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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

ESCOLA DE VETERINRIA E ZOOTECNIA


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINRIOS APLICADOS

TCNICAS PARA AVALIAO DA INTEGRIDADE E


FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CINCIA
ANIMAL

Fernanda Vieira Castejon


Orientador: Prof. Dr. Jos Henrique Stringhini

GOINIA
2011

ii

FERNANDA VIEIRA CASTEJON

TCNICAS PARA AVALIAO DA INTEGRIDADE E


FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CINCIA
ANIMAL

Seminrio apresentado junto disciplina


Seminrios Aplicados do Programa de Psgraduao em Cincia Animal da Escola de
Medicina Veterinria e Zootecnia da
Universidade Federal de Gois

Nvel: Mestrado

rea de concentrao:
Produo animal

Linha de pesquisa:
Metabolismo nutricional, alimentao e
forragicultura na produo animal

Orientador:
Prof. Dr. Jos Henrique Stringhini EVZ/UFG
Comit de orientao:
Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceio FF/UFG
Prof. Dra. Elisabeth Gonzales EVZ/UFG

GOINIA
2011

iii
SUMRIO

INTRODUO ................................................................................................. 1

REVISO DA LITERATURA ............................................................................ 2

2.1 AVALIAO DA INTEGRIDADE INTESTINAL ............................................... 2


2.1.1

Avaliao da diferenciao e desenvolvimento ........................................... 2

2.1.2

Avaliao dos fatores endgenos que regulam o desenvolvimento e

crescimento intestinal ............................................................................................. 9


2.2 AVALIAO DA FUNCIONALIDADE ............................................................ 12
2.2.1

Avaliao dos parmetros fsico-qumicos ................................................ 12

2.2.2

Avaliao da permeabilidade intestinal ..................................................... 14

2.2.3

Avaliao das protenas da parede intestinal ............................................ 16

CONSIDERAES FINAIS ........................................................................... 19

REFERNCIAS .................................................................................................... 20

INTRODUO

Pesquisadores da cincia animal tm um objetivo comum, que o


de manter a integridade fsica, funcional e comportamental dos animais. Isso
obtido por meio de um conjunto de aes e fatores interdependentes que vo
desde o perodo anterior ao nascimento (melhoramento gentico e qualidade
das matrizes) nutrio e ambincia adequadas.
Na produo animal, para que se obtenha os melhores resultados
zootcnicos (menor mortalidade, melhor converso alimentar e menor tempo
de criao at o abate), o perfeito funcionamento intestinal necessrio. A
integridade fsica e funcional da parede intestinal dos animais um dos
principais fatores a serem considerado na produo, pois se deve associar
essa integridade intestinal a correta digesto dos alimentos e absoro dos
nutrientes.
Alm das funes de digesto e absoro, outra funo no menos
importante do epitlio intestinal, a de proteo. O epitlio intestinal possui a
capacidade de impedir que substncias indesejveis como microorganismos e
toxinas presentes no lmen intestinal atravessem a mucosa e atinjam tecidos e
rgos.
A integridade da mucosa intestinal mantida por dois fatores
principais. O primeiro deles a prpria camada contnua de clulas que
ntegras constituem uma forte barreira. O segundo a camada de muco
produzido pelas clulas caliciformes que recobre as clulas intestinais.
H necessidade que os estudos feitos por pesquisadores da rea de
produo animal elucidem os princpios bsicos morfolgicos e fisiolgicos dos
animais para que se possa obter, de fato, o controle completo de todos os
fatores envolvidos.
Existem

algumas

tcnicas

desenvolvidas

que

esto

constantemente sendo aprimoradas para avaliar o intestino e auxiliar na


compreenso de processos que ocorrem no mesmo.
Objetivou-se elucidar alguns fatores que afetam a integridade
intestinal, assim como especificar as metodologias mais utilizadas na cincia
animal para avaliaes dos mesmos.

2
2

REVISO DA LITERATURA

2.1

AVALIAO DA INTEGRIDADE INTESTINAL

2.1.1 Avaliao da diferenciao e do desenvolvimento

As clulas que compem o epitlio intestinal so formadas nas


criptas atravs de divises mitticas de clulas totipotentes. Essas clulas
produzidas migram ao longo da membrana basal at o topo da vilosidade, e
durante esse processo amadurecem. J no topo da vilosidade, ocorre a
apoptose da clula que ento descartada no lmen intestinal (JEURISSEN et
al., 2002). O processo de extruso de clulas no pice dos vilos ocorre,
tambm, em decorrncia do atrito com o bolo alimentar, presena de toxinas e
microorganismos com potencial patognico (MAIORKA et al., 2002).
O processo de absoro de nutrientes totalmente dependente dos
mecanismos que ocorrem na mucosa intestinal. Desta forma, a integridade no
pode ser comprometida, pois influencia diretamente a produtividade dos
animais, devendo permanecer saudvel e funcional por toda a vida (SANTOS,
2010).
O desenvolvimento intestinal consiste basicamente da associao
entre a renovao celular e a perda de clulas. O equilbrio entre esses dois
processos denomina-se turnover celular.
O desenvolvimento e diferenciao intestinal podem ser avaliados
por diversas tcnicas, variando de algumas bastante especficas a outras que
devem ser realizadas em conjunto com outras tcnicas para que seja possvel
apresentar resultados confiveis.
Uma das tcnicas utilizadas a quantificao do cido ribonuclico
(RNA), cido desoxirribonuclico (DNA) e protenas totais. A dosagem de RNA
indicadora da capacidade de sntese protica, e a de DNA indicadora da
proliferao celular do epitlio (BAGALDO et al., 2006).
A quantidade de protena por clula verificada pela relao
protena/DNA. A concentrao de RNA e protenas pode aumentar, mesmo
mantendo constante o nmero de clulas. A esse estado denomina-se
hipertrofia da mucosa (MAIORKA et al., 2002).

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FURLAN (2008) afirmou que o mecanismo de secreo de enzimas
e transportadores de membrana depende de estmulos para ativar a transcrio
de genes, os quais pelo processo de traduo sintetizam as enzimas
envolvidas na digesto e absoro de nutrientes.
As concentraes de DNA, RNA e suas relaes com o contedo de
protena passam por uma variao natural durante o desenvolvimento do trato
gastrointestinal especficos para cada espcie.
De acordo com MAIORKA et al., (2002) o mtodo mais comumente
utilizado para essa avaliao a incorporao de
radioativo)

ao

DNA

quantificados

atravs

de

H-timidina (istopo

auto-radiografias

ou

radioautografia. Porm, trabalhos que utilizam essa tcnica, em sua maioria,


no a utilizaram com a finalidade de quantificar DNA e RNA.
GARTNER & HIATT (2003) descrevem a tcnica de radioautografia,
e afirmam ser um mtodo til para localizao e o estudo de uma seqncia
temporal de eventos. WHEBY et al. (1963) utilizaram a tcnica de
radioautografias para verificar a absoro intestinal de ferro em ratos.
GERSHON et al., (1965) tambm utilizaram a tcnica, porm para avaliar a
sntese e liberao de serotonina pelo plexo mioentrico do intestino de ratos
(Figura 1).

FIGURA 1 - Radioautografias do plexo mioentrico do intestino de ratos.


Seqncia temporal (A e B). O acmulo de gros prata que indica presena
de serotonina titulveis em torno de clulas ganglionares(G).
Fonte: GERSHON et al. (1965)

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O elemento que se deseja estudar radiomarcado (etapa de
incorporao) e injetado no animal. Fragmentos do tecido em estudo so
colhidos em vrios intervalos de tempo. A lmina de vidro recoberta com uma
fina camada de emulso radiogrfica. Posteriormente, a lmina colocada em
uma caixa escura por alguns dias ou semanas, durante os quais partculas
emitidas pelo istopo radioativo atingem a emulso nos locais da clula em que
o istopo est localizado. A emulso revelada e fixada por tcnicas
fotogrficas e pequenos gros de prata fixam-se nas pores expostas da
emulso. O espcime ento lacrado com uma lamnula e observado em
microscpio ptico (GARTNER & HIATT, 2003). Provavelmente, o menor uso
dessa tcnica, atualmente, devido descoberta de novas tcnicas com maior
rapidez e facilidade de execuo, e que no necessitem de instalao
especfica para uso de material radioativo.
Os mtodos que utilizam o espectrofotmetro para quantificao de
DNA e RNA so os mais utilizados. BAGALDO et al. (2006) realizaram
experimento para comparar o desenvolvimento dos segmentos jejuno e leo do
intestino delgado de bezerros com o uso de indicadores de atividade celular
(DNA, RNA e protena) e pela expresso do gene do IGF-I (insuline like growth
factor) e de seu receptor. Para extrao do DNA um grama de tecido foi
homogeneizado em 19 mL de gua deionizada, e aps seguiu-se a
metodologia

de

LABARCA

&

PAIGEN

(1980)

que

utilizaram

espectrofotmetro calibrado para diferentes comprimentos de ondas. Para a


quantificao da protena total, retirou-se 1mL do homogenato, sendo feita a
determinao segundo o mtodo de LOWRY et al. (1951). A utilizao dessas
tcnicas possibilitou a concluso, pelos autores, de que as pores do intestino
delgado,

jejuno

leo,

apresentam

diferenas

temporais

no

seu

desenvolvimento.
BAGALDO et al. (2007) determinaram o DNA total do jejuno, leo e
fgado de bezerros para verificar a ao do IGF-I presente no colostro de vacas
tratadas com o hormnio somatrotopina recombinante bovina (rbST). A
determinao do DNA e RNA foi realizada pelas mesmas metodologias j
citadas. Atravs das respostas dos indicadores de atividade celular intestinal e
heptica, os autores sugeriram a importante participao do IGF- I na
maturao celular e no comportamento da primeira gerao de entercitos.

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Outra tcnica, utilizada para identificao do material gentico
celular, a reao em cadeia da polimerase (PCR). A tcnica bsica foi sendo
modificada para diferentes finalidades, fazendo com que hoje existam diversos
tipos de protocolos. O PCR em tempo real, por exemplo, pode quantificar a
expresso gnica. Em humanos, bastante utilizada na pesquisa de doenas e
cncer de intestino (DYDENSBORG et al., 2006). HOUGHTON & COCKERILL
(2006) publicaram uma reviso sobre a tcnica relatando tambm vrias
aplicaes da mesma, inclusive a possvel aplicao para avaliao intestinal.
LEHMANN & KREIPE (2001) fizeram algumas consideraes sobre
a tcnica de PCR em tempo real para a quantificao de DNA e RNA em
tecidos j fixados com formalina e embebidos em parafina, o que bem til
quando se faz anlises conjuntas de um mesmo material por diferentes
tcnicas.
A avaliao do intestino atravs de cortes histolgicos e mensurao
de parmetros morfomtricos , sem dvida, a tcnica mais utilizada nos
trabalhos feitos para avaliao intestinal, principalmente na cincia animal.
uma tcnica simples, barata e que oferece bons resultados para avaliao.
O desenvolvimento da mucosa intestinal avaliado por meio de
dados morfomtricos do tamanho e nmero de vilos, da profundidade das
criptas, da altura do epitlio, da altura e nmero de microvilos do entercito e
da integridade da mucosa ou perda de epitlio (STERZO, 2007).
Quando o intestino responde a algum agente com desequilbrio da
relao de extruso e proliferao, ocorre modificao na altura dos vilos. O
nmero e o tamanho dos vilos dependem do nmero de clulas que o
compem. Assim, quanto maior o nmero de clulas, maior o tamanho do vilo,
e por conseqncia, maior a rea de absoro de nutrientes. No geral, a
maior altura de vilos e relao vilo/cripta esto associadas com uma boa
diferenciao da mucosa intestinal (JEURISSEN et al., 2002). Criptas menos
profundas indicam melhor estado de sade intestinal (VIOLA & VIEIRA, 2007).
SCHEEMAN et al. (1982) sugeriram que vilos curtos (relativo a profundidade de
cripta) tem menos clulas absortivas e mais clulas secretrias.
Outro fator relevante para a absoro dos nutrientes na membrana
luminal a quantidade de microvilos existentes nos entercitos. Os microvilos
so modificaes do plasmalema apical das clulas epiteliais que recobrem as

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vilosidades intestinais (GARTNER & HIATI, 2003). O nmero de microvilos atua
como um amplificador de rea para a absoro dos nutrientes (MAIORKA et
al., 2002).
As metodologias utilizadas para confeco das lminas histolgicas
para visualizao em microscpio ptico j so consolidadas e variam entre si
de acordo com protocolos dos laboratrios nos quais feito o processamento
do material. Fragmentos do duodeno, jejuno e leo so coletados e
imediatamente lavados com soluo fisiolgica e fixados, na maioria dos
protocolos, em soluo de Bouin por 24 horas. Passam pelas etapas de
desidratao em lcool, diafanizao ou clareamento por xilol e incluso em
parafina. So feitos cortes com micrtomo que, posteriormente, so corados.
Quanto colorao, SILVA et al. (2010) em anlise dos efeitos da
infeco causada pelo Toxoplasma gondii sobre a parede do duodeno de
gatos, utilizaram em seu experimento diferentes corantes, sendo o Azan para
evidenciao de fibras colgenas, o Tricrmico-Mallory para deteco das
clulas de Paneth. J o cido Peridico de Schiff (PAS) indicado para
deteco de mucinas neutras e sialomucinas lbeis. O Alcian- Blue (AB) pH 2,5
para deteco de sialomucinas e sulfomucinas e Alcian-Blue (AB) pH 1,0 para
deteco das sulfomucinas. Um dos resultados encontrados por SILVA et al.
(2010), foi que na avaliao qualitativa, as fibras colgenas ocupavam uma
rea dos estratos da parede intestinal visivelmente maior, o que sugere que
estejam aumentadas no grupos infectados (Figura 2).

FIGURA 2 - Cortes transversais, corados com Azan, de 3 m da parede do


duodeno de gatos. Evidncia de fibras colgenas envolvendo glndulas
duodenais. Gatos hgidos (esquerda) e submetidos infeco pelo
Toxoplasma gondii (direita).
Fonte: Adaptado de SILVA et al. (2010).

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A colorao para a anlise morfomtrica feita com os corantes
hematoxilina e eosina (HE) que so de utilizao rotineira na avaliao
histolgica de tecidos. Pode-se, tambm, quantificar linfcitos intraepiteliais.
A hematoxilina cora preferencialmente os componentes cidos da
clula com tonalidade azulada. Como o DNA e o RNA, o ncleo e as regies do
citoplasma ricas em ribossomos coram-se em azul-escuro, estes componentes
so ditos basfilos. A eosina um cido que cora os componentes bsicos da
clula com uma cor rsea. Como muitos dos componentes citoplasmticos tm
pH bsico, vrias regies do citoplasma se coram em rosa, estes elementos
so ditos como acidfilos (GARTNER & HIATT, 2003).
A avaliao feita a partir de imagens dos cortes corados com HE,
capturadas com o auxlio de uma cmera digital acoplada a um microscpio de
luz. So efetuadas medidas, em micrmetros, de vilosidades e profundidade de
cripta. As medidas de altura das vilosidades so tomadas a partir da regio
basal. A medida de profundidade das criptas realizada da base at a regio
de transio cripta-vilo.
FASINA et al. (2010) estudaram a influncia da infeco por
Salmonella enterica Sorovar Typhimurium nas clulas caliciformes e na
morfologia de vilos intestinais de frangos de corte. Determinaram a densidade e
o tamanho das clulas caliciformes, alm dos tradicionais parmetros
morfomtricos. A densidade foi definida pelo nmero de clulas PAS ou Alcian
blue (ALB) positivas por mm2 de superfcie quadrada do vilo (Figura 3).
A segunda barreira de proteo da integridade do epitlio intestinal
o muco. O muco produzido por clulas caliciformes, glndulas unicelulares,
que se encontram entre as clulas epiteliais. O duodeno tem o menor nmero
de clulas caliciformes e seu nmero aumenta ao se aproximar do jejuno.
Essas clulas produzem mucingeno, cuja forma hidratada constitui a mucina,
um componente do muco (GARTNER & HIATT, 2003).
composto por glicosaminoglicanas que protegem o vilo, ou at
mesmo participam do processo absortivo atravs das protenas ligadoras de
clcio (MACARI et al. 1994). O aumento da proliferao celular na cripta pode
alterar o nmero de clulas caliciformes e podem mudar a composio da
mucina e propriedades fsico-qumicas do muco.

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A determinao do nmero de clulas caliciformes uma tcnica
estabelecida usando segmentos intestinais corados com Alcian blue e cido
peridico Schiff (PAS). Embora a alta densidade de clulas caliciformes pode
resultar em um aumento da secreo de mucina, o nmero de clulas
caliciformes no pode ser usado para quantificar a secreo de mucina, que
necessita de anlise especfica.

FIGURA 3 Vilosidades do jejuno coradas em PAS, ALB e HE,


respectivamente. ME: camada epitelial da mucosa; VLP: lmina prpria.
1) Clulas coradas em rosa so PAS positivas; 2) Clulas coradas em azul so
ALB positivas. 3) a- altura do vilo; b- largura do vilo; c- profundidade de cripta.
Fonte: Adaptado de FASINA et al. (2010)

A biometria dos rgos que compem o sistema digestrio outra


metodologia utilizada para avaliao do desenvolvimento intestinal expressa
pelo comprimento e peso relativo. O peso do intestino grosso dado pela soma
do peso dos cecos (aves), clon e reto. O peso e comprimento do intestino
delgado so medidos da poro compreendida entre o piloro e a juno leoceco-clica (LEITO, 2007).
ROCHA (2009) avaliou a incluso de glicomanano esterificado em
raes para frangos contendo milho ou sorgo contaminado por fungos, e fez a
biometria dos rgos do aparelho digestrio das aves. Obteve resultados
diferentes dos relatados na literatura. O autor sugere que a avaliao somente
dos dados de peso dos rgos no constitui em bom indicador de avaliao do
efeito de gros de diferentes tipos e qualidades na rao.

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Portanto, avaliao qualitativa e quantitativa da perda do epitlio
muito importante, tendo em conta que permitem uma avaliao confivel da
capacidade digestiva e absortiva do intestino, alm da avaliao dos danos
causados mucosa intestinal por agentes patognicos ou jejum.
Para avaliao qualitativa da mucosa intestinal, tem-se usado a
tcnica de microscopia eletrnica de varredura. Usada para observar a
superfcie de um espcime slido, obtendo uma imagem tridimensional do
objeto. O material a ser observado preparado de um modo especial que torna
possvel o depsito de uma delgada camada de metal pesado (ouro, paldio,
smio, etc.) sobre a superfcie do espcime.
O microscpio emite um feixe de eltrons que varre a superfcie do
objeto. Alguns eltrons so refletidos diretamente, mas outros so emitidos
pela cobertura de metal pesado. Ambos so capturados por detectores de
eltrons e essas diferenas so interpretadas e mostradas em um monitor
como uma imagem tridimensional. Pode ser acoplado a um computador para
armazenar as imagens obtidas (GARTNER & HIATT, 2003).
GOMIDE JUNIOR et al. (2004) realizaram, com microscopia
eletrnica, estudo sobre a estrutura do duodeno, jejuno e leo de frangos de
corte que passaram por perodo de restrio hdrica e alimentar. Com as
imagens obtidas, fizeram classificao por escore das leses atravs das
imagens obtidas. Assim, o nmero de vilosidades com perda de epitlio foi
expressa como porcentagem do nmero total de vilosidades, considerando
cada grau de perda do epitlio. Desta forma puderam no s qualificar quanto
quantificar as leses (Figura 4).

2.1.2 Avaliao de fatores endgenos que regulam o desenvolvimento e


crescimento intestinal

Estudos relacionados ao controle do crescimento e renovao da


mucosa intestinal tm sido feitos, principalmente, em relao aos efeitos
modulatrios dos peptdeos secretados na mucosa. Os peptdeos so
produzidos por clulas enteroendcrinas e tm ao regulatria sobre o
desenvolvimento da mucosa.

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FIGURA 4 Micrografia eletrnica de varredura de intestino de frangos.


Nveis de perda epitelial das vilosidades intestinais. A) graus 0 e 1; B) grau 2;
C) grau 3; D) grau 4; E) grau 5; F) grau 6.
Fonte: Adaptado de GOMIDE JUNIOR et al. (2004)

Dentre esses peptdeos incluem-se os fatores de transformao do


crescimento (transforming growth factor) TGF, sendo os mesmos TGF-,
TGF- e IGF (insuline like growth factor). O TGF- estimulador da
proliferao celular e o TGF- potente inibidor da proliferao das clulas
intestinais indiferenciadas. As evidncias de participao desses peptdeos no
processo regulatrio so claras, pois o TGF- encontrado em grandes
concentraes nas clulas no proliferativas dos vilos. Por outro lado, a
expresso do TGF- tem sido verificada em maior concentrao nas clulas da
cripta (MAIORKA et al., 2002).
Como a maioria dos fatores de crescimento, o IGF-I produzido
amplamente pelo organismo e liberado assim que sintetizado, diferindo da

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maioria dos hormnios clssicos que so armazenados em grnulos secretores
(BAGALDO et al., 2006). A sntese do IGF-I difusa, porm o fgado a maior
fonte do peptdeo circulante (MURPHY et al., 1987).
Em aves, o receptor do IGF expresso na maioria dos tecidos. No
intestino, expresso na regio da submucosa e clulas da cripta. A quantidade
de receptor de IGF diminui com o avanar da idade (JEURISSEN et al., 2002).
Os nveis sricos de IGF podem ser detectados em radioimuno
ensaios (RIE). KINDLEIN et al. (2008) realizou ensaio imunoradiomtrico
utilizando kit comercial para quantificao da concentrao de IGF-I no
colostro.
O radioimunoensaio uma reao de ligao competitiva, na qual
uma quantidade fixa de antgeno radio-marcado e antgeno da amostra
competem por um nmero limitado de stios de ligao de anticorpos
especficos. Ambos os antgenos, marcado e no marcado, ligam-se ao
anticorpo e formam complexos precipitveis. Os antgenos marcados livres e
os ligados ao anticorpo so separados por centrifugao, decantao, etc. para
mensurar a radioatividade dos radioistopos ligados. A concentrao de
antgeno nas amostras testadas inversamente proporcional quantidade de
radioatividade na frao ligada (STEINBECK & WYNER, 1993).
O RIE possui alta sensibilidade para detectar antgenos em
concentraes picomolares ou inferiores. prtico, pois na maioria dos kits de
RIE os tubos j possuem forrao com o anticorpo especfico, diminuindo
assim a quantidade de pipetagens a serem realizadas e facilitando o processo
de separao (STEINBECK & WYNER, 1993).
As desvantagens deste mtodo so que a utilizao do radioistopo
de iodo,

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I, exige licena e instalaes adequadas para sua manipulao e

descarte, ocasionando ainda, problemas de armazenamento e, principalmente,


o perigo de exposio sua radiao (REGHELIN, 2007).
Outra tcnica que pesquisadores utilizam para mensurar IGF a
quimioluminescncia. TSE et al. (2010), avaliando a adio de protenas
lcteas e zinco suplementar em leites desmamados, analisaram as
concentraes sricas de IGF-I pelo mtodo de quimioluminescncia com kits
comerciais.

12
Vrios sistemas esto disponveis comercialmente com a finalidade
de dosar hormnios, drogas e outras substncias presentes em baixos nveis
em fluidos orgnicos. Esses mtodos utilizam um anticorpo ligado a um
marcador quimioluminescente ou luminescente (luciferina, luciferase, luminol e
outros).

energia

excedente

dissipada

na

forma

de

radiao

eletromagntica, diferente do que a maioria das reaes exotrmicas, onde a


dissipao na forma de calor ou exitao rotacional ou vibracional (SANTOS
et al., 1993)
Segundo

REGHELIN

(2007),

as

principais

vantagens

da

quimioluminescncia em relao ao RIE so a ausncia do risco de


contaminao radioativa tanto pessoal quanto ambiental e o fato de no serem
necessrias licenas para que sejam realizados. Porm, possui menor
sensibilidade, ocorrem problemas na leitura de algumas amostras e h
necessidade

de

ambiente

refrigerado,

pois

os

reagentes

atuam

adequadamente em baixas temperaturas.

2.2

AVALIAO DA FUNCIONALIDADE

2.2.1 Avaliao dos parmetros fsico-qumicos

A viscosidade e o pH do contedo intestinal so os principais


parmetros fsico-qumicos avaliados, pois podem interferir nos processos
digestivos e absortivos.
A viscosidade da dieta fator importante principalmente em animais
no ruminantes. Dietas que contm grandes quantidades de polissacardeos
no amilceos (PNAs) solveis apresentam maior viscosidade. So dietas
formuladas com trigo, aveia, centeio e outros cereais.
MEURER & HAYASHI (2003) relataram que a diminuio do
desempenho animal relacionado ao aumento dos nveis de PNAs na rao
consequncia da influncia destes elementos sobre a digesto. Ocorre menor
digestibilidade dos nutrientes e energia, alm de diminuio da ingesto de
matria seca. H aumento da demanda energtica com o aumento da
produo de secrees digestivas, aumento do tamanho dos rgos do trato

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gastrointestinal e maior taxa de renovao celular, quando o organismo faz
modificaes adaptativas s raes com altos nveis de PNAs. O aumento da
viscosidade do bolo alimentar dificulta o acesso das enzimas aos substratos e
dos alimentos digeridos borda do intestino (BEDFORD, 1996).
JEURISSEN et al. (2002) afirmaram que o aumento da viscosidade
intraluminal pode limitar a mistura de nutrientes da dieta com enzimas
pancreticas e cidos biliares. Alm disso, tambm aumenta a espessura da
camada aquosa estacionria que recobre as clulas da mucosa. As duas aes
limitam, respectivamente, a digesto e absoro de nutrientes.
Os mesmos autores ainda acrescentam que o crescimento de
determinados microorganismos pode ser favorecido, j que a reduo da
mistura diminui a oxigenao do contedo intestinal. H aumento na velocidade
de passagem, com dietas contendo PNA insolvel,que tambm pode interferir
no equilbrio da microbiota intestinal.
A medida da viscosidade da dieta feita por uma tcnica
estabelecida por BEDFORD & CLASSEN (1993) em que h coleta e
centrifugao do contedo do intestino delgado, com a viscosidade do
sobrenadante sendo determinada por um viscosmetro. A limitao dessa
tcnica a quantidade de digesta. Aps a centrifugao deve haver quantidade
suficiente de sobrenadante para avaliar a viscosidade.
O pH intestinal aumenta da extremidade oral para aboral e o pH de
cada segmento regulado pela atividade secretria do prprio segmento. A
produo bacteriana de metablitos cidos diminui o pH no papo, ceco e clon.
Essa alterao do pH ao longo do trato gastrointestinal necessria para que
atividade enzimtica seja tima para os grupos enzimticos presentes em cada
segmento.
Modificao no pH da dieta pode, alm de interferir na atuao
enzimtica, alterar tambm a absoro, j que alguns mecanismos de
absoro ativa dependem de potenciais inicos. A absoro de minerais, assim
como o tamanho dos complexos minerais tambm podem ser alterados
(JEURISSEN et al., 2002).
A determinao do pH simples, e pode ser feita na mesma frao
aquosa na qual a viscosidade medida.

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CALAA (2009) ao pesquisar cidos orgnicos para controle de
Salmonella enteritidis, mensurou o pH intestinal utilizando a metodologia
descrita por SILVA et al. (2000), em que os contedos do intestino e cecos
foram colhidos, diludos 15 mL em gua destilada, homogeneizados por 30
minutos, deixado em descanso por 5 minutos e determinado o pH.
A determinao do pH utiliza o peagmetro digital. O principio de
funcionamento desse equipamento a quantificao de ons H + devido
diferena de potencial entre a substncia na qual o pH est sendo medido e
soluo padro presente dentro do eletrodo.

2.2.2 Avaliao da permeabilidade intestinal e turnover

A permeabilidade intestinal (PI) est relacionada com a capacidade


da mucosa intestinal em permitir a passagem de molculas para a corrente
sangunea (MENDONA et al., 2009), por difuso (JEURISSEN et al., 2002).
As tcnicas estudadas so capazes de estimar a permeabilidade
intestinal

atravs

da

administrao

oral

de

acares

que

no

so

metabolizados, e posteriormente so determinados em fluidos biolgicos,


principalmente na urina. Os acares mais utilizados, segundo JEURISSEN et
al. (2002) so L-rhamnose, manitol, lactulose, 3-O-metilglicose, porm outros
monossardeos e dissacardeos so utilizados.
STEINER et al. (2000) descrevem, na introduo de seu trabalho
para avaliao da permeabilidade em caninos, os principais tipos de transporte.
Acredita-se que h dois tipos de transporte que permitem a passagem de
molculas de maneira passiva pela mucosa gastrointestinal. Poros menores
esto localizados entre as clulas da parede intestinal (dimetro mximo de 0,4
nm) permitindo a passagem de molculas pequenas (massa molecular 150-185
Da) como os monossacardeos. A freqncia desses poros transcelulares
maior e mais dependente da rea de superfcie da mucosa intestinal.
Poros maiores com raios mximos de dimetro de aproximadamente
0,5 a 0,8 nm permitem a penetrao de molculas maiores, como o Cr-EDTA e
dissacardeos (aproximadamente 340 Da). Esses poros esto localizados na

15
rea das junes celulares (tight junctions). A freqncia desses poros
paracelulares bem menor e muito dependente da integridade da mucosa.
O mtodo mais aceito para verificao da integridade da barreira
intestinal o teste de manitol (monossacardeo) e lactulose (dissacardeo) que
so transportados por caminhos transcelular e paracelular, respectivamente.
Atravs

da

razo

lactulose/manitol

(L/M)

infere-se

as

condies

da

permeabilidade intestinal (MENDONA et al., 2009).


Em processos patolgicos do intestino delgado, as junes
paracelulares podem permitir a passagem de molculas maiores, levando ao
aumento da permeabilidade dos marcadores dissacardeos. Geralmente esto
associados a diminuio da rea de superfcie, levando a diminuio da
permeabilidade a marcadores monossacardeos (STEINER et al., 2000).
Para medir a presena dos acares na urina muitos mtodos j
foram desenvolvidos e validados. H relatos do uso de cromatografia lquida de
alta eficincia, ensaio imunoenzimtico, espectrometria de massas (LEE &
CHUL CHUNG, 2006) e cromatografia gasosa. MENDONA et al. (2009)
desenvolveram um protocolo de cromatografia gasosa que permite medir
adequadamente a presena de manitol e lactulose em amostras biolgicas,
comprovando ser um excelente mtodo para explorar a permeabilidade
intestinal normal e em condies patolgicas. mais realizada em humanos e
em animais nos quais a urina facilmente coletada. Em aves, h limitao ao
uso dessa tcnica, devido produo de excretas. Entretanto, possvel que
seja realizada utilizando sondas nas aves (JEURISSEN et al., 2002).
A integridade intestinal tambm pode ser avaliada in vitro. A
vantagem que pode-se investigar a permeabilidade de diferentes regies
intestinais, e h a possibilidade de eliminar a interferncia de outros fatores que
no sejam o objeto de estudo, j que as condies experimentais podem ser
controladas e monitoradas.
So estudos que utilizam a metodologia semelhante realizada por
WAGNER & GALEY (2003). Os autores fizeram anlise cintica do transporte
de hexoses para determinar a cintica de absoro de medicamentos.
Para avaliao do turnover intestinal e da taxa metablica dos
tecidos, tcnicas que utilizam istopos estveis esto sendo cada vez mais
usadas. Os istopos so tomos de um mesmo elemento qumico que

16
possuem mesmo nmero de prtons, mas diferente nmero de nutrons.
Caractersticas que fazem com que tenham propriedades fsicas distintas, mas
as mesmas propriedades qumicas. So ditos estveis por no emitirem
radiao. Para mensurao das diferenas de proporo entre istopos nos
tecidos, aps preparao do material, utiliza-se espectrmetro de massa
(BORDINHON, 2008).
CALDARA et al., 2010 afirmaram que dietas isotopicamente distintas
podem ser usadas para medir taxas de turnover nos tecidos do animal. Aps a
troca de dieta, a mudana na composio isotpica do tecido depende de quo
rpido esses constituintes so assimilados.
Tecidos com rpido metabolismo refletem dietas recentes, enquanto
aqueles com baixo turnover metablico representam dietas consumidas h
mais tempo. Esses autores avaliaram a influncia da glutamina sobre o
turnover do carbono da mucosa intestinal de leites desmamados.
PELCIA et al. (2011) utilizando tambm istopos estveis de
carbono, avaliaram o efeito da dieta suplementada com nucleotdeos sobre
taxa de turnover da mucosa intestinal de frangos antes e aps leses causadas
por coccidiose.

2.2.3 Avaliao das protenas da parede intestinal

A camada de muco presente no trato gastrointestinal, como j


mencionado, secretada pelas clulas caliciformes e fundamental na
manuteno da integridade e sade intestinal. As propriedades funcionais das
mucinas so a lubrificao das superfcies epiteliais, formao da barreira de
difuso para nutrientes, proteo contra microorganismos patognicos e
interao com o sistema imune.
Vrias tcnicas foram desenvolvidas e modificadas durante os anos
para mensurar a secreo de muco. Variam de testes inespecficos at
imunoensaios para quantificao de determinadas protenas mucinas. Os
ensaios de protena por espctofotometria permitem a quantificao da protena
total do muco dentro de uma rea especfica do intestino, mas sem a
especificidade da origem dessa protena.

17
Tcnicas colorimtricas so formas especficas para medir as
glicoprotenas que so presentes em uma amostra a partir de superfcies
epiteliais. Alm disso, so uma forma muito barata para determinar a
quantidade e composio do muco.
SHIRAISHI et al. (2009) estudaram a dinmica de mucinas
secretadas no leo de frangos infectados por Toxoplasma gondii. Utilizaram o
protocolo descrito por MYERS et al. (2008), no qual foi quantificado o nmero
de clulas caliciformes presentes em 0,3 mm 2 de tnica mucosa de cada
animal. Essa anlise foi realizada com lminas submetidas s tcnicas
histoqumicas para deteco de glicoconjugados (PAS, AB pH 2,5 e AB pH
1,0).
A composio de mucinas em condies patolgicas expressa
pela alterao na relao entre mucinas neutras, sulfatadas e sialomucinas. No
estudo de

SHIRAISHI et al. (2009) houve somente alterao no perfil

secretrio de mucinas neutras. Sugere-se que o aumento da secreo de


mucinas neutras nos grupos infectados tem a finalidade de deixar mais denso o
muco que recobria o epitlio, no intuito de proteg-lo da abraso que
normalmente ocorre durante a diarria que foi observada nesses animais.
MONTAGNE et al. (2000) propuseram um teste de ELISA (EnzymeLinked

Immunoabsorbent

Assay)

para

isolamento,

caracterizao

quantificao de mucinas na digesta ileal desenvolvido para bezerros. O


mtodo utilizado para realizar o teste se baseia na interao anticorpoantgeno. A limitao da utilizao do ELISA a necessidade de desenvolver
teste especfico para cada espcie animal. As mucinas no apresentam
reatividade cruzada entre as espcies animais (JEURISSEN et al., 2002).
Aumento na secreo de mucina pode ser benfico ou no de
acordo com a espessura da camada de muco. Se essa camada aumenta
somente em quantidades suficientes para maior proteo contra adeso
bacteriana, pode ser benfico. Porm, se tornar-se demasiadamente densa,
pode ocorrer alterao na mistura da digesta com enzimas digestivas.
O aumento da renovao celular resulta em maturidade reduzida de
clulas caliciformes. Nessa situao verifica-se aumento de sialomucinas e
reduo de sulfomucinas. Assim, o tipo de mucina produzida pode ser reflexo

18
do comprimento do vilo e, portanto, o perfil de mucina particular pode ser
indicativo de uma morfologia intestinal alterada.
Outra avaliao que pode ser feita a da atividade das enzimas da
borda em escova. Na superfcie dos microvilos so encontradas enzimas de
membrana (dissacaridases, oligapeptidases, etc.) que tm papel importante na
digesto de nutrientes (MACARI et al., 1994). So dissacaridases, fosfatase
alcalina, g-glutamiltransferase, aminopeptidases, sacarase-isomaltase (BOLELI
et al., 2002), que degradam oligmeros e oligopeptdeos em componentes
absorvveis.
SAKAMOTO (2009) utilizou a metodologia descrita por DAHLQVIST
(1964) com espectrofotmetro para avaliao de atividade enzimtica em
frangos de corte suplementados com glutamina e nucleotdeos. A unidade de
atividade especifica das enzimas foi definida como a quantidade de enzima que
hidrolisa 1 mol de substrato por mg de protena por minuto.

19
3

CONSIDERAES FINAIS

Tcnicas histolgicas para observao em microscpio de luz


continuam sendo bastante utilizadas para avaliao intestinal devido
facilidade de execuo, custo reduzido, e principalmente, porque resultam em
bons dados para anlise.
Porm, as metodologias moleculares so promissoras por serem
bastante especficas, sensveis, possibilitar diagnsticos rpidos e no serem
invasivas. Na medicina humana essas tcnicas so as mais utilizadas e notase que a pesquisa animal j est seguindo esse caminho, principalmente
devido preocupao crescente com o nmero de animais utilizados pela
experimentao animal. Pelo mesmo motivo, metodologias in vitro para
determinar funes fisiolgicas tambm devem ser promissoras.
As

tcnicas

disponveis

para

avaliao

da

integridade

funcionalidade intestinal tm mostrado serem eficientes para as determinaes


em que so utilizadas. Porm, alguns ajustes nas metodologias so sempre
necessrios para que as diferenas fisiolgicas entre indivduos e espcies
sejam minimizadas.
Sempre que possvel, deve-se preferir realizar as anlises de dados
obtidos por vrias tcnicas, para que se tenha maior segurana ao relatar um
evento no intestino. E assim, poder inferir os eventos de digesto e absoro,
conhec-los e otimiz-los, obtendo o melhor desempenho do animal.

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