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Derivados 4-Aminoquinolnicos como potenciais agentes anti-Leishmania

Leishmanioses um complexo de doenas causadas pelo protozorio Leishmania e


classificado como uma das doenas tropicais negligenciadas (DTNs) mais
importantes. Conforme dados do WHO, 12 milhes de pessoas esto infectadas em
todo o mundo e estima-se que 2 milhes de novos casos. Alm disso, mais de 310
milhes de pessoas vivem em reas endmicas em 98 pases ou territrios, e h 20
000- 30 000 mortes por ano, e de 2,4 milhes de incapacitados. Alm disso, de acordo
com a carga de doena estima-se que a leishmaniose a segunda causa de mortes
relacionadas com parasitas aps malaria (1).
Leishmaniose causada por cerca de 20 espcies diferentes de Leishmania, e as
manifestaes clnicas dependem das espcies de Leishmania associados (2). A
leishmaniose pode assumir trs formas clnicas, que vo desde a leishmaniose
cutnea no-letal, para a progressiva mucocutnea e a leishmaniose visceral
potencialmente letal, se no tratada (3).
Os

medicamentos

utilizados

na

terapia,

como

antimnio

pentavalente

(estibogluconato de sdio e antimoniato de meglumina) e outros, tais como


pentamidina e anfotericina B tm algumas caractersticas em comum: (i) so txicos
e sua longa administrao faz com que vrios efeitos secundrios indesejveis; (ii)
eles so caros; (iii) alm disso, eles mostram baixa eficcia em reas endmicas
devido resistncia observada de vrias espcies de parasitas (3,4).
Miltefosina, uma nova droga utilizada como um agente antineoplsico, o nico
agente oral em uso para leishmaniose visceral na India e do Leste Africano, mas esta
droga teratognica e contraindicada durante a gravidez (4). Assim, a descoberta de
novos frmacos que so menos txicos e mais eficazes contra a leishmaniose de
extrema urgncia.
Quinolinas pertencem a uma importante classe de compostos que apresentam
diversas propriedades biolgicas notveis, incluindo atividade antiprotozoria (5).
Com efeito, quinolinas substitudas tm sido eficazes contra vrias espcies de
Leishmania, tanto in vitro e em modelos in vivo (6-8). Alm disso, sitamaquina, a 8aminoquinolina, est em desenvolvimento a GlaxoSmithKline (Reino Unido) para o
tratamento oral da leishmaniose visceral na ndia e na frica (9-11).

Para obter molculas originais que exibem atividades anti-Leishmania, nosso grupo de
pesquisa

relatou

anteriormente

resultados

promissores

com

derivados

da

aminoquinolina (12-16). Agora, como uma continuao de nossos esforos para obter
novas drogas contra as leishmanioses, decidimos continuar a explorar as propriedades
biolgicas dos derivados de 4-aminoquinolina (AMQ) conjugando-a aos resduos de
sulfonamida, hidrazida e hidrazina. Alguns sulfonamidas e hbridos isoniazida
mostraram interessantes propriedades biolgicas, incluindo a atividade leishmanicida
(17). Assim, esta nova classe de compostos pode representar uma associao
subunidade atraente. Uma srie de AMQ (Figura 1), com base na estrutura de
amodiaquina, uma 4-aminoquinolina ativa contra Leishmania sp. a uma concentrao de
M (16), foi previamente sintetizada mostrando uma importante atividade antioxidante
(18). Neste trabalho, estes AMQ foram ensaiadas contra promastigotas e amastigotas de
L. amazonensis. Como composto AMQ-j foi encontrado muito ativo contra ambas as
formas de L. amazonensis, temos vindo a desenvolver uma srie de ensaios biolgicos,
a fim de esclarecer o mecanismo de ao levando morte celular deste protozorio.
Materiais e mtodos
Produtos quimicos
Miltefosina foi fornecido por Cayman Chemical Company (Michigan, EUA).
Amodiaquina foi comprada pela Ellipse Pharmaceuticals (Pessac, Frana).
Geneticina (G418), iodeto de propdio (PI), rodamina 123 (123 Rh), LPS
(lipopolissacardeo
a partir de Escherichia coli O26: B6), soluo de sal equilibrada de Hanks (HBSS),
hemina, cido flico, MTT, e JC-1 foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, EUA). 20,70-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) foi obtido a
partir de Invitrogen Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Soro fetal bovino e meio
RPMI 1640 foram adquiridos a CULTILAB (Campinas, So Paulo, Brasil); infuso
crebro-corao (BHI) foi comprado de-Lo? EDIA (Mumbai, ndia).
Parasitas
Promastigotas

de

L.

amazonensis

(IFLA/BR/67/PH8)

L.

amazonensis

(WHOM/BR/75/Josefa) transfectadas com o gene da protena verde fluorescente

(GFP) foram cultivadas em meio de Warren (infuso crebro-corao-BHI -plus


hemina e o cido flico), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 10%
e de urina humana a 25C. Promastigotas de L. amazonensis (WHOM/BR/75/Josefa)
foram periodicamente selecionados para fluorescncia verde por cultura em 1 mg/mL
do antibitico geneticina durante 72 h (19). Os parasitas foram rotineiramente
isolados a partir de leses cutneas de camundongos BALB/C infectados e mantidos
como formas promastigotas a 25C em meio de Warren suplementado com FBS a
10%.
Ensaios leishmanicidas
Ensaio Antipromastigota
Ensaio antipromastigota foi realizado usando o ensaio colorimtrico com 3- (4,5dimetiltiazol-2-il) -2,5- de difenil-tetrazlio (MTT) que baseado na reduo sal de
tetrazlio por desidrogenases mitocondriais (20). Resumidamente, promastigotas de L.
amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) a partir de uma cultura em fase logartmica foram
suspensos para produzir 2x106 clulas/mL aps a contagem cmara de Neubauer. Os
parasitas foram expostos a uma concentrao crescente dos compostos (0,5-30,0 g /
mL) durante 72 horas a 25C. Controles contendo DMSO a 0,1% (o que no txico
para os parasitas) e o meio sozinho tambm foram includos. A viabilidade dos
promastigotas foi mensurada a 570 nm (Multiskan MS leitor de microplacas,
LabSystems Oy, Helsink, Finlndia). Os resultados so expressos como a concentrao
que inibe o crescimento do parasita em 50% (IC50), aps um perodo de incubao de
72 h. Os valores de IC50 foram obtidos a partir de trs experimentos independentes
realizadas em duplicata. Miltefosina (0,5-30,0 g / mL) e amodiaquina 0.5-30,0 g /
mL) foram utilizadas como o medicamento de referncia.
Ensaio Antiamastigota
Leishmania amazonensis-GFP foi usado para verificar o efeito dos compostos sobre a
forma amastigota intracelular. Os macrfagos foram obtidos a partir da cavidade
peritoneal de camundongos BALB/C previamente inoculados com 3% de tioglicolato
(Sigma Chemical Co). Macrfagos aderentes foram infectados com promastigotas de L.

amazonensis-GFP numa proporo de clulas de parasitas, de 20:1 durante 4 h a 33 C.


Aps 72 h de incubao com diferentes concentraes dos compostos (1,5-30,0 g /
mL) dissolvido em DMSO (concentrao final <0,1% v/v), os macrfagos foram lisados
com gua destilada e transferido para microplacas negras. Macrfagos no infectados
foram

utilizados

como

um

branco.

intensidade

de

fluorescncia

das culturas foi mensurada utilizando um fluormetro de leitor de placas (FLx800,


BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) ajustado a 485 nm de excitao/emisso
de 528 nm (21). Os resultados foram expressos como percentagem de inibio em
relao aos controles da infeco de macrfagos com L. amazonensis. Trs
experimentos independentes foram realizados em duplicata. A concentrao de
composto que inibe 50% do crescimento do parasita (IC50) foi calculada utilizando o
modelo

de

regresso

de

Probit.

Miltefosina

(0,5-30,0

g/ml)

amodiaquina (0,5-30,0 g / mL) foram utilizadas como o medicamento de referncia.


Todos os protocolos foram aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa Animal da
Universidade Federal de Juiz de Fora (# 016/2012-CEEA).
Citotoxicidade em macrfagos
Macrfagos peritoneais de camundongos foram obtidos e cultivados como descrito
antes. Resumidamente, os macrfagos foram usados para o ensaio de citotoxicidade em
uma concentrao de 2 x de 106 clulas / ml em placas de cultura de 96 poos com meio
RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inativado, a 33 C e 5% de atmosfera de
CO2. Aps 24 h, os macrfagos aderentes foram incubados com os compostos em uma
diluio em srie (1.5- 30,0 g /mL) durante 72 h a 33 C e 5% de atmosfera de CO2.
Macrfagos no tratados foram utilizados como controle negativo. A viabilidade dos
macrfagos foi determinada atravs do Ensaio de MTT, tal como descrito acima. Todos
os protocolos foram aprovados pelo Comit de tica em Pesquisa Animal da
Universidade Federal de Juiz de Fora (# 015/2012-CEEA).
Ensaios biolgicos utilizando formas promastigotas de L. amazonensis tratadas
com AMQ-j
Determinao do potencial de membrana mitocondrial (Dm)

Promastigotas de Leishmania amazonensis (10 x 106 clulas / ml) foram cultivadas na


ausncia e na presena de 12,0 e 24,0 g / mL AMQ-j a 25 C. Os procedimentos
foram realizados de acordo com Ribeiro et al. (22), com algumas modificaes. Aps 24
horas, os parasitas foram incubadas com 0,5 g/ ml corante fluorescente Rh 123 durante
15 min no escuro a 37 C. Aquisio e anlise dos dados foram realizados utilizando
um citmetro fluxo FACsCanto II (Becton Dickinson, Rutherford, NJ, EUA) equipado
com o software DIVA (Joseph Trotter, Instituto de Pesquisa Scripps, La Jolla, CA,
EUA). Um total de 10 000 eventos foram adquiridos utilizando o canal de FITC. Os
resultados foram obtidos a partir de pelo menos dois experimentos independentes
realizados em triplicata. O ndice de variao (IV) foi utilizado para quantificar as
alteraes na fluorescncia Rh 123 obtidos pela equao: IV = (Pf - MC) / MC, onde
Mp a mediana da fluorescncia para promastigotas tratados, e mc a mediana da
fluorescncia para promastigotas no tratados. Os valores negativos correspondem IV
para a despolarizao da membrana mitocondrial (22). Miltefosina foi utilizado como
um controle positivo (9 g / mL).
Alm disso, o ensaio foi tambm realizado utilizando JC-1 fluorocromo, que um
corante catinico lipoflico mitocondrial vital que se concentra na mitocndria em
resposta a m (23). Promastigotas de L. amazonensis (10 x 106cells / ml) foram
cultivadas durante 24 h na ausncia e na presena de 12,0 e 24,0 g / mL AMQ-j a 25
C. As clulas foram coletadas, novamente suspensas em soluo salina equilibrada
Hank0s (HBSS), e o nmero de clulas foi contado na cmara de Neubauer.
Promastigotas (5x 106 clulas / ml) foram incubadas com JC-1 (10 g / mL) durante 20
min no escuro a 37 C. Depois de lavar duas vezes com HBSS, a fluorescncia foi
medida espectrofluorometricamente (FLx800, BioTek Instruments, Inc.) a 528 e 600
ambos nm, utilizando um comprimento de onda de excitao de 485 nm. O valor
relativo m foi quantificado utilizando a razo entre a leitura a 600 nm e leitura a 528
nm. Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos dois experimentos
independentes realizados em triplicata. Miltefosina em 9 g/ml foi utilizado como
controle positivo.
A medio dos nveis de ROS
Promastigotas de L. amazonensis foram cultivadas durante 24 h na ausncia e na
presena de 24,0 e 30,0 g/mL AMQ-J. Promastigotas foram ento coletadas e

ressuspensas em soluo salina tamponada com fosfato, (PBS) e a concentrao de


parasita foi ajustada para 4 x 107 promastigotas em 200 L de PBS. Em seguida, 20 M
de H2DCFDA foi adicionado, e as amostras foram incubadas durante 30 min no escuro
a 37 C (23). A fluorescncia foi monitorizada espectrofluorometricamente (FLx800,
BioTek Instruments, Inc.) utilizando comprimentos de onda de excitao e emisso de
485 e 528 nm, respectivamente. Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos dois
experimentos independentes realizados em triplicata. Miltefosina em 9 g / ml foi
utilizado como um controle positivo.

A determinao da integridade da membrana celular


Promastigotas de L. amazonensis (10 x 106 clulas / ml) foram tratadas ou no com
12,0, 24,0, e 30,0 g / mL AMQ-j durante 24 h a 25 C, coletadas, lavadas com PBS,
ressuspensas em PBS e incubadas com 1 g/mL de PI durante 15 min no escuro
temperatura ambiente. Os procedimentos foram realizados de acordo com Volpato et al.
(24),

com

algumas

modificaes.

fluorescncia

foi

monitorizada

espectrofluorometricamente (FLx800, BioTek Instruments, Inc.) utilizando um


comprimento de onda de excitao de 540 nm e um comprimento de onda de emisso
de 600 nm. Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos dois experimentos
independentes realizados em triplicata. Como controle positivo, as clulas aquecidas a
65 C durante 10 min foram utilizadas para se obter um valor mximo da intensidade
de fluorescncia.
Ensaios biolgicos utilizando macrfagos infectados L. amazonensis-tratados com
AMQ-J
Foram usadas macrfagos infectados com Leishmania amazonensis, e os macrfagos
peritoneais foram obtidos como descrito anteriormente. Os macrfagos foram
adicionados a 2 x 106 clulas/mL a laminulas (13 mm de dimetro), previamente
dispostos numa placa de 24 poos em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS
inativado e deixados aderir a 33 C em 5% de CO2. Macrfagos aderentes foram
infectados com promastigotas de L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) na fase
estacionria

de

crescimento

usando

uma

proporo

de

1:10

em

33 C; 5% de CO2 durante 4 h. Promastigotas no-internalizados foram eliminados e as


clulas foram tratadas com AMQ-j a 7,0, 13,5, e 27,0 g / ml e mantida a 33 C em 5%
De CO2 durante 24 h. As clulas foram lavadas, fixadas com etanol absoluto, e coradas
com Giemsa. As clulas foram em seguida desidratadas em acetona, seguido por um
gradiente de acetona-xilol (9: 1; 1: 1; 1: 9) e, finalmente, o xilol. As lminas foram
montadas com blsamo do Canad para a contagem de parasitas (microscopia ptica,
10009 ampliao). A carga parasitria foi avaliada por contagem dos parasitas
intracelulares, os macrfagos infectados e no infectados (com 200 clulas mnimos em
culturas tratadas e no tratadas. Os resultados foram obtidos a partir de pelo menos dois
experimentos independentes realizados em duplicata.
Determinao do potencial de membrana mitocondrial (Dm)
O ensaio foi realizado em macrfagos no infectados e em infectados, tal como descrito
acima, mas os macrfagos foram plaqueadas em placas de 96 poos de cultura de
tecidos pretas. Depois 24 h de tratamento de AMQ-j a 7,0, 13,5, e 27 lg / ml, o meio foi
rejeitado, os macrfagos foram lavados em PBS e, em seguida as clulas foram
incubadas com 10 g / ml de JC-1 durante 30 min no escuro a 37 C em 5% de CO2.
Depois de ter sido lavado trs vezes com HBSS, a fluorescncia foi medida
spectrofluorometrically (FLx800, BioTek Instruments, Inc.) a ambos os 528 e 600 nm,
utilizando um comprimento de onda de excitao de 485 nm. O valor relativo Dwm foi
quantificado utilizando a razo entre a leitura a 600 nm e leitura a 528 nm. Os
resultados foram obtidos a partir de pelo menos duas experincias independentes
realizadas

em

triplicado.

Miltefosina

foi

utilizado

como

positiva

controlo (25 lg / mL).


A medio dos nveis de ROS
Intracelular nveis de ROS em L. amazonensis macrfagos infectados com que foram
tratados previamente com AMQ-j em 7,0, 13,5, e 27,0 lg / mL foram medidos usando o
H2DCFDA corante. Aps 24 horas de infeco, o meio foi rejeitado, os macrfagos
foram lavados em PBS e, em seguida as clulas foram incubadas com H2DCFDA (20
lm), durante 60 min no escuro a 37 C em 5% de CO2. A fluorescncia foi medida
utilizando um spectrofluorometrically comprimento de onda de excitao de 485 nm e

um comprimento de onda de emisso de 528 nm (25). Os resultados foram obtidos a


partir de pelo menos duas experincias independentes realizadas em triplicado.
Miltefosina (25 lg / mL) foi utilizada como um controlo positivo.
O xido ntrico (NO)
Produo de xido ntrico foi determinada nos sobrenadantes da cultura de macrfagos
infectados com L. amazonensis depois incubadas durante 24 h na presena de AMQ-j
composto.
O ensaio foi realizado como descrito por Green et al. (26). Resumidamente, 50l de
reagente de Griess LL de: 1% de sulfanilamida em 2,5% de H3PO4 e 0,1% de N-1naphthylethylenediamine dicloreto em 2,5% de H3PO4 (v / v) foi adicionado a 50 lL
dos sobrenadantes de cultura de clulas de uma microplaca de 96 poos. Referncia em
branco foi realizada, e teor em nitrito foi quantificada por extrapolao a partir de uma
curva padro de nitrito de sdio em cada experincia. Todos os ensaios foram realizados
em duplicado. Os nveis de absorvncia foram quantificadas a 540 nm usando um leitor
de microplacas (leitor de microplacas Multiskan MS, LabSystems Oy, Helsink,
Finlndia). Os resultados foram calculados como percentagens em relao ao controlo
LPS-positivo (30 lg / mL).
Anlise estatstica
A concentrao inibitria de 50%, isto , a concentrao mnima de composto que
causou uma reduo de 50% na sobrevivncia ou a viabilidade da Leishmania (IC50) e
murino macrfagos (CC50) foi realizado, e os intervalos de confiana de 95% foram
includos, calculada pela Litchtfiet e Wilcoxon, utilizando o mtodo de Probit
considerando o significar a partir de trs experimentos independentes. Os dados foram
analisados estatisticamente pela anlise de varincia seguida do ps-teste de Dunnett
utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As diferenas
foram consideradas significativas quando p <0,0001 (***), p <0,001 (**), e p <0,01 (*).

Resultados
A atividade dos derivados 4-aminoquinolinicos (AMQ) contra promastigotas e
amastigotas de L. amazonensis
Neste trabalho, foi avaliada a citotoxicidade em clulas de mamferos e atividade in
vitro contra ambas as formas promastigotas de insetos e as intramacrofgicas de
amastigotas de L. amazonensis de dez 4-aminoquinolina (AMQ) derivados e seus
precursores (Tabela 1). Para a atividade antipromastigota, entre dez compostos AMQ
avaliada, trs compostos (AMQ-b, f, e j) apresentou uma forte atividade
antipromastigota (IC50 de 10,9, 0,5, e 5,9 g /ml, respectivamente), sendo mais eficaz
do que a amodiaquina e miltefosina nesta fase extracelular do parasita. Dos cinco
compostos contendo o ncleo de quinolina e seus derivados de sulfonamida, composto
AMQ-b exibida uma atividade significativa (valores de IC50 de 10,9 g / mL). A
presena destes dois grupos heterocclicos dentro da mesma estrutura (quinolina e
piridina) pode ser responsvel pela atividade do presente composto, quando comparado
com os outros da srie (AMQ-A-E). A associao entre o composto aminoquinolina e os
anlogos hidrazida tambm provou ser vantajosa. Este destacada no caso AMQ-f,
que cerca de 28 vezes mais ativo contra promastigotas de L. amazonensis, quando
comparado com miltefosina utilizado como contrelo positivo. Mais uma vez, a presena
de ambos os heterociclos encontrado pode ser interessante, porque mesmo nesta srie,
eles tambm exibem atividade (tal como o composto AMQ-F). vlido salientar que,
aparentemente, deslocando o anel de piridina na posio 4, como composto AMQ-i
tambm heterociclos contm, no provou ser ativa por causa do padro de substituio
no anel de piridina de 1,3 (ou 3-posio ). Na srie de hidrazina, a frao quinolina
combinada com um anel de benzeno tambm foi favorvel. O caso do composto AMQ-j
o qual apresenta um IC50 de 5,9 g / mL contra promastigotas de L. amazonensis
notvel.
Para avaliar os efeitos citotxicos do AMQ, macrfagos hospedeiros foram tratados com
estes compostos e avaliados pelo mtodo de MTT. Entre os compostos avaliados AMQ
(a-j), nenhum deles mostrou citotoxicidade para macrfagos peritoneais nas
concentraes mais elevadas ensaiadas (30,0 g / mL). Em contraste, amodiaquina foi
mais citotxica para os macrfagos (IC50 de 20,9 g / mL). Este resultado favorvel

no que respeita associao (ou sua combinao) de estes grupos farmacofricos em


uma nica estrutura.
Realizaram-se ensaios em amastigota com estes compostos conjugados para determinar
mais precisamente o seu potencial como agentes leishmanicidas seletivos. Como pode
ser visto na Tabela 1, a maioria dos compostos testados eram ativos contra formas
amastigotas de L. amazonensis, com melhores resultadoas nas sries de hidrazida e de
hidrazina (AMQ-f-j). Em geral, eles exibiram uma atividade mais elevada contra
amastigotas quando comparado com promastigotas. Isto deve provar uma vantagem,
porque amastigotas representam a forma do parasita que est presente no hospedeiro
mamfero, sendo responsvel pela manuteno da infeco do hospedeiro. Por exemplo,
compostos AMQ-g, AMQ-h, e AMQ-i no mostraram qualquer atividade
antipromastigota significativa (IC50> 30,0 g / mL). No entanto, eles exibiram uma
elevada atividade contra amastigotas com valores de IC50 de 1,2, 16,5, e 0,8 g / ml,
respectivamente.
A relao entre a toxicidade e atividade contra amastigota intracelular de mamferos
foram comparados utilizando o ndice de seletividade (IS) (CC50 para macrfagos /
IC50 para parasita). Quando este valor maior do que 1, o composto mais seletivo
para a atividade contra o parasita do que os macrfagos; caso contrrio, o composto
mais txico em macrfagos (27). Uma seletividade notvel foi observada no caso de
compostos AMQ-g, AMQ-i, e AMQ-j. Eles eram muito mais ativos contra
amastigotas intracelulares do que contra as clulas hospedeiras (SI> 12,0).
A capacidade do composto AMQ-j para inibir o crescimento tanto de formas
promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis por meio de alto ndice
de seletividade devem estimular novos estudos, a fim de caracterizar seus alvos nos
protozorios.
AMQ-j induz estresse oxidativo em L. amazonensis
Foram avaliados os efeitos da produo total de ROS em promastigotas e macrfagos
infectados com L. amazonensis tratados com AMQ-j, utilizando uma sonda
fluorescente, H2DCFDA. Em promastigotas, os nossos resultados mostraram que, aps
24 h de incubao com 24,0 e 30,0 g /ml deste composto, a produo de ROS foi
aumentada em 48,9% e 66,9%, respectivamente, quando comparados com o grupo

controle (Figura 2). Miltefosina (9,0 g / ml), utilizado como frmaco de controle,
induziu um aumento de 40% nos nveis de ROS.
Quando macrfagos infectados com L. amazonensis foram tratados com AMQ-j, a
produo de ROS foi aumentada de uma forma dose dependente quando comparado
com macrfagos infectados com L. amazonensis no-tratados (Figura 3). Aps 24 h de
tratamento com 7,0, 13,5, e 27,0 g / ml do composto, pode-se observar um aumento na
produo de ROS (25,3%, 33,0%, e 46,3%, respectivamente) em comparao com o
controlo (Macrfagos infectados com L. amazonensis). Macrfagos infectados com L.
amazonensis tratados com AMQ-j nas mesmas concentraes utilizadas para os ensaios
de ROS, isto , a 7,0, 13,5, e 27,0 g / mL tambm inibiram a multiplicao de parasitas
intracelulares em todas as concentraes testadas (51,7%, 55,3%, e 91,2%,
respectivamente). Alm disso, uma correlao linear (R2 = 0,9666) entre a percentagem
de inibio da carga global dos parasitas intracelulares e a produo de ROS, aps
tratamento foi tambm observada.

AMQ-j induz a despolarizao do potencial de membrana mitocondrial (Dm) em


L. amazonensis
Os histogramas mostram que um tratamento de 24 h de promastigotas de L.
amazonensis com 12,0 e 24,0 g / mL AMQ-j conduziu a uma reduo de fluorescncia
de Rh123 de 83,9% e 97,9%, respectivamente. Miltefosina (9,0 g / mL) foi utilizado
para comparao e diminuiu em 35,2% Dm (Figura 4A). Os resultados de IV
confirmou a despolarizao da membrana mitocondrial, porque os promastigotas
tratados com o composto em 12,0 e 24,0 g/ml apresentaram valores de IV 0,83 e 0,97,
respectivamente (Figura 4B).
Usando a sonda fluorescente de JC-1, os resultados tambm confirmaram que AMQ-j
modifica a funo de mitocndrias de promastigotas de L. amazonenis (Figura 5). O
tratamento com o composto em 12,0 e 24,0 g / mL durante 24 h diminuiu a relao
entre intensidade de fluorescncia vermelho/verde (70,7% e 73,7% de inibio,
respectivamente), quando comparados com o controle de parasitas no tratados. Alm
disso, a fluorescncia diminuiu de 53,8% para as clulas de controle tratadas com
miltefosina (9,0 g/mL).

Para avaliar os efeitos da AMQ-j sobre a funo mitocondrial de macrofagos infectados


com L. amazonensis, medimos o potencial de membrana mitocondrial utilizando a
sonda fluorescente de JC-1. Os resultados foram expressos como a relao da
intensidade de fluorescncia obtida a 600 e 528 nm. A diminuio da relao da
intensidade de fluorescncia vermelha/verde indica um colapso no potencial de
membrana mitocondrial. A Figura 6A mostra uma reduo significativa no potencial da
membrana mitocondrial de macrfagos infectados correspondentes para 43,6%, 36,7%,
e 53,0% aps o tratamento com 7,0, 13,0, e 27 g / mL AMQ-j, respectivamente. Uma
correlao linear (R2 = 0,8486) foi observada entre a percentagem inibio da carga
global dos parasitas intracelulares, bem como uma diminuio no potencial
mitocondrial (Figura 6B). As clulas tratadas com 25,0 g / ml de miltefosina mostrou
uma diminuio de 58,0% no potencial de membrana. Por outro lado, a anlise realizada
com macrfagos no infectados tratados com AMQ-J no tm uma reduo
estatisticamente significativa da Dwm quando comparado com o controlo no tratado
(Figura S1).

AMQ-j no altera a integridade da membrana plasmtica em promastigotas de L.


amazonensis
Para avaliar se o mecanismo de morte celular desencadeada pelo AMQ-j envolve a
ruptura da integridade da membrana plasmtica, promastigotas foram tratados com o
composto e coradas com PI, que uma estirpe de cido nucleico especfica que se
difunde atravs da membrana plasmtica comprometida. O composto AMQ-j em 12,0;
24,0 e 31,0 g / ml no induziu um aumento significativo em promastigotas
manchado-PI quando comparado com o controle negativo, indicando assim um no
permeabilizao da membrana plasmtica (Figura S2). O controle positivo (clulas
aquecida a 65 C durante 10 min) mostraram um aumento de 80,3% da percentagem
de promastigotas manchado-PI.
AMQ-j no induz a produo de NO em macrfagos infectados com L. amazonensis
Em relao produo de produtos reativos de nitrognio, tais como NO, os nossos
resultados mostraram que AMQ-J no induziu um aumento significativo na produo

de xido ntrico em qualquer das concentraes usadas quando comparados com


macrfagos infectados com L. amazonensis no tratadas (dados no mostrados).

Discusso
Neste trabalho, ns informamos a atividade leishmanicida de derivados da 4aminoquinolina (AMQ) contra promastigotas e amastigotas de L. amazonensis. Os
resultados demonstraram que alguns compostos exibiram um forte efeito leishmanicida
contra L. amazonensis, sendo mais seletivo contra o parasita do que para o macrfago
hospedeiro. Leishmania amazonensis tem sido associado com vrias caractersticas
clnicas da leishmaniose humana, incluindo cutnea e leishmaniose cutnea difusa no
Brasil e tambm pode induzir a resultados clnicos fatais, incluindo a forma visceral da
doena (28,29).
Muitos compostos antimalricos so baseados no uso de ncleo de quinolina tal como
4-aminoquinolinas, lcoois arilo-aminoquinolina e 8-aminoquinolinas (30). Isto tambm
foi o caso de medicamentos leishmanicidas, tais como sitamaquina e tafenoquine
(31,32). Alm disso, outros alvos de mecanismo de ao destas drogas em Leishmania,
est relacionada com desordens mitocondriais e suas consequncias (31-34). Nos
estudos descritos aqui, ns tambm confirmamos que o efeito leishmanicida da AMQ
est relacionado disfuno mitocondrial. O composto AMQ-j induz a despolarizao
do potencial de membrana mitocondrial em promastigotas e de macrfagos com L.
amazonensis. Como os amastigotas esto dentro da clula hospedeira, seria de interesse
determinar se a despolarizao mitocondrial observadas em clulas infectadas a partir
de macrfagos ou de parasitas intracelulares. Curiosamente, os macrfagos no
infectados tratados com AMQ-j no induziu a despolarizao do potencial de
membrana mitocondrial, sugerindo que este composto foi seletivamente txico
unicamente para as mitocndrias em macrfagos infectados com L. amazonensis. Alm
disso, em macrfagos infectados, a despolarizao do potencial de membrana
mitocondrial era dependente da dose. A correlao foi tambm observada entre a
reduo da carga global de parasitas intracelulares e a diminuio do potencial
mitocondrial. Por conseguinte, podemos concluir que a AMQ-j pode atuar diretamente
dentro da mitocndria do parasita, causando disfuno mitocondrial do protozorio e,
posteriormente, a morte do parasita intracelular.

Alm disso, observou-se um aumento nos nveis de ROS em promastigotas e


macrfagos infectados com L. amazonensis tratados com AMQ-j. As mitocndrias so
as principais fontes de ROS em Leishmania e um aumento do ROS pode induzir
alteraes mitocondriais (33). Estes resultados so realmente interessantes, porque a
diferena morfolgica mais marcante entre a mitocndria de eucariotas superiores e
de tripanosomatdeos o nmero e volume relativo dessas organelas. Em contraste
com eucariotas, estes parasitas conter apenas uma organela, que se torna um nico
local potencial para interveno farmacolgica (33).
Neste trabalho, foi observada uma despolarizao do potencial mitocondrial associada
com a produo de ROS em L. amazonensis. No entanto, o tratamento AMQ-j de
promastigotas no envolve a ruptura da membrana de plasma. Alguns eventos, incluindo
os acima mencionados, associados externalizao da fosfatidilserina na membrana e a
fragmentao do DNA nuclear so indicados como apoptose em protozorio
Leishmania. Algumas drogas, incluindo o sitamaquina, 8-aminoquinolinas e
tafenoquine, tm seu efeito leishmanicida associada a um evento apoptose-like (31-34).
Mais estudos so necessrios para esclarecer se o modo de ao do composto AMQ-j
est relacionada com apoptose ou outro tipo de morte do parasito do gnero Leishmania.
Embora Leishmania infecte outras clulas, macrfagos so considerados como as
principais clulas hospedeiras para tal parasita. Estas clulas fagocticas tem um duplo
papel no controle da doena, porque em experimentos de leishmanioses os macrfagos
so significativos em ambas a sobrevivncia e a eliminao do parasita (34). Algumas
molculas microbicidas produzidas por macrfagos esto envolvidos na eliminao
completa de Leishmania. Em relao produo de produtos de nitrognio reativo, o
xido ntrico (NO) um dos mecanismos utilizados pelos macrfagos para matar as
amastigotas intracelulares (35). Contudo, nossos resultados mostraram que os
macrfagos infectados com L. amazonensis tratados com AMQ-j no induziu aumento
significativo na produo de xido ntrico em todas as concentraes utilizado quando
em comparao com macrfagos infectados com L. amazonensis no tratados. Isto
sugere que a atividade leishmanicida contra o parasita intracelular observada neste
trabalho pode estar mais fortemente relacionadas com outros mecanismos, tais como a
produo de ROS, que para a produo de NO por macrfagos infectados.
Concluso

Em concluso, temos demonstrado que AMQ-j exibe uma promissora atividade


leishmanicida. Alm disso, composto AMQ-j foi capaz de induzir distrbios no
parasita que so mediados principalmente pela disfuno mitocondrial associada
com a produo de ROS. Alm disso, estudos in vitro e in vivo so necessrios para
aumentar o nosso conhecimento sobre o modo de ao deste composto.