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Técnicas moleculares em biologia aplicadas ao

diagnóstico
Esta disciplina tem 60 h (30T e 30P) e é oferecida como eletiva pelo Curso
de Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da UFPE. Para o
roteiro deste semestre (1o. sem/2006), consulte Notícias para TMB.

A disciplina no 1o. semestre em que foi oferecida (2o. sem. 2005,


ministrada em 2006) seguiu o roteiro abaixo. Para este ano
procuraremos seguir o roteiro especificado em Programa.

Roteiro 2o. sem. 2005, ministrada em 2006


Parte A: 6 aulas baseadas no programa de Genética Molecular para
Ciências Biológicas
Parte B
Aula 1: PCR
Aula 2: Desenho de primers
Aula 3: Outras técnicas moleculares
Aula 4: Ferramentas de data-mining on-line para busca de alvos de
PCR (aula dividida em 3 partes, acessadas ao final de cada parte
anterior)

Programação 2005 (2o. sem) de seminários

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Aula 1: PCR

Esta aula foi baseada no capítulo 2 de nosso livro-texto.

O capítulo comenta várias técnicas, entre elas o PCR. Fala também de forma
breve sobre a extração de DNA e de RNA. Nesta aula complementamos em
sala alguns pontos que julgamos importantes e que estavam pouco
explorados no livro ou mesmo não foram comentados.

1. Extração de DNA

Durante toda a primeira parte do século XX as proteínas tiveram muito mais


atenção da ciência do que os ácidos nucléicos. Como censequência, os
métodos de extração, purificação e análise de proteínas avançaram muito
mais do que os equivalentes para DNA. A partir da década de 60 esta
situação foi lentamente se modificando até que, ao final do século, ficou
muito mais fácil extrair, purificar e analisar DNA do que proteína. Parecia
um caminho sem volta, mas a proteômica aos poucos vai igualando este
placar outra vez, Esta, entretanto, é outra história, que vamos contar em
outras aulas.

A extração clássica de DNA envolve os passos descritos no livro: lise,


desproteinização e concentração do DNA. Devemos manter em mente que o
DNA é extremamente solúvel em água, muito mais do que a maioria das
proteínas e mesmo de muitos açúcares. Mas mesmo antes que se possa
proceder à primeira destas etapas, é preciso considerar o material que nos
vai doar as células ou, ao menos, o DNA (já fora delas),

1.1 Tipos de material fonte e manipulações prévias à extração

Há uma ampla gama de material do qual poderemos ter interesse em extrair


o DNA, como mostrado na tabela abaixo. Uns são duros, outros moles ou
líquidos, uns abundantes, outros escassos, uns fáceis de extrair o DNA e
outros positivamente dificílimos.

Tabela I. Alguns exemplos de fontes de DNA. Podem ser duras ou friáveis e


mesmo líquidas.

material mole ou
material duro
fluido
osso ascite
tumor sólido aspirado de medula
coral tecidos moles em geral
esponjas marinhas sangue
água de reservatórios
coprólitos
naturais ou artificiais

O material duro geralmente é fragmentado antes da extração por


maceração, o que pode ser feito de muitas formas distintas: com um pistilo
e uma cuba, com um ralador, com alicate, etc. Em geral o material a ser
macerado e os instrumentos são todos congelados ou pelo menos mantidos
em gelo durante o trabalho, embora o DNA seja muito resistente às
temperaturas usuais, O problema é que a maceração gera um calor local
surpreendente, que não se percebe facilmente.
Tecidos moles e tumores devem ser congelados em nitrogênio líquido ou gelo
seco e macerados como o material duro. Sangue, ascite, água e qualquer
outro material que contenha o DNA em suspensão celular devem ser
centrifugados para a coleta das células e fragmentos de tecidos.
O precipitado (ou pellet) deve ser ressuspenso num tampão
adequado e passado por um homogeneizador Potter, que consiste
de um tubo onde passa muito justo um êmbolo de vidro
sinterizado ligado a uma haste. O material líquido é obrigado,
pelo movimento do êmbolo, a subir e descer pelo tudo, entre a parede do
tubo e a do êmbolo. Nesta passagem as células são rompidas. Dependendo do
ajuste entre o êmbolo e o tubo, até mesmo as organelas serão rompidas. A
figurinha ao lado mostra três tubos Potter e seus êmbolos. Em geral o
material que vai ser homogeneizado num Potter é mantido gelado e o próprio
Potter fica imerso num banho de gelo. Este procedimento é especialmente
importante na extração do RNA. A figura abaixo mostra um Potter num
banho de gelo.

Figura 1. Homogeneizador Potter num banho de gelo. A suspensão de células é obrigada a


subir e descer pelo êmbolo quando este é gentilmente movimentado ao longo do tubo.

Simplificações são possíveis na etapa de preparação prévia do material,


como passar a suspensão de células repetidas vezes por uma agulha fina,
empurrando a suspensão com uma seringa. Ainda mais simples, pode-se
ferver o material e usar o sobrenadante como fonte de DNA.

1.2 Lise química

Esta etapa está bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas alguns
pontos suplementares:
algumas células têm uma parede celular rígida (como os vegetais) ou estão
de alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas).
Em alguns casos podemos empregar uma enzima específica para estas
paredes rígidas (lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos
temos que empregar o Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra forma
muito eficiente de lise e a quebra por ultra-som.

Se a lise é feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, por
exemplo), o DNA liberado da célula vai para o sobrenadante. A manipulação
d solução com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar o
DMA em grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandes
fragmentos são úteis para quase todas as técnicas de análise de DMA.
Apenas para a análise de tamanhos de cromossomos temos que ser muito
cuidadosos na extração, mas isto não será tema de nossa disciplina.

O aquecimento do material a ser lisado ajuda na lise, mas se for acima de 65


o
C vai levar à desnaturação do DNA cromossômicos (que está em grandes
fragmentos, como dito acima). O DNA desnaturado é pouco solúvel e
tenderá a precipitar na etapa de desproteinização, o que vai forçar a perda
de material para análise. O aquecimento, contudo, é usado quando queremos
extrair DNA plasmidial de uma célula, e nos ver livres do DNA
cromossômico.

1.3 Desproteinização

Classicamente a retirada de proteínas é feita com o uso do fenol. Este


solvente orgânico tem um coeficiente de partição muito elevado para
proteínas, isto é, quando misturado numa solução aquosa contendo proteínas,
o feno sequestra as proteínas em sua fase e, à medida em que vai se
separando da água, leva as proteínas consigo. A água fica no sobrenadante e
as proteínas ficam retidas no fenol, no fundo do tubo. Mas normalmente a
etapa de extração com fenol é precedida de uma outra, mais simples, em
que as proteínas menos solúveis são retiradas pela adição de sal à
suspensão. Este é o clássico "salting out" da bioquímica, que também é o
princípio da conservação de carnes por salmouras, etc. Após a adição do sal
(em geral acetato de amônia) a suspensão é centrifugada e o pellet
descartado. No sobrenadante há, agora menos proteína e já se pode extrair
o que ficou com fenol.

A desproteinização está bem descrita no livro e não vamos dar maior ênfase
a ela aqui.
1.4 Concentração do DNA

Uma vez que nos vimos livres das proteínas (e com elas outras moléculas,
que vão embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Para
concentrar o DNA geralmente precipitamos o dito com álcool. Para isso
adicionamos álcool 100% gelado ao mesmo volume de solução de DNA e
centrifugamos o tubo a 13.000 por 5 minutos. Após o descarte do álcool
pode-se lavar gentilmente o pellet com àlcool a 70% e deixar secar o
material. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num volume adequado
de água ou de tampão (em geral Tris-EDTA). Há outros detalhes e
comentários importantes no texto do livro.

1.5 Alternativas ao fenol

Hoje em dia há um grande número de kits comerciais que empregam resinas


e outros produtos para a purificação rápida de DNA. Em nossas mãos o
DNAzol é um dos mais eficientes: a quantidade de DNA obtida por mg de
tecido não é muito grande, mas a pureza é satisfatória para a maioria das
aplicações. Há também uma variante do DNAzol para extração de DNA do
sangue, o BloodDNAzol, e outra para extração de RNA (o RNAzol). Estes
kits são baseados nas propriedades caotrópicas da tioguanidina na
concentração de 6M ou maior: neste produto os componentes celulares se
desagregam, as enzimas páram de atuar e o material se torna estável por
longo tempo à temperatura ambiente. É a forma ideal de transportar
amostras para extração e análise posterior

2. Observações sobre o PCR

A técnica de PCR já foi discutida nas aulas anteriores (veja Aulas de


Genética Molecular no site www.biolmol.cjb.net) e vamos aqui apenas
enfatizar certos pontos.

2.1 Tubos, placas e evaporação

Os termocicladores de hoje, também chamados máquinas de PCR ou


simplemente PCRs, trabalham com tubos diminutos de plástico (para volumes
de, no máximo, 200 µ l, mas usualmente levam reações com 10 a 50 µ l) ou
com microplacas com 96 poços, cada um para até 200 µ l. É claro que uma
reação feita com 10 ou 50 microlitros, se aquecida repetidamente como
pede uma reação de PCR, vai evaporar completamente. Para evitar isso pode-
se colocar uma pequena gota de óleo mineral sobre a reação, em cada tubo,
ou selar a placa com um filme plástico muito aderente. Ultimamente a
indústria vende tubos com uma tampa especial que evita a evaporação e
também um selo plástico formado por 96 pequenas tampas que pode ser
colocado sobre a placa e mantido apertado contra ela pela tampa do
termociclador, o que também evita a evaporação.

2.2 Falta de energia

Um problema crítico no PCR é que ele não


deve ser interrompido e retomado algum
tempo depois. Assim, falta de energia é
sempre uma dor de cabeça para o
experimentador. idealmente, a máquina de
PCR deve estar conectada a um no-break,
como um computador.

2.3 Rampas de aquecimento e


resfriamento

Quanto mais rápida seja a mudança de


temperatura entre os pontos escolhidos
para uma reação de PCR (usualmente 96,
56 e 72 C). melhor será o resultado do PCR: menos bandas espúrias, mais
o

nitidez da banda esperada, etc. Entretanto, aquecer rapidamente não ´pe


tão simples, e esfriar rapidamente é ainda mais complicado. As rampas de
esfriamento e aquecimento mais íngremes são as melhores. O sistema
Peltier, pelo qual a passagem de corrente elétrica num bi-mental aquece ou
esfria uma placa, é muito simples e confiável, mas não dá rampas muito
íngremes. Os melhores termocicladores não usam este princípio, mas são
muito caros. Então, o comprador deve estar atento ao resultado que quer
atingir e aos custos que deve tolerar.

A figura ao lado mostra duas rampas de inclinação diferente para um


termociclador hipotético.

Outro ponto importante: os termocicladores não servem só para fazer PCR,


mas podem ser usados para um grande número de outras aplicações no
laboratório.
2.4 Hot start

Quando se começa um PCR, a enzima Taq polimerase vai atuar ainda durante
a rampa de aquecimento, antes que os DNAs estejam devidamente
desnaturados a 96 oC. Isto pode dar umas bandas extras no PCR e borrões
feios no gel. Para evitar isso pode-se pipetar a Taq no tubo quando a mistura
já alcançou a temperatura de desnaturação. Há hoje em dia resinas
especiais que se desmancham quando a temperatura é adequada e liberam a
Taq. Começar a ação da Taq quando a temperatura é alta é conhecido como
hot start.

2.5 PCR touch down

No livro há um item sobre o uso desta técnica para determinar a melhor


temperatura de pareamento (anelamento ou annealing). Mas hoje em dia é
muito mais corriqueiro o uso de termocicladores com gradiente de
temperatura. Pode-se regular a placa aquecedora para ter à sua esquerda
uma temperatura e à direita outra, vários graus maior ou menor. O
resultado é que todas as temperaturas intermediárias estarão distribuídas
nos poços ao longo da placa. Esta forma é muito mais eficiente para
determinar a melhor temperatura de pareamento, ou de extensão.

2.6 PCR em tempo real

Muitas vezes as pessoas confundem a nomenclatura RT-PCR, porque de


fato ela tem dois significados. Um que está no livro, é reverse-
transcriptase-PCR, um PCR que começa pela ação da transcriptase reversa,
para transformar um RNA num cDNA. Depois a reação continua como um
PCR convencional. O outro significado é real time PCR, um sistema moderno
de PCR, quantitativo, em que a reação não é visualisada num gel e sim medida
pela fluorescência emitida no sistema. esta técnica está breveente descrita
e comentada no final da aula de PCR na página de aulas de genética
molecular deste site.

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Aula 2: Desenho de primers

Além da apresentação do Prof. Kido, há também aqui d o site do programa


que foi empregado na aula parta desenho de primers (software on-
lineprimer3).

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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Aula 3: Outras técnicas moleculares e aplicações não mencionadas


na aula 1

O PCR foi inventado no meio da década e 80 e só veio encontrar


uma ampla aplicação, inclusive comercial, na década de 90. Antes
disso, outras técnicas moleculares dominavam o mercado. Como
eram todas menos sensíveis que o PCR, suas aplicações eram, de
certa forma, mais limitadas. Duas delas se destacavam e se
complementavam: o uso de sondas de DNA e o uso de enzimas de
restrição. A união das duas técnicas ficou conhecida como RFLP
(restriction fragment lenght polymorphism, polimorfismo dos
comprimentos de fragmentos de restrição). As sondas e o RFLP
continuam tendo grande aplicação, inclusive no diagnóstico
laboratorial, apesar do PCR. A seguir comentaremos brevemente o
desenvolvimento de sondas e suas aplicações e o RFLP.

1. Sondas de DNA e hibridização com DNA ou RNA

Uma sonda de DNA é um DNA fita simples, de tamanho pequeno


(em geral ente 50 e 300 bases), que está marcado com uma
susbtância radiativa ou conjugado a um produto qualquer que
permita sua visualização nuam etapa final do ensaio de hibridização.
Assim, o objetivo de uma sonda é encontrar (hibridizar com) um
trecho de um DNA para o qual ela seja pelo menos parcialmente
complementar, e permitir a posterior localização de sua presença
num ensaio qualquer: num Southern blot (como uma banda), num dot
assay (como um ponto), num ELISA (como susbtrato colorido), etc.
Veremos inicialmente, de forma muito breve, como é possível
produzir uma sonda com uma sequência conhecida, e de tamanho
determinado.

Há várias formas de se produzir uma sonda e as que vamos


descrever são apenas duas delas, talvez as mais frequentemente
empregadas. Para uma revisão mais completa deste assunto, favor
consultar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
rid=hmg.section.458 , que mostra o capítulo de um dos nossos livros
da bibliografia (neste caso, em inglês), o Genética Molecular
Humana, de Strachan e Reed.

1.1 Preparação de sondas de DNA

As sondas de DNA vão servir, em geral, para vários tipos de testes de


hibridização. Estes testes têm, em comum, o objetivo de identificar
visualmente uma sequencia de ácido nucleico (em geral DNA, mas também
am alguns casos RNA) que está em mistura com muitas outras. As sondas de
DNA podem ser feitas como fitas duplas ou fitas simples, mas para
funcionarem nos ensaios de hibridização, elas devem ser desnaturadas,
numa primeira etapa, se forem feitas como fitas duplas.

As sondas convencionais são feitas de DNA clonado num plasmídeo. A partir


deste plasmídeo é possível produzir fitas simples de DNA copiadas do
trecho clonado, como primeiro passo para a produção de sondas fitas
simples. Pode-se também amplificar o DNA clonado por PCR (empregando
primers que hibridizam com as regiões flanqueadores do inserto no
plasmídeo). Estas duas formas básicas de iniciar a produção de sondas fita
simples ou fita dupla estão mostradas na figura 1 abaixo: Um pedaço de
DNA fita dupla (em segmento de um gene, uma região com repetições, uma
região telomérica, etc.) pode ser clonado num plasmídeo e a partir desta
construção pode-se produzir uma fita simples (por extensão de um primer, à
esquerda, como na parte A da figura 1) ou por PCR, à direita. Pode-se, neste
processo, incorporar, por exemplo, um precursor radioativo de uma das
bases nitrogenadas, e a fita simples ou dupla já será produzida marcada e
será, portanto, uma sonda. Por outro lado, pode-se marcar o DNA fita
simples ou fita dupla recém produzido pela conjugação com uma enzima ou
biotina (parte B da figura 1 ) ou se pode ainda empregar um primer
previamente "marcado" com material radioativo ou fluorescente (parte C da
figura 1 ). Há várias outras possibilidades de se marcar uma sonda, mas
remetemos o leitor ao link já comentado anteriormente ou a manuais
específicos de laboratório. Quanto ao tamanho da sonda, ela pode ter umas
poucas centenas de bases, mas pode, em alguns casos, ser muito longa, com
mais de 10.000 bases. Tudo dependerá do que queremos identificar na nossa
posterior hibridação.

Figura 1: A - Um segmento de DNA (em vermelho) pode ser clonado num plasmídeo (em
amarelo) e a partir de posições específicas no plasmídeo pode-se estender uma fita simples
(com o auxílio de uma DNA polimerase) ou produzir uma fita dupla (por PCR). Se
precursores de bases (dNTPs) marados forem empregados neste processo, a fita simples
ou dupla já sai marcada, sendo, poranto, uma sonda. B - uma fita previamente produzida
pode ser "marcada" pela conjugação de algumas bases com uma enzima ou outra molécula
apropriada (biotina, por exemplo). Estas moléculas auxiliarão na visualização posterior da
sonda, no ensaio de hibridização. C - A marcação da sonda pode ser feita pelo uso de um
primer previamente marcado.

Uma alternativa para a produção de sondas de pequeno tamanho é a síntese


de oligonucleotídeos, isto é, pequenas sequências de DNA fita simples,
neste caso, marcadas com radiatividade ou outro tipo qualquer de marcação.
Os oligonucleotídeos têm em geral menos de 50 bases e a hibridização deve
ser feita em condições especiais para que estas sondas possam ficar
aderidas ao DNA alvo ao fim do ensaio de hibridização.

Os marcadores de sondas podem ser, como dito anteriormente, de origem


radioativa ou não. Tradicionalmente, a marcação radioativa é feita pela
incorporação de nucleotídeos contendo radioisótopos (32P, 33P, 35S ou 3H),
que pode ser detectada de várias formas, sendo a mais usual a auto-
radiografia (exposição do material - gel, membrana de blot, etc - a um filme
de raio X).

As marcações não radioativas, pela conjugação de uma molécula específica a


várias bases da cadeia de DNA, são em geral de três tipos:

• incorporação de um fluoróforo (ou fluorocromo), isto é, uma molécula


que emitirá florescência quando devidamente excitada (Figura 2,
abaixo)
• incorporação de uma enzima, que deverá quebrar um substrato
cromogênico adicionado posteriormente, que irá gerar uma cor sobre
o ponto em que ocorreu a reação ou dentro do recipiente onde a
sonda está presente.
• incorporação de uma molécula repórter, que será ligada numa segunda
etapa a uma segunda molécula com a missão de identificar a primeira,
por reação cromogênica ou por outro sistema qualquer. Atualmente a
molécula repórter biotina tem sido bastante utilizada: ela é
fortemente reconhecida pela avidina (ou estreptoavidina), sendo a
segunda molécula conjugada com uma molécula adequada para a
geração do sinal (cor, fluorescência, etc) no ensaio. Outra molécula
bastante empregada é a digoxigenina (um esteróide de planta), que
atua como repórter. Um anticorpo específico anti-digoxigenina,
conjugado com uma enzima (a peroxidase, por exemplo) é empregado
para revelar a posição da digoxigenina no ensaio.
Figura 2: A - A conjugação de um fluorocromo (fluoresceína, que brilha verde no
microscópio) ou rodamina (que tem uma cor avermelhada) é feita através de um braço
espaçador ao nucleotídeo de uma cadeia ou diretamente oa precursor de bases
trifosfatado (como na figura). B - A amostra cujo DNA foi reconhecido com a sonda
marcada com fluoresceína é observada ao microscópio de fluorescência por epi-iluminação.
O comprimento de luz adequado para a excitação do fluorocromo é selecionado pelo filtro
de excitação, a luz reflete no espelho dicróico e desce pela objetiva até a amostra. O
flouorocromo excitado emite a radiação verde característica que é direcionada pela
objetiva de volta ao espelho, mas desta vez a luz o atravessa e vai, através da ocular, ao
olho do observador. Fonte da imagem: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
rid=hmg.figgrp.476
1.2 Princípios de hibridização de ácidos nucléicos

A hibridização de ácidos nucléicos pressupõe a mistura de fitas simples de


DNA de fontes distintas. A sonda é usualmente composta de um conjunto de
moléculas idênticas de DNA, marcadas como discutido acima. O DNA alvo
pode ser composto de fragmentos de genoma, DNA previamente submetido
a digestão por enzimas de restrição, RNA mensageiro e ainda muitas outras
fontes de ácidos nucléicos. A fonte de DNA alvo tem, em geral, uma
natureza heterogênea, isto é, muitas diferentes sequências de bases
estarão presentes nos fragmentos de DNA oferecidos à análise.

Se o DNA alvo ou a sonda (ou ambos) são DNA fita dupla, é preciso separar
as duas fitas antes de iniciar a hibridização, o que é geralmente obtido por
aquecimento ou por tratamento com tampão muito alcalino. Quando se
restauram as condições adequadas para o pareamento de bases, as fitas
voltam a parear. A sonda pode então parear com sua região de
complementariedade no DNA alvo. É claro que, se a sonda era originalmente
fita dupla, ela tenderá a formar de novo a fita dupla, assim como o DNA alvo
voltará a formar uma dupla fita, se originalmente ele estava nesta forma no
ensaio. Mas o que interessa para o ensaio é a hibridização da sonda com o
DNA alvo. Em geral o DNA alvo está aderido a um suporte, enquanto a sonda
está na fase líquida, o que permite, por simples lavagem, retirar toda a
sonda que não pareou com o DNA alvo ao final do ensaio, e revelar o
resultado.

A temperatura de desnaturação dos ácidos nucléicos depende da


composição de bases do DNA: quanto maior o conteúdo CG maior a
temperatura necessária para a desnaturação. A temperatura em que 50%
das moléculas de DNA se desnaturam (chamada Tm), para o genoma humano
(que tem perto de 40% de C+C) é de 87 oC. Então, quando a desnaturação é
feita pelo aumento de temperatura, classicamente empregamos 94 oC. Mas
a temperatura de desnaturação também determina a melhor temperatura
de pareamento (ou anelamento, como é designado o processo no nosso livro-
texto de Rossetti e cols.). Geralmente ela é 25 oC menor que a de
desnaturação. Então, temperaturas de hibridização entre 56 e 64 oC são
comuns. Se descermos demais a temperatura de hibridização (pareamento
ou anelamento) há sempre o risco, como no PCR, de provocarmos
pareamentos sem sentido, ruins, que vão atrapalhar nossa análise dos
resultados, posteriormente.

Depois que o pareamento é feito, é preciso lavar o excesso de sonda, que


não pareou com o DNA alvo. Isso pode ser feito com o tampão de lavagem a
uma temperatura mais alta do que a ambiente. Esta temperatura mais alta
(em geral 37 a 45 oC) cria uma condição de estringência (de rigor) mais
forte, e lava embora o que não estiver muito bem preso no suporte onde
está preso o DNA alvo.

Um dos fatores que vai determinar se a sonda fica bem aderida ao DNA alvo
é o seu tamanho. Outro fator é a porcentagem de identidade
(complementariedade) entre a sonda e o DNA alvo. Com a prática (e a
leitura de manuais específicos) o experimentador vai se familiarizando com
estas variáveis do ensaio de hibridização. Vários outros fatores influenciam
na reação de hibridização e não cabe aqui uma discussão mais completa.

1.3 Ensaios de hibridização de ácidos nucléicos

A imobilização do DNA alvo num suporte qualquer, em geral uma


membrana de nylon ou uma lâmina de vidro, foi a forma encontrada
para, ao mesmo tempo, aumentar muito a concentração de DNA alvo
no ensaio e facilitar as etapas de lavagem da sonda não aderida ao
DNA alvo. Praticamente todos os ensaios de hibridização são, assim
heterogêneos, isto é, uma parte dos reagentes fica na fase sólida
(a membrana) e outra na fase líquida (o tampão). Nos últimos anos
a inversão dos elementos do suporte passou a ser adotada em
ensaios de alto desempenho (high throughput). A tabela abaixo
mostra os vários ensaios mais comumente empregados em
laboratórios de pesquisa e de serviços no mundo todo.

Tabela I - Ensaios padrão e ensaios reversos mais adotados em laboratórios


de pesquisa e serviços no mundo. Baseado em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.499

Ensaios padrão Sonda marcada em solução DNA alvo não marcado ligad

Populações complexas de DNA


Qualquer DNA ou RNA marcados, mas
Dot-blot tamanho, mas pipetadas direta
usualmente um oligonucleotídeo
pequenos pontos (dots)

Geralmente DNA genômico co


Southern blot Qualquer individuais de DNA), digerido co
tamanho (em eletroforese), e tr
População complexa de RNA (
Northern blot Qualquer fracionada por tamanho (em ele
membrana
DNA nos cromossomos (em ge
Hibridização in situ de cromossomo Geralmente um clone genômico marcado
numa lâmina de microscópio
Geralmente uma ribo-sonda anti-sense (isto
RNA dentro de células de tecid
Hibridização in situ de tecido é, complementar à fita de RNA do tecido) ou
microscópio
ainda um oligonucleotídeo
Colônias de bactérias ou célula
Blot de colônia Qualquer
transferidas para uma membran
Plaques de lise fágica em tapet
Blot de plaque viral (ou fágica) Qualquer
ágar nutriente, transferidas para
Clones de bactérias transferido
Ensaio de hibridização de grid de
Qualquer ordenada, em membrana. Pode
colônias
menor.
Ensaios reversos DNA alvo marcado em solução Sondas não marcadas ligada
Dot-blot reverso DNA complexo Oligonucleotideos pipetados em
Clones de DNA aplicados em m
DNA microarray DNA complexo
auxílio de um robô
Oligonucleotideos sintetizados
Microarray de oligonucleotídeos DNA complexo
micro-pontos ordenados.

Muitas das técnicas acima podem encontrar aplicação imediata em


diagnóstico.

No Dot blot podemos pipetar numa membrana os DNAs extraídos de tecidos


de pacientes com uma suposta infecção por um fungo, por exemplo, e em
seguida hibridizarmos o material com uma sonda representando uma região
gênica exclusiva (característica) deste fungo. Muitos pacientes podem ser
investigados, assim, ao mesmo tempo. A limitação é a quantidade de DNA do
fungo presente no ensaio, que não deve ser tão pequena que, frente ao
enorme excesso de DNA do próprio paciente, não possa ser localizada pela
sonda.

A hibridização de cromossomos, também chamada FISH, pode ser aplicada


à identificação de alterações de sequências nos cromossomos que não levam
a mudanças conformacionais detectáveis pelas técnicas de bandeamento
convencionais. É, assim, uma aliada do diangóstico genético humano ou de
animais, além de ter inúmeras aplicações em pesquisa.

A hibridização in situ de tecidos se assemelha ao FISH, mas o alvo é em


geral o RNA das células, e não um cromossomo individualizado na metáfase.
Ela pode ser aplicada ao estudo da expressão de certos genes que podem
estar ligados, por exemplo, ao câncer. Mas também pode ser aplicada à
detecção de RNA viral ou de um agente infeccioso qualquer no tecido de um
paciente.

O Southern blot (que ganhou este nome por ter sido inventado por um
pesquisador de nome Southern) também encontrou muitas aplicações no
diagnóstico. Estranhamente, não é uma técnica trivial, mas foi de tal forma
aprimorada e padronizada pelas várias empress fornecedoras de insumos
que alcançou considerável uso na área diagnóstico, com especial aplicação na
detecção de doenças genéticas e no diagnóstico de paternidade. Vamos
focalizar um pouco mais a atenção sobre este ensaio e deixaremos os
demais para outra disciplina, que será oferecida em breve no CCB (UFPE)
pelo Gentrop (Departamento de Genética). Para uma leitura on-line (em
inglês) deste assunto, recomendamos o livro texto de Genética Molecular
Humana - Strachan e Reed, pelo link
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.

A figura abaixo sumariza os principais passos do Southern blot aplicado a


um DNA pré-digerido com enzimas de restrição. Esta associação técnica é
conhecid como RFLP e envolve a purificação do DNA alvo (de um paciente,
por exemplo), sua digestão com enzimas de restrição, a separação dos
fragmentos gerados e a transferência destes fragmentos para uma
membrana de nylon ou material análogo. Esta membrana será então incubada
com a sonda de DNA marcada, que deverá ser dirigida contra o segmento de
DNA que se tem interesse em estudar. Vão aparecer bandas
correspondentes a fagmentos de restrição do DNA original que têm
sequências total ou parcialmente complementares à sonda.
Figura 3: Esquema representativo da técnica conhecida como RAPD, que é de fato a
aplicação do Souther blot a um conjunto de amostras de DNA pré-digeridas com enzima de
restrição. A figura é auto-explicativa. Ressaltamos apenas o resultado da eletroforese, que
dá um número muito grande de bandas com diferentes pesos moleculares e que não podem
ser resolvidas no gel, que mostra apenas um rastro (smear) no lugar das bandas. As bandas
só surgirão pela identificação destas pela sonda.

Se a sonda tiver um número razoável de bases (suponhamos, 1000 b), ela


poderá ser capaz de identificar alterações ocorridas no padrão de
fragmentação do DNA pelas enzimas de restrição, toda vez que um sítio de
restrição dentro da região de reconhecimento da sonda o próximo a ela for
criado ou desaparecer, devido a uma mutação. Isto vai provocar o
aparecimento ou desaparecimento de uma banda no resultado final mostrado
na figura abaixo, indicando que houve alteração na sequência de DNA.
Figura 4: - A digestão de um DNA genômico com enzimas de restrição gera um número
muito elevado de bandas. Mas com o uso de uma sonda dirigida a uma única região do
genoma (um gene ou região intergênica de interesse) é possível estudar apenas um pequeno
trecho. A figura mostra à esquerda e à direita dois segmentos de DNA idênticos exceto
pela presença de uma mutação que elimina um sítio de restrição para a enzima BamH1
(GGATCC) do segmento em estudo; Os sítios de restrição que ainda permanecem no DNA
mutado geram um segmento de 9 kpb, que será identificado pela sonda no Southern blot,
enquanto no DNA selvagem (não mutante) o mesmo fregmanto será cortado em dois pela
enzima de restrição, gerando dois fragmentos de 4 e 5 kpb. Apenas um deles (o de 4 kpb)
será reconhecido, já que o outro não contém região de homologia com a sonda.

Quando o RFPL é aplicado ao estudo de diferenças entre fragmentos de


restrição contendo regiões repetidas, que não fazem parte de genes, ele
pode se tornar uma ferramenta para identificar indivíduos e apontar
relações de cruzamento entre casais. Isto se deve ao fato de que estar
regiões ricas em repetições, não sendo genes, divergem muito entre
indivíduos. Estas repetições, chamadas VNTR, poderiam, em princípio, ter
um número muito variado de repetições, mas na prática o termo é guardado
para arranjos de tamanho moderado, contendo repetições de 5 a 64 pb.
estas repetições são conhecidas como DNA mini-satélite hipervariável, ao
contrário das repetições de um a 4 nucleotídeos, que são chamadas micro-
satélites.
Cada um de nós carrega, em princípio, dois alelos para quaisquer destas
repetições, uma trazida do genoma de nossas mães e outra de nossos pais.
Quando transmitimos à progênie estas "marcas", uma delas apenas passará à
F1, que receberá a outra do outro parceiro (ou parceira) do cruzamento.
Então, estudando estas regiões, que são polimórficas em tamanho,
poderemos inferir hereditariedade e individualidade. A figura abaixo,
adaptada de um excelente portal sobre biologia molecular
(http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/), mostra como poderiam
aparecer estes fragmentos de restrição reconhecidos por uma sonda, numa
análise de relação de parentesco.

Figura 5: - O RFLP para paternidade gera um número de bandas grande (simplificado na


figura), fruto da digestão do DNA genômico do indivíduo com enzimas de restrição e do
reconhecimento de múltiplos fragmentos pela sonda dirigida contra a região repetida de
interesse. Neste esquema as cores das bandas maternas e paternas correspondem às cores
de seus ovócito e espermatozóide. D1, filha do casal, tem 2 bandas maternas, sendo as
restantes necessariamente paternas. D2, filha de um primeiro casamento da mãe, tem 3
bandas maternas mas as bandas paternas (em vermelho) não coincidem todas elas com as
esperadas no atual marido (uma pequena diferença de migração é suficiente para
diferenciar duas bandas). S1, filho do casal, tem duas bandas maternas e as 3 esperadas
bandas paternas. S2, filho adotivo, tem bandas que não correspondem nem à mãe nem ao
pai (embora possa haver algumas coincidências). Na prática, o RFLP não tem cores distintas
para as bandas materna e paterna, o que faz com que a distinção seja baseada
exclusivamente na posição da banda no gel (migração).
Fonte: http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/

Como as bandas que aparecem na digestão do DNA de um indivíduo são


numerosas, é relativamente comum que dois indivíduos quaisquer, quando
comparados, mostrem ao menos uma banda diferente entre si. Mas a
variedade de padrões de banda não é infinita e numa composição de bandas,
no caso de paternidade, como a descrita acima (Fig. 5), pode haver
coincidência entre as bandas do suposto pai e do filho, sem que este seja,
de fato, gerado por aquele. É preciso lançar mão de testes estatísticos, que
avaliam a probabilidade de que cada banda observada esteja presente uma
vez num ensaio qualquer. As frequências destas bandas correspondem às
frequências alélicas que aprendemos, quando estudamos genes. Há tabelas
sobre a frequência de cada banda e uma estatística rebuscada para analisar
os resultados, e recomendamos aos interessados que procurem o livro-texto
de Strachan e Reed e consultem o site mencionado na legenda da figura.

Na prática, o RFLP não tem cores distintas para as bandas materna e


paterna, o que faz com que a distinção seja baseada exclusivamente na
posição da banda no gel (migração). Um RFLP precisa, assim como outras
técnicas onde muitas bandas são geradas numa eletroforese, de uma
regularidade grande da corrida eletroforética, e dá para ver que isso nem
sempre é alcançado (Figura ao lado)

Figura 6: - RFLP real. Veja a distorção das


faixas (lanes) de eletroforese, tornando
difícil identificar com precisão a posição
relativa de uma banda e outra entre colunas
não adjacentes.

O mesmo princípio descrito acima pode ser aplicado para os testes de


individualidade empregados nos casos de criminalística e genética forense
(em geral a identificação de paternidade é também um tema da genética
forense).

Uma variante mais moderna deste ensaio, e que não usa a etapa de Southern
blot e sim a amplificação inicial de um trecho do genoma (com as repetições
a serem estudadas), tem sido oferecida como kit e empregada em
laboratórios. Neste caso, um trecho do genoma é amplificado por PCR. O
produto do PCR é aplicado ao gel. O resultado está ilustrado na figura
abaixo, para a identificação de um suspeito de um crime.
Figura 7: Resultado de uma
investigação de um crime (estupro).
O DNA da vítima, dos suspeitos, do
namorado e do material colhido na
vagina (evidência ou corpo de delito)
foi obtido. Um DNA controle também
é empregado no ensaio. As bandas
obtidas do suspeito 1 coincidem com
as obtidas do esperma do corpo de
delito. As bandas obtidas do DNA
das células da mulher, obtidas em
mistura com o esperma, coincidem
com as bandas da vítima (de fato, o
DNA é da vítima).

Pela inspeção simples da imagem acima fica evidente que o padrão de bandas
com esta variante da técnica (que está mais detalhadamente descrita na
página da aula 7 para Genética Molecular - C. Biológicas) é bem mais simples
do que o do RAPD. Geralmente só são discernidas duas bandas,
correspondentes aos dois alelos com repetições nos cromossomos homólogos
do indivíduo.

2. Outras técnicas moleculares

Ainda vamos pensar o que virá aqui, o que foi comentado em aula foi o PCR
em tempo real, mas este já está revisto nas aulas de Genética Molecular de
C. Biológicas.

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