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ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO E DE NITROGNIO, ANTIOXIDANTES E MARCADORES DE DANO

OXIDATIVO EM SANGUE HUMANO: PRINCIPAIS MTODOS ANALTICOS PARA SUA DETERMINAO


Sandra Mary Lima Vasconcelos
Faculdade de Nutrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil
Marlia Oliveira Fonseca Goulart*
Instituto de Qumica e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil
Jos Benedito de Frana Moura
Hospital Universitrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-900 Macei - AL, Brasil
Vanusa Manfredini e Mara da Silveira Benfato
Departamento de Biofsica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonalves, 9500, 91501-970
Porto Alegre - RS, Brasil
Lauro Tatsuo Kubota
Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971
Campinas - SP, Brasil

Divulgao

Quim. Nova, Vol. 30, No. 5, 1323-1338, 2007

Recebido em 1/2/06; aceito em 9/1/07; publicado na web em 2/7/07

REACTIVE OXYGEN AND NITROGEN SPECIES, ANTIOXIDANTS AND MARKERS OF OXIDATIVE DAMAGE IN HUMAN
BLOOD: MAIN ANALYTICAL METHODS FOR THEIR DETERMINATION. We review here the chemistry of reactive oxygen
and nitrogen species, their biological sources and targets; particularly, biomolecules implicated in the redox balance of the human
blood, and appraise the analytical methods available for their detection and quantification. Those biomolecules are represented by
the enzymatic antioxidant defense machinery, whereas coadjutant reducing protection is provided by several low molecular weight
molecules. Biomolecules can be injured by RONS yielding a large repertoire of oxidized products, some of which can be taken as
biomarkers of oxidative damage. Their reliable determination is of utmost interest for their potentiality in diagnosis, prevention
and treatment of maladies.
Keywords: biomarkers of oxidative stress; oxidative and nitrosative stress; antioxidants.

INTRODUO
O balano redox em lquidos biolgicos, organelas, clulas ou
tecidos determinado pela presena de pares redox responsveis
pelo fluxo de eltrons. Esses sofrem freqentes interconverses
entre o estado reduzido e o oxidado. Alguns desses pares redox so
interligados (redox cycling), outros constituem sistemas redox
independentes. O balano redox, na clula, relaciona-se soma
dos produtos do potencial de reduo e da capacidade redutora de
uma srie de pares redox, acoplados, presentes. A capacidade redutora pode ser estimada pela determinao da concentrao de
espcies reduzidas em um par redox e, o potencial de reduo,
pelo emprego da Equao de Nernst1. Em termos matemticos, isto
pode ser representado por:

onde Ei o potencial de reduo da semi-clula para um dado par


redox e [espcie reduzida]i a concentrao das espcies reduzidas em um par redox.
Mudanas no balano redox de sistemas biolgicos podem causar o estresse oxidativo1. A intensidade e patogenicidade destes
desequilbrios vo depender, naturalmente, das concentraes locais de espcies pr e antioxidantes, das constantes de velocidade

*e-mail: mofg@qui.ufal.br

de reao com molculas-alvo e da compartimentalizao celular


destes processos, em que fatores de solubilidade e difusibilidade
so determinantes2.
ESTRESSE OXIDATIVO
A produo de espcies reativas de oxignio (ERO), de nitrognio (ERN), entre outras espcies reativas, parte integrante do metabolismo humano e observada em diversas condies fisiolgicas. ERO e ERN tm importante funo biolgica, como na fagocitose, fenmeno em que essas espcies so produzidas para eliminar o agente agressor. Por outro lado, quando sua produo exacerbada, o organismo dispe de um eficiente sistema antioxidante que
consegue controlar e restabelecer o equilbrio. O estresse oxidativo
resulta do desequilbrio entre o sistema pr e antioxidante1,3, com
predomnio dos oxidantes, com dano conseqente (Figura 1). A clula, unidade da vida, uma verdadeira usina de pr e antioxidantes
(Figura 2).
A Tabela 1 traz um resumo da natureza das principais espcies,
de sua gerao e destino.
AO DE ESPCIES REATIVAS SOBRE
MACROMOLCULAS
Em sistemas biolgicos, a membrana celular constitui um dos
focos de atuao de ERO, de ERN e de outras espcies reativas
(Figura 1, Tabela 1) e sua funo vital para a clula (Figura 2).
Alm da membrana que envolve a clula, as membranas das

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Vasconcelos et al.

Figura 1. Fontes e respostas celulares s Espcies Reativas (ER) de Oxignio


(ERO), de Nitrognio (ERN), derivados de Enxofre (ERS), de Cloro (ERCl), de
carbono (ERC) e metais de transio [M n+)]. Oxidantes so gerados do
metabolismo normal como na mitocndria, em peroxissomas e em uma
variedade de enzimas citoslicas. Existem diversas fontes exgenas de produo
de ER. Os sistemas de defesa antioxidante enzimtico e no enzimtico, quando
eficientes, mantm a homeostase fisiolgica e quando esto ineficientes,
permitem a instalao do estresse oxidativo, representado pelo dano celular
em macromolculas como o DNA, protenas e lipdios, que se expressam
clinicamente como envelhecimento ou doena. Adaptado da ref. 3

Quim. Nova

Figura 2. A clula como fonte de espcies reativas (ER). (A) Fontes celulares
de ERO, ERN e outras, por ao de vrias enzimas. A capacidade de uma via
especfica produzir ER varia com o tipo de clula e com o dano em curso; p.
ex., na fagocitose, as NADPH oxidases da membrana de neutrfilos e
macrfagos so particularmente ativadas e reduzem O2 a O2, a partir de um
burst respiratrio necessrio para eliminar o agente agressor. (B)
Distribuio dos antioxidantes, enzimas de desintoxicao e protenas de
ligao a metais de transio que compreendem o sistema de defesa dentro
das membranas e organelas celulares

Tabela 1. Natureza, gerao e destino de espcies radicalares (ou seus intermedirios) biologicamente importantes
Espcies derivadas do oxignio
nion-radical
superxido O2

Gerado continuamente por diversos processos celulares (cadeia de transporte de eltrons na mitocndria, no
microssomo, atravs enzimas como xantina oxidase e NADPH oxidase), ou pela reduo monoeletrnica de
O2. Rapidamente desaparece em soluo aquosa por reao de dismutao:
O2 + O2 + 2H+
H2O2 + O2 Em soluo aquosa um forte agente redutor. Sua habilidade em reduzir Fe3+
a Fe2+ pode acelerar a reao de Fenton:
O2 + Fe3+
Fe2+ + O2 Em soluo aquosa um oxidante fraco, porm pode formar ERN:

O2 + NO
ONOO permevel a membranas. Em fagcitos, como neutrfilos e macrfagos, um dos
microbicidas mais importantes.

Perxido de
hidrognio H2O2

Intermedirio formado pela reao de dismutao de O2 catalisada pela enzima SOD, pela reduo de 2 ena molcula de O2 e pela ao de diversas enzimas oxidases in vivo, localizadas nos peroxissomas. muito
difusvel dentro e entre as clulas in vivo. um fraco agente oxidante e um fraco agente redutor, reage
lentamente com tiis, com sais de ferro e cobre reduzidos, com protenas heme e peroxidases para iniciar
reaes radicalares e peroxidaes lipdicas. Em presena de metal de transio gera OH, atravs da reao
de Fenton
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + -OH + OH

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

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Tabela 1. continuao
Radical hidroxila OH

o mais reativo e mais lesivo radical conhecido e para o qual, uma vez formado, o organismo humano no
dispe de mecanismo de defesa, reage com uma srie de endobiticos, causa modificao no DNA (com
modificao das bases e quebras das fitas), danos nas protenas e inativao enzimtica, peroxidao lipdica.
mbito limitado de ao (poucos dimetros moleculares).

Radicais
peroxila (RO2)
alcoxila(RO)

Formados durante a decomposio de perxidos orgnicos e reaes de carbono radicalar com oxignio,
como na peroxidao lipdica.

Oxignio singlete 1O2*

Estado eletronicamente excitado do oxignio, produzido por reaes fotoqumicas ou por outras radiaes;
reage com um grande nmero de molculas biolgicas, incluindo lipdeos da membrana, iniciando processos
de peroxidao. 1O2* pode ser gerado, entre outras reaes, por transferncia de energia a partir de um
sensibilizador S, no estado excitado tripleto (3S*) (porfirinas, clorofila e riboflavina) para o oxignio. O
sensibilizador S absorve energia e deixa o estado fundamental singlete (S), passando para o estado excitado
singlete (1S*), a partir do qual convertido, por cruzamento intersistema, para o estado excitado triplete.
1
3
(3S*): S
S*
S* ; 3S* + 3O2*
S + 1O2*

Oznio O3

Produzido no ar atmosfrico poludo e por fonte de luz intensa de algumas fotocopiadoras e outros
equipamentos. extremamente danoso ao pulmo, oxidando rapidamente protenas, DNA e lipdeos.
Espcies derivadas do nitrognio e cloro

cido hipocloroso HOCl

Espcie no radicalar, membrana-permevel, oxida um grande nmero de compostos biolgicos, como tiis
e tioteres, aminas, fenis e ligaes insaturadas, mais seletivo que o radical hidroxila, oxida ferro e protenas.
Produzido por fagcitos ativados, reage com O2 para formar OH

HOCl + O2
OH + OH + O2 produzido no miocrdio, como resultado de invaso de clulas
inflamatrias.

xido ntrico ou monxido


de nitrognio NO

Sintetizado nos organismos vivos pela ao da enzima xido ntrico sintase (NOS), que converte o aminocido
L-arginina a NO + L-citrulina (outro aminocido). um radical abundante que age em uma variedade de
processos biolgicos, incluindo relaxao muscular, neurotransmisso e regulao imune. Originalmente
identificado como fator relaxante derivado do endotlio (endothelium-derived relaxing factor: EDRF)
um potente vasodilatador, envolvido na regulao da presso arterial. Difunde-se rapidamente entre e dentro
das clulas. Quando exposto ao ar, reage com oxignio para formar NO2.
2NO + O2
2 NO2. Reage rapidamente com O2 e produz o intermedirio ONOO
O2 + NO
ONOO

Dixido de nitrognio NO2

Formado a partir da exposio de NO ao ar ou da protonao de peroxinitrito 2NO + O2


Potente iniciador da peroxidao lipdica em fluidos biolgicos.

Cloreto de nitrila NO2Cl

Formado a partir de misturas de NO2 e HOCl. Oxidante, agente de clorao e de nitrao, pode inibir
fosforilao dependente de quinase de resduos de tirosina, provoca a clorao de resduos de tirosina (3clorotirosina considerada biomarcador).

Peroxinitrito ONOO

Intermedirio formado pela reao O2 + NO


ONOO
Instvel, tempo de vida curto, oxidante potente, propriedades semelhantes ao radical hidroxila, causa danos
a muitas molculas biolgicas, inclusive a grupos S-H das protenas, provoca hidroxilaao e nitrao de
compostos aromticos. Forma OH independente da presena de metal de transio

OH + NO2 Aps protonao, rearranja-se para nitrato (NO3-) e interage com bicarbonato
ONOO + H+
(CO2/HCO3-), com alterao de sua reatividade.
[NO2 OH]
NO3
ONOOH
Em presena de CO2, o peroxinitrito forma o peroxicarboxilato nitroso, que rapidamente se decompe,
segundo as etapas 1 e 2. O CO2 est presente em elevada concentrao no compartimento intra e extracelular,
o que favorece a formao do CO3, em presena de ONOO-.
ONOO + CO2
ONOOCO2
NO2OCO2

(1) NO2OCO2
NO3 + CO2 (65%)
(2) NO2OCO2
NO2 + CO3 (35%)
O nion radical carbonato formado mediador de diversas reaes de oxidao e nitrao

Cloraminas

Oxidantes mais suaves e de vida mais longa que HOCl, reagem com tiis, tioteres e centros metlicos de ferro.
Toxicidade varivel, dependendo da polaridade e da permeabilidade da membrana. Cloraminas de -aminocidos
sofrem degradao para aldedos potencialmente txicos

2 NO2

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Vasconcelos et al.

Quim. Nova

Tabela 1. continuao
Espcies derivadas do enxofre
Denominao genrica para um grupo de radicais com o eltron desemparelhado residindo no enxofre.
Formado quando um grupo tiol (RSH) reage com uma espcie radicalar (C, OH, RO, RO2, O2 , NO2 ou
com metais de transio).

Radical tila
RS

Miscelneos e metais
Catalisam reaes de radicais livres.
Fe2+ em presena de O2 gera O2 que, por sua vez, pode reduzir Fe3+ a Fe2+
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2
Fe2+ em presena de H2O2 gera OH (reao de Fenton)
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH
Fe3+ em presena de H2O2 gera O2

Fe, Cu, Mn, etc

organelas intracelulares, tais como mitocndria, retculo endoplasmtico, ncleo etc., apresentam uma estrutura bilipdica e uma
variedade de protenas e acares4,5 (Figura 2). O dano celular resulta basicamente de ataque de ERO e ERN sobre as macromolculas, tais como acares (CHOH)n, DNA, protenas e lipdios,
conforme mostrado na Tabela 2.
H fortes evidncias de que o estresse oxidativo tem importncia capital nos processos de envelhecimento, transformao e morte celular, com conseqncias diretas em muitos processos patolgicos, entre eles, a induo do cncer e a propagao de AIDS em
pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de
muitas doenas crnicas, entre elas, doenas auto-imunes, cardiopatias, cncer, doenas do pulmo, intoxicao por xenobiticos e
muitas outras (Tabela 3)6-10. Por outro lado, tambm fato reconhecido que ERO e ERN desempenham papis fisiolgicos importantes como o controle da presso sangnea, na sinalizao celular, na apoptose, na fagocitose de agentes patognicos, na fertilizao de ovos e no amadurecimento de frutos. Esse tpico ser reavaliado no final deste artigo.
O reconhecimento dessa relao estimulou o desenvolvimento

de estudos de marcadores de dano oxidativo e de substncias


antioxidantes em sistemas biolgicos.
BIOMARCADORES
Segundo Zwart e colaboradores8 e LaBaer11, os biomarcadores
tm caractersticas passveis de avaliao e mensurao, como
indicadoras de processos biolgicos normais, processos patognicos
ou de resposta farmacolgica a uma interveno teraputica. Como
tal, refletiriam mudanas em sistemas biolgicos relacionadas
exposio ou aos efeitos de xenobiticos, ou outros tipos de fatores (aqui incluiramos aqueles relacionados a doenas). Eles podem ser classificados, segundo os mesmos autores 8,11 , como
biomarcadores: de exposio, de efeito e de susceptibilidade. O
biomarcador ideal deve reunir as seguintes caractersticas: mostrar
alta especificidade para o efeito de interesse; refletir o efeito desde
o incio; ser passvel de determinao e anlise fceis e de baixo
custo; ser analisado por tcnica no invasiva, de alta sensibilidade,
no fluido biolgico escolhido. Deve existir uma relao bem estabelecida entre a concentrao do biomarcador e a exposio ao agen-

Tabela 2. Atuao das principais espcies radicalares (ou seus intermedirios) sobre endobiticos
Endobitico

Sumrio das reaes mais importantes

Acares
(CHOH)n

cidos nucleicos

ERO, principalmente OH, ataca o acar desoxirribose (principalmente em 4 e/ou 5) e as bases purnicas
(adenina e guanina) e pirimidnicas (timina, citosina e uracila), com ataque preferencial guanina, gerando 8hidroxi- ou 8-oxoguanina5, mutagnicas. Como resultado, ocorre a quebra da cadeia do DNA, a ligao cruzada
entre as fitas e modificaes nas suas bases levando a mutaes e apoptose.

Protenas

As protenas tm muitos stios reativos5. Durante o estresse oxidativo, o primeiro evento a formao de um
radical centrado no carbono, por extrao de H do carbono , em uma ligao peptdica, da, ocorre fragmentao
das cadeias e oxidao de quase todos os tipos de aminocidos, com produo freqente de compostos carbonilados,
particularmente a partir de prolina, arginina e lisina (Figura 8). Essa modificao (contedo em protenas
carboniladas) facilmente mensurvel. Adicionalmente, protenas podem conter stios de ligao com metais
que so especialmente susceptveis a reaes reversveis de oxidao e reduo, as quais podem produzir uma
seqncia de sinais que podem ser reconhecidos por proteases celulares especficas que degradam tais protenas.
Muitas protenas intracelulares tm grupos sulfidrila reativos em resduos de cistena, que podem ser oxidados a
dissulfeto ou cidos cisticos, que podem ser novamente reduzidos metabolicamente. Similarmente, muitas
protenas tm um aminocido metionina que pode sofrer modificao reversvel a sulfxido ou sulfona. Os
aminocidos aromticos formam quinurenina, grupos cateclicos e polmeros. H formao de produtos de
adio com perxidos lipdicos e com hidroxialdedos derivados de lipdeos insaturados.

OH reage com (CHOH)n por abstrao randomizada de um tomo de H de um dos tomos de C, produzindo um
radical centrado no carbono. Isto leva quebra da cadeia de importantes molculas, tais como o cido hialurnico.

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

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Tabela 2. continuao
Endobitico

Sumrio das reaes mais importantes

Lipdeos

A peroxidao lipdica causada pelo ataque de uma ER (geralmente OH), que abstrai um tomo de hidrognio
(H) de um grupo metileno allico, normalmente, de um cido graxo poli-insaturado, deixando um eltron
desemparelhado no carbono, caracterizando a etapa de iniciao. Este radical usualmente estabilizado por
rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Sob condies aerbicas, o carbono radicalar do dieno
conjugado reage com O2 (que uma molcula hidrofbica e, portanto, se concentra no interior das membranas)
e forma o radical peroxila. Este radical peroxila capaz de abstrair H de molculas de lipdeos adjacentes, cujo
carbono radicalar sofre novo rearranjo, reage com O2 e forma outro radical peroxila e assim sucessivamente,
caracterizando a reao em cadeia da etapa de propagao. O radical peroxila combina-se com o H abstrado,
gerando o lipdeo hidroperxido (LOOH) que ao sofrer quebra, forma aldedos como malonaldedo e 4hidroxinonenaldedo, entre outros. Na decomposio dos hidroperxidos lipdicos so gerados radicais peroxila
e alcoxila atravs da reao de Fenton. A terceira e ltima etapa da peroxidao lipdica, a etapa de terminao
instala-se com a neutralizao dos radicais formados por ao de antioxidantes lipossolveis (-tocoferol, caroteno, NO) ou pela reao de dois radicais lipdicos formando produtos no radicalares. Nos sistemas biolgicos,
a peroxidao lipdica pode ocorrer por via enzimtica (ciclooxigenases e peroxidases) e por via no enzimtica
(auto-oxidao) cujo mecanismo supracitado envolve a participao de espcies reativas de oxignio, metais e
outros radicais livres. Pode ocorrer peroxidao de estruturas supramoleculares, como em fosfolipdeos e em
agregados de lipoprotenas5. Todas estas modificaes oxidativas causam mudanas nas propriedades fsicas e
qumicas das membranas, alterando sua fluidez e permeabilidade, com expanso do lquido intracelular e risco
de ruptura das membranas da clula e das organelas, com conseqente morte celular. Reaes envolvendo os
vrios intermedirios entre si levam a novos produtos, por ex., malondialdedo (MDA) reage com o grupo amina
de purinas e HNE reage com guanosina, entre outras reaes.

Tabela 3. Doenas selecionadas, relacionadas ao estresse oxidativo


Doena

Natureza do envolvimento com ER

Aterosclerose, Sndrome de Bloom, Sndrome de Down, Kwashiorkor, Doena de Keshan


Doena de Parkinson, estados txicos causados por lcool, fumo,
CCl4 etc.
Doena de Alzheimer, Asma, Artrite reumatide, asbestose,
Sndrome de Insuficincia Respiratria do Adulto
Esclerose mltipla

Falha ou consumo excessivo de defesas antioxidantes.

Doena granulomatosa crnica


Diabetes mellitus, anoxia, injria da reperfuso, pr-eclmpsia
Hipertenso arterial sistmica
Hemocromatose idioptica, talassemia, anemia falciforme, doena
de Wilson
Doena granulomatosa crnica, Deficincia de enzimas antioxidantes (Acatalassemia, por ex.)

te, ao dano induzido e susceptibilidade pesquisada. A Tabela 4


exemplifica alguns biomarcadores para doenas selecionadas12.
til ressaltar que a rea de biomarcadores se encontra em
desenvolvimento exponencial e no h qualquer pretenso, no presente artigo, de esgot-la em profundidade.
ANLISE DE BALANO REDOX DE UM ORGANISMO
EM AMOSTRAS DE SANGUE
No caso de estresse oxidativo, os marcadores de balano redox,
no invasivos, refletiriam o dano causado pelas ERO e ERN sobre
o sistema biolgico e a eficincia da defesa antioxidante de contrapartida. Tratando-se desses biomarcadores, h um esforo mundial
para sua validao multilaboratorial. Trabalhos de colaborao internacional, em andamento, liderados por Kadiiska13,14, utilizaram
um modelo murino, aps injeo intraperitoneal de CCl4, com pes-

Uso de drogas e toxinas. Na doena de Parkinson as toxinas


produzidas estariam envolvidas com a produo de radicais livres.
Produo de O2, H2O2 e HClO por clulas fagocticas ativadas.
Perturbao estrutural da clula. As hemcias tornam-se mais
susceptveis ao dos radicais livres.
Defeito gentico no sistema antioxidante.
Oxidao anormal de substratos ou mudanas na concentrao de
oxignio.
Produo de O2 por NADPH/NADP oxidase.
Transferncia de eltrons ao oxignio por metais de transio.
Defeito gentico no sistema antioxidante, especificamente o sistema
NADPH oxidase.

quisa de marcadores de balano redox em sangue, plasma e urina


de ratos tratados com esse xenobitico, segundo protocolos bem
estabelecidos13.
Neste trabalho, dar-se- nfase caracterizao de alguns
biomarcadores quantificveis em sangue humano e s tcnicas mais
empregadas para sua anlise. Vale salientar que outros fluidos biolgicos, como urina, saliva, suor e at mesmo o ar expirado, que
trariam informaes de produtos volteis de peroxidao lipdica8,
so tambm utilizados para anlise de biomarcadores de balano
redox; contudo, no fazem parte do escopo dessa reviso.
O sangue total constitudo de elementos figurados que so
eritrcitos e leuccitos, soro e plaquetas ou elementos da coagulao. O plasma compe-se da parte lquida do sangue, separada das
clulas sanguneas e o soro constitui-se do plasma sem os fatores
de coagulao, tais como fibrina15.
O sangue humano uma excelente fonte de marcadores in vivo

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Vasconcelos et al.

Tabela 4. Biomarcadores de dano oxidativo associado com algumas


doenas humanas
Doenas

Biomarcadores de dano

Cncer

MDA, razo GSH/GSSG,


NO2-Tyr, 8-OH-dG
HNE, razo GSH/GSSG, acrolena,
NO2-Tyr, F2-isoprostano
razo GSH/GSSG, F2-isoprostano
MDA, HNE, razo GSH/GSSG,
acrolena, NO2-Tyr, F2-isoprostano,
AGE
HNE, razo GSH/GSSG, protenas
carboniladas, nvel de ferro
razo GSH/GSSG, F2-isoprostano
MDA, HNE, acrolena, NO2-Tyr,
F2-isoprostano, NO2-Tyr
MDA, razo GSH/GSSG, protenas
S-glutationadas, NO2-Tyr,
F2-isoprostano, AGE.

Doena cardiovascular
Artrite reumatide
Doena de Alzheimer

Doena de Parkinson
Isquemia reperfuso
Aterosclerose
Diabetes mellitus

Fonte: Adaptada da ref. 90


de estresse oxidativo, uma vez que nele so transportados e redistribudos antioxidantes e endobiticos modificados por ao de ERO
e ERN. considerado uma amostra biolgica nica, potencialmente
mais informativa, j que, obtida de um indivduo, pode descrever
seu estado de sade no momento da coleta16. Pode ser obtido em
larga escala, com uma quantidade relativamente grande de protenas (em mg), disponvel para estudo de numerosas condies e
estados de sade17.
A anlise do balano redox pode ser feita em soro, e/ou plasma
e/ou eritrcitos.
O sistema antioxidante sanguneo classificado em enzimtico
e no enzimtico. O enzimtico representado, principalmente,
pelas enzimas antioxidantes: a superxido dismutase (SOD) que
catalisa a dismutao do nion radical superxido (O2) a perxido
de hidrognio (H2O2) e O2 (Equao 1), a catalase (CAT) que atua
na decomposio de H2O2 a O2 e H2O (Equao 2) e a glutationa
peroxidase (GPx), que atua sobre perxidos em geral, com utilizao de glutationa como co-fator (Equao 3).
O sistema antioxidante no enzimtico formado por muitas
substncias, com destaque para a glutationa (GSH), principal composto antioxidante intracelular, tocoferis, ascorbato, cido rico e
-caroteno, alm de protenas de transporte de metais de transio,
como a transferrina (transporte do ferro) e ceruloplasmina (transporte do cobre e oxidao do ferro para ser captado pela transferrina)18.
Os metais de transio so potenciais formadores de espcies reativas
atravs da reao com outros compostos, uma vez que sofrem reaes redox. Decorre, da, a necessidade de serem transportados associados a protenas, impedindo que essas reaes ocorram.
2 O2+ 2H+
2 H2O2
2 GSH + H2O2

H2O2 + O2
2 H2O + O2
2 H2O + GSSG

(1)
(2)
(3)

O sistema antioxidante enzimtico e a glutationa esto presentes, predominantemente, no meio intracelular (Figura 2), da a utilizao do eritrcito para sua anlise. Por outro lado, o sistema
antioxidante no enzimtico localiza-se, principalmente, no meio
extracelular, sendo por isso analisado em plasma e soro. No sangue circulam importantes antioxidantes, a exemplo das vitaminas
C, E, -caroteno etc., bem como biomarcadores do dano causado
por ERO e ERN e outros, como malondialdedo (MDA), isopros-

Quim. Nova

tanos, lipoperxidos e outros derivados da peroxidao lipdica das


membranas celulares.

Figura 3. Reao utilizada no ensaio TEAC ou Teste do ABTS. A capacidade


antioxidante determinada a partir da leitura da inibio do ction radical
2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamnio) - ABTS+,
produzido nesta reao

As substncias envolvidas no binmio antioxidante pr-oxidante


caracterizam o ambiente redox biolgico (Tabela 5) e podem ser
quantificadas associando as tcnicas bioqumicas tradicionais de
amostragem e determinao espectrofotomtrica, tcnicas cromatogrficas, eletroanalticas, de ressonncia magntica e espectrometria
de massas18-20. Tal combinao possibilita relacionar o balano redox
avaliado em indivduos com diferentes aspectos ambientais (poluio
urbana, por ex.), demogrficos, tnicos, culturais, clnicos e nutricionais,
surgindo assim uma importante ferramenta no estudo de fenmenos
biolgicos vinculados ao estresse oxidativo.
Tabela 5. Exemplos de biomarcadores de doenas
Doenas

Exemplos de biomarcadores

Diabetes
mellitus

Glicemia, frutosaminas, hemoglobina A1c,


avaliao da retina, neuropatia perifrica e
nefropatia
Nveis pressricos, angiotensina I e II,
aldosterona, renina plasmtica, atividade da
ECA (Enzima Conversora da Angiotensina)
Citocinas, leucotrienos
Testes de funo pulmonar,
citocinas, leucotrienos

Hipertenso
arterial
sistmica
Artrite reumatide
Asma, DPOC
(doena pulmonar
obstrutiva crnica)
Injria cardiovascular cTroponina I e T
Doena heptica
ALT (alanina amino-transferase) e
GT (-glutamil-transpeptidase)
Fonte: Adaptada da ref.12

No que se refere aos antioxidantes, alguns autores defendem o


estudo da capacidade antioxidante total (CAOT), ao invs de anlise
de antioxidantes isolados, principalmente devido interao que
existe entre eles no plasma ou soro20. Na anlise da CAOT, leva-se
em conta a ao acumulativa de todos os antioxidantes presentes;
obtm-se um parmetro integrado, capaz de revelar nuanas acerca
do delicado equilbrio redox existente in vivo. A medida de CAOT
auxilia na avaliao dos fatores nutricionais, fisiolgicos e ambientais
do balano redox em seres humanos20. Por outro lado, a anlise de
antioxidantes ou marcadores de dano isolados, adequadamente escolhidos, pode facilitar a compreenso de situaes especficas como,
por ex., a anlise de peroxinitrito (ONOO-) em doena vascular ou
em inflamao associada leishmaniose. Outro aspecto a dualidade
das informaes obtidas: um aumento da CAOT no , necessariamente, uma condio desejvel (p. ex., verificado em pacientes com
insuficincia renal crnica), nem indesejvel, uma vez que pode ocor-

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

rer quando h uma diminuio na produo de ERO e ERN (p. ex.,


em ratos submetidos restrio calrica)21. O mesmo raciocnio aplica-se a um marcador isolado.
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (CAOT)
Os diversos testes propostos na literatura variam quanto ao tipo de
radicais gerados, ao indicador de oxidao escolhido e ao mtodo usado para sua deteco e quantificao. So chamados ensaios de captao (trap assays). Em todos esses ensaios, um radical gerado e
reage com molculas-alvo, para produzir cor, fluorescncia, quimioluminescncia, perda ou ganho de sinais de ESR (Electron Spin
Resonance ou Ressonncia do Spin Eletrnico) ou outra mudana
mensurvel. A presena de antioxidantes altera esses sinais, o que
permite sua anlise quantitativa18.
Dentre os testes utilizados, citam-se aqueles conhecidos pelas
siglas TRAP, ORAC, FRAP e TEAC18, 20-33 (Tabela 6). TRAP e
ORAC so mtodos cuja determinao analtica envolve reaes
de transferncia de tomos de hidrognio e FRAP e TEAC, transferncia de eltrons27.
til registrar que o decrscimo da CAOT no significa necessariamente que o dano oxidativo ocorreu; pode significar simplesmente que o mecanismo de defesa cumpriu sua funo habitual18.
TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter)
O TRAP foi o primeiro ensaio desenvolvido para determinar a
CAOT do plasma sangneo. O mtodo foi desenvolvido por Wayner
et al.25. Consiste na gerao de radicais peroxila (RO2), por decomposio trmica, a uma velocidade controlada, de azoiniciadores (Equaes 4 e 5). O dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina)
(AAPH ou ABAP, C8H18N6.2HCl, M.M 271,20 g/mol)18,28,29 exemplo
de azoiniciador hidrossolvel. Existem outros azocompostos, que se
distinguem por serem lipossolveis, como, por exemplo, o AMVN
(2,2-azobis-2,4-pentanonitrila). Estes reagem rapidamente com o
oxignio originando radicais peroxila (Equaes 4 e 5).
Aps adicionar AAPH ao plasma sangneo, a oxidao
monitorada, a partir, por exemplo, de medidas de oxignio consumido, durante a reao, em eletrodo de oxignio. O perodo no
qual a oxidao inibida pelos antioxidantes plasmticos comparado ao do trolox (cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2carboxlico, C14H18O4, M.M 250,3 g/mol), o anlogo hidrossolvel
da vitamina E, usado como antioxidante de referncia e quantitativamente relacionado CAOT do plasma.
Os valores de TRAP so expressos em mol de radical peroxila
capturado por molcula de trolox/L de plasma. Cada molcula de

1329

trolox captura duas molculas de RO2. O RO2 gerado para reagir


com os antioxidantes do fluido biolgico pode tambm ser detectado diretamente atravs de mtodos de quimioluminescncia. No
plasma humano, o valor normal de TRAP de 1 mM de RO2 capturado por litro; as maiores contribuies so do urato (35-65%),
das protenas plasmticas (10-50%), do ascorbato (acima de 24%)
e da vitamina E (5-10%).
RN=NR
R + O2

N2 + 2R
RO2

(4)
(5)

ORAC (Oxygen-Radical Absorbancy Capacity)


Este mtodo usa a protena Phycoerythrin (PE) (Ficoeritrina),
fotossinttica, marcadora de fluorescncia, como alvo dos radicais. O ORAC mede a diminuio da emisso de fluorescncia de
PE adicionada ao plasma em presena de um composto azo, gerador de radicais (Equao 4). A habilidade antioxidante do plasma
calculada a partir da medida da rea sob a curva de decaimento da
fluorescncia (Area Under the Fluorescence Decay Curve AUC,
com emisso a 565 nm) comparada ao padro que, na maioria das
vezes, o trolox. A PE pode ser oxidada por AAPH para gerar
radical peroxila (Teste ORACRO2) ou por Cu2+-H2O2 para gerar radical hidroxila (Teste ORACHO) ou ainda, adicionando-se ons Cu+
como redutores (Teste ORACCu+).
O ORAC combina o tempo de inibio e a percentagem (%) de
inibio da ao do radical pelo antioxidante e usa a rea sob a
curva para a quantificao. O teste expressa os resultados como
unidades de ORAC ou equivalentes do trolox, que corresponde
quantidade de trolox em mol que tem a mesma atividade
antioxidante para o radical peroxila em 1 L de plasma. Porm, se o
gerador de radicais for o Cu2+, o trolox no pode ser usado como
padro, pois o mesmo pode atuar como pr-oxidante na presena
de Cu2+. Neste caso, a ao antioxidante ser expressa em unidade
antioxidante: uma unidade equivale atividade antioxidante que
causa o aumento da rea sob a curva de decaimento de fluorescncia
de PE em 100%22.
Esse o nico mtodo que permite a medida total dos radicais
gerados e usa a tcnica de AUC ao invs da lag fase (fase de
retardo), utilizada pelos outros mtodos para quantificao dos radicais. A AUC combina o percentual de inibio ao tempo de inibio da ao do radical (lag fase) pelo antioxidante22.
Mais recentemente, Prior e colaboradores31 sistematizaram e validaram o uso do ORACFL, prprio para a quantificao da CAOT em
plasma ou soro. A separao das fraes antioxidantes lipoflicas e
hidroflicas do plasma, foi obtida por extrao com hexano, aps adi-

Tabela 6. Grupo de biomarcadores em sangue e principais mtodos de anlise


Grupos de biomarcadores

Sub-grupos

Principais substncias e mtodos de anlise

Antioxidantes

Capacidade antioxidante total


Enzimas antioxidantes

TRAP, ORAC, FRAP, TEAC, por espectrofotometria.


SOD, GPx e CAT so avaliadas espectrofotometricamente. Sua atividade
antioxidante e tcnica de anlise esto descritas no texto.
Vitaminas E, C e -caroteno avaliadas por HPLC; glutationa avaliada por
espectrofotometria; ceruloplasmina e transferrina, por turbidimetria e cido
rico pelo mtodo enzimtico.
Deteco de grupos carbonila por espectrofotometria.
Deteco de malondialdedo por HPLC com deteco no ultravioleta.
3-Nitrotirosina (3-NO2-Tyr) por HPLC, com deteco eletroqumica.
Deteco de 8-oxo-2-desoxiguanosina (8-oxodG) em linfcitos por HPLC
Teste do cometa (comet assay) em leuccitos

Antioxidantes no enzimticos

Marcadores de
dano oxidativo

Protenas oxidadas
Lipdeos oxidados
Protenas nitradas
Oxidao das bases do DNA
Quebra de DNA

1330

Vasconcelos et al.

o de gua e etanol ao plasma. As duas fraes sofrem partio eficiente entre o hexano e os solventes aquosos. Esse mtodo pode ser
empregado em outros fluidos biolgicos ou amostras de alimentos31.
FRAP (Ferric-Reducing Ability of Plasma)
Testa a fora antioxidante do plasma, via avaliao da reduo
do complexo Fe3+-TPTZ (ferritripiridiltriazina) [2,4,6-tri(2-piridil)1,3,5-triazina, C18H12N6, M.M. 312,33 g/mol] a ferroso-tripiridiltriazina (Fe2+-TPTZ) por redutores, no caso, os antioxidantes
plasmticos, em valor de pH baixo. Baseia-se no fato de que a
habilidade de um composto em produzir Fe2+ a partir de Fe3+ define
sua fora antioxidante. O complexo Fe2+-TPTZ tem uma cor azul
intensa e pode ser monitorado, a 593 nm, em espectrofotmetro. A
vitamina C e o cido rico, por ex., reduzem Fe3+ a Fe2+. Por outro
lado, um antioxidante que reduz efetivamente um pr-oxidante,
no reduz, necessariamente, Fe3+ a Fe2+.
As limitaes do mtodo so, portanto: nem todo redutor que
hbil para reduzir Fe3+ a Fe2+ antioxidante; nem todo antioxidante
tem a habilidade especfica para reduzir Fe3+ a Fe2+, como por ex.,
a glutationa. O resultado final pode ser convertido a mmol de equivalentes de trolox por litro de plasma. A atividade relativa do trolox
em FRAP de 2,0 mmol/L, ou seja, a reao direta de Fe2+ proporciona uma mudana de absorbncia que a metade de 1 equivalente molar para o trolox31.
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ou Teste
do ABTS
O TEAC baseia-se na inibio por antioxidantes do ction radical 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de
diamnio) (C18H24N6O6S4, M.M. 548,7 g/mol, ABTS+), que apresenta absorbncia caracterstica primria em 415 nm e absores
secundrias em 660, 734 e 820 nm.
O mtodo original baseia-se na ativao de metamioglobina como
peroxidase, em presena de ABTS. O complexo perferril da
hemeprotena produziria o ction radical ABTS + de cor azul
esverdeada. A adio desse radical a um meio contendo antioxidantes,
permite avaliar, atravs do grau de descolorao, a capacidade
antioxidante do mesmo. Alguns autores sugerem o uso de oxidao
qumica de ABTS, com utilizao de reagentes como dixido de
mangans ou persulfato de potssio, uma vez que outros antioxidantes
podem contribuir para reduzir o radical ferrimioglobina formado
durante a reao. O percentual de inibio de ABTS+ determinado
em funo da concentrao e do tempo. Quando a medida relativa
reatividade do trolox, como padro, sob as mesmas condies, o
teste denominado TEAC, expresso como unidades equivalentes de
trolox que correspondem a 1,0 mmol/L18,33.
Esse mtodo aplicvel para o estudo de antioxidantes lipossolveis e hidrossolveis.
A Tabela 7 ilustra valores de CAOT, obtidos em plasma e soro

Quim. Nova

humanos, com o emprego dos ensaios supracitados.


Cao e Prior22 compararam TEAC e FRAP com ORAC na determinao in vivo da CAOT em soro humano e concluram que o
ORAC apresenta maior especificidade. No ORAC, a razo molar
de AAPH/antioxidante > 2000 e para a quantificao utiliza uma
combinao do percentual de inibio com o tempo de inibio da
ao do radical pelo antioxidante. No FRAP, a maior limitao diz
respeito menor sensibilidade e especificidade do mtodo. No
TEAC, a razo molar entre os reagentes H2O2/metamioglobina/
ABTS/trolox somente 10,2/0,25/25/1, o que pode reduzir ou equilibrar o aumento na produo de espcies radicalares. Alm disso,
a quantificao da atividade antioxidante feita atravs do
percentual de inibio em um tempo fixo, sem considerar o tempo
de durao da inibio22,23.
preciso destacar que esses mtodos se baseiam estritamente
em reaes qumicas in vitro e no tm qualquer similaridade com
sistemas biolgicos. A validade de seus dados limita-se a um contexto de interpretao estritamente qumico. Assim, Niki e Yoshida34
discriminam o que denominam potencial antioxidante qumico
daquele biolgico (determinado in vivo ou em modelos biomimticos), onde a compartimentalizao e a partio dos protagonistas redox (agente oxidante e alvo) entre fase aquosa e fase lipdica
so consideradas35.
O uso de tais testes para determinar a bioatividade de uma
amostra biolgica deve ser visto com cautela, uma vez que eles
no medem biodisponibilidade, estabilidade in vivo, reteno de
antioxidantes pelos tecidos, nem reatividade in situ25.
Uma srie de novos mtodos, ainda no padronizados, foi e
continua a ser relatada, o que mostra o vigor da rea de pesquisa.
Em vista da necessidade de mtodos cada vez mais sensveis, de
pesquisa in situ, da mimetizao do ambiente biolgico, h forte
interesse nesse desenvolvimento. Como exemplo, podem-se citar
alguns mtodos eletroqumicos, no caso, a coulometria em corrente constante, para anlise de CAOT em plasma humano32. O mtodo utiliza bromo eletrogerado (eletrlise corrente constante a partir
de brometo de tetraetilamnio, em HClO4 0,1 mol/L) e o ponto
final da titulao detectado amperometricamente32.
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE ESPECFICA
Enzimas antioxidantes
Superxido dismutase (SOD)
As principais formas de superxido dismutases (EC 1.15.1.1),
encontradas em humanos so a Cu/ZnSOD localizada no citosol
(dimrica), alm de lisossomas, ncleo e espao entre as membranas interna e externa da mitocndria (tetramrica) e a MnSOD localizada na mitocndria (Figura 2).
A maioria das anlises de SOD realizada verificando-se a atividade de SOD indiretamente, geralmente por adio ao eritrcito do
sistema xantina - xantina oxidase como fonte de O2 e um composto

Tabela 7. Capacidade antioxidante total em plasma/soro humanos por vrios ensaios


Mtodo

Resultados tpicos (M) e referncias

Comentrios

TRAP
Ensaio da Ficoeritrina
(PE) ou ORAC

~1000
Free Radical Biol. Med. 1994, 21, 211.
1162 265
Free Radical. Biol. Med. 1995, 18, 29.

Ensaio ABTS
FRAP

1320-1580 Redox Rep. 1996, 2, 161


612-1634 Anal. Biochem. 1996, 239, 70.

Uso de azoiniciadores na gerao de radicais,


que reagem com O2, dando radical peroxila.
Mede a diminuio da emisso de fluorescncia de PE,
adicionada ao plasma, em presena de um composto azo,
gerador de radicais.
Ver Figura 3.
A reduo de Fe3+ a Fe2+ define a capacidade antioxidante.

Fonte: Adaptada da ref. 18

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

que seja reduzido pelo O2 18,26 como, por ex., o 2-(4-iodofenil)-3-(4nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (INT, C19H13ClIN5O2.x H2O, M.M.
505,7 g/mol). O O2 transfere um eltron ao INT e produz formazana,
detectada em espectrofotmetro a 505 nm. A atividade da enzima
medida a partir do grau de inibio da reao a que o eritrcito foi
submetido e os valores so expressos em unidades por grama de
hemoglobina (Hb) (U/g Hb). A inibio da formao do cromgeno
proporcional atividade de SOD presente na amostra. Nessa tcnica,
uma inibio de 50% definida como uma unidade de SOD36-39.
Catalase (CAT)
A catalase (EC 1.11.1.6), cujo stio ativo contm o grupo heme,
est enclausurada no peroxissoma, a principal organela responsvel pela desintoxicao celular e pela oxidao de cidos graxos
de cadeia longa, fonte inesgotvel de perxidos orgnicos, produtos carbonlicos e oxignio singlete. A catalase , tambm, encontrada nas mitocndrias das clulas do tecido cardaco.
Os dois caminhos mais utilizados para estudo de sua atividade
referem-se medida do decaimento na concentrao de H2O2 e da
gerao do oxignio18,26. A leitura do decaimento de H2O2 feita
por espectrofotometria no ultravioleta a 240 nm. Os valores de CAT
tambm so expressos em unidades por g de hemoglobina (U/g
Hb). Uma unidade de CAT corresponde atividade da enzima necessria para o consumo de 1 mol de H2O2 em 1 min40.
Glutationa Peroxidase (GPx)
A famlia de GPx (EC 1.11.1.9) reduz H2O2 e outros perxidos
a gua ou lcool. Apresenta-se sob 4 formas: GPx 1 ou clssica,
encontrada no citosol de todas as clulas do corpo; GPx 2 ou gastrointestinal, especfica do trato gastrointestinal; GPx 3 ou plasmtica ou extracelular, encontrada no fluido do revestimento interno do pulmo e no leite materno, alm do plasma em mamferos, e
a GPx 4, que atua sobre perxidos de resduos de cidos graxos nas
membranas e lipoprotenas, reduzindo, tambm, o hidroperxido
da timina, formado como conseqncia do ataque dos radicais
base timina do DNA41,42. A famlia de GPx integra o grupo de
selenoprotenas, que tm, em seu stio ativo, o selnio (Se), obtido
da dieta ligado metionina, em alimentos de origem vegetal (selenometionina) e, ligado cistena, em alimentos de origem animal
(selenocistena). O Se reconhecidamente um nutriente antioxidante, com recomendaes de obteno na dieta considerando sua
atividade antioxidante e nutricional43,44.
No organismo humano, a selenometionina ocupa o lugar da
metionina nas protenas e a selenocistena constituinte das
selenoprotenas (selenocistena a forma na estrutura primria de
todas as selenoprotenas, inclusive GPx)41,44. Uma unidade de GPx
corresponde atividade de enzima necessria para converter 1 mol
de NADPH a NADP+ em 1 min. Como as demais enzimas antioxidantes, os valores de GPx so expressos em unidades por g de
hemoglobina (U/g Hb).
Um mtodo muito utilizado para avaliar a atividade de GPx em
eritrcitos consiste em adicionar ao lisado de hemcias uma mistura contendo NADPH, GSH, GR, EDTA (agente quelante que tem
tambm a funo de impedir a oxidao de GSH a GSSG) e tampo fosfato. Uma alquota da mistura adicionada ao hemolisado,
mantido em banho-maria a 37 C durante 1 min, adicionando-se,
em seguida, H2O2 ou hidroperxido orgnico, para iniciar a reao,
que acompanhada em espectrofotmetro.
O mtodo similar quele tradicional de Mills45,46, que mede a
velocidade de oxidao de GSH por H2O2 catalisada por GPx presente no hemolisado. O consumo de GSH medido, mantendo em
concentraes constantes a GR e o NADPH que converte imediatamente a GSSG produzida em GSH. Portanto, a anlise de GPx

1331

pode ser feita adicionando-se GSH, GR, NADPH e um perxido


para dar incio reao (t-BOOH, por ex.), sendo monitorada a
340 nm quando o NADPH convertido a NADP47.
Glutationa redutase (GR)
A glutationa redutase (EC 1.6.4.2) uma flavoprotena dependente de NADPH e da integridade da via das pentoses. a enzima
necessria para manuter a glutationa em sua forma reduzida e, possivelmente, para controlar o estado redox de NADP em tecidos
onde GSSG est disponvel48. A recuperao de GSH por GR
uma etapa essencial para manter ntegro o sistema de proteo celular, pois, baixas concentraes de GSH esto associadas ao
estresse oxidativo1.
A anlise de GR em eritrcitos feita utilizando-se tcnicas
espectrofotomtricas, em valores de absorbncia de 340 nm, quando
o NADPH convertido a NADP+. Uma unidade de GR definida
como 1 mol de GSSG reduzida por min a 30 C, em pH 7,4 48,49.
Conforme citado acima, a anlise de enzimas antioxidantes
comumente realizada em eritrcitos49, o que requer o hemograma ou
eritrograma dos indivduos estudados e aponta para a adoo da unidade
de enzima expressa em unidade de enzima por grama de hemoglobina,
cujos valores de referncia esto dispostos na Tabela 7.
Sistema antioxidante no enzimtico
Relaciona-se a um grupo de antioxidantes que podem ser agrupados em compostos produzidos in vivo, como o caso da glutationa,
da ubiquinona e do cido rico, e em compostos obtidos diretamente da dieta tais como vitaminas E, C, -caroteno e outros.
Glutationa
A glutationa (GSH) (C10H17N3O6S, M.M 307 g mol-1) um
tripeptdeo (L--glutamil-L-cisteinilglicina) que exerce funes
essenciais na clula, destacando-se sua funo como cofator da
famlia de enzimas glutationa peroxidases (GPx), em que desempenha papel protetor contra o estresse oxidativo, com sua oxidao
a dissulfeto da glutationa (GSSG) (C20H32N6O12S2, Mr 612,6 g/mol).
um tampo redox sulfidrlico que mantm os resduos cisteinila
da hemoglobina e de outras protenas do eritrcito, no estado reduzido. A GSH o nico tiol no protico presente em espcies
aerbias e seu papel intracelular antioxidante inclui a desintoxicao
de xenobiticos e de ERO. A falha nesta funo resulta na formao de meta-hemoglobina e conseqente incapacidade do eritrcito
em transportar oxignio, alm de causar uma variao na forma do
eritrcito, impedindo sua passagem para rgos vitais50-52.
O preparo das amostras muito importante para minimizar a
atividade de -glutamil-transpeptidase, que quebra ligaes glutamilpeptdeo de GSH; a reduo de GSSG por GR ou a oxidao de GSH. Muitos procedimentos so desenvolvidos para inibir
estas reaes enzimticas e no enzimticas: acidificao, utilizando, por ex., cido perclrico, capaz de inibir tanto a -glutamiltranspeptidase quanto a GR, e o uso de quelantes como o cido
etilenediaminotetractico (EDTA), que limita a oxidao de GSH53.
A concentrao de glutationa total (GSH + GSSG) pode ser
medida usando-se 5,5-ditiobis-(2-cido nitrobenzico) (DTNB,
C14H8N2O8S2, M.M 396,3 g/mol) e GR. A velocidade de reduo de
DTNB verificada espectrofotometricamente a 412 nm, comprimento de onda relativo absoro do produto reduzido, o cido 5mercapto-2-nitrobenzico (TNB), ou sais correspondentes (Figura
4). O mesmo procedimento pode ser utilizado para a determinao
de GSSG, com acompanhamento da mudana de absorbncia em
NADPH a 340 nm. Entretanto, para evitar a interferncia de GSH,
essa deve ser derivatizada com vinilpiridina26 (no interfere com

1332

Vasconcelos et al.

GR) ou com N-etilmaleimidina (NEM)49,53,54. Quando NEM utilizada, o derivado formado deve ser eliminado antes da anlise, pois
o mesmo inibe a GR.
Outra forma de determinar a concentrao de glutationa nas
hemcias descrita no trabalho de Calvo-Marzal e colaboradores55, onde se utilizam eletrodos de pasta de carbono modificados
com Tetratiofulvaleno Tetracianoquinodimetano (TTF-TCNQ).

Figura 4. Reaes usadas para deteco de glutationa. (A) Reao enzimtica


DTNB e do produto da sua reduo, TNB (cido 5-tio-2-nitrobenzico), sob
ao de GSH, observado em 412 nm. (B) Reao no enzimtica para
deteco de NADP a 340 nm

Coenzima Q (CoQ)
A coenzima Q10 (Figura 5) ou ubiquinona o nico lipdio
endogenamente sintetizado atravs da via do mevalonato, que apresenta funo redox56. um AO que desempenha papel central na
cadeia respiratria mitocondrial, na cadeia de transporte de eltrons
extra-mitocondrial, participa da regulao da permeabilidade, diminui a oxidao de protenas de membrana, previne a oxidao do
DNA e impede a disfuno endotelial, provavelmente por aumentar
a disponibilidade de NO. Sua forma antioxidante, o ubiquinol
(CoQH2), produto da reduo de CoQ, inibe a iniciao e propagao da peroxidao lipdica, com conseqente impedimento da formao de ROO (radical peroxila). Alm disso, a coenzima Q regenera a vitamina E do radical tocoferila57,58.

Figura 5. Stios de ao de coenzima Q, vitamina E e ascorbato na peroxidao


lipdica. LH: cido graxo polinsaturado; OH; radical hidroxila; Fe3+O2:radical perferrila; CoQH2: coenzima Q reduzida; CoQH-: semiubiquinona;
L: carbono central radicalar do cido graxo; LOO: radical lipdico peroxila;
vitE-OH: vitamina E (-tocoferol); vitE-O: vitamina E (radical -tocoferila);
Asc: Ascorbato; Asc: radical ascorbila. Adaptado da ref. 57

Quim. Nova

A CoQ transportada na circulao ligada a lipoprotenas, sendo


60% associada com LDL, 25% com HDL e 15% com outras
lipoprotenas. A atividade antioxidante de CoQH2 depende, no
somente da sua concentrao total, mas tambm do seu estado redox,
ou seja, da proporo de CoQH2 em relao CoQ total.
A ubiquinona, tanto na forma reduzida (CoQH2), como na forma
oxidada (CoQ), pode ser quantificada em plasma humano obtido de
sangue coletado em heparina, centrifugado e armazenado a -70 C,
30 min aps a coleta. A anlise feita em HPLC, com o plasma
tratado com 1-propanol para dissociao de CoQ, e -tocoferol da
lipoprotena e com a adio do anlogo dietoxlico da CoQ, como
padro interno. O sobrenadante injetado diretamente na cmara de
injeo do HPLC e CoQH2 e CoQ so determinadas26,49.
cido rico
O cido rico (URH3) deriva do metabolismo das purinas e produzido pela oxidao de hipoxantina e xantina pela xantina oxidase
(XO) e xantina desidrogenase (XD). Na maioria das espcies, a enzima
peroxissomal urato-oxidase converte urato a alantona, que, por sua
vez, convertida a alantoato e depois a glioxilato e uria, todos produtos mais solveis em gua que o urato. Seres humanos e outros primatas
no contm a urato-oxidase, da, o urato acumula-se no plasma e
excretado na urina. Em pH fisiolgico, o cido rico dissociado a
urato (UrH2-) (pKa 5,4)5. O urato tem solubilidade menor em gua e
sua concentrao encontra-se muito prxima de seu limite de solubilidade (300 M) 5; por isso, o excesso de produo de urato leva
formao de cristais, o que ocorre na gota, tratada com alopurinol,
inibidor de XO/XD. Oxidantes fortes, tais como OH, podem oxidar o
nion urato (UrH2-) ao radical urato, que dissociado (pKa 3,1), ao
nion radical urato (UrH). Esse estvel graas ressonncia que
permite a disperso da carga negativa. O urato tambm reage com
radicais ROO antes de este penetrar a membrana celular e iniciar o
dano e, com o dixido de nitrognio (NO2), para formar o nion
nitroxila NO2- e por fim, atua como antioxidante, por sua capacidade
de quelar metais de transio. O nion radical urato (UrH) pode reagir
com ascorbato (AscH-), regenerando o urato5 (Equao 6)18.
UrH + AscH-

UrH2- + Asc

(6)

O cido rico apresenta atividade antioxidante significativa e


sua concentrao no plasma maior que a de outros antioxidantes,
como vitaminas C e E20.
A anlise de urato pode ser feita em soro ou em plasma (obtido
em heparina ou EDTA), de preferncia frescos, pelo mtodo
enzimtico automatizado, utilizando kits para dosagem, atravs da
diminuio da absorbncia, aps tratamento com uricase. O cido
rico, que absorve em 293 nm, ao ser convertido a alantona pela
uricase, apresenta diminuio na sua absorbncia15.
Vitamina E ou tocoferol
O termo vitamina E a designao comum de duas diferentes
famlias de compostos que ocorrem na natureza: os tocoferis e os
tocotrienis, que exibem, qualitativamente, a atividade biolgica do
-tocoferol, que o composto mais potente e, geralmente, a forma
predominante. Estruturalmente, tocoferis e tocotrienis diferem
apenas na cadeia lateral e ambos se subdividem em , , e ,
dependendo do nmero e posio do grupo metila no anel cromanol59.
O tocoferol o antioxidante lipossolvel que atua bloqueando a
etapa de propagao da peroxidao lipdica dos cidos graxos poliinsaturados das membranas e lipoprotenas. Intercepta o radical
peroxila (RO2), resultante com formao do radical tocoferila, que
ser regenerado por ascorbato, glutationa ou ubiquinol a tocoferol5,60.
O tocoferol pode ser medido em plasma, soro, plaquetas e eritrcitos

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

por tcnicas cromatogrficas, sendo a HPLC em fase reversa, a tcnica de escolha, com deteco por espectrofotometria no UV (cujo
comprimento de onda depender do solvente), por espectrofluorimetria ou ainda por mtodos eletroqumicos26. Por ser lipoflico, o
tocoferol requer uma etapa pr-analtica de extrao com hexano,
que realizada ao abrigo da luz e sob refrigerao.
Vitamina C ou ascorbato
O cido ascrbico essencial ao homem, pois no pode ser sintetizado a partir da glicose que seu precursor, como ocorre em
plantas e na maioria dos animais. Em sistemas biolgicos, em pH
fisiolgico (7,4), 99,95% da vitamina C (AsCH2) encontra-se na forma de ascorbato (Asc-), que a forma que atua como antioxidante,
ao doar um H ou [H+ + e-] para um radical. O ascorbato (AscH-) atua
como antioxidante sobre ERO e ERN, em ambiente biolgico aquoso, resultando na formao do nion radical semidesidroascorbato
(Asc), ou ascorbila, pouco reativo. Atua eficientemente sobre o nionradical superxido (O 2), o perxido de hidrognio (H 2O2), o
hipoclorito (ClO-) e os radicais hidroxila (OH) e peroxila (OOH). O
ascorbato pode atuar diretamente nas membranas celulares, por impedir a iniciao da peroxidao lipdica ou indiretamente por regenerar a vitamina E, que atua como antioxidante na face lipoflica da
membrana5. Alm disso, pode regenerar o nion radical urato a partir de urato, fechando o ciclo de atuao antioxidante do mesmo,
como discutido anteriormente (Equao 6)18.
A deteco de vitamina C em plasma ou em soro requer precauo, uma vez que um composto facilmente oxidvel. Devido
a sua facilidade de oxidao, em pH neutro (fisiolgico) ou alcalino, recomendvel a acidificao do plasma, preferencialmente
aps sua separao por centrifugao, adicionando-se cido
tricloroactico, cido metafosfrico, ou cido oxlico, isolado ou
em associao com cido tricloroactico. HPLC a tcnica mais
comumente usada na sua separao e anlise. Recentemente,
Katepe61 desenvolveu uma tcnica para deteco simultnea de
ascorbato e malondialdedo em soro humano, utilizando HPLC com
deteco no UV.
-caroteno
Os carotenides so pigmentos intensamente coloridos,
lipossolveis, sintetizados por plantas e microrganismos, presentes em muitos alimentos, particularmente frutas, vegetais e peixes.
Existem mais de 600 tipos de carotenides e apenas 10% tm atividade pr-vitamina A, que a capacidade de converso dos
carotenides em retinol62.
As propriedades antioxidantes dos carotenides esto associadas com sua capacidade de capturar radicais e outras espcies, como
oxignio singlete, em baixas concentraes e em baixa presso
parcial de oxignio, tais como aquelas da maioria dos tecidos sob
condies fisiolgicas62. No entanto, as funes de carotenides na
dieta, na preveno de doenas no esto definitivamente estabelecidas, havendo muita controvrsia na literatura. Neste aspecto,
importante citar dois estudos de associao da suplementao de
-caroteno e preveno de cncer de pulmo e doena arterial
coronariana (DAC) em fumantes, onde se verificou, inclusive, um
aumento da mortalidade: o CARET (Carotene and Retinol Efficacy
Trial)63, com 18.314 fumantes acompanhados durante 4 anos revelou aumento de 46% na mortalidade por CA de pulmo, de 26%
na mortalidade por DAC e de 17% na mortalidade geral e, o ATBC
(Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene Lung Cancer Prevention
Study)64, de preveno secundria, com 29.133 fumantes acompanhados durante 6 anos revelou aumento de 18% na mortalidade
por CA de pulmo, de 12% na mortalidade por DAC e de 8% na
mortalidade total.

1333

O mtodo mais comumente adotado para analisar carotenides


em soro humano HPLC em fase reversa. A amostra de sangue
deve ser coletada sem anticoagulante, uma vez que o EDTA (cido
etilenodiaminotetraactico), o oxalato e o citrato reduzem a concentrao de -caroteno, porque catalisam as reaes de
isomerizao ou de oxidao do mesmo. Alm disso, todas as etapas requerem proteo contra a luz26. As protenas devem ser previamente desnaturadas por exposio ao cido perclrico; o caroteno subseqentemente extrado com mistura de acetato de
etila tetraidrofurano (1:1) e nenhuma etapa de evaporao
requerida. A separao obtida usando-se eluio isocrtica em
coluna C18 com deteco em ultravioleta a 436 nm65. A anlise pode
ser realizada com cada um dos tipos de carotenides ou em termos
da concentrao de carotenides total, que podem ser extrados
tambm com solvente orgnico, geralmente hexano, e detectados
medindo-se a absorbncia a 453 nm26.
Protenas de transporte de metais de transio
Os metais de transio Fe e Cu so essenciais ao organismo
humano para a sntese de muitas enzimas e protenas envolvidas na
respirao, transporte de O2, formao de xido ntrico e outras
reaes redox (por ex., oxidao de adrenalina, noradrenalina e
ascorbato). Sua habilidade na transferncia de eltrons os caracteriza como potentes pr-oxidantes, uma vez que tm o poder de
converter H 2O2 em OH (Tabela 1). Alm disso, so potentes
catalisadores de reaes de auto-oxidao e decompem perxidos
lipdicos a radicais peroxila e alcoxila, muito reativos.
Estes ctions podem ser dosados sob a forma livre, ou ligados a
sua protena de transporte. Essa ltima forma a mais adequada, uma
vez que os mesmos circulam no plasma, em sua quase totalidade,
ligados s protenas transferrina e ceruloplasmina, respectivamente.
Transferrina
A transferrina uma betaglobulina sintetizada pelo fgado, responsvel pelo transporte de ferro no plasma. O Fe obtido da dieta
pode ser o Fe3+ (frrico) ou Fe2+ (ferroso). Para entrar na clula
duodenal necessrio que o Fe esteja na forma reduzida. No interior do eritrcito oxidado a Fe3+ e, em seguida, reduzido a Fe2+,
para circular no plasma inicialmente ligado ceruloplasmina, que
novamente o oxida, para que seja captado pela transferrina e da
transportado para o fgado, onde armazenado e distribudo para
as clulas66.
A transferrina pode ser medida diretamente em soro ou plasma
(coletado em heparina ou EDTA), fresco ou refrigerado (de 2 a 8
C) por at 7 dias ou congelado a -20 C, por at 3 meses. A anlise
feita por turbidimetria, utilizando-se kits comerciais, em
espectrofotmetro cuja leitura feita a 37 C em comprimento de
onda de 340 nm. A transferrina pode tambm ser medida indiretamente pelo clculo que utiliza a Capacidade Total de Ligao do
Ferro CTLF (ou TIBC Total Iron Binding Capacity), que
se refere quantidade total de ferro que a transferrina capaz de
ligar. A CTLF determinada medindo-se o excesso de ferro no
sobrenadante de uma quantidade conhecida de ferro adicionado ao
soro para saturar a transferrina, o qual separado aps precipitao da protena. De posse de tal valor, calcula-se a transferrina
srica (TS) a partir da frmula67
TS (mg/100 mL) = (0,8 x CTLF) 43
Ceruloplasmina
A ceruloplasmina ou ferroxidase I uma 2-glicoprotena que
transporta cerca de 90 a 95% do cobre total no plasma66. O Cu2+,
obtido da dieta, quelado pelo aminocido histidina e absorvido no

1334

Vasconcelos et al.

duodeno. transportado ao fgado ligado albumina e l incorporado na protena ceruloplasmina. O Cu2+ ligado ceruloplasmina ,
ento, distribudo para as clulas. Alm do transporte de Cu2+, a
ceruloplasmina oxida Fe2+ a Fe3+ para sua subseqente transferncia
para a transferrina, da a sinonmia de ferroxidase, e catalisa a Snitrosao de biomolculas tilicas66,68,69.
A determinao de ceruloplasmina humana baseia-se na reao entre essa enzima como antgeno e o anti-soro especfico obtido em kits disponveis no mercado. O princpio do mtodo a
reao antgeno (a enzima presente no soro) com o anticorpo contido no kit. A reao d lugar a um complexo insolvel, produzindo uma turbidez que pode ser lida espectrofotometricamente. Portanto, sua anlise feita por imunoturbidimetria, a 37 C, utilizando-se espectrofotmetro, em 340 nm. A ceruloplasmina pode ser
medida diretamente em soro fresco ou refrigerado entre 2 a 8 C
por at 2 dias ou congelado a -20 C por at 3 meses.
Os valores de referncia para os antioxidantes no enzimticos
citados esto ilustrados na Tabela 8.
Tabela 8. Valores de referncia para enzimas antioxidantes em
eritrcito humano
Enzimas antioxidantes

Quim. Nova

derivam da peroxidao lipdica. Eles so classificados em primrios (os hidroperxidos lipdicos) e secundrios, que derivam da ruptura dos hidroperxidos lipdicos.
Malondialdedo (MDA)
O malondialdedo um produto secundrio da peroxidao
lipdica, derivado da -ruptura de endociclizao de cidos graxos
polinsaturados com mais de duas duplas ligaes, tais como cido
linolico, araquidnico e docosaexanico18,70-72. Atualmente, o MDA
considerado um candidato potencial para ser escolhido como um
biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14.
O MDA foi o foco de ateno da peroxidao lipdica durante
muitos anos, pelo fato de poder ser medido livre, utilizando-se o
cido tiobarbitrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma um
cromgeno de cor rosa fluorescente, cuja absoro ocorre em de
532 nm e fluorescncia em 553 nm26 (Figura 6). Considerando-se
que o teste no especfico para MDA, pois outros aldedos participam da mesma reao, a tcnica utilizando HPLC com deteco
no UV, recentemente desenvolvida por Katepe61, em soro humano,
revela-se mais especfica. Na tcnica de Katepe, o soro acidificado
para liberar o MDA ligado ao grupo amino de protenas.

Valores de Referncia (U/g Hb)

Superxido Dismutase (SOD)


Catalase (CAT)
Glutationa Peroxidase (GPx)
Glutationa Redutase (GR)

6.500 14.500
16.500 26.500
30 44
5,4 8,8

Obs: Se for adotado protocolo de kit, considerar o valor referncia


do kit. p.ex., kit RANSOD, RANDOX para SOD, VR = 1102 -=
1601 U/g Hb. Fonte: Adaptado da ref. 49
Avaliao de dano oxidativo em componentes celulares
As macromolculas reagem com ERO e ERN com a produo
de diversos marcadores de dano oxidativo (Tabela 2), que podem
ser identificados em sangue humano, entre outros fluidos biolgicos. A presente reviso dar nfase anlise de marcadores da
peroxidao lipdica com ateno particular MDA, marcadores
de oxidao de protenas, especificamente os derivados contendo
grupos carbonila e se far um breve comentrio de marcadores de
espcies reativas de nitrognio.
Conforme mencionado13,14, h um esforo mundial para validao de biomarcadores de estresse oxidativo. No momento, no entanto, no h consenso sobre qual o mtodo mais til, mais confivel,
mais acurado, ou especfico para os diferentes tipos de dano
oxidativo. No h possibilidade de se fazer a comparao direta
entre os mtodos, usando amostras idnticas, da, a extrema dificuldade de obteno de valores de referncia absolutos para
marcadores especficos em sistemas vivos13,14. mister anotar que
o balano redox de uma dada populao normal sofre influncias genticas (caractersticas tnicas), ambientais (ex., poluio atmosfrica), nutricionais (consumo de carnes e vegetais) e culturais
(ex., hbitos de exerccio fsico intenso, alcoolismo, ou tabagismo), o que um complicador adicional. Enquanto os trabalhos de
sistematizao prosseguem, til conhecer os principais marcadores
e os mtodos mais utilizados para sua quantificao.
Marcadores de peroxidao lipdica
A importncia do dano oxidativo causado por ERO e ERN em
lipdios motivo de discusses na busca do melhor marcador em
fluidos biolgicos, uma vez que produtos numerosos e complexos

Figura 6. Reao utilizada para deteco de malondialdedo (MDA) em


plasma humano. Ao plasma adicionado cido tiobarbitrico (TBA), que
reage com MDA e forma um cromgeno que absorve a 532 nm

Hidroxinonenal (HNE)
O HNE o produto majoritrio da oxidao de cidos graxos
polinsaturados. Vrias tcnicas foram desenvolvidas para sua determinao em amostras biolgicas, em sua forma livre, pois a recuperao de HNE do plasma muito baixa e, como acontece com
todos os aldedos, h necessidade de sua derivatizao para anlise
em HPLC 18,26,70-72. A derivatizao com 2,4-dinitrofenilidrazina
(DNFH), seguida de cromatografia em camada delgada e HPLC,
com deteco por espectrofotometria no UV, consome um tempo
considervel. Neste sentido, foi proposto um mtodo utilizando-se
1,3-cicloexanodiona, que forma um derivado que pode ser detectado por fluorescncia73. A seletividade do mtodo pode ser aumentada por utilizao de tetraidrofurano ao invs de cinco outros
solventes, porm a recuperao de HNE muito baixa (cerca de
8%)74. Mais recentemente, a quantificao de HNE em plasma passou a ser realizada com pentafluorobenzil-hidroxilamina para formar o derivado pentafluorobenziloxima (Figura 7), que analisado por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas
com ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS) usando HNE
deuterado como padro interno26. Nesse mtodo, apesar de haver
um aumento significativo na recuperao de HNE do plasma (60 a
80% versus 8%), sua concentrao permanece, ainda, mais baixa
do que a de outros aldedos marcadores de peroxidao lipdica,
devido, provavelmente, ligao aos grupos sulfidrila ou amina de
protenas26.

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1335

de reao que forma os AGEs (Advanced Glycation End products),


denominada reao de Maillard 72,78.

Figura 7. Esquema reacional para a determinao de hidroxinonenal (HNE)

Isoprostano (8-epi-prostaglandina 2,8epi-PGF2)


Os isoprostanos pertencem famlia dos eicosanides, de origem no enzimtica e so produzidos pela oxidao do cido
araquidnico. Inicialmente, so formados nos fosfolipdios da
membrana celular e depois liberados para os fluidos biolgicos
pela fosfolipase26,72. Ao contrrio do que ocorre com os hidroperxidos lipdicos (produtos primrios da peroxidao lipdica - PL),
que se decompem rapidamente nos fluidos e tecidos humanos,
F2-isoprostanos so produtos secundrios da peroxidao lipdica
quimicamente estveis podendo, inclusive, ser dosados na urina.
Essa estabilidade a razo pela qual a sua quantificao desperta
interesse, com o aparecimento de muitos protocolos para sua anlise. Alm disso, so produtos especficos da PL, esto presentes
em quantidades detectveis em todos os fluidos biolgicos e tecidos, sua formao aumenta drasticamente em modelos animais de
dano oxidativo e modulada pelo estado antioxidante e seus nveis
no so afetados pelo contedo de lipdios da dieta75. Como MDA,
ele , tambm, considerado um candidato potencial para ser escolhido como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14.
O mtodo mais adequado para anlise de isoprostanos a
cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas com
ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS), contudo, devido aos
altos custos financeiro e operacional, os mtodos radiomtricos e
imunolgicos so mais utilizados26,71,72.
Marcadores de oxidao de protenas
Grupos carbonila em protenas
A modificao de protenas pode ser induzida por ERO, por
ctions metlicos (Fe2+, Cu+), por endobiticos (GSH), por HOCl e
HOBr, no processo da fagocitose, por irradiao, por perxidos
lipdicos, por oxidorredutases, por frmacos etc. (Tabela 2). Todos
os aminocidos so susceptveis oxidao, principalmente os aromticos, que so os alvos preferidos de ataque. Existem, portanto,
muitos mecanismos para oxidao de protenas e, ao mesmo tempo, muitas substncias passveis de tal modificao26,76. A oxidao direta de lisina, arginina, prolina e treonina fornece derivados
carbonlicos (Figura 8). Alm disso, grupos carbonila podem ser
introduzidos em protenas via reao com aldedos derivados da
peroxidao lipdica (MDA, HNE) ou gerados a partir da reao de
reduo de acar (p.ex., glicose) ou produtos de sua oxidao com
resduos de lisina (reaes de glicao e de glicoxidao formando
carboximetil-lisina) 69,76,77. Vale salientar que, segundo o Joint
Commission on Biochemical Nomenclature, o termo glicao difere de glicosilao. Esta ltima constitui o processo ps-traducional
catalisado enzimaticamente. A glicao um processo no
enzimtico a que esto sujeitas todas as protenas e consiste de 2
etapas: a glicose e o grupo amino de lisina reagem e formam frutoselisina (FL); FL sofre desidratao, rearranjo e ciclizao, seguida

Figura 8. Exemplos de processos de formao de grupos carbonila por


oxidao de aminocidos. Adaptado da ref. 18

O contedo carbonlico de protenas amplamente utilizado


como marcador de dano oxidativo em protenas, sob condies de
estresse oxidativo. necessrio, porm, identificar a natureza do
grupo carbonila, i.e, qual dos resduos de aminocido sofreu o dano.
A ligao de certos aldedos a protenas (ex. MDA e HNE) pode
gerar carbonilas por glicoxidao, de modo que a presena de grupo carbonila no , necessariamente, indicativa de oxidao de
aminocidos.
H diversas tcnicas para se medir a presena de grupo carbonila
em protenas, sendo imprescindvel uma preparao adequada da
amostra79. Por isso, tal anlise em plasma humano requer uma exaustiva seqncia de procedimentos para separar as protenas. O mtodo mais conveniente o espectrofotomtrico, baseado na reao
de DTNB com o grupo carbonila, que forma a hidrazona da protena, cuja leitura de absorbncia feita a 370 nm72,76,79,80. A unidade mais utilizada para carbonila nmol/g de protena, por isso
preciso quantificar a protena total da amostra utilizando-se o mtodo de Bradford81 ou outros.
A Tabela 9 mostra valores de referncia de alguns marcadores
de dano oxidativo em macromolculas analisados em sangue humano, embora haja muita controvrsia na literatura13,14.
Tabela 9. Valores de referncia para antioxidantes no enzimticos
em sangue humano
Antioxidantes
Glutationa GSH (plasma)
Glutationa GSH (eritrcito)
Coenzima Q CoQ (plasma)
cido rico ou Urato (soro)
Vit. E ou Tocoferol (plasma)
Vit. C ou Ascorbato (plasma)
-Caroteno (plasma)
Transferrina (soro)
Ceruloplasmina (soro)

Valores de referncia
1 3 M
1 3 M
0,4 1,0 M
0,2 0,4 mM
20 M
30 100 M
0,3 0,6 M
200 360 mg/dL
15 60 mg/dL

Fonte: Adaptada das refs. 18 e 98 e kit analtico Spinreact.


Marcadores de espcies reativas de nitrognio (ERN)
O xido ntrico (NO) rapidamente metabolizado a produtos
estveis, ou seja, nitrito e nitrato, na maioria dos fluidos do corpo,
inclusive no plasma. Quando em presena de O2 forma ONOO,

1336

Vasconcelos et al.

que promove diferentes efeitos biolgicos a partir de trs reaes:


reao redox direta 82, reao com CO 2 formando CO 382, 83,84 e
homlise de cido peroxinitroso82 (Tabela 1).
O mtodo de determinao mais comumente utilizado baseiase na reao de diazotao (mtodo de Griess), especfico para
nitrito e que no detecta nitrato. O tratamento da amostra com agentes redutores ou enzimas gera o total de produtos em termos de
nitrito e nitrato, com deteco espectrofotomtrica26. Outros mtodos foram desenvolvidos, incluindo-se HPLC, eletroforese capilar
e cromatografia de troca inica com deteco no ultravioleta, desde que em soro ou plasma frescos.
Existem diversas limitaes para a determinao de nitrato e
nitrito em sangue, destacando-se: sua meia vida no plasma de
cerca de 1 h e 30 min sendo, a seguir, excretados pela urina; seus
valores plasmticos so dependentes da integridade renal. Assim,
o real valor de sua determinao precisa ainda ser estabelecido26. A
combinao de NO com outras ERO gera reagentes (Tabela 1) que
promovem a nitrao das biomolculas, incluindo resduos de
tirosina e tocoferol localizados nas membranas. A 3-nitrotirosina
(3-NO2-Tyr) e o 5--nitrotocoferol constituem os biomarcadores
de oxidao NO-dependentes de tecidos biolgicos. Para ambos,
HPLC com deteco eletroqumica a tcnica de escolha, pela
sensibilidade e seletividade, pois necessrio separ-los de outros
produtos de oxidao: 3,4-DOPA, 3-clorotirosina, 3,3-ditirosina,
m-tirosina e o-tirosina, no caso de 3-NO2-Tyr e de outras formas de
tocoferol (, , ) no caso de 5--nitrotocoferol26,85.
Outros marcadores de dano em macromolculas
Em sangue, o dano ao DNA detectado atravs do teste do
cometa em leuccitos, (comet assay)86-89. Idealmente, a avaliao do dano em DNA deve reunir os marcadores excretados na
urina, 8-hidroxi-desoxinucleotdeos (8-OH-dG) e suas bases livres
(8-hidroxiguanina) e os marcadores medidos em sangue26,71,72.
Associao de marcadores de balano redox a doenas
A Tabela 3 ilustra exemplos de doenas cujo mecanismo
fisiopatolgico tem a participao do estresse oxidativo, a Tabela 4
lista os marcadores de dano oxidativo associado com algumas doenas humanas e a Tabela 5 apresenta exemplos de biomarcadores utilizados para o diagnstico e/ou monitoramento de doenas7-10,12,90. A
determinao de antioxidantes e marcadores de dano oxidativo com
aplicao clnica para diagnstico, com excees, como o caso da
ceruloplasmina na doena de Wilson, permanece em nvel de pesquisa, uma vez no foi possvel ainda sequer determinar se o fenmeno oxidativo observado causa ou conseqncia da doena.
Muitos estudos permitiram verificar o fenmeno do estresse
oxidativo em doenas. Em pacientes com hemocromatose, diminuio dos nveis de -tocoferol, ascorbato e retinol foram encontrados e positivamente correlacionados com o aumento de TBARS
(substncias reativas do cido tiobarbitrico) no plasma91. Em pacientes com doena de Alzheimer, foram encontrados nveis eleva-

Quim. Nova

dos de GPx, CAT e SOD e positivamente correlacionados com o


aumento de TBARS no tecido cerebral92. Diabticos no dependentes de insulina (tipo II) apresentaram queda significativa nos
nveis de SOD, CAT, GSH, ascorbato e -tocoferol no plasma e
eritrcitos, nos 2 primeiros anos de diagnstico, o que foi positivamente correlacionado com a durao da doena e com o desenvolvimento de complicaes93. Estudos recentes com hipertensos
revelaram nveis mais baixos de SOD, CAT e GPx em eritrcitos94-97
e nveis elevados de MDA92. Esses so alguns dos muitos exemplos
de estudos de estresse oxidativo em doenas j instaladas, utilizando marcadores obtidos em fluidos biolgicos, principalmente em
sangue humano.
CONSIDERAES FINAIS
Como visto, muitos processos celulares so governados pelo
balano redox. As substncias envolvidas no binmio antioxidante
pr-oxidante e que configuram o ambiente redox biolgico podem ser quantificadas associando s tcnicas bioqumicas tradicionais, tcnicas cromatogrficas, espectrofotomtricas e eletroanalticas, selecionadas pela observao de critrios de sensibilidade,
especificidade, acuracidade, facilidade de manipulao, rapidez,
robustez, objetivo, tipo de amostra, preo, repetibilidade, eficincia, entre outros. A determinao dessas substncias revela-se de
grande importncia, com perspectivas de aplicao clnica para
diagnstico de doenas e do estado geral de sade do indivduo.
Alm disso, o entendimento dos mecanismos utilizados pelas clulas para a manuteno do balano redox do meio fundamental
na identificao de biomarcadores representativos para a avaliao
do nvel de estresse oxidativo de diferentes indivduos. H interesse dos especialistas em cincias da sade, em cincias qumica e
bioqumica, em nutrio, e, principalmente, do pblico em geral.
H muita complexidade nas diversas reas envolvidas, muita
informao e discusso. O nmero de artigos publicados quadruplicou na ltima dcada26. O presente trabalho procurou citar os
mtodos de determinao analtica mais conhecidos e utilizados,
aplicados em sangue/ou plasma/ou soro humano. A natureza nica
do plasma humano, enquanto fonte no s de protenas clssicas j
utilizadas no diagnstico de doenas (em concentraes de mg/
mL), mas em nvel de protemica (pg/mL at ng/mL), torna esse
biofluido um desafiante meio de investigao e aponta para o desenvolvimento de tcnicas capazes de identificar biomarcadores
mais especficos16, inclusive do ambiente redox. Apesar de reconhecido que os testes de diagnstico in vitro contribuem em 94%
com os registros de dados clnicos e influenciam em 60 a 70% das
decises clnicas97, o seu uso em nvel de protemica no est estabelecido e encontra-se em franco desenvolvimento.
H enormes desafios que impedem ou pelo menos dificultam a
sua aplicao para descobrir biomarcadores de maior sensibilidade e especificidade, entre outras caractersticas importantes11 para
o fenmeno que est sendo investigado e, conseqentemente, a utilizao destes dados para inferir estado redox de indivduos e para
auxiliar em terapia antioxidante. No h consenso. No momento, a

Tabela 10. Valores de referncia para alguns marcadores de dano oxidativo em macromolculas analisados em soro e plasma humanos
Marcador de dano oxidativo

Valores de referncia

Mtodo analtico

Malondialdedo MDA (plasma)

1 3 M

Isoprostano
Carbonila em protenas

35 6 pg/mL
0,4 1,0 nmol/g ptna

Separao por HPLC de MDA de adutos TBA ou deteco


fluorimtrica de TBARS
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
Espectrofotometria (Figura 8)

Fonte: Adaptada das refs. 18, 76 e 99

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

despeito do forte interesse, desenvolvimento e plausibilidade biolgica, a hiptese de ligao direta entre estresse oxidativo e doenas ainda de difcil comprovao, uma vez que h inmeros fatores limitantes, tais como procedimentos de coleta e armazenamento;
a tcnica analtica em si, em muitos casos, de elevado custo e de
difcil operacionalizao, a falta de uniformidade nas unidades em
que se exprimem os resultados, bem como os valores de referncia; a quantidade de fatores interferentes e, principalmente, questes ligadas variabilidade gentica. Apesar da existncia de vrios biomarcadores de balano redox em sangue (Tabela 6) e da
listagem dos valores considerados normais ou de referncia18,49,76,98,99
(Tabelas 7 a 10), til salientar que no existem ainda valores de
referncia universalmente aceitos/adotados, uma vez que os prprios mtodos de anlise e quantificao, alm de envolverem diferentes tcnicas, esto em processo de desenvolvimento e aperfeioamento. A validao dos mtodos encontra-se em curso13,14, com
utilizao do modelo murino, tratado com injeo intra-peritoneal
de CCl413,14. O desenvolvimento de outros modelos faz-se ainda
necessrio para comparao.
Nessa perspectiva, pesquisas aliando esses marcadores e novos
desenvolvimentos de ferramentas e mtodos analticos que possibilitem uma avaliao de forma menos invasiva, sensvel, rpida e
simples, com janelas de deteco cada vez menores, vm assumindo um papel relevante no avano da investigao. Estaremos, provavelmente, em condies de relacionar o ambiente redox avaliado em indivduos com diferentes aspectos demogrficos, clnicos e
nutricionais, de entender os mecanismos do estresse oxidativo, bem
como de prevenir ou minimizar os efeitos das doenas oriundas
dos mesmos, realizando diagnsticos antecipados.
AGRADECIMENTOS
Aos rgos financiadores PADCT/CNPq/CTINFRA, MCT, MS,
Fundao de Amparo Pesquisa de Alagoas (FAPEAL), Banco do
Nordeste do Brasil (BNB), PPSUS/CNPq/SESAU/FAPEAL, CAPES/COFECUB, Instituto do Milnio-INOFAR e RENORBIO/
CNPq. Ao Prof. N. A. Soares, pela reviso da linguagem, ao Prof.
E. J. H. Bechara pela cuidadosa reviso e constantes discusses na
rea e aos revisores do presente artigo pelos valiosos comentrios.
LISTA DE ABREVIAES
AAPH:
ABAP:
ABTS:
AGEs:
AIDS:
AMVN:
AO:
ATBC:
AUC:
CAT:
CAOT:
CARET:
CCl4:
(CHOH)n:
DAC:
8-OH-dG:
DNFH:
DPOC:

2,2-Azobis(2-metilpropanoamidina)
Dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina)
2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal
de diamnio
Advanced Glycation End products. Produtos finais
de glicao avanada.
Sndrome de deficincia imunolgica adquirida
2,2-Azobis-2,4-pentanonitrila
Antioxidante
Alpha-Tocopherol and Beta- Carotene Lung Cancer
Prevention Study
Area-under-curve. rea sob a curva
Catalase
Capacidade Antioxidante Total
Carotene and Retinol Efficacy Trial
Tetracloreto de carbono
Hidrocarboneto
Doena Arterial Coronariana
8-hidroxi-desoxiguanosina
Dinitrofenilidrazina
Doena pulmonar obstrutiva crnica

1337

DTNB:
EDTA:
ER:
ERO:
ERN:
ESR:

5,5-Ditiobis (2-nitro-5-cido tiobenzico)


cido etilenediaminotetra-actico
Espcies Reativas
Espcies Reativas de Oxignio
Espcies Reativas de Nitrognio
Electron Spin Resonance. Ressonncia de spin
de eltron
Fe3+-TPTZ:
Ferritripiridiltriazina
Fe2+-TPTZ:
Ferrosotripiridiltriazina
FL:
Frutose-lisina
FRAP:
Ferric-Reducing Ability of Plasma Habilidade
plasmtica de reduzir o sal frrico
GC/NICI-MS: Gas chomatography/negative ion chemical
ionization mass spectrometry: cromatografia
gasosa acoplada espectrometria de massas com
ionizao qumica negativa
GPx:
Glutationa Peroxidase
GR:
Glutationa Redutase
GSH:
Glutationa reduzida
GSSG:
Glutationa oxidada
GT:
Glutationa Transferase
Hb:
Hemoglobina
HIV+:
Pacientes soropositivos em relao ao HIV (Human
Immunodeficiency Virus)
HNE:
Hidroxinonenal
H 2O 2 :
Perxido de hidrognio
HPLC:
High Performance Liquid Chromatography Cromatografia lquida de alta eficincia
INT:
2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol
LH:
cido graxo poli-insaturado
MDA:
Malondialdedo
NEM:
N-Etilmaleimidina
ORAC:
Oxygen Radical Absorbancy Capacity Capacidade
de absorbncia do radical oxignio
PE:
Phycoerythrin- Ficoeritrina
PhGPx:
Fosfoidrolipdio glutationa peroxidase
Ptna:
Protena
R:
Radical
RONS:
Reactive oxygen and nitrogen species- Espcies
reativas de oxignio e nitrognio
SOD:
Superxido dismutase
TBA:
cido tiobarbitrico
TBARS:
Thiobarbituric Reactive Substances - Substncias
Reativas do cido Tiobarbitrico.
t- BOOH:
terc-Butil-hidroperxido
TCNQ:
Tetracianoquinodimetano
TEAC:
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Capacidade antioxidante equivalente ao trolox
TS:
Transferrina srica
TRAP:
Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter.
Parmetro antioxidante relacionado captura total
de radicais
TROLOX:
cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2carboxlico
TTF:
Tetratiofulvaleno
XD:
Xantina desidrogenase
XO:
Xantina oxidase
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