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GOINIA
2011
ii
Nvel: Mestrado
rea de concentrao:
Produo animal
Linha de pesquisa:
Metabolismo nutricional, alimentao e
forragicultura na produo animal
Orientador:
Prof. Dr. Jos Henrique Stringhini EVZ/UFG
Comit de orientao:
Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceio FF/UFG
Prof. Dra. Elisabeth Gonzales EVZ/UFG
GOINIA
2011
iii
SUMRIO
INTRODUO ................................................................................................. 1
2.1.2
2.2.2
2.2.3
REFERNCIAS .................................................................................................... 20
INTRODUO
algumas
tcnicas
desenvolvidas
que
esto
2
2
REVISO DA LITERATURA
2.1
3
FURLAN (2008) afirmou que o mecanismo de secreo de enzimas
e transportadores de membrana depende de estmulos para ativar a transcrio
de genes, os quais pelo processo de traduo sintetizam as enzimas
envolvidas na digesto e absoro de nutrientes.
As concentraes de DNA, RNA e suas relaes com o contedo de
protena passam por uma variao natural durante o desenvolvimento do trato
gastrointestinal especficos para cada espcie.
De acordo com MAIORKA et al., (2002) o mtodo mais comumente
utilizado para essa avaliao a incorporao de
radioativo)
ao
DNA
quantificados
atravs
de
H-timidina (istopo
auto-radiografias
ou
4
O elemento que se deseja estudar radiomarcado (etapa de
incorporao) e injetado no animal. Fragmentos do tecido em estudo so
colhidos em vrios intervalos de tempo. A lmina de vidro recoberta com uma
fina camada de emulso radiogrfica. Posteriormente, a lmina colocada em
uma caixa escura por alguns dias ou semanas, durante os quais partculas
emitidas pelo istopo radioativo atingem a emulso nos locais da clula em que
o istopo est localizado. A emulso revelada e fixada por tcnicas
fotogrficas e pequenos gros de prata fixam-se nas pores expostas da
emulso. O espcime ento lacrado com uma lamnula e observado em
microscpio ptico (GARTNER & HIATT, 2003). Provavelmente, o menor uso
dessa tcnica, atualmente, devido descoberta de novas tcnicas com maior
rapidez e facilidade de execuo, e que no necessitem de instalao
especfica para uso de material radioativo.
Os mtodos que utilizam o espectrofotmetro para quantificao de
DNA e RNA so os mais utilizados. BAGALDO et al. (2006) realizaram
experimento para comparar o desenvolvimento dos segmentos jejuno e leo do
intestino delgado de bezerros com o uso de indicadores de atividade celular
(DNA, RNA e protena) e pela expresso do gene do IGF-I (insuline like growth
factor) e de seu receptor. Para extrao do DNA um grama de tecido foi
homogeneizado em 19 mL de gua deionizada, e aps seguiu-se a
metodologia
de
LABARCA
&
PAIGEN
(1980)
que
utilizaram
jejuno
leo,
apresentam
diferenas
temporais
no
seu
desenvolvimento.
BAGALDO et al. (2007) determinaram o DNA total do jejuno, leo e
fgado de bezerros para verificar a ao do IGF-I presente no colostro de vacas
tratadas com o hormnio somatrotopina recombinante bovina (rbST). A
determinao do DNA e RNA foi realizada pelas mesmas metodologias j
citadas. Atravs das respostas dos indicadores de atividade celular intestinal e
heptica, os autores sugeriram a importante participao do IGF- I na
maturao celular e no comportamento da primeira gerao de entercitos.
5
Outra tcnica, utilizada para identificao do material gentico
celular, a reao em cadeia da polimerase (PCR). A tcnica bsica foi sendo
modificada para diferentes finalidades, fazendo com que hoje existam diversos
tipos de protocolos. O PCR em tempo real, por exemplo, pode quantificar a
expresso gnica. Em humanos, bastante utilizada na pesquisa de doenas e
cncer de intestino (DYDENSBORG et al., 2006). HOUGHTON & COCKERILL
(2006) publicaram uma reviso sobre a tcnica relatando tambm vrias
aplicaes da mesma, inclusive a possvel aplicao para avaliao intestinal.
LEHMANN & KREIPE (2001) fizeram algumas consideraes sobre
a tcnica de PCR em tempo real para a quantificao de DNA e RNA em
tecidos j fixados com formalina e embebidos em parafina, o que bem til
quando se faz anlises conjuntas de um mesmo material por diferentes
tcnicas.
A avaliao do intestino atravs de cortes histolgicos e mensurao
de parmetros morfomtricos , sem dvida, a tcnica mais utilizada nos
trabalhos feitos para avaliao intestinal, principalmente na cincia animal.
uma tcnica simples, barata e que oferece bons resultados para avaliao.
O desenvolvimento da mucosa intestinal avaliado por meio de
dados morfomtricos do tamanho e nmero de vilos, da profundidade das
criptas, da altura do epitlio, da altura e nmero de microvilos do entercito e
da integridade da mucosa ou perda de epitlio (STERZO, 2007).
Quando o intestino responde a algum agente com desequilbrio da
relao de extruso e proliferao, ocorre modificao na altura dos vilos. O
nmero e o tamanho dos vilos dependem do nmero de clulas que o
compem. Assim, quanto maior o nmero de clulas, maior o tamanho do vilo,
e por conseqncia, maior a rea de absoro de nutrientes. No geral, a
maior altura de vilos e relao vilo/cripta esto associadas com uma boa
diferenciao da mucosa intestinal (JEURISSEN et al., 2002). Criptas menos
profundas indicam melhor estado de sade intestinal (VIOLA & VIEIRA, 2007).
SCHEEMAN et al. (1982) sugeriram que vilos curtos (relativo a profundidade de
cripta) tem menos clulas absortivas e mais clulas secretrias.
Outro fator relevante para a absoro dos nutrientes na membrana
luminal a quantidade de microvilos existentes nos entercitos. Os microvilos
so modificaes do plasmalema apical das clulas epiteliais que recobrem as
6
vilosidades intestinais (GARTNER & HIATI, 2003). O nmero de microvilos atua
como um amplificador de rea para a absoro dos nutrientes (MAIORKA et
al., 2002).
As metodologias utilizadas para confeco das lminas histolgicas
para visualizao em microscpio ptico j so consolidadas e variam entre si
de acordo com protocolos dos laboratrios nos quais feito o processamento
do material. Fragmentos do duodeno, jejuno e leo so coletados e
imediatamente lavados com soluo fisiolgica e fixados, na maioria dos
protocolos, em soluo de Bouin por 24 horas. Passam pelas etapas de
desidratao em lcool, diafanizao ou clareamento por xilol e incluso em
parafina. So feitos cortes com micrtomo que, posteriormente, so corados.
Quanto colorao, SILVA et al. (2010) em anlise dos efeitos da
infeco causada pelo Toxoplasma gondii sobre a parede do duodeno de
gatos, utilizaram em seu experimento diferentes corantes, sendo o Azan para
evidenciao de fibras colgenas, o Tricrmico-Mallory para deteco das
clulas de Paneth. J o cido Peridico de Schiff (PAS) indicado para
deteco de mucinas neutras e sialomucinas lbeis. O Alcian- Blue (AB) pH 2,5
para deteco de sialomucinas e sulfomucinas e Alcian-Blue (AB) pH 1,0 para
deteco das sulfomucinas. Um dos resultados encontrados por SILVA et al.
(2010), foi que na avaliao qualitativa, as fibras colgenas ocupavam uma
rea dos estratos da parede intestinal visivelmente maior, o que sugere que
estejam aumentadas no grupos infectados (Figura 2).
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A colorao para a anlise morfomtrica feita com os corantes
hematoxilina e eosina (HE) que so de utilizao rotineira na avaliao
histolgica de tecidos. Pode-se, tambm, quantificar linfcitos intraepiteliais.
A hematoxilina cora preferencialmente os componentes cidos da
clula com tonalidade azulada. Como o DNA e o RNA, o ncleo e as regies do
citoplasma ricas em ribossomos coram-se em azul-escuro, estes componentes
so ditos basfilos. A eosina um cido que cora os componentes bsicos da
clula com uma cor rsea. Como muitos dos componentes citoplasmticos tm
pH bsico, vrias regies do citoplasma se coram em rosa, estes elementos
so ditos como acidfilos (GARTNER & HIATT, 2003).
A avaliao feita a partir de imagens dos cortes corados com HE,
capturadas com o auxlio de uma cmera digital acoplada a um microscpio de
luz. So efetuadas medidas, em micrmetros, de vilosidades e profundidade de
cripta. As medidas de altura das vilosidades so tomadas a partir da regio
basal. A medida de profundidade das criptas realizada da base at a regio
de transio cripta-vilo.
FASINA et al. (2010) estudaram a influncia da infeco por
Salmonella enterica Sorovar Typhimurium nas clulas caliciformes e na
morfologia de vilos intestinais de frangos de corte. Determinaram a densidade e
o tamanho das clulas caliciformes, alm dos tradicionais parmetros
morfomtricos. A densidade foi definida pelo nmero de clulas PAS ou Alcian
blue (ALB) positivas por mm2 de superfcie quadrada do vilo (Figura 3).
A segunda barreira de proteo da integridade do epitlio intestinal
o muco. O muco produzido por clulas caliciformes, glndulas unicelulares,
que se encontram entre as clulas epiteliais. O duodeno tem o menor nmero
de clulas caliciformes e seu nmero aumenta ao se aproximar do jejuno.
Essas clulas produzem mucingeno, cuja forma hidratada constitui a mucina,
um componente do muco (GARTNER & HIATT, 2003).
composto por glicosaminoglicanas que protegem o vilo, ou at
mesmo participam do processo absortivo atravs das protenas ligadoras de
clcio (MACARI et al. 1994). O aumento da proliferao celular na cripta pode
alterar o nmero de clulas caliciformes e podem mudar a composio da
mucina e propriedades fsico-qumicas do muco.
8
A determinao do nmero de clulas caliciformes uma tcnica
estabelecida usando segmentos intestinais corados com Alcian blue e cido
peridico Schiff (PAS). Embora a alta densidade de clulas caliciformes pode
resultar em um aumento da secreo de mucina, o nmero de clulas
caliciformes no pode ser usado para quantificar a secreo de mucina, que
necessita de anlise especfica.
9
Portanto, avaliao qualitativa e quantitativa da perda do epitlio
muito importante, tendo em conta que permitem uma avaliao confivel da
capacidade digestiva e absortiva do intestino, alm da avaliao dos danos
causados mucosa intestinal por agentes patognicos ou jejum.
Para avaliao qualitativa da mucosa intestinal, tem-se usado a
tcnica de microscopia eletrnica de varredura. Usada para observar a
superfcie de um espcime slido, obtendo uma imagem tridimensional do
objeto. O material a ser observado preparado de um modo especial que torna
possvel o depsito de uma delgada camada de metal pesado (ouro, paldio,
smio, etc.) sobre a superfcie do espcime.
O microscpio emite um feixe de eltrons que varre a superfcie do
objeto. Alguns eltrons so refletidos diretamente, mas outros so emitidos
pela cobertura de metal pesado. Ambos so capturados por detectores de
eltrons e essas diferenas so interpretadas e mostradas em um monitor
como uma imagem tridimensional. Pode ser acoplado a um computador para
armazenar as imagens obtidas (GARTNER & HIATT, 2003).
GOMIDE JUNIOR et al. (2004) realizaram, com microscopia
eletrnica, estudo sobre a estrutura do duodeno, jejuno e leo de frangos de
corte que passaram por perodo de restrio hdrica e alimentar. Com as
imagens obtidas, fizeram classificao por escore das leses atravs das
imagens obtidas. Assim, o nmero de vilosidades com perda de epitlio foi
expressa como porcentagem do nmero total de vilosidades, considerando
cada grau de perda do epitlio. Desta forma puderam no s qualificar quanto
quantificar as leses (Figura 4).
10
11
maioria dos hormnios clssicos que so armazenados em grnulos secretores
(BAGALDO et al., 2006). A sntese do IGF-I difusa, porm o fgado a maior
fonte do peptdeo circulante (MURPHY et al., 1987).
Em aves, o receptor do IGF expresso na maioria dos tecidos. No
intestino, expresso na regio da submucosa e clulas da cripta. A quantidade
de receptor de IGF diminui com o avanar da idade (JEURISSEN et al., 2002).
Os nveis sricos de IGF podem ser detectados em radioimuno
ensaios (RIE). KINDLEIN et al. (2008) realizou ensaio imunoradiomtrico
utilizando kit comercial para quantificao da concentrao de IGF-I no
colostro.
O radioimunoensaio uma reao de ligao competitiva, na qual
uma quantidade fixa de antgeno radio-marcado e antgeno da amostra
competem por um nmero limitado de stios de ligao de anticorpos
especficos. Ambos os antgenos, marcado e no marcado, ligam-se ao
anticorpo e formam complexos precipitveis. Os antgenos marcados livres e
os ligados ao anticorpo so separados por centrifugao, decantao, etc. para
mensurar a radioatividade dos radioistopos ligados. A concentrao de
antgeno nas amostras testadas inversamente proporcional quantidade de
radioatividade na frao ligada (STEINBECK & WYNER, 1993).
O RIE possui alta sensibilidade para detectar antgenos em
concentraes picomolares ou inferiores. prtico, pois na maioria dos kits de
RIE os tubos j possuem forrao com o anticorpo especfico, diminuindo
assim a quantidade de pipetagens a serem realizadas e facilitando o processo
de separao (STEINBECK & WYNER, 1993).
As desvantagens deste mtodo so que a utilizao do radioistopo
de iodo,
125
12
Vrios sistemas esto disponveis comercialmente com a finalidade
de dosar hormnios, drogas e outras substncias presentes em baixos nveis
em fluidos orgnicos. Esses mtodos utilizam um anticorpo ligado a um
marcador quimioluminescente ou luminescente (luciferina, luciferase, luminol e
outros).
energia
excedente
dissipada
na
forma
de
radiao
REGHELIN
(2007),
as
principais
vantagens
da
de
ambiente
refrigerado,
pois
os
reagentes
atuam
2.2
AVALIAO DA FUNCIONALIDADE
13
gastrointestinal e maior taxa de renovao celular, quando o organismo faz
modificaes adaptativas s raes com altos nveis de PNAs. O aumento da
viscosidade do bolo alimentar dificulta o acesso das enzimas aos substratos e
dos alimentos digeridos borda do intestino (BEDFORD, 1996).
JEURISSEN et al. (2002) afirmaram que o aumento da viscosidade
intraluminal pode limitar a mistura de nutrientes da dieta com enzimas
pancreticas e cidos biliares. Alm disso, tambm aumenta a espessura da
camada aquosa estacionria que recobre as clulas da mucosa. As duas aes
limitam, respectivamente, a digesto e absoro de nutrientes.
Os mesmos autores ainda acrescentam que o crescimento de
determinados microorganismos pode ser favorecido, j que a reduo da
mistura diminui a oxigenao do contedo intestinal. H aumento na velocidade
de passagem, com dietas contendo PNA insolvel,que tambm pode interferir
no equilbrio da microbiota intestinal.
A medida da viscosidade da dieta feita por uma tcnica
estabelecida por BEDFORD & CLASSEN (1993) em que h coleta e
centrifugao do contedo do intestino delgado, com a viscosidade do
sobrenadante sendo determinada por um viscosmetro. A limitao dessa
tcnica a quantidade de digesta. Aps a centrifugao deve haver quantidade
suficiente de sobrenadante para avaliar a viscosidade.
O pH intestinal aumenta da extremidade oral para aboral e o pH de
cada segmento regulado pela atividade secretria do prprio segmento. A
produo bacteriana de metablitos cidos diminui o pH no papo, ceco e clon.
Essa alterao do pH ao longo do trato gastrointestinal necessria para que
atividade enzimtica seja tima para os grupos enzimticos presentes em cada
segmento.
Modificao no pH da dieta pode, alm de interferir na atuao
enzimtica, alterar tambm a absoro, j que alguns mecanismos de
absoro ativa dependem de potenciais inicos. A absoro de minerais, assim
como o tamanho dos complexos minerais tambm podem ser alterados
(JEURISSEN et al., 2002).
A determinao do pH simples, e pode ser feita na mesma frao
aquosa na qual a viscosidade medida.
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CALAA (2009) ao pesquisar cidos orgnicos para controle de
Salmonella enteritidis, mensurou o pH intestinal utilizando a metodologia
descrita por SILVA et al. (2000), em que os contedos do intestino e cecos
foram colhidos, diludos 15 mL em gua destilada, homogeneizados por 30
minutos, deixado em descanso por 5 minutos e determinado o pH.
A determinao do pH utiliza o peagmetro digital. O principio de
funcionamento desse equipamento a quantificao de ons H + devido
diferena de potencial entre a substncia na qual o pH est sendo medido e
soluo padro presente dentro do eletrodo.
atravs
da
administrao
oral
de
acares
que
no
so
15
rea das junes celulares (tight junctions). A freqncia desses poros
paracelulares bem menor e muito dependente da integridade da mucosa.
O mtodo mais aceito para verificao da integridade da barreira
intestinal o teste de manitol (monossacardeo) e lactulose (dissacardeo) que
so transportados por caminhos transcelular e paracelular, respectivamente.
Atravs
da
razo
lactulose/manitol
(L/M)
infere-se
as
condies
da
16
possuem mesmo nmero de prtons, mas diferente nmero de nutrons.
Caractersticas que fazem com que tenham propriedades fsicas distintas, mas
as mesmas propriedades qumicas. So ditos estveis por no emitirem
radiao. Para mensurao das diferenas de proporo entre istopos nos
tecidos, aps preparao do material, utiliza-se espectrmetro de massa
(BORDINHON, 2008).
CALDARA et al., 2010 afirmaram que dietas isotopicamente distintas
podem ser usadas para medir taxas de turnover nos tecidos do animal. Aps a
troca de dieta, a mudana na composio isotpica do tecido depende de quo
rpido esses constituintes so assimilados.
Tecidos com rpido metabolismo refletem dietas recentes, enquanto
aqueles com baixo turnover metablico representam dietas consumidas h
mais tempo. Esses autores avaliaram a influncia da glutamina sobre o
turnover do carbono da mucosa intestinal de leites desmamados.
PELCIA et al. (2011) utilizando tambm istopos estveis de
carbono, avaliaram o efeito da dieta suplementada com nucleotdeos sobre
taxa de turnover da mucosa intestinal de frangos antes e aps leses causadas
por coccidiose.
17
Tcnicas colorimtricas so formas especficas para medir as
glicoprotenas que so presentes em uma amostra a partir de superfcies
epiteliais. Alm disso, so uma forma muito barata para determinar a
quantidade e composio do muco.
SHIRAISHI et al. (2009) estudaram a dinmica de mucinas
secretadas no leo de frangos infectados por Toxoplasma gondii. Utilizaram o
protocolo descrito por MYERS et al. (2008), no qual foi quantificado o nmero
de clulas caliciformes presentes em 0,3 mm 2 de tnica mucosa de cada
animal. Essa anlise foi realizada com lminas submetidas s tcnicas
histoqumicas para deteco de glicoconjugados (PAS, AB pH 2,5 e AB pH
1,0).
A composio de mucinas em condies patolgicas expressa
pela alterao na relao entre mucinas neutras, sulfatadas e sialomucinas. No
estudo de
Immunoabsorbent
Assay)
para
isolamento,
caracterizao
18
do comprimento do vilo e, portanto, o perfil de mucina particular pode ser
indicativo de uma morfologia intestinal alterada.
Outra avaliao que pode ser feita a da atividade das enzimas da
borda em escova. Na superfcie dos microvilos so encontradas enzimas de
membrana (dissacaridases, oligapeptidases, etc.) que tm papel importante na
digesto de nutrientes (MACARI et al., 1994). So dissacaridases, fosfatase
alcalina, g-glutamiltransferase, aminopeptidases, sacarase-isomaltase (BOLELI
et al., 2002), que degradam oligmeros e oligopeptdeos em componentes
absorvveis.
SAKAMOTO (2009) utilizou a metodologia descrita por DAHLQVIST
(1964) com espectrofotmetro para avaliao de atividade enzimtica em
frangos de corte suplementados com glutamina e nucleotdeos. A unidade de
atividade especifica das enzimas foi definida como a quantidade de enzima que
hidrolisa 1 mol de substrato por mg de protena por minuto.
19
3
CONSIDERAES FINAIS
tcnicas
disponveis
para
avaliao
da
integridade
20
REFERNCIAS
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