PRACTICA No 2

CALIBRACIN DEL ESPECTROFOTMETRO

OBJETIVO
Conocer uno de los mtodos analticos ms usuales en bioqumica, as como la
forma correcta de calibracin del espectrofotmetro.

ANTENCEDENTES
La calibracin del espectrofotmetro se puede verificar graficando la
absorbancia contra la concentracin, usando una serie de soluciones especiales de
concentracin conocida de cromato cido y alcalino, dinitrofenol y sulfato amoniacal de
cobalto de varias concentraciones, como soluciones de prueba de calibracin.
La absorcin selectiva de la radiacin electromagntica al atravesar una solucin
da lugar a que el rayo emergente difiera del incidente. En le caso de la radiacin visible,
esta diferencia es evidente frecuentemente a simple vista. Por ejemplo, un rayo de luz
blanca, visto a travs de una solucin de sulfato de cobre, aparece azul, a causa de
que los iones interactan, absorbindolos con los componentes rojos del rayo, mientras
que transmiten completamente la parte azul de la radiacin. La aplicacin de este tipo
de fenmenos de absorcin a la identificacin cualitativa de substancias,
indudablemente es conocida, pues muchas de las reacciones de la investigacin
cualitativa se basan en la absorcin del color de las soluciones. De igual importancia es
el empleo de la absorcin de la luz para la determinacin cuantitativa de los sistemas
qumicos.
Ley de Beer
Cuando un haz de radiacin monocromtica atraviesa una solucin que contiene
una especie absorbente, la energa radiante del haz se reduce progresivamente como
consecuencia de la absorcin de parte de la energa por las partculas de dicha especie
qumica. La disminucin de energa depende de la concentracin de la sustancia
responsable de la absorcin as como de la longitud del recorrido del haz a travs de la
solucin. La ley de Beer expresa cuantitativamente estas relaciones.
Sea Po la intensidad de la radiacin de un haz que incide sobre una seccin de
una solucin que contiene c moles de una sustancia absorbente por litro. Adems, sea
P la intensidad del haz despus de atravesar una capa de dicha solucin de b

centmetros de espesor. A consecuencia de la absorcin, P ser menor que P o. La ley

de Beer relaciona estas dos cantidades por medio de la expresin siguiente:
log Po / P = bc = A
En esta ecuacin es una constante llamada absortividad molar o coeficiente
de absorcin molar . El logaritmo decimal de la razn de la intensidad incidente a la
transmitida recibe el nombre de absorbancia de la solucin, y se simboliza por la letra
A. Se ve en la ecuacin anterior que la absorbancia de una solucin aumenta
directamente con la concentracin de la sustancia absorbente y con la longitud del
camino atravesado por el haz.
La transmitancia se define como:
T = P/Po
La transmitancia es, pues, la fraccin de la radiacin incidente transmitida por la
solucin; en general se expresa como tanto por ciento. La transmitancia est
relacionada directamente con la absorbancia por la expresin:
-

log T = A

MATERIAL Y REACTIVOS

Espectrofotmetro Spectronic 20 con dos celdas

4 matraces volumtricos de 50 ml
pipeta de 10 ml
KOH 0.05 N
K2Cr2O7 50 mg/ml
Riboflavina 5x10-5 M

PROCEDIMIENTO
1. Prepare las siguientes soluciones:
a) KOH 0.05 N (2.8 g de KOH en 1 litro de agua destilada)
b) K2Cr2O7 de concentracin de 50 mg/ml. (20 mg de dicromato de potasio,
500 ml de KOH 0.05 N)
c) En 4 matraces volumtricos de 50 ml pipetee por separado lo siguiente:
3 ml de K2Cr2O7
7 ml de K2Cr2O7
10 ml de K2Cr2O7
13 ml de K2Cr2O7
Diluya cada una a 50 ml con KOH 0.05 N

2. Enciende el espectrofotmetro y djelo calentar por 20

aproximadamente enseguida, seleccione la longitud de onda a 370 nm

minutos

3. Ajuste la absorbancia a cero con el blanco (kOH 0.05 N)

4. Lea la absorbancia de las 4 soluciones ya preparadas, ajustando nuevamente
con el blanco entre cada una de ellas.
5. Lea la absorbancia de una muestra problema proporcionada por el instructor.

MANEJO DE DATOS
1.Calcular la concentracin de K2Cr2O7 (mg/litro) para cada matraz
volumtrico de 50 ml que utilizo para elaborar la curva de calibracin.
2. Grafique la absorbancia en el eje de las ordenadas y la concentracin
de K2Cr2O7 (mg/lt) en el eje de las abscisas en papel milimtrico.
3. Leyendo la absorbancia de la muestra problema a la misma longitud de
onda, calcule la concentracin de una muestra problema en forma
visual.
4.Calcule el coeficiente de correlacin y la regresin lineal de la curva de
calibracin y determine con este mtodo la concentracin de muestra
problema.

DETERMINACIN DEL ESPECTRO DE ABSORCIN DE LA RIBOFLAVINA

1. Usando Riboflavina de concentracin 5x10-5 M, lea la absorbancia de sta
sustancia a intervalos de 10 a 25 nm (200-500 nm)
2. Recordar que el hacer cada cambio de longitud de onda necesitar un reajuste
con el blanco a cero de absorbancia.
3. Alrededor de las longitudes de 260, 370 y 450 nm, haga mediciones ms
cercanas (espacios de 10 nm)
4. Grafique absorbancia en el eje de las ordenadas contra longitud de onda en el
eje de las abscisas.

CUESTIONARIO

1.--Cul es el propsito de la utilizacin de un blanco en la elaboracin de la

curva de calibracin?
2. - Anote los intervalos de la longitud de onda de la luz ultravioleta, visible e
infrarroja
3. - Cules son los beneficios de la aplicacin de la ley de Beer?
4. - Cul es la relacin que existe entre absorbancia y transmitancia?
5. - Que importancia tiene la determinacin del espectro de absorcin en una
sustancia?

BIBLIOGRAFIA

1. Douglas, A. S and Donald, M. W. Introduccin a la Qumica Analtica. Ed.

Revert.1974. Barcelona. Espaa.
2. Douglas, A. S and D. M. W. Anlisis Instrumental. 2 ed. Ed. McGraw-Hill. 1989.
Mxico.
3. Harold, F. W. Anlisis Qumico e Instrumental Moderno. Ed. Revert. 1983.
Barcelona. Espaa.