a
partir da diluicao 1/20, realizar sucessivas diluicoes de razao 2 a te 2560
em tampao glicocola. O procedimento da analise diluidas. O titulo de Ac
ASO e calculado da seguinte forma: UI/mL = inverso da ultima diluicao
positiva x 10.
HEMAGLUTINAO INDIRETA
Hemacias estao entre os melhores suportes de Ag para os testes de
aglutinacao, pois uma serie de Ag que pode ser ligada a sua superficie
para fornecer um sistema indicador sensivel na deteccao de Ac, porem,
sua superficie e complexa, facilitando a ligacao de muitos Ag e,
frequentemente, acarreta a presenca de Ac heterofilos que devem ser

removidos antes da execucao do teste.

v CHAGAS
- Princpio Eritrocitos de aves estabilizados, sensibilizados com
compontes
antigenicos Trypanossoma cruzi altamente purificados, mostram
aglutinacao quando reagem com Ac contra esses antigenos presentes no
soro do paciente.
- Materiais e Mtodos
a) Determinacao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano umido para
neutralizar as forcas eletrostaticas. Usar 1 cavidade da placa por
amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. Usar diluicao
do soro 1/32 com a solucao diluente com os controles positivo e
negativo. Transferir 25uL da suspensao homogenea de hemacias placa.
Adicionar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em cada
cavidade. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4 minutos. Deixar
em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em locar livre de
vibracoes. Fazer a leitura. Reacao positiva como um tapete e reacao
negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um
botao.
b) Determinacao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, deve-se
realizar
sucessivas diluicoes (titulacao) a partir da diluicao do soro de 1/32.
Pipetar 25uL da solucao diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da
Segunda cavidade da placa, ate a diluicao que se pretende estudar.
Titular sempre deixando 25uL da diluicao, desprezar
os ultimos 25uL. Pipetar 25uL da suspensao homogenea de hemacias
em todas as
cavidades. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4 minutos. Deixar
em repouso por
1 a 2 horas a temperatura ambiente, em local livre de vibracoes. Fazer a
leitura.
v TOXOPLAMOSE
- Princpio Eritrocitos de aves estabilizados, sensibilizados com
componentes antigenicos do Soxoplasma gonddi altamente purificados,
mostram aglutinacao quando reagem com Ac contra esses antigenos
presentes no soro do paciente.
- Materiais e Mtodos
a) Determinacao Qualitativa: Colocar a placa sobre um pano umido
para neutralizar as forcas eletrostaticas. Usar cavidade da placa por
amostra, incluindo

sempre os controles positivo e negativo. Usar diluicao do soro 1/16 com


a solucao
diluente com 2-Mercaptonol. Fazer o mesmo com os controles positivo e
negativo.
Transferir 25uL da diluicao 1/16 de cada amostra e controles para as
respectivas
cavidades da placa. Adicionar 25uL da suspensao homogenea de
hemacias em cada cavidade. Agitar a placa por vibracao mecanica por 4
minutos. Deixar em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente,
em local livre de vibracoes. Fazer a leitura. Reacao positiva quando as
hemacias de depositam no fundo da cavidade como um tapete e reacao
negativa quando se depositam no fundo da cavidade formando um
botao.
b) Determinacao Quantitativa: Em caso de amostra positiva, devese realizar sucessivas diluicoes (titulacao) a partir da diluicao do soro de
1/32. Pipetar 25uL da solucao diluente com 2-Mercaptoetanol, a partir da
Segunda cavidade da placa, ate a diluicao que se pretende estudar.
Titular sempre deixando 25uL da diluicao, desprezar os ultimos 25uL.
Pipetar 25uL da suspensao homogenea de hemacias em todas as
cavidades. Agitar a placa por vibracoes mecanicas por 4 minutos. Deixar
em repouso por 1 a 2 horas a temperatura ambiente, em local livre de
vibracoes. Fazer a leitura.
v FLOCULAO (VDRL)
O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) emprega cristais
de colesterol que sao sensibilizados com cardiolipina para a pesquisa de
Ac na sifilis. E classificado como um teste nao treponemico, usado como
triagem ou controle da cura.
- Princpio Reacao imunologica de floculacao utilizando antigeno
de cardiopina, lecitina e colesterol em solucao alcoolica, onde as
particulas de Ag floculam ao entrar em contato com o soro ou plasma
(reagina).
- Materiais e Mtodos
a) Determinacao Qualitativa: Tem como objetivo a triagem e
eliminacao dos soros
nao reagentes. Para isso, toma-se uma placa de Kline com suas
cavidades devidamente identificadas para cada reacao. Pipetar 50uL da
amostra a ser analisada e dos soros controle positivo e negativo.
Adicionar-se 25uL da suspensao antigenica a cada cavidade, que ira
reagir com os Ac presentes. Colocar lamina em agitador mecanico por 4
minutos. Fazer leitura em microscopio com objetiva de 10x.
b) Determinacao Semi - Quantitativa: Tem como objetivo reduzir a
pequenos intervalos a quantidade de Ac presentes na amostra. Para
tanto, devera ser feita
diluicao da amostra em solucao salina. Proceder cada diluicao do mesmo

modo como no teste qualitativo. O titulo da amostra sera o da ultima


diluicao onde ainda se visualiza a presenca de agregados.