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Parasitologia

Clnica
Seleo de Mtodos e Tcnicas
de Laboratrio para
o Diagnstico das Parasitoses Humanas
Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Parasitologia
Clnica
Seleo de Mtodos e Tcnicas
de Laboratrio para
o Diagnstico das Parasitoses Humanas

Geraldo Attilio De Carli


Professor Titular de Parasitologia. Mestre em Parasitologia e Doutor em Farmcia
e Bioqumica. Professor de Parasitologia Clnica, Faculdade de Farmcia,
Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Porto Alegre, RS, Brasil.
Ex-Professor Titular de Anlises Parasitolgicas, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, UFRGS (1963-1997), Porto Alegre, RS, Brasil. Ex-Professor Titular
de Parasitologia, Universidade do Vale do Rio dos Sinos, UNISINOS,
So Leopoldo, RS, Brasil (1976-1987). Ex-Bolsista da Universidade de
Wisconsin, Madison, EUA (1965-1967). Ex-Bolsista do Centro Panamericano
de Zoonoses, Oficina Sanitria Panamericana (OPS/OMS), Buenos Aires, Argentina (1982).
Ex-Bolsista da Japan International Cooperation Agency (JICA), Japan Association of Parasite
Control (1987) e Universidade de Kyorin, Tquio, Japo (1993). Ex-Bolsista da Comisso
das Comunidades Europias (CEE), Universidade de Rouen, Rouen, Frana (1987-1988).
Ex-Bolsista da Deutscher Akademischer Austauschdiemst (DAAD), Instituto de Medicina
Tropical Bernhard Nocht, Hamburgo, Alemanha (1991)

So Paulo Rio de Janeiro Belo Horizonte


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PLANEJAMENTO GRFICO/CAPA: Equipe Atheneu

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)


(Cmara Brasileira do Livro, SP, Brasil)
Parasitologia clnica: seleo de mtodos e tcnicas de laboratrio
para o diagnstico das parasitoses humanas / [editor]
Geraldo Attilio De Carli. So Paulo: Editora Atheneu, 2001.

Vrios colaboradores.

1. Diagnstico laboratorial 2. Doenas parasitrias 3. Parasitologia


diagnstica 4. Parasitologia mdica I. De Carli, Geraldo Attilio.

01-3246

CDD-616.960756
NLM-WV 615

ndices para catlogo sistemtico:


1. Parasitoses humanas: Diagnstico
laboratorial: Medicina
616.960756

DE CARLI, G.A.
Parasitologia Clnica Seleo de Mtodos e Tcnicas de Laboratrio para o Diagnstico das Parasitoses Humanas
Direitos reservados EDITORA ATHENEU So Paulo, Rio de Janeiro, Belo Horizonte, 2001
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Colaboradores

ADELAIDE JOS VAZ


PhD. Professora Doutora do Departamento de Anlises Clnicas da Faculdade
de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo, USP e Professora Titular
da Universidade Paulista, UNIP, So Paulo, SP.

ANA LGIA BENDER


MSc. Professora Assistente do Departamento de Anlises Clnicas da Faculdade
de Farmcia da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, PUCRS,
Porto Alegre, RS.

CARLOS GRAEFF-TEIXEIRA
PhD. Professor Adjunto do Departamento de Microbiologia e Parasitologia
da Faculdade de Biocincias da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande
do Sul, PUCRS, Porto Alegre, RS.

COR JSUS FERNANDES FONTES


PhD. Professor Assistente em Clnica Mdica do Hospital Universitrio
Jlio Mller da Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Federal do Mato
Grosso, UFMT, Cuiab, MT.

HRCULES MOURA
PhD. Pesquisador Associado da Division of Parasitic Diseases MS F13 do National
Center for Infectious Diseases do Centers for Disease Control and Prevention, CDC,
Atlanta, Georgia, EUA. Professor Adjunto da Faculdade de Cincias Mdicas
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, UERJ, Rio de Janeiro, RJ.

EDMUNDO CARLOS GRISARD


PhD. Professor Adjunto do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal
de Santa Catarina, UFSC, Florianpolis, SC.

EMLIO ANTONIO JECKEL NETO


PhD. Professor Adjunto do Laboratrio de Biologia do Envelhecimento,
Instituto de Geriatria e Gerontologia e Departamento de Cincias Morfolgicas,
da Faculdade de Biocincias da Pontifcia Universidade Catlica do Rio
Grande do Sul, PUCRS, Porto Alegre, RS.
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GERUSA DREYER
PhD. Professora Adjunta de Doenas Infecciosas e Parasitrias da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Pernambuco,UFPE.
Pesquisadora Titular do CPqAM-FIOCRUZ. Consultora da Organizao
Mundial de Sade, OMS, para Filariose.

LUIZ CARLOS SEVERO


PhD. Professor Titular da Faculdade de Medicina da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS.

MARCO MASTROENI
MSc. Universidade da Regio de Joinville (UNIVILLE), Faculdade
de Farmcia, Joinvile, SC. Doutorando em Sade Pblica, Universidade
de So Paulo (USP), SP.

MARIA ANETE LALLO


PhD. Professora Titular da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade
Paulista, UNIP e da Universidade Bandeirante, So Paulo, SP.

MARILISE BRITTES ROTT


PhD. Professora Adjunta. Instituto Bsico da Sade. Setor de Parasitologia.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS.

MRIO STEINDEL
PhD. Professor Adjunto do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal
de Santa Catarina, UFSC, Florianpolis, SC. Pesquisador do CNPq.

MARISA PORTA MICHE HIRSCHFELD


PhD. Professora Doutora do Departamento de Anlises Clnicas da Faculdade de
Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo, USP, So Paulo, SP.

OSMAR LUIZ M. DE OLIVEIRA


MSc. Professor Assistente da Faculdade de Farmcia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS.

PATRCIA DREYER
Doutoranda. Acadmica de Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal de Pernambuco, UFPE. Estagiria do Ncleo de Ensino, Pesquisa
e Assistncia em Filariose, NEPAF-UFPE, Recife, PE.

PHILIPPE BRASSEUR
PhD. Professor Titular da Facult Mixte de Medicine et de Pharmacie de Rouen e do
Departamento de Parasitologia do Hpital Charles Nicolle, Centre Hospitalier
Universitaire, CHU, Rouen, Frana.

SILVANA DE ALMEIDA
Mestranda. Farmacutica Bioqumica. Programa de Ps-Graduao em Gentica e
Biologia Molecular do Departamento de Gentica do Instituto de Cincias Bsicas da
Sade da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS.

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SUZANA BENCKE AMATO


PhD. Professora Titular do Instituto de Biocincias da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS.

TIANA TASCA
MSc. Farmacutica Bioqumica e Pesquisadora do Laboratrio de Protozoologia,
Disciplina de Parasitologia Clnica, da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande
do Sul, PUCRS, Porto Alegre, RS.

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Prefcio

A Parasitologia Clnica sofreu um acrscimo de informaes desde a publicao de meu primeiro livro Diagnstico Laboratorial das Parasitoses Humanas. Mtodos e Tcnicas.
Na preparao deste novo livro Parasitologia Clnica foi realizada
uma grande e slida reviso de novos contedos com o auxlio de publicaes relacionadas com a Parasitologia Clnica.
Um diagnstico clnico acurado das infeces parasitrias humanas, alm de
difcil, no permite uma diferenciao especfica do agente infeccioso e depende
da confirmao laboratorial. Para os parasitos intestinais e do sangue a demonstrao morfolgica do(s) estgio(s) de diagnstico o principal meio para estabelecer uma diagnose diferencial e definitiva. Entretanto, para as infeces dos
tecidos o diagnstico no-morfolgico (sorologia) o mais importante, incluindo a
triquinelose, a hidatidose, a cisticercose, a toxocarase, a esquistossomose crnica por Schistosoma mansoni, a amebase extra-intestinal, a toxoplasmose, a
tripanossomase americana e a leishmaniose visceral ou calazar.
Um diagnstico incorreto resulta de dois tipos de erros: de procedimento e de
interpretao. Os erros de procedimento so uma conseqncia do uso incorreto
do microscpio, de esfregaos impropriamente preparados, de deficincias no exame de toda a preparao, de uma observao muito rpida das preparaes, de
falhas no uso dos aparelhos de medida, de uma variedade de tcnicas ou de boas
tcnicas e da falta de experincia para uma pesquisa criteriosa de certas espcies. Os erros de interpretao se devem falta de conhecimento das vrias espcies e dos diferentes tipos de artefatos presentes nas fezes; incapacidade para
observar que os organismos de certas espcies apresentam uma variedade de
caractersticas e que muitas vezes no se assemelham s figuras e fotografias de
atlas, ou desconhecimento do fato de que os parasitos com diagnstico duvidoso
devero ser estudados at a sua identificao, ou encaminhados a um especialista, ou, ainda, a necessidade de amostra adicional do paciente.
A Parasitologia Clnica estuda os organismos que parasitam o homem. Os
organismos referidos como parasitos so um grupo heterogneo que varia em
tamanho, desde os pequenos microspordios at os complexos organismos
multicelulares, como a Taenia saginata.
As infeces parasitrias so encontradas em todas as reas geogrficas do
mundo e inmeras doenas, como a toxoplasmose e a larva migrans visceral, so
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comuns nos pases temperados. O crescimento do nmero de viajantes individuais


pelo mundo quebrou a barreira de tempo colocada entre os pases desenvolvidos
e os em desenvolvimento. O aumento do nmero de viagens realizadas aos pases
tropicais disseminou as infeces, as quais no passado recente eram
caracterizadas como doenas exticas comuns. Existe, em conseqncia disso, a
necessidade imediata de um correto e preciso diagnstico laboratorial das
parasitoses humanas.
Este livro foi escrito para os parasitologistas, os profissionais das reas da
Sade e das Anlises Clnicas e, principalmente, os estudantes que buscam conhecer os elementos bsicos do diagnstico microscpico e que necessitam adquirir
experincia nos procedimentos de laboratrio voltados pesquisa e as suas aplicaes na Parasitologia.
O meu primeiro livro teve como principal objetivo reunir os mtodos e tcnicas
indicados para o diagnstico de laboratrio das Parasitoses Humanas. As principais modificaes nesta edio foram a incluso de colaboradores e o acrscimo
de novos captulos relacionados com os Protozorios Emergentes e Oportunistas,
Amebas de Vida Livre, Parasitos do Sangue e dos Tecidos, Controle de Qualidade, Biossegurana em Laboratrio de Parasitologia, Imunodiagnstico, Biologia
Molecular e Tcnicas Histolgicas. No Captulo Diagnstico e Identificao dos
Parasitos, foram descritos os principais parasitos com a incluso de um pequeno
atlas com fotografias, ilustraes e grficos. Esses novos captulos trouxeram um
novo rumo para o conhecimento, a identificao e o diagnstico das infeces parasitrias, alm da incluso de um apndice, que ir dirigir o leitor para o estudo
da Parasitologia atravs da Internet. Os novos captulos, como Controle de Qualidade e Biossegurana em Laboratrio de Parasitologia, foram escritos para mostrar a importncia e a obrigatoriedade de seguir regras rgidas nos diferentes procedimentos de diagnstico. Nesta edio, segui, em parte, a orientao do Dicionrio de Termos Tcnicos de Medicina e Sade, escrito pelo Professor Lus Rey,
como um sinalizador na normatizao da maioria dos termos especficos usados.
Seis anos depois do lanamento do Diagnstico Laboratorial das Parasitoses
Humanas Mtodos e Tcnicas, inmeros colegas pediram-me para combinar
o texto com um atlas. Apesar de meu maior esforo ter sido o da reviso e atualizao de novos procedimentos para o diagnstico de laboratrio das doenas parasitrias, inclu neste livro uma srie de excelentes fotografias, recebidas de amigos e de instituies, para a ilustrao dos textos. A participao de novos colaboradores trouxe a esta publicao sua maturidade, pois novos captulos foram
escritos e novos procedimentos apresentados. O entusiasmo de meus colegas, que
ensinam a Parasitologia Clnica, em diferentes universidades, foi uma permanente fonte de inspirao para a incluso de um grande nmero de novos procedimentos de laboratrio.
Freqentemente, so sugeridos nomes comerciais de equipamentos e produtos, os quais no significam adoo ou excluso de outros. Se houve alguma omisso, no deve ser considerada intencional.

Porto Alegre, inverno de 2001


Geraldo Attilio De Carli

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Agradecimentos e Crditos

Os meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que contriburam de diferentes maneiras para a realizao deste livro. Eu sou reconhecido pela participao efetiva do Professor Hrcules Moura, PhD, Pesquisador Visitante da
Division of Parasitic Diseases MS F13, National Center for Infectious
Diseases, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Gergia,
EUA, pelas sugestes e co-autoria de vrios captulos. A Phuc Nguyen-Dinh, PhD,
do CDC DPDx Network Group, Atlanta, Gergia, EUA, pela autorizao da incluso das fotogravuras coloridas do DPDx, the CDC Website for Parasitology
Diagnosis, EUA. A Denis Lemeteil, PhD da Facult Mixte de Medicine et de
Pharmacie de Rouen, Rouen, Frana. Professora Lenilza Mattos de Lima, MSc,
do Departamento de Anlises Clnicas, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianpolis, SC, e Professora Regina Maura Bueno Franco, PhD, do Departamento de Parasitologia, IB-UNICAMP, Campinas, SP, pelas fotografias. Sou
profundamente agradecido ao Professor Jos Fernando Fagundes de Azevedo e
Cristiano Max Pereira Pinheiro da AGEXPP (PUCRS), aos fotgrafos Marcos
Colombo e Gilson Jos de Oliveira, e a Marco Fiori pela digitalizao das imagens.
Agradeo senhora Lcia Barreiros, da Produo Editorial da Editora Atheneu,
pela participao efetiva na concretizao desta obra.
As microfotografias e os desenhos includos neste livro foram copiados e
adaptados dos seguintes autores e instituies: Melvin DM, Brooke MM.
Laboratory Procedures for the Diagnosis of Intestinal Parasites. 3rd ed.
HHS publication N. (CDC)82-8282. Atlanta: Laboratory Training and Consultation
Division, Centers for Disease Control, 1982 (Figs. 2.1, 2.6, 2.9, 4.4, 5.1). Markell
EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. 7th ed. Philadelphia (Pa): WB
Saunders Co,1992 (Figs. 2.8, 3.2, 6.5, 12.1, 12.2). Ash LR, Oriehl TC. Parasites:
A Guide to Laboratory Procedures and Identification. Chicago (Ill): ASCP
Press,1991 (Figs. 2.11, 8.1). DPDx, the CDC website for parasitology
diagnosis. USA (Figs. 10.2, 10.7, 10.9, 10.10, 11.1-11.3, 16.1, 38.1, 38.2, 38.4,
38.5, 38.7, 38.8, 38.9, 39.10, 38.11, 38.12, 38.13, 38.14, 38.15, 38.16, 38.17, 38.19,
38.24, 38.25, 38.28, 38.29, 38.30, 38.32AB, 38.34B, 38.35, 38.36, 38.37, 38.38,
38.39, 38.40, 38.41). Rey L. Parasitologia. 2. ed. Rio de Janeiro: GuanabaraKoogan, 1991 (Figs. 4.2, 4.3). Pessa SB, Martins AV. Pessa Parasitologia
Mdica. 11. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1982. (Figs. 4.1, 4.3, 6.3).
Division of Communicable Diseases, WHO, Genebra (Fig. 5.3). Faust EC,
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Beaver PC, Jung RC. Animal Agents and Vectors of Human Disease. 3. ed.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1968 (Fig. 6.1). Craig CF, Faust ECF. Clinical
Parasitology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1970 (Fig. 19.7). Centers for Disease
Control and Prevention National Institutes of Health (Figs. 34.1, 34.2, 34.3).
Brumpt E, Neveu-Lemaire N. Travaux Pratiques de Parasitology. Paris:
Masson et Cie Editeurs, 1958 (Fig. 36.1). Dobell C, OConnor FW. The Intestinal
Protozoa of Man. London: John Bale Sons & Danielsson, 1921 (Fig. 38.6).
Mehlhorn H. editor. Parasitology in Focus. Berlin: Springer-Verlag, 1988 (Fig.
38.18). National Institutes of Health, USPHS, USA (Figs. 38.20, 38.21, 38.22,
38.23). Spencer FM, Monroe LS. The Color Atlas of Intestinal Parasites.
Springfield (III): Charles C. Thomas, Publisher, 1968 (Figs. 38.26, 38.27, 38.31).
Suzuki N. Human Helminth Eggs. Tokyo: JAPC e JOICFP, 1981 (Figs. 6.4,
38.32CD, 38.42). Gradwohl RBH, Kouri P. Clinical Laboratory Methods and
Diagnosis Parasitology and Tropical Medicine. 4th ed. St. Louis: CV
Mosby Co, 1948 (Fig. 6.2). Gardiner et al. An Atlas of Protozoa Parasites in
Animal Tissues. USDA, Agriculture Handbook n. 651; 1988 [on line).
Disponvel em URL: http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasit (1999, Set 3) (Fig.
10.3). Laboratory Diagnosis of Parasitic Diseases. Emory Medical School
Course and Laboratory Training Unit Laboratory Consultation and Developed
Branch, CDC, Atlanta, Gergia, USA, 1966 (Fig. 12.3). Leica Aotec (Figs. 31.1,
31.2, 31.3, 31.4, 31.5). Burke JA. The clinical and laboratory diagnosis of
giardiasis. CRC Cr Rev Clin Lab Sci 1977;7:373-391 (Fig. 8.2). Moura RADA.
Colheita de Material para Exame de Laboratrio. Assegurando a
Qualidade dos Servios no Laboratrio Clnico. So Paulo: Editora Atheneu;
1998 (Fig. 8.4). Barreto MP, Zago Filho H. Comportamento de Trichomonas
vaginalis Donn, 1837 e de Trichomonas tenax (O.F. Mller, 1773) em meio
de cultura viscoso. Rev Brasil Biol 1957;17:501-508 (Fig. 25.1). Biomed
Diagnostic, 1743, Hudson Dr., So Jos, Ca, EUA (Fig. 25.2). Olympus Optical
Co., Ltd., Tquio, Japo (Fig. 33.1). Lushbaugh B. Coccidia & Microsporidia
[on line]. Disponvel em <URL: http://fiona.umsmed.edu> (1999, Jun 27) (Fig.
38.3). Pappas PW, Wardrop SM e Oklahoma State University, College of
Veterinary Medicine. Trichomonas vaginalis [on line]. Disponvel em <URL:
http://calvin.biosci.ohio-state-edu/~zoology> [1997, Jan 24] (Fig. 8.6). Collins R.
Protozoan parasites of the intestinal tract: A review of coccidia and microsporidia.
JAOA 1997;10:593-598 (Fig. 10.1). Schell SC. Parasitology manual. New York,
John Wiley & Sons, Inc., 1962 (Fig. 2.4). Neto Amato V, Campos R. Diagnstico
das Parasitoses Intestinais pelo Exame das Fezes. So Paulo: Livraria Editora
Artes Mdicas Ltda; 1968 (Fig. 38.33), Department of the Army, USA; 1961 (Fig.
38.34A). As outras microfotografias e desenhos foram entregues pelos autores
dos diferentes captulos. Tiana Tasca, MSc, farmacutica bioqumica e
pesquisadora, que, com segurana e dedicao, revisou os originais. Ao Professor
Srgio De Meda Lamb, Diretor da Faculdade de Farmcia da Pontifcia
Universidade Catlica do Rio Grande do Sul (PUCRS), pelo apoio e incentivo. Eu
sou extremamente grato a minha esposa Mirian e a minha filha Cristina, pela compreenso, alento e assistncia, durante os longos meses nos quais esse livro foi
submetido a interminveis revises.

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Sumrio

SEO 1 PARASITOS INTESTINAIS, 1


1. Colheita e Preservao da Amostra Fecal, 3
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 3
Colheita, 4
Fezes Emitidas Espontaneamente
Amostras Mltiplas, 5
Fezes Emitidas com o Uso de Laxantes, 7
Estabilidade das Amostras, 7
Preservao da Amostra Fecal, 7
Soluo de Formaldedo
Fixador de Schaudinn
Fixador de Schaudinn Modificado
Fixador lcool Polivinlico (Fixador APV)
Fixador lcool Polivinlico Modificado
Fixador Mertiolato-Iodo-Formaldedo (MIF)
Fixador Acetato de Sdio-cido Actico-Formaldedo (SAF)
Controle de Qualidade dos Preservadores, 21
Fixador Fenol-lcool-Formaldedo (PAF)
Albumina Fixadora de Mayer
2. Exames Macroscpico e Microscpico da Amostra Fecal Fresca
e Preservada, 27
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 27
Exame Macroscpico, 28
Simples Observao
Tamisao
Identificao de Proglotes de Taenia spp., 29
Mtodo do cido Actico Glacial
Mtodo de Campos
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Mtodo da Tinta da China


Exame Microscpico, 33
Exame Direto a Fresco
Preparaes Salinas
Coloraes Temporrias, 37
Solues de Iodo, 38
Soluo de Iodo de Lugol
Soluo de Iodo de Dobell e OConnor
Soluo de Iodo de DAntoni Modificada
Soluo de Quensel, 41
Soluo Tamponada de Azul-de-Metileno de Nair, 43
Soluo de Mertiolato-Iodo-Formaldedo (MIF), 46
Exame Direto para a Pesquisa de Ovos de Helmintos, 47
Mtodo do Esfregao Espesso de Celofane
Tcnicas de Concentrao, 49
Tcnicas de Flutuao
Flutuao em Soluo Saturada de Cloreto de Sdio
Flutuao em Soluo de Sulfato de Zinco
Flutuao em Soluo de Sulfato de Magnsio
Centrfugo-Flutuao em Sulfato de Zinco
Tcnicas de Sedimentao
Sedimentao Espontnea
Centrfugo-Sedimentao pela Formalina-ter ou
Centrfugo-Sedimentao pela Formalina-Acetato de Etila
Centrfugo-Sedimentao pelo Sulfato de Sdio-cido ClordricoTriton-ter (AMSIII)
Centrfugo-Sedimentao pelo Acetato de Sdio-cido Actico
Corante Iodo-Tricrmico para Sedimento
Tcnicas de Concentrao Especficas para Coccdios, 72
Centrfugo-Flutuao em Soluo de Sacarose
Centrfugo-Sedimentao pelo Formaldedo-ter Modificado
Centrfugo-Sedimentao pelo Hidrxido de Potssio
3. Preparao e Colorao de Esfregaos Permanentes,
Geraldo Attilio De Carli

83

Consideraes Gerais, 83
Coloraes Derivadas da Hematoxilina, 84
Colorao pela Hematoxilina Frrica, Segundo Heidenhain, Modificada
por Burrows
Colorao pela Hematoxilina Frrica, Segundo Heidenhain, Modificada
por Melvin e Brooke (FNP)
Colorao pela Hematoxilina Frrica, Segundo Heidenhain, Modificada
por Melvin e Brooke (FP)
Colorao pela Hematoxilina Frrica-cido Fosfotngstico
Colorao pela Hematoxilina Frrica-cido Clordrico
Coloraes pelo Tricrmico, 100
Mtodo de Wheatley
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Mtodo de Brooke
Mtodo de Yang e Scholten
Outros Mtodos de Colorao, 107
Colorao pela Tionina
Soluo de Fenol de Kohn
Colorao pelo Corante Clorazol Black E
Colorao pelo Corante Polychrome IV
4. Isolamento e Cultura de Larvas de Nematides, 115
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 115
Mtodo de Baermann-Moraes
Mtodo de Rugai, Mattos e Brisola
Cultura no Papel-Filtro em Tubo de Ensaio
Cultura no Papel-Filtro em Placa de Petri
Cultura de Larvas em Carvo
Cultura de Larvas de Strongyloides stercoralis em Placa de gar
5. Demonstrao e Quantificao de Ovos na Fezes,
Geraldo Attilio De Carli

129

Consideraes Gerais, 129


Mtodo de Stoll e Hausheer
Mtodo de Stoll Modificado
Mtodos Coprolgicos Quantitativos Especficos para o Diagnstico do
Schistosoma mansoni
Mtodo de Bell
Mtodo de Barbosa
Mtodo de Kato-Katz
Mtodo de Teesdale e Amin
6. Artefatos que Podem Ser Confundidos com Organismos
Parasitos, 141
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 141
Elementos em Trnsito
Elementos Derivados de Contaminao Externa
7. Expresso dos Resultados no Exame Parasitolgico das Fezes, 155
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 155
Expresso dos Resultados
Anexo, 159
Parasitos do Sangue, do Trato Geniturinrio e Exame Cultural de
Protozorios
Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

SEO 2 EXAME DE ASPIRADOS, DOS TECIDOS, DA URINA,


DAS SECREES E DE MATERIAL DE BIPSIA, 163
8. Exame de Outros Espcimes do Trato Intestinal e Sistema
Urogenital, 165
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 165
Pesquisa de Enterobius vermicularis, 165
Mtodo da Fita de Celofane Adesiva e Transparente
Mtodo do Swab de Vaselina e Parafina (VASPAR)
Aspirado Duodenal, 170
Mtodo da Cpsula Duodenal (Entero Test)
Sigmoidoscopia, 174
Material de Sigmoidoscopia: Exame Direto a Fresco
Material de Sigmoidoscopia: Esfregaos Permanentes Corados
Endoscopia, 178
Sistema Urogenital, 178
Tcnica da Trplice Concentrao da Urina
Tcnica da Urina Concentrada pela Centrifugao
Tcnica da Urina Concentrada pela Membrana Filtrante (Nuclepore)
Pesquisa de Trichomonas vaginalis, 184
Amostra
Colheita da Amostra
Preservao da Amostra
Exame Microscpico, 190
Exame Direto a Fresco
Preparaes Coradas
Corante Vaginal Identification of Pathogens (VIP)
Colorao pela Soluo de Iodo de DAntoni
Colorao de Giemsa
Exame das Culturas, 198
Imunodiagnstico, 199
9. Escarro, Aspirados, Material de Bipsia e Exame dos Tecidos, 207
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 207
Escarro, 207
Escarro Expectorado: Exame Direto a Fresco e Preparaes
Permanentes Coradas
Aspirados, 211
Exame dos Tecidos, 215
Pele
Mtodo do Fragmento Superficial da Pele (Retalho Cutneo)
Tecidos Muscular e Subcutneo
Reto e Bexiga
Raspados e Material de Bipsia Crnea

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SEO 3 PARASITOS EMERGENTES E OPORTUNISTAS, 221


10. Mtodos de Colorao para Coccdios Intestinais, 223
Geraldo Attilio De Carli
Hrcules Moura
Consideraes Gerais, 223
Cryptosporidium parvum
Cyclospora cayetanensis
Isospora belli
Mtodos de Colorao, 229
Mtodo de Henriksen-Pohlenz
Mtodo Modificado de Kinyoun (a Frio)
Mtodo Modificado de Ziehl-Neelsen (a Quente)
Mtodo Modificado da Safranina (a Quente)
Mtodo Modificado de Ziehl-Neelsen-Dimetilsulfxido (DMSO)
Mtodo de Heine
Colorao Negativa pela Fucsina-Fenicada
Mtodo Rpido da Safranina
Mtodo Modificado da Safranina (Forno de Microondas)
Colorao pela Hematoxilina Frrica Modificada
Anexo, 255
Mtodo Modificado de Kinyoun (a Frio)
Colorao de Giemsa
11. Mtodos de Colorao para Microspordios Intestinais,
Geraldo Attilio De Carli
Hrcules Moura

265

Consideraes Gerais, 265


Colorao pelo Chromotrope (Tricrmico Modificado) (Weber-verde)
Colorao pelo Chromotrope ou Modificao de Ryan (Ryan-azul)
Colorao pelo Chromotrope a Quente ou Modificao de Kokoskin
(a Quente)
Colorao de Gram-Chromotrope para Microspordios
Colorao Rpida a Quente pelo Gram-Chromotrope
Colorao pelo Chromotrope

SEO 4 PARASITOS DO SANGUE E DOS TECIDOS, 289


12. Exame do Sangue, 291
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 291
Preparao dos Esfregaos Sangneos, 292
Esfregaos Estirados
Esfregaos Espessos (Gota Espessa)

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Combinao de Esfregaos Estirados e Espessos


Colorao dos Esfregaos Sangneos, 296
Colorao de Giemsa
Colorao de Field
Colorao de Leishman
Colorao de Wright
Concentrao do Sangue, 305
Centrifugao do Sangue (Creme Leucocitrio)
Mtodo da Centrifugao Trplice
Tcnica das Fito-Hemaglutininas
Centrifugao do Micro-Hematcrito
Tcnicas da Diferena de Gravidade
Mtodo da Membrana Filtrante
13. Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi,
Mrio Steindel
Edmundo Carlos Grisard

313

Consideraes Gerais, 313


Mtodos Parasitolgicos, 314
Mtodos Diretos
Mtodos Indiretos
Mtodos Sorolgicos
Mtodos Moleculares
14. Leishmanioses, 325
Mrio Steindel
Edmundo Carlos Grisard
Consideraes Gerais, 325
Mtodos Parasitolgicos, 326
Leishmaniose Visceral, 328
Mtodos Imunolgicos
Mtodos Moleculares
15. Plasmodium spp., 333
Cor Jesus Fernandes Fontes
Consideraes Gerais, 333
Patogenia, 333
Destruio dos Eritrcitos Parasitados
Toxicidade Resultante da Liberao de Citocinas
Seqestro dos Eritrcitos Parasitados na Rede Capilar
Leso Capilar por Deposio de Imunocomplexos
Quadro Clnico, 334
Epidemiologia, 335
Imunidade, 335
Morfologia, 336
Diagnstico de Laboratrio, 339
Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Esfregao Espesso ou Esfregao Estirado


QBC (Quantitative Buffy Coat)
ParaSight-F e ICT Malaria PF
ICT Malaria PF/Pv e OpitMAL
16. Babesiose Humana, 345
Philippe Brasseur
Consideraes Gerais, 345
Mtodos Parasitolgicos, 345
Exame Microscpico
Imunodiagnstico, 347
Reao de Imunofluorescncia Indireta (RIFI)
Mtodos Moleculares, 348
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Inoculao em Animais, 348
Outros Resultados de Laboratrio, 349
Concluses, 349
17. Angiostrongilase Abdominal,
Carlos Graeff-Teixeira

351

Consideraes Gerais, 351


Diagnstico de Laboratrio, 352
Exame Anatomopatolgico
Imunodiagnstico
Mtodos Moleculares
Exame Parasitolgico das Fezes
18. Filarioses, 355
Geraldo Attilio De Carli
Tiana Tasca
Consideraes Gerais, 355
Diagnstico (Laboratorial) da Filariose, 356
Filariose pela Wuchereria bancrofti, 356
Filariose pela Mansonella ozzardi, 356
Filariose pela Onchocerca volvulus, 357
Exame a Fresco do Sangue, 357
Esfregaos Sangneos Espessos e Corados
Mtodo da Contagem em Cmara
Mtodos de Colorao, 359
Colorao de Giemsa
Colorao pela Hematoxilina de Delafield
Colorao pela Hematoxilina de Harris, segundo Mallory
Colorao pela Hematoxilina de Mayer
Colorao pela Hematoxilina de Bohmer

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Colorao pela Hematoxilina de Carrazzi


Mtodos e Tcnicas de Concentrao, 367
Tcnica de Knott
Mtodo da Membrana-Filtrante
Bipsia Cutnea
19. Diagnstico Laboratorial da Filariose Bancroftiana, 373
Gerusa Dreyer
Patrcia Dreyer
Consideraes Gerais, 373
Epidemiologia, 373
Consideraes Clnicas, 373
Diagnstico de Laboratrio, 373
Pesquisa de Microfilria
Pesquisa de Verme Adulto
Diagnstico Sorolgico
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Outros Exames Complementares

SEO 5 CULTIVO DE PROTOZORIOS,

395

20. Entamoeba histolytica, 397


Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 397
Meio Trypticase-Yeast Extract-Iron-Serum (TYI-S-33)
Meio Trypticase-Yeast Extract-Gastric Mucin (TYSGM-9)
Meio de Balamuth
Meio de Boeck and Drbohlav Locke-Egg-Serum (LES)
Meio de Robinson
21. Amebas de Vida Livre, 417
Geraldo Attilio De Carli
Hrcules Moura
Consideraes Gerais, 417
Amostras, 418
Cultura em Placa de gar
Meio Proteose Peptona-Extrato de Levedo-Glicose (PYG) para
Acanthamoeba spp., pH 6,5 0,2
Meio Modificado de Nelson para Naegleria fowleri
Exflagelao dos Organismos

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

22. Giardia lamblia, 429


Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 429
Meio Trypticase-Yeast Extract-Iron-Serum (TYI-S-33) Modificado
(Biosate-Iron-Serum) (BI-S-33).
Meio de Keister Modificao do Meio Trypticase-Yeast
Extract-Iron-Serum (TYI-S-33)
23. Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli e Leishmania spp, 435
Mrio Steindel
Edmundo Carlos Grisard
Consideraes Gerais, 435
Cepas-Padro, 436
Reagentes, 436
Meios de Cultura, 437
Meio Liver Infusion Tryptose (LIT)
Meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN)
Meio Brain Heart Infusion (BHI)
Meio de Schneider (Schneiders Insect Medium)
Meio Triatomine Artificial Urine (TAU)
24. Plasmodium falciparum, 447
Cor Jesus Fernandes Fontes
Consideraes Gerais, 447
Meio de Cultura de Trager e Jensen (RPMI 1640)
Criopreservao de Cepas de Plasmodium falciparum, 450
25. Trichomonas vaginalis, 453
Geraldo Attilio De Carli
Tiana Tasca
Consideraes Gerais, 453
Meios de Cultura, 454
Meio Trypticase-Yeast Extract-Maltose (TYM)
Meio Trypticase-Yeast Extract-Maltose (TYM) Modificado por Klass
Meio Trypticase-Yeast Extract-Maltose (TYM) Modificado por Kulda
e Hollander
Meio Simplified-Trypticase-Serum (STS)
Meio Cysteine-Peptone-Liver-Maltose (CPLM)
Meio de Feinberg e Whittington (FW)
Meio Cysteine-Tryptose-Liver-Maltose (CTLM), American Type
Culture Collection (ATTC) N. 745
Meio Semi-Slido de Lowe para Diagnstico e Transporte

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Meio Connaught Medical Research Laboratory 1066 (CMRL


Modificado)
Procedimentos de Inoculao em Meios de Cultura
InPouch TVTM
Criopreservao, 467
26. Trichomonas tenax e Trichomonas hominis, 473
Geraldo Attilio De Carli
Tiana Tasca
Consideraes Gerais, 473
Trichomonas tenax, 474
Meio TTYS-CEEC25 (Tryptose-Trypticase-Yeast Extract-Serum
Chick Embryo Extract, Crude 25%)
Tcnica de Isolamento
Trichomonas hominis, 477
27. Microspordios, 479
Marisa Porta Miche Hirschfeld
Maria Anete Lallo
Consideraes Gerais, 479
Cultivo de Microspordios em Culturas Celulares, 481
Cultura de Clulas
Processamento das Amostras Biolgicas e Inoculao nas Culturas
Celulares
Metodologia das Culturas Celulares Inoculadas
Concentrao e Purificao de Esporos, 485
Armazenamento e Transporte das Amostras, 486
Criopreservao, 486

SEO 6 IMUNODIAGNSTICO,

491

28. Testes Sorolgicos ou Imunoensaios, 493


Ana Lgia Bender
Consideraes Gerais, 493
Reaes de Precipitao, 493
Reaes de Aglutinao, 496
Ensaios Lticos, 498
Ensaios com Marcadores Fluorescentes, 498
Ensaios de Imunohistoqumica, 500
Ensaios com Marcadores Radioativos, 501
Ensaio de Quimioluminescncia (QL), 501
Ensaios com Marcadores Enzimticos, 501
Tcnicas de Imunoeletrotransferncia, 503

Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

29. Diagnstico Imunolgico das Parasitoses,


Adelaide Jos Vaz

505

Consideraes Gerais, 505


Imunologia das Parasitoses, 505
Fenmenos Imunolgicos, 506
Modelos de Estudo, 507
Diagnstico das Parasitoses, 507
Mtodos Diretos
Biologia Molecular Aplicada s Infeces Parasitrias
Mtodos Indiretos
Reao Cruzada e Reao Inespecfica, 509
Antgenos, 509
Imunoglobulinas/Anticorpos, 510
Testes Imunolgicos, 511
Princpio de Alguns Testes Imunolgicos, 511
Precipitao
Aglutinao
Reao de Fixao do Complemento
Mtodos Utilizando Ligantes, 514
Imunofluorescncia
Imunoenzimticos
Western ou Imunoblot
Radioimunoensaio (RIE), Quimioluminescncia e Outros
Parmetros dos Testes Imunolgicos, 517
Simplicidade e Custo dos Testes Imumolgicos, 518
Testes Imunolgicos nas Infeces Parasitrias, 518
Teste de Hipersensibilidade Imediata, 520
Teste de Hipersensibilidade Tardia, 520
Outros Testes de Imunidade Celular, 521
Marcadores Imunolgicos no Diagnstico de Algumas Infeces
Parasitrias, 521
Protozorios
Helmintos

SEO 7 BIOLOGIA MOLECULAR, 541


30. Mtodos Moleculares no Diagnstico das Parasitoses Humanas, 543
Edmundo Carlos Grisard
Mrio Steindel
Consideraes Gerais, 543
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), 544
Extrao de DNA
Dosagem de DNA
Iniciadores
Deoxinucleotdeos Trifosfatados
Tampo
Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

Taq DNA Polimerase


Termocicladores
Reao
Visualizao dos Resultados, 549
Aplicaes Prticas, 550
Genes de Interesse, 552
Cuidados com as Contaminaes, 552
Consideraes Finais, 552

SEO 8 IDENTIFICAO HISTOLGICA, 557


31. Tcnicas de Rotina em Histologia, 559
Emlio Antonio Jeckel-Neto
Consideraes Gerais, 559
Fixao, 560
Tipos de Fixao
Fixadores, 561
Solues Fixadoras de Rotina
Processamento de Tecidos, 562
Congelao, 563
Incluso em Meio Slido, 564
Cortes, 567
Colorao, 570
Corantes
Montagem, 572
Recomendaes Gerais, 573

SEO 9 CONTROLE DE QUALIDADE E BIOSSEGURANA, 575


32. Controle de Qualidade em Parasitologia Clnica, 577
Geraldo Attilio De Carli
Osmar Luiz M. de Oliveira
Consideraes Gerais, 577
Garantia de Qualidade
Controle de Qualidade Interno
Controle de Qualidade Externo
Material de Referncia
Manual de Procedimentos
Qualificao do Pessoal Tcnico
Equipamento
Morfometria Feita com Micrmetro Ocular
Protozorios e Helmintos Intestinais, 584
Colheita da Amostra Fecal

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Soluo Salina
Reagentes, Corantes e Outras Solues
Exame Direto a Fresco
Preservadores
Coloraes Temporrias
Coloraes Permanentes
Coloraes Especficas para Coccdios
Coloraes Especficas para Microspordios
Tcnicas de Concentrao
Isolamento e Cultura de Larvas de Nematides
Pesquisa de Enterobius vermicularis
Mtodo da Cpsula Duodenal (Entero Test)
Parasitos do Sangue e dos Tecidos, 595
Esfregaos Estirado e Espesso
Colorao de Esfregaos Sangneos
Tcnica de Knott
Mtodo da Membrana Filtrante
Exame de Outros Espcimes do Trato Intestinal e Sistema Urogenital, 598
Material de Sigmoidoscopia
Pesquisa de Trichomonas vaginalis
Escarro
Cultivo de Protozorios, 601
Trichomonas vaginalis
Entamoeba histolytica
Leishmania spp. e Trypanosoma (S) cruzi
Coleo de Parasitos de Referncia, 603
Parasitos da American Type Culture Collection (ATCC) para Controle
de Qualidade, 604
33. Manuteno de Instrumentos e Controle de Qualidade, 611
Tiana Tasca
Silvana de Almeida
Consideraes Gerais, 611
Autoclave
Banho de gua
Balana
Capelas de Segurana Biolgica
Centrfuga
Geladeira
Freezer
Estufas Microbiolgicas
Estufas de Esterilizao
Microscpio ptico
Termmetros

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34. Biossegurana em Laboratrio de Parasitologia, 623


Marco Mastroeni
Consideraes Gerais, 623
Biossegurana: Conceito e Importncia, 624
Nveis de Biossegurana, 625
Laboratrios Clnicos, 626
Equipamentos de Proteo, 626
Capelas de Segurana Biolgica, 627
Classificao dos Microrganismos por Classe de Risco, 630
Parasitos, 631
Protozorios
Nematides
Cestides
Trematdeos
Descontaminao do Material de Trabalho, 634
Boas Prticas de Laboratrio, 635
Comentrios, 636

SEO 10 IDENTIFICAO E DIAGNSTICO,


35. Microscopia ptica, 641
Suzana Bencke Amato
Consideraes Gerais, 641
Componentes do Microscpico ptico, 642
Fonte Luminosa
Condensador
Platina
Objetivas
Oculares
Iluminao Khler, 646
Morfometria Feita com Micrmetro Ocular, 646

36. Blastocystis hominis, 649


Geraldo Attilio De Carli
Marilise Brittes Rott
Consideraes Gerais, 649
Diagnstico de Laboratrio, 651
37. Pneumocystis carinii,
Luiz Carlos Severo

655

Consideraes Gerais, 655


Abordagem Diagnstica

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639

Colheita do Espcime Clnico


Diagnstico Etiolgico
Mtodo Rpido de Colorao pela Prata
38. Diagnstico e Identificao de Parasitos, 663
Geraldo Attilio De Carli
Tiana Tasca
Consideraes Gerais, 663
Protozorios Intestinais, 663
Protozorios com Diferentes Localizaes, 667
Protozorios do Sangue e dos Tecidos, 668
Nematides, 669
Cestides, 670
Trematdeos, 671
Diagnstico dos Protozorios Intestinais, 671
Amebas Intestinais, 672
Flagelados Intestinais, 679
Ciliados Intestinais, 683
Coccdios Intestinais, 684
Trichomonas spp., 686
Diagnstico dos Protozorios do Sangue e dos Tecidos, 688
Critrios para a Diferenciao das Espcies do Gnero Plasmodium, 690
Diagnstico dos Helmintos, 696
Nematides Intestinais, 702
Nematides do Sangue e dos Tecidos, 708
Cestides Intestinais, 711
Cestides dos Tecidos, 714
Trematdeos do Sangue, Fgado e Pulmes, 714
Parasitos Humanos de Importncia Clnica, 717
Parasitos Humanos e suas Localizaes Primrias, 720

SEO 11 APNDICE, 725


Apndice 1 Solues, Corantes, Reagentes, Fixadores, 727
Geraldo Attilio De Carli
Consideraes Gerais, 727
Anticoagulantes, 727
Corantes, 729
Preparaes Permanentes para Ovos e Larvas de Helmintos, 733
Fixadores/Preservadores, 735
Meios de Montagem, 740
Solues Salinas Balanceadas, 741
Solues Tamponadas, 742
Massa Molecular

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Soluo Molar (M)


Soluo Tamponada de Fosfatos (Srensen)
Soluo Tamponada de Fosfatos 0,2 M
Tampo PBS (Phosphate Buffer Solution), pH 7,2
Soluo para Limpeza de Vidraria
Apndice 2 Livros, Atlas, Abstracts e Peridicos, 747
Geraldo Attilio De Carli
Parasitologia Geral, Parasitologia Clnica e Medicina Tropical, 747
Livros
Atlas
Abstracts
Peridicos
Apndice 3 Parasitologia Humana Websites e Internet, 759
Geraldo Attilio De Carli
Fotografias, Figuras e Desenhos (Images), 759
Guia de Fontes de Pesquisa, 759
Parasitology Name Index, 759
Imagens de Parasitos, 763
Informaes sobre a Parasitologia, 764
Referncias Bibliogrficas, 764
Abreviaturas, 765
ndice Remissivo, 767

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1
Parasitos
Intestinais

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CAPTULO 1

CAPTULO

Colheita e Preservao
da Amostra Fecal
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
A maioria dos parasitos intestinais diagnosticada pelo exame
das fezes, embora outros materiais, como urina, escarro, secrees urogenitais, aspirados, tecidos, contedo duodenal e espcimes obtidos por bipsia, possam ser utilizados para a identificao de certas espcies. Os estgios usuais de diagnstico so
os ovos e as larvas de helmintos e os trofozotos, cistos, oocistos
e esporos de protozorios. Na realidade, uma identificao segura e correta de um parasito depende de critrios morfolgicos, os quais esto sujeitos a uma colheita bem feita e a uma
boa preservao dos espcimes fecais. No pode ser esquecido que um material fecal inadequadamente colhido, velho ou mal
preservado ser de pequeno valor para o diagnstico. Os espcimes submetidos ao exame em condies timas devero ser
colhidos recentemente, sem contaminao e convenientemente
preservados.
Freqentemente fragmentos de alimentos, clulas vegetais,
gros de plen, leuccitos, clulas de tecido animal e outros
artefatos presentes nas fezes podem assemelhar-se a certas
espcies de parasitos, mas um cuidadoso exame revelar caractersticas que determinaro o diagnstico do parasito. O bolo fecal
normal composto quase que exclusivamente de fezes, mas em
certas situaes uma poro do bolo pode ser constituda de sangue
e muco, ou ter considervel quantidade de tecido morto. Neste
Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 1

caso, essas pores da massa fecal evidenciam uma infeco parasitria,


quando no obstante, o exame das fezes pode fornecer um resultado negativo. Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, proglotes
de Taenia spp. e de Dipylidium caninum 26 podem ser encontrados no
bolo fecal, sem que a presena de ovos seja identificada. Por esta razo o
exame macroscpico deve sempre preceder ao exame microscpico 1,8,9,17,18,19,23,31 .
COLHEITA

FEZES EMITIDAS ESPONTANEAMENTE


A deteco e a identificao dos parasitos intestinais esto em relao
direta com a qualidade da amostra entregue ao laboratrio. Na colheita dos
espcimes fecais, vrios fatores devem ser considerados: tipo do recipiente,
volume, idade da amostra, as drogas e os compostos qumicos, que podem
interferir na realizao do exame. O paciente deve receber instrues impressas para facilitar a colheita das fezes. Cada amostra dever apresentar
no mnimo as seguintes informaes: nome do paciente, nmero de identificao, nome do mdico, data e horrio da colheita, a qual dever ser acompanhada de uma requisio mdica, indicando o procedimento laboratorial a
ser seguido. O recipiente deve ser limpo e seco, com boca larga, com capacidade aproximada de 250ml, para que possa receber uma amostra significativa e que tenha vedao hermtica, para impedir o derrame, permitindo
a preservao da umidade. A amostra seca na superfcie e nas bordas dever ser rejeitada. As fezes devem ser colhidas diretamente no frasco, ou
em urinol, ou, ainda, em jornal ou em papel limpo e transferidas diretamente
para o recipiente. O pote deve estar livre de anti-spticos, de agentes
germicidas, gotas de leo e de urina para evitar a destruio das formas
vegetativas. As fezes excretadas no solo no devem ser usadas, pois larvas
de vida livre e outros contaminantes provenientes do solo poderiam confundir o diagnstico. Fezes obtidas de privadas (latrinas) no podem ser aproveitadas, no somente devido ao risco de contaminao, mas porque a gua
e a urina poderiam destruir as formas trofozoticas.
Para permitir um exame macro e microscpico satisfatrio todo o bolo
fecal deve ser enviado ao laboratrio; caso este procedimento no possa ser
cumprido, uma quantidade mnima de 20 a 30g pode ser empregada na anlise. Esta conduta no somente abastece o laboratrio com suficiente material para a realizao de vrias tcnicas, como permite ao tcnico selecionar uma poro especfica para o exame. As fezes pastosas ou mucosas
so indicadas para a preparao de esfregaos corados e as pores formadas so empregadas nas tcnicas de concentrao. Os espcimes fecais
nunca devem ser incubados (37C) ou congelados antes do exame, exceto
para a pesquisa de oocistos de Cyclospora cayetanensis 32, esta amostra
permite estudos baseados na Biologia Molecular.
Certos medicamentos e produtos qumicos podem tornar a amostra
insatisfatria para a anlise ou para a pesquisa dos protozorios intestinais.
Entre estes, citam-se os antidiarricos, os antibiticos, os anticidos, deri Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 1

vados de bismuto e do brio, a vaselina e os leos minerais. A pesquisa


parasitolgica deve ser realizada antes do paciente ser submetido a um exame
radiolgico, com a administrao do contraste sulfato de brio. As amostras excretadas que contenham brio ou bismuto so inaceitveis para o exame,
visto que partculas desses produtos podem interferir no exame pelo excesso de substncias cristalinas, as quais podem destruir os trofozotos devido
sua ao abrasiva. A colheita deve ser retardada por um perodo de sete
a 10 dias.
Os antibiticos, como tetraciclina, afetam a flora intestinal normal e
freqentemente causam diminuio ou ausncia temporria dos organismos
nas fezes, visto que esses parasitos se alimentam de bactrias intestinais, e
um diagnstico seguro no possvel antes de duas a trs semanas. O nmero de amostras necessrias para a identificao de parasitos intestinais
varia de acordo com a qualidade do espcime, com a anlise que ser realizada e com a gravidade da infeco.
Os recipientes com amostras fecais, recebidos de pacientes com o vrus da imunodeficincia humana (HIV) e sua seqela, a sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS), devero ser protegidos por um invlucro de plstico e identificados com etiqueta vermelha ou HIV positivo1,18,23.
AMOSTRAS MLTIPLAS
A possibilidade de encontrar organismos aumenta pelo exame de amostras
mltiplas, em razo: a) da intermitncia da passagem de certos parasitos a
partir do hospedeiro; b) da distribuio no uniforme dos ovos dos helmintos;
c) dos estgios dos protozrios e d) das limitaes das tcnicas de diagnstico. Em uma nica passagem normal so revelados somente de um tero
metade das espcies presentes na massa fecal. Em geral os nematides, como
A. lumbricoides, ancilostomdeos e Trichuris trichiura, emitem ovos com
certa continuidade, os quais podem ser detectados diariamente nas fezes.
Em outras espcies de parasitos, especialmente nos protozorios, a emisso
dos estgios irregular. O nmero de cistos de Entamoeba histolytica que
passa junto com as fezes apresenta oscilaes dirias, e com picos cclicos
que ocorrem entre sete e 10 dias. Os cistos de Giardia lamblia apresentam intermitncia de passagem com intervalos que variam de dois a trs dias
para sete, oito ou mais dias. A produo de ovos tambm irregular em
certos helmintos, particularmente no gnero Schistosoma. As proglotes das
espcies de Taenia passam com interrupes, sendo prefervel obter as
proglotes em intervalos de dois a trs dias.
A emisso dos estgios de diagnstico varia com as diferentes espcies de parasitos. Nas infeces com Ascaris, Trichuris e ancilostomdeos
os ovos so emitidos continuamente. Entretanto, em outras infeces, como
na tenase, giardase, dientamebase e estrongiloidase, o nmero de estgios de diagnstico emitidos varia significativamente de um dia para outro,
podendo no serem detectados at que o paciente atinja a fase sintomtica.
As razes da emisso cclica dos estgios de alguns protozorios ainda no
est completamente entendida. Em alguns helmintos, incluindo o E. vermicularis
e a Taenia spp., os ovos so liberados somente esporadicamente, pelo ver Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 1

me intacto ou pelo rompimento das proglotes, resultando em distribuio


desigual no espcime fecal com variaes de um dia para o outro. Nos
parasitos que habitam o intestino delgado (Strongyloides stercoralis,
ancilostomdeos, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e G.
lamblia) ou prximo ao intestino grosso (outros protozorios e helmintos
produtores de ovos) os estgios de diagnstico usualmente esto distribudos irregularmente no espcime fecal. Os parasitos que infectam o reto e o
baixo clon podem tambm apresentar uma distribuio anormal no bolo fecal.
Os vermes adultos do esquistossomo, dependendo da espcie, ovipem nas
pequenas vnulas do intestino ou na bexiga. Nos pacientes com colite amebiana
(E. histolytica) pode haver uma relao entre a emisso fecal dos trofozotos,
que so mais numerosos na superfcie do que no centro das fezes emitidas,
e as reas ulceradas do clon.
No existe uma uniformidade de conduta relacionada com o nmero de
amostras que devam ser colhidas. Como a maioria dos estgios de diagnstico no aparece no material fecal em nmero constante todos os dias, a
colheita das fezes em dias alternados propiciar uma porcentagem maior de
resultados positivos. Um procedimento aconselhvel colher, em dias separados, uma srie de trs espcimes em no mais de 10 dias ou uma srie
de seis amostras, em dias alternados, dentro de 14 dias. Fezes emitidas espontaneamente apresentam uma probabilidade maior de conter cistos, os quais
podem ser identificados com maior confiabilidade do que os trofozotos.
O nmero de amostras necessrias para a demonstrao de parasitos
intestinais varia de acordo com a qualidade dos espcimes submetidos ao
estudo; a exatido das anlises realizadas e com a gravidade da infeco.
Alguns autores recomendam, no mnimo, a colheita de trs amostras antes
de iniciar o tratamento, duas obtidas atravs de evacuaes normais e a terceira
depois da administrao de um laxante29. Aps o tratamento, devero ser
colhidas trs amostras. Um novo exame dever ser realizado trs a quatro
semanas aps o tratamento dos pacientes que receberam medicao para
protozrios. Nos casos de infeces por helmintos o controle se efetuar
uma a duas semanas aps o tratamento; para as tnias, um novo exame ser
necessrio aps cinco a seis semanas.

O BSERVAES
1. A criptosporidiose sintomtica usualmente est associada a um substancial nmero de oocistos nas fezes, tornando facultativa a necessidade da
concentrao das fezes antes da aplicao dos mtodos diretos de diagnstico (esfregaos permanentes corados).
2. O nmero de oocistos varivel, mesmo nas fezes lquidas, e por
esta razo amostras mltiplas de fezes devem ser testadas antes de reportar um diagnstico como negativo.
3. Os oocistos da Cyclospora cayetanensis so excretados intermitentemente, esporadicamente e raramente em pequeno nmero; logo, algumas tcnicas para concentrar oocistos tm sido usadas com freqncia como
parte da rotina dos procedimentos de diagnstico13,33.

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CAPTULO 1

FEZES EMITIDAS COM O USO DE LAXANTES


Em alguns casos, fezes liquefeitas, obtidas pela administrao de laxantes, so necessrias para estabelecer e confirmar os diagnsticos de
amebase, giardase e estrongiloidase. O uso de laxantes requer solicitao mdica e indicado nos casos em que uma srie de exames for negativa. So recomendados laxantes salinos, como o fosfato de sdio e o
sulfato de sdio tamponado, porque causam menos danos morfolgicos aos
parasitos. No so indicados os leos minerais, os compostos de bismuto
e de magnsio, pois os glbulos de leo interferem no exame, os restos de
cristais de bismuto e de magnsio podem obscurecer os organismos, ou
afetar a aparncia dos trofozotos. Todas as fezes induzidas por purgativos devem ser totalmente colhidas e levadas imediatamente ao laboratrio. Caso este procedimento no possa ser obedecido, uma frao do material
dever ser preservada com o fixador lcool polivinlico (fixador APV). No
material obtido aps a catarse so pesquisados ovos, larvas, cistos e
trofozotos. A prtica do uso de purgativos indicada para clnicas e hospitais, onde teoricamente os espcimes fecais so recebidos pelo laboratrio imediatamente aps a colheita.
ESTABILIDADE DAS AMOSTRAS
O tempo de colheita das amostras fecais influi de maneira direta na
identificao dos parasitos. Desde que os trofozotos de protozorios no se
multiplicam ou se encistam fora do corpo humano, eles morrem e se degeneram aps a excreo das fezes. O tempo de exame recomendado para
os espcimes lquidos de 30 minutos, enquanto as amostras pastosas devem ser examinadas dentro de uma hora aps a evacuao; no sendo possvel observar esta orientao, o material dever ser preservado. Os limites
de tempo no so crticos quando se tratam de amostras slidas, podendo
ser estudadas dentro de 24 horas aps a excreo. Neste caso, uma poro
do espcime pode ser preservada e outra refrigerada. Quando os critrios
indicados para a colheita e exame das amostras fecais no puderem ser observados, o laboratrio dever solicitar uma amostra adicional.
PRESERVAO DA AMOSTRA FECAL
Para preservar a morfologia dos protozorios e prevenir um contnuo
desenvolvimento de alguns ovos e larvas de helmintos, as amostras fecais
que no forem entregues ao laboratrio imediatamente aps a passagem
devero ser preservadas. Os espcimes no preservados podem ser temporariamente refrigerados (3C a 5C) em recipientes hermeticamente fechados para evitar o dessecamento e imediatamente aps, enviados ao laboratrio. Nessas temperaturas os ovos, as larvas e os cistos mantm-se viveis
durante vrios dias, enquanto as larvas de S. stercoralis e dos ancilostomdeos
podero sofrer alteraes morfolgicas. A preservao permanente de
trofozotos, cistos, ovos e larvas realizada atravs de vrios preservadores,
como formalina, mertiolato-iodo-formaldedo (MIF), acetato de sdio-cido
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CAPTULO 1

actico-formaldedo (SAF), lcool polivinlico (fixador APV), lquido de


Schaudinn e fenol-lcool-etlico-formaldedo (PAF) (Tabela 1.1).
Os mesmos protocolos, procedimentos e medidas de segurana desenvolvidos para os espcimes fecais coletados para o diagnstico de outras
parasitoses intestinais so aplicados para os organismos C. parvum e
Cyclospora cayetanensis. As fezes, na pesquisa de oocistos desses coccdios,
podem ser examinadas frescas ou preservadas na soluo tamponada de
formaldedo a 10% (v/v), como tambm emulsificadas na soluo de bicromato
de potssio a 2,5% (m/v). Nessa soluo os oocistos de C. parvum estocados temperatura de 4C permanecem viveis durante trs meses, podendo manter sua infectibilidade, em alguns casos, por mais de 12 meses. Essa
soluo no preservadora, entretanto usada na rotina como um meio de
armazenamento e de manuteno da viabilidade dos oocistos. Portanto, para
tornar os oocistos inviveis recomendado preservar os espcimes fecais
na soluo tamponada de formaldedo a 10% ou no fixador acetato de sdiocido actico-formaldedo (SAF). O tempo necessrio de contato entre as
fezes e a soluo tamponada de formaldedo a 10% para matar os oocistos
no est determinado, entretanto estimado o perodo de 18 a 24 horas. A
soluo tamponada de formaldedo a 10% apresenta a vantagem de preservar os oocistos, destruir o seu poder patognico e inativar outros agentes
infecciosos. A soluo fixadora lcool polivinlico (fixador APV) no recomendada para a preservao de oocistos devido a sua incompatibilidade
com os mtodos de colorao derivados de Ziehl-Neelsen e com as tcnicas de concentrao1,23. Alguns parasitologistas recomendam armazenar os
Tabela 1.1
Amostras Fecais: Preservadores Usados no Diagnstico Parasitolgico
Preservadores

Estgio de
Diagnstico

Exame Direto
a Fresco

Tcnicas de
Concentrao

Colorao
Permanente

C, O, L

Sim

Sim

Sim (HF frrica


ou Tr)

C, O, L, Oc
C, O, L, Oc

No
No

Sim
Sim

C, O, L

No

Sim

Lquido de Schaudinn T, C

No

No

Schaudinn mod.
(sem APV)
APV

T, C

No

No

T, C, O

No

Sim

APV mod.

T, C, O

No

Sim

SAF
PAF

T, C, O, Oc
T, C, O, L

No
No

Sim
No

Temporria
Refrigerao 3-5C
Permanente
Formalina 5-10%
Formalina tamponada
5-10%
MIF

Corante
Polychrone IV
Sim (HF frrica
ou Tr)
Sim (HF frrica
ou Tr)
Sim (HF frrica
ou Tr)
Sim (HF frrica
ou Tr)
Sim (HF frrica)
Tionina/Azur A

T = trofozoto; C = cisto; O = ovo; L = larva; Oc = oocisto; Schaudinn mod. = Schaudinn


modificado; APV = fixador lcool polivinlico; APV mod. = fixador lcool polivinlico modificado; MIF = mertiolato-iodo-formaldedo; SAF = acetato de sdio-cido actico-formaldedo;
PAF = fenol-lcool etlico-formaldedo, HF = hematoxilina frrica; Tr = tricrmico.

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CAPTULO 1

oocistos de C. parvum em solues salinas balanceadas suplementadas com


antibiticos, como a soluo de Hanks (HBSS), com 10.000UI/ml de penicilina, 10mg/ml de estreptomicina, 0,05g/ml de anfotericina B e 500UI/ml de
nistatina11.
Na pesquisa de oocistos de Cyclospora cayetanensis uma parte da
amostra no preservada pode ser congelada 33 . Essa amostra permite o
armazenamento por um longo perodo de tempo, a realizao de diferentes
avaliaes e, principalmente, estudos baseados na Biologia Molecular (reao em cadeia da polimerase PCR), os quais no poderiam ser realizados com amostras fecais formolizadas24.
Os esporos dos microspordios so preservados pela soluo tamponada
de formaldedo a 10%.

SOLUO

DE

FORMALDEDO

A formalina (soluo de formaldedo) usada para a preservao dos


estgios de diagnstico de protozorios e helmintos. Duas concentraes so
recomendadas: 5% para a preservao de cistos de protozorios e 10% para
oocistos de coccdios, esporos de microspordios, ovos e larvas de helmintos.
Na rotina, a soluo a 5% preferida soluo a 10%, porque os cistos e
os ovos de Hymenolepis nana, H. diminuta e larvas de S. stercoralis podero ser distorcidos e/ou alterados. Os ovos de A. lumbricoides e, algumas vezes, de T. trichiura continuam o seu desenvolvimento nas concentraes de 5%, no havendo interferncia na identificao dessas espcies.
A soluo de formaldedo a quente (60C) pode tambm ser usada para
espcimes que contenham ovos, desde que a fixao a frio no impede o
desenvolvimento embrionrio de muitos ovos, os quais tornam-se infectivos
e permanecem viveis por longos perodos. A formalina no recomendada para a fixao de trofozotos. A soluo de formaldedo neutra mais
eficaz na manuteno das caractersticas morfolgicas, especialmente na
fixao de cistos. Por esta razo indicada a soluo de formaldedo tamponada
com fosfato de sdio1,18,23.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Formaldedo 37-40% (HCHO)


Soluo salina a 0,85%
Hidrogenofosfato dissdico (Na2HPO4.7H2O)
Diidrogenofosfato de sdio (NaH2PO4.H2O)

Preparao das Solues


1. Soluo de Formaldedo a 5% e 10% (v/v)
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

10ml
90ml

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CAPTULO 1

2. Soluo Salina de Formaldedo a 5% e 10% (v/v)


Formaldedo 37-40%

5ml

10ml

Soluo salina a 0,85%

95ml

90ml

3. Soluo Tamponada de Formaldedo a 5% e 10%


Hidrogenofosfato dissdico

6,10g

0,10g

Diidrogenofosfato de sdio

0,15g

0,15g

Formaldedo 37-40%

400ml

800ml

gua destilada-deionizada

7.600ml

7.200ml

Misturar o formaldedo com a gua. Adicionar os sais Na 2HPO 4 e


NaH2PO4 e agitar vigorosamente. Para a rotina diria aconselha-se preparar quantidades pequenas: para cada litro de soluo de formaldedo a 5%
ou 10%, adicionar 0,8g da mistura tampo. A gua destilada-deionizada poder
ser substituda pela soluo salina a 0,85% para a preparao de soluo
salina tamponada de formaldedo.
4. Soluo Salina a 0,85% ou Soluo Fisiolgica (m/v)
Cloreto de sdio (NaCl)

0,85g

gua destilada-deionizada

100ml

Preservao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar uma poro de fezes em trs volumes de soluo de formaldedo.
3. A soluo aquosa de formaldedo permite somente o exame a fresco, no sendo indicada para a preparao de esfregaos corados para a
identificao de protozorios intestinais.
4. Certos protozorios e helmintos apresentam problemas fixao;
entre eles esto os cistos de E. histolytica, ovos de H. nana e larvas rabditides
de S. stercoralis.
5. Os outros parasitos so facilmente fixados e permanecem por longo perodo em timas condies para anlise.
Observaes: O formaldedo comercial apresenta a concentrao de
37-40% de soluo de HCHO, embora para a diluio considera-se 100%
(ver Apndice 1 e p. 9).
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10

CAPTULO 1

REVISO: SOLUO DE FORMALDEDO A 5% E 10%


(TAMPONADA E NO TAMPONADA)
Vantagens: a) excelente preservador de amostras fecais (cistos, oocistos
e esporos de protozorios e ovos e larvas de helmintos) para as tcnicas de concentrao; b) de fcil preparao e longo perodo de validade; c) o sedimento concentrado pode ser usado para a preparao de
esfregaos permanentes corados pelos derivados de Ziehl-Neelsen e com
kits para o diagnstico com monoclonais e d) os organismos so fixados em duas a quatro horas, exceto o A. lumbricoides.
Desvantagens: a) no preserva os trofozotos dos protozorios e b) a
morfologia dos organismos no preservada adequadamente para as
coloraes permanentes.

FIXADOR

DE

SCHAUDINN

O fixador de Schaudinn30 freqentemente usado na preservao de fezes


frescas ou amostras da superfcie da mucosa intestinal. Esta soluo fixadora
usada para a preparao de esfregaos permanentes corados para a demonstrao de protozorios intestinais. O grande problema do fixador de Schaudinn a
presena do cloreto de mercrio-II na sua frmula, substncia txica ao homem
e ao meio ambiente. Os frascos devero ser etiquetados como VENENO15,16,18.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Cloreto de mercrio-II (ou mercrico) (HgCl2)


lcool etlico a 95% (C2H 6O)
cido actico glacial (C2H4O2)
Glicerina (C3H8O3)

Preparao das Solues


1. Soluo Aquosa Saturada de Cloreto de Mercrio-II
Cloreto de mercrio-II
gua destilada-deionizada

110g
1.000ml

Dissolver o HgCl2 em gua destilada-deionizada quente. Aquecer em


banho de gua at a completa dissoluo do sal. Deixar esfriar e filtrar a
soluo. Estocar em recipiente de vidro com tampa esmerilhada.
2. Soluo Estoque
Soluo aquosa de cloreto de mercrio-II

600ml

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CAPTULO 1

11

lcool etlico a 95%


Glicerina

300ml
15ml

3. Soluo Fixadora
Soluo estoque
cido actico glacial

100ml
5ml

Adicionar o cido actico glacial, imediatamente, antes do uso.


Preservao da Amostra
1. Esfregaos estirados devem ser preparados com as amostras fecais
frescas.
2. Aps a preparao, mergulhar as lminas durante 30 minutos no
fixador.
3. Terminada a fixao, os esfregaos esto prontos para serem corados, montados e examinados.
Controle de Qualidade: Fixador de Schaudinn
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher sangue venoso em tubo de centrfuga de 15ml contendo EDTA
(usar sangue com alta contagem de leuccitos). Agitar com cuidado.
3. Centrifugar (300 x g por dois minutos) e remover a camada de leuccitos.
4. Misturar os leuccitos com aproximadamente 2 a 4g de fezes frescas pastosas. Agitar com cuidado.
5. Colocar em lmina de microscopia, perto de uma das extremidades,
uma gota da mistura fezes-leuccitos. Com outra lmina, estirar a mistura
da direita para a esquerda, em direo ao lado oposto. Preparar vrios
esfregaos e mergulhar imediatamente na soluo fixadora de Schaudinn.
Com a finalidade de garantir melhor fixao, as lminas so colocadas na
soluo fixadora de Shaudinn com a face do esfregao virada para baixo,
ou em cubas de Coplin, que podem ser usadas nessa fase do processo de
colorao.
6. Aps a colorao, se os leuccitos estiverem bem fixados, apresentando morfologia tpica, todos os protozorios intestinais fixados no mesmo
lote do fixador de Schaudinn sero muito bem fixados, indicando que a amostra
fecal estava fresca e fixada dentro dos limites recomendados de tempo.
7. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio, seguir o plano de ao para resultados fora de controle8,9,17.
Observaes: Os esfregaos fixados pelo Schaudinn apresentam excelentes resultados de colorao quando corados pela hematoxilina frrica
segundo Heidenhain ou pelo tricrmico.
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12

CAPTULO 1

REVISO: FIXADOR DE SCHAUDINN


Vantagens: a) usado para a preservao de fezes frescas ou amostras da superfcie da mucosa intestinal; b) produz excelente preservao dos trofozotos e cistos de protozorios; e c) os esfregaos fixados
pelo Schaudinn apresentam timos resultados de colorao quando corados pela hematoxilina-frrica, segundo Heidenhain ou pelo tricrmico.
Desvantagens: a) no recomendado para as tcnicas de concentrao; b) contm na frmula cloreto de mercrio-II e c) apresenta fraca
capacidade de adeso lmina quando usado com espcimes lquidos ou mucides.

FIXADOR

DE

SCHAUDINN MODIFICADO

Horen20 substituiu o cloreto de mercrio-II (HgCl2) pelo sulfato de cobre


(CuSO4.5H2O) na formulao do fixador de Schaudinn, como tambm na
preparao do fixador lcool polivinlico (fixador APV). A resina lcool
polivinlico (APV) se dissolve mais rapidamente no fixador modificado do
que no convencional fixador de Schaudinn9,10,18,20.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Sulfato de cobre II (ou cprico) (CuSO4.5H2O)


lcool etlico a 95% (C2H6O) (v/v)
cido actico glacial (C2H4O2)
Glicerina (C3H8O3)

Preparao das Solues


1. Soluo de Sulfato de Cobre
Sulfato de cobre II.5H2O
gua destilada-deionizada

20g
1.000ml

Dissolver o CuSO4.5H2O em gua destilada-deionizada quente. Deixar esfriar. Armazenar em recipiente de vidro com tampa esmerilhada.
2. Soluo Estoque
Soluo de sulfato de cobre II
lcool etlico a 95%
Glicerina

600ml
300ml
15ml

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CAPTULO 1

13

Armazenar at o momento do uso.


3. Soluo Fixadora
Soluo estoque
cido actico glacial

100ml
5ml

Adicionar o cido actico glacial, imediatamente, antes do uso.

FIXADOR LCOOL POLIVINLICO (FIXADOR APV)


Brooke e Goldman3 desenvolveram a soluo fixadora lcool polivinlico
(fixador APV). O lcool polivinlico uma resina solvel em gua, que
incorporada ao fixador de Schaudinn. Quando fezes e o fixador APV so
misturados e estirados sobre uma lmina de microscopia, o p APV age como
um adesivo para o material fecal. A adeso devida aos componentes da
resina e a fixao ao lquido de Schaudinn. A soluo fixadora APV indicada para cistos e trofozotos, os quais so conservados de meses a anos.
A grande vantagem do uso do fixador APV est na preparao de esfregaos
permanentemente corados, sem que os organismos sejam danificados, como
nas tcnicas de concentrao (sedimentao) que podero ser realizadas a
partir de fezes preservadas. A soluo fixadora APV estvel por seis meses
a um ano, quando conservada em frasco hermeticamente fechado. O frasco dever conter uma etiqueta com a data de validade e a identificao do
fixador como VENENO15,16,18. O APV fabricado por diferentes produtores, mas os graus de hidrlise e a baixa ou mdia viscosidade so importantes para a preparao da soluo fixadora. O APV (Evanol) fabricado
pela J.T. Baker Co. e pela Eastman Chemical Co., EUA.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

Fixador de Schaudinn (ver p. 11)


lcool etlico a 95% (C 2H6O) (v/v)
cido actico glacial (C2H4O2)
Glicerina (C3H8O3)
lcool polivinlico (APV), p

Preparao das Solues


1. Fixador APV, segundo Burrows 4,5
Fixador de Schaudinn
cido actico glacial
Glicerina
APV, p

93,5ml
5ml
1,5ml
5g

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14

CAPTULO 1

2. Fixador APV, segundo Brooke e Goldman 3


Fixador de Schaudinn
cido actico glacial
Glicerina
lcool etlico a 95%
APV, p

125ml
10ml
3ml
62,5ml
10g

3. Preparao da Soluo Fixadora APV


1. Misturar em um beaker os componentes lquidos.
2. Adicionar lentamente, sem agitao, o p APV.
3. Deixar a mistura em repouso de 18 a 24 horas para permitir que o
p APV seja embebido pelos lquidos. Cobrir o beaker com uma tampa de
placa de Petri ou com papel-alumnio.
4. Aps, aquecer a soluo lentamente at 75C. Quando a temperatura for atingida, remover o beaker do aquecimento e agitar a mistura at
uma completa homogeneizao. Uma soluo viscosa clara e levemente
esbranquiada obtida em 30 segundos.
5. Estocar o preservador APV em frasco de plstico com tampa de
rosca ou em um frasco de vidro com tampa esmerilhada.
Observaes: Pequenas quantidades do fixador APV podem ser mantidas em frasco conta-gotas para a rotina diria.
Preservao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Para obter todas as vantagens do fixador APV como preservador,
as amostras fecais devem ser vigorosamente misturadas com a soluo fixadora
imediatamente aps a excreo, antes que os organismos alterem as suas
caractersticas morfolgicas.
3. Usar aproximadamente trs partes do fixador para uma parte de fezes.
4. O material fecal pode ser misturado com o fixador APV em lminas de microscopia para a preparao de esfregaos ou em frascos.
5. A preparao e a fixao direta em esfregaos so indicadas quando
a quantidade de material pequena e/ou quando os trofozotos so identificados em esfregaos salinos, havendo a necessidade de uma colorao permanente para a confirmao final do diagnstico.
6. A preservao do material fecal em frascos aconselhada para
a rotina diria, quando o laboratrio recebe uma quantidade satisfatria de
fezes.
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CAPTULO 1

15

Preservao Direta em Esfregaos


1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar trs gotas do fixador APV em uma lmina de microscopia
e emulsificar uma gota de fezes com o preservador.
3. Preparar um esfregao fino, estirando a mistura sobre um tero da
superfcie da lmina e, aps, coloc-la na posio horizontal para secar
temperatura ambiente ou na estufa a 37C.
4. Os esfregaos secos permanecem viveis para a colorao durante meses. Melhores resultados so obtidos quando a colorao realizada
dentro de um perodo de dois meses aps a preparao dos esfregaos.
5. A soluo do fixador APV no recomendada para espcimes de
pacientes com o vrus da imunodeficincia humana (HIV) e de sua seqela,
a sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS).
6. Os oocistos de coccdios preservados com o fixador APV no apresentam bons resultados quando corados pelos mtodos derivados de ZiehlNeelsen (fucsina-fenicada).
Preservao em Frascos
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Uma parte da amostra vigorosamente misturada em um frasco com
trs ou mais partes do fixador APV.
3. O mtodo de preservao em frascos um excelente procedimento para enviar material fecal preservado para um laboratrio central de referncia ou com propsitos de ensino e/ou de treinamento.
Controle de Qualidade: Fixador lcool Polivinlico
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar aproximadamente 2g de fezes frescas pastosas com 10ml
do fixador APV (soluo pronta para o uso).
3. Adicionar vrias gotas de sedimento de leuccitos (como foi descrito no fixador de Schaudinn) mistura do fixador APV-fezes.
4. Depois de 30 minutos de fixao, colocar em lmina de microscopia,
perto de uma das extremidades, uma gota do material (mistura de fezesfixador APV-leuccitos). Com outra lmina, estirar a mistura da direita para
a esquerda, em direo ao lado oposto. Deixar secar (60 minutos temperatura ambiente e 30 minutos a 35C) e corar.
5. Aps a colorao, se os leuccitos estiverem bem fixados, apresentando morfologia e colorao tpica, todos os protozorios intestinais fixados
no mesmo lote do fixador APV sero muito bem fixados, mostrando que a
amostra fecal estava fresca e fixada dentro dos limites recomendados de tempo.
6. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio, seguir o plano de ao para resultados fora de controle 9,18.
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16

CAPTULO 1

Observaes: Os esfregaos fixados pelo fixador APV apresentam


excelentes resultados de colorao quando corados pela hematoxilina frrica,
segundo Heidenhain, ou pelo tricrmico. O cloreto de mercrio-II foi substitudo pelo sulfato de cobre ou pelo sulfato de zinco na frmula dos novos
preservadores, com o objetivo de aumentar a qualidade de preservao da
morfologia dos protozorios na colorao de esfregaos permanentes. O sulfato
de zinco mostrou ser um excelente substituto do mercrio, podendo ser usado na colorao de esfregaos permanentes corados pelo tricrmico. Apesar de estar sendo usado com muita freqncia, a sua frmula no foi divulgada e continua sendo propriedade de diferentes laboratrios15,16,18.

REVISO: FIXADOR LCOOL POLIVINLICO


(FIXADOR APV)
Vantagens: a) excelente preservador de trofozotos e cistos de
protozorios para colorao de esfregaos permanentes; b) muito boa
adeso das amostras fecais lmina; c) longo perodo de validade (meses
a anos); d) os esfregaos fixados apresentam timos resultados de
colorao quando corados pela hematoxilina-frrica, segundo Heidenhain,
ou pelo tricrmico e e) os organismos so fixados em uma a duas horas.
Desvantagens: a) contm na frmula cloreto de mercrio-II (fixador
de Schaudinn); b) de difcil preparao no laboratrio; c) no indicado para as tcnicas de concentrao; d) amostras preservadas pelo fixador
APV no podem ser usadas na colorao de esfregaos permanentes
corados pelos derivados de Ziehl-Neelsen (fucsina-fenicada); e) ovos
de T. trichiura e cistos de G. lamblia no so facilmente concentrados como nos fixadores que possuem na frmula a formalina; f) a
morfologia das larvas de S. stercoralis alterada e os oocistos de
Isospora belli podem no ser visveis nas amostras preservadas pelo
fixador APV e g) torna-se branco ou gelatinoso quando comea a desidratar ou quando refrigerado. O material preservado no fixador APV
no pode ser usado nos testes imunolgicos.

FIXADOR LCOOL POLIVINLICO MODIFICADO


Reagentes
1. Sulfato de cobre II (ou cprico) (CuSO4.5H2O)
2. lcool etlico a 95% (C2H6O) (v/v)
3. cido actico glacial (C2H4O2)

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CAPTULO 1

17

Preparao das Solues (fixador de Schaudinn modificado)


1. Soluo de Sulfato de Cobre
Sulfato de cobre
gua destilada-deionizada

20ml
1.000ml

Dissolver o CuSO4.5H2O em gua quente. Aquecer em banho de gua


at a completa dissoluo do sal. Deixar esfriar e filtrar a soluo.
2. Fixador APV Modificado (soluo estoque)
Soluo de sulfato de cobre
lcool etlico a 95%

600ml
300ml

3. Soluo Fixadora
Soluo estoque
100ml
cido actico glacial
5ml
Adicionar o cido actico glacial imediatamente antes do uso.
REVISO: FIXADOR LCOOL-POLIVINLICO MODIFICADO
Vantagens: a) as tcnicas de concentrao e esfregaos permanentes
corados podem ser realizados a partir das fezes preservadas e b) no
contm na frmula cloreto de mercrio-II.
Desvantagens: a) a morfologia dos protozorios bastante alterada quando a preservao realizada com sulfato de cobre; entretanto, a morfologia dos organismos apresenta-se melhor quando na preservao usado
sulfato de zinco e b) a visualizao dos organismos bastante difcil.

FIXADOR MERTIOLATO-IODO-FORMALDEDO (MIF)


Sapero e Lawless 27 e Sapero, Lawless e Strone 28 descreveram o
corante-fixador mertiolato-iodo-formaldedo (MIF). Esse corante permite obter
ao mesmo tempo a preservao e a colorao de quase todos os estgios
dos protozorios, de ovos e larvas de helmintos que se encontram nas fezes. Este procedimento possibilita tambm um exame direto a fresco imediato do material fecal ou depois de vrias semanas, sem a necessidade de
outra colorao. Entretanto, com freqncia, esta conduta no apresenta bons
resultados no diagnstico de todos os protozorios intestinais, sendo necessria a preparao de outros esfregaos para uma colorao permanente.
Este processo de fixao apresenta certas desvantagens, como a precipitao do iodo da soluo conservadora12. O corante-fixador MIF composto
por duas solues estoques mantidas separadamente em frascos mbar e
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18

CAPTULO 1

misturadas, imediatamente antes do uso. Este mtodo indicado para trabalhos de campo. Blagg e cols. 2 mostraram que o sedimento resultante da
centrifugao do material fecal conservado pelo MIF apresenta melhores
resultados do que o exame direto a fresco com o MIF na pesquisa de
protozorios e ovos de helmintos intestinais.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

Formaldedo 37-40% (HCHO)


Tintura de mertiolato (Timerasol), n. 99, 1:1.000 (Lilly)
Glicerina (C3H8O3)
Iodeto de potssio, forma cristalina (KI)
Iodo, forma cristalina (I2)

Preparao das Solues


1. Soluo I (Soluo estoque MF, estvel)
Glicerina
Formaldedo 37-40%
Tintura de mertiolato, 1:1000
gua destilada-deionizada

2ml
10ml
80ml
100ml

Manter a soluo em frasco mbar.


2. Soluo II (Soluo de Iodo de Lugol)
Iodo, cristais
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

5g
10g
100ml

O iodeto de potssio dissolvido em gua e o iodo adicionado lentamente com agitao at sua completa dissoluo. Filtrar e manter a soluo em frasco mbar.
Preservao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar 9,4ml da Soluo I com 0,6ml da Soluo II, imediatamente antes do uso, pois o iodo pode causar uma densa precipitao, impedindo
uma boa colorao dos protozorios.
3. Misturar, vigorosamente, uma parte de fezes frescas para duas a
trs partes da soluo MIF.
4. Para examinar, colher uma gota do lquido junto ao sedimento ou
na fase intermediria.
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CAPTULO 1

19

Observaes
1. A soluo fixadora MIF instvel; recomendado preservar as fezes
na Soluo I (MF) e adicionar a Soluo II ao sedimento, no momento do exame.
2. Coutinho10 substituiu o mertiolato na Soluo I por igual volume de
mercuriocromo a 0,2%.
REVISO: MERTIOLATO-IODO-FORMALDEDO (MIF)
Vantagens: a) no exame direto a fresco os reagentes preservam e coram simultaneamente os organismos; b) de fcil preparao; c) no contm
na frmula cloreto de mercrio-II; d) longo perodo de validade; e) indicado para estudos epidemiolgicos de campo e f) os organismos so
fixados em uma a duas horas.
Desvantagens: a) a morfologia dos organismos alterada nos esfregaos
permanentes corados.

FIXADOR ACETATO

DE

SDIO-CIDO ACTICO-FORMALDEDO (SAF)

A soluo fixadora acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF)


originalmente descrita por Junod21 e desenvolvida por Yang e Scholten33 o
resultado de uma pesquisa intensa para obteno de um mtodo de utilidade
ampla, com bom rendimento ao diagnstico de trofozotos, cistos e oocistos de
protozorios e ovos de helmintos, atravs de esfregaos permanentes e de preparaes concentradas a fresco. O fixador SAF uma combinao de formaldedo com o acetato de sdio, o qual age como tampo. Esta combinao estvel
e no txica, assegurando uma excelente fixao dos organismos com a
manuteno de suas caractersticas morfolgicas. A grande vantagem dessa
soluo preservadora no possuir em sua frmula o cloreto de mercrio-II.
Quando o sedimento usado para a preparao de esfregaos permanentes, a albumina fixadora de Mayer (ver p. 23) e/ou o soro de cavalo inativado
(56C/30min) so indicados como adesivos do material lmina de microscopia.
As lminas depois de secas podem ser fixadas em lcool a 70% (v/v).
Reagentes
1. Acetato de sdio triidratado (C2H3O2Na.3H2O)
2. cido actico glacial (C2H4O2)
3. Formaldedo 37-40% (HCHO)
Preparao do Fixador
1. Fixador Acetado de Sdio-cido Actico-Formaldedo
Acetato de sdio

1,5g

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20

CAPTULO 1

cido actico glacial


2ml
Formaldedo 37-40%
4ml
gua destilada-deionizada
92,5ml
Misturar em um beaker os componentes. Estocar o fixador em frasco de plstico ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
Preservao da Amostra
Misturar uma parte da amostra com trs partes do fixador. O sedimento usado para a preparao de esfregaos permanentes.

REVISO: ACETATO DE SDIO-CIDO ACTICO-FORMALDEDO (SAF)


Vantagens: a) pode ser usado na concentrao e na preparao de
esfregaos permanentes corados; b) no contm na frmula cloreto de
mercrio-II; c) de fcil preparao; d) longo perodo de validade; e) os
esfregaos fixados pelo SAF apresentam excelentes resultados de colorao quando corados pela hematoxilina-frrica, segundo Heidenhain
e f) os organismos so fixados em uma a duas horas.
Desvantagens: a) requer o uso da albumina fixadora de Mayer para
a adeso da amostra fecal lmina e b) os esfregaos fixados pelo
SAF apresentam resultados regulares de colorao quando corados pelo
tricrmico.
CONTROLE DE QUALIDADE DOS PRESERVADORES
Os preservadores para amostras fecais so testados pelos fabricantes
com protozorios vivos antes do produto ser vendido. A rotina descrita dever ser seguida para os preservadores preparados nos laboratrios de
Parasitologia. Os preservadores devem ser controlados com freqncia para
assegurar se as solues preservadoras efetivamente preservam os espcimes fecais. Os fixadores lcool polivinlico (fixador APV) e o lquido de
Schaudinn devem ser testados durante a preparao de esfregaos permanentes para conferir se amostras de clulas mantm suas caractersticas
morfolgicas. As rotinas descritas abaixo devem ser seguidas no controle
de qualidade (CQ) do lquido de Schaudinn, do fixador APV, do fixador lcool polivinlico modificado (fixador APV modificado), do fixador acetato de
sdio-cido actico-formaldedo (SAF) ou do fixador mertiolato-iodo-formaldedo (MIF).
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher sangue venoso em tubo de centrfuga de 15ml contendo EDTA.
Usar sangue com alta contagem de leuccitos. Agitar com cuidado. Centrifugar
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CAPTULO 1

21

(300 x g por 2 minutos) e remover a camada de leuccitos. Misturar os


leuccitos com aproximadamente 2 a 4g de fezes frescas pastosas. Agitar
com cuidado.
3. Colocar em lmina de microscopia, perto de uma das extremidades,
uma gota da mistura fezes-leuccitos. Com outra lmina, estirar a mistura
da direita para a esquerda, em direo ao lado oposto. Preparar vrios
esfregaos e mergulhar imediatamente na soluo fixadora de Schaudinn.
Com a finalidade de garantir melhor fixao, as lminas so colocadas na
soluo fixadora de Schaudinn com a face do esfregao virada para baixo.
Cubas de Coplin podem ser usadas nessa fase do processo de colorao.
Misturar o restante das fezes-sedimento sangneo com 10ml dos fixadores
APV, APV modificado, SAF ou MIF.
4. Deixar 30 minutos em contato com os preservadores, aps preparar os esfregaos. Deixar secar durante 30 minutos temperatura ambiente ou 30 a 60 minutos a 35C.
5. Para a identificao dos trofozotos e cistos de protozorios, corar
os esfregaos pelas coloraes permanentes usadas na rotina do laboratrio.
6. Aps a colorao, se os leuccitos estiverem bem fixados e apresentarem morfologia e colorao tpica, os protozorios intestinais fixados
no mesmo lote da soluo fixadora sero perfeitamente preservados, mostrando que a amostra fecal estava fresca e fixada dentro das recomendaes dos limites de tempo.
7. A amostra usada para o CQ pode ser concentrada pelos procedimentos de rotina. Quando o preservador misturado corretamente com as
fezes, os leuccitos so visveis no sedimento concentrado ou na superfcie
da pelcula (depende da tcnica usada).
8. Quando a morfologia dos leuccitos no confirmar uma boa fixao, descrever os resultados e indicar quais os procedimentos de correo que devem ser usados (repetir o teste e preparar um novo
preservador).
9. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
plano de ao para resultados fora de controle8,9.
Observaes
1. A fixao apropriada depende dos seguintes parmetros: a) observar o tempo limite entre a excreo da amostra fecal e a preservao; b)
usar a correta proporo entre o preservador e a amostra fecal (3:1); e c)
misturar vigorosamente o preservador e a amostra.
2. Usar os corantes apropriados para cada preservador. A colorao final dos esfregaos permanentes corados poder apresentar dificuldades de visualizao no exame microscpico. Alguns exemplos de combinaes adequadas: a) fixador de Schaudinn ou fixador APV: corar com
hematoxilina frrica ou tricrmico e b) fixador SAF: corar com hematoxilina
frrica.
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CAPTULO 1

FIXADOR FENOL-LCOOL-FORMALDEDO (PAF)


O fixador fenol-lcool-formaldedo (PAF) usado para a preservao
de trofozotos e cistos de protozorios e ovos e larvas de helmintos. Os
espcimes fixados e preservados em PAF6,7,25 podem ser examinados diretamente (usando corantes especiais) ou depois de serem filtrados em gaze
e lavados em soluo salina a 0,85%. Os esfregaos fixados em PAF apresentam resultados ineficazes quando corados pela hematoxilina frrica, segundo Heidenhain ou pelo tricrmico. Entretanto, esfregaos a fresco corados pela tionina, ou pelo azur A apresentam bons resultados.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Fenol, cristais (C6H6O)


lcool etlico a 95% (C2H6O) (v/v)
Formaldedo 37-40% (HCHO)
Soluo salina 0,85% (ver p. 38)

Preparao da Soluo Fenol-lcool-Formaldedo (PAF)


Fenol (fundido a 44C)
Soluo salina a 0,85%
lcool etlico a 95%
Formaldedo 37-40%

23ml
825ml
125ml
50ml

Misturar o fenol com a soluo salina. Adicionar o lcool etlico e o


formaldedo e agitar vigorosamente. Estocar em recipiente de vidro com tampa
esmerilhada.
Preservao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar uma parte da amostra com trs partes do fixador.
3. Uma gota da suspenso usada para a preparao de esfregaos.
Observao: Usar com cuidado, j que o fenol muito corrosivo e
absorvido pela pele.

ALBUMINA FIXADORA DE MAYER


Quando o material fecal fixado pela soluo fixadora acetato de sdiocido actico-formaldedo (SAF), a albumina fixadora de Mayer indicada
como adesivo do material lmina de microscopia para a preparao de
esfregaos permanentes 18,22.
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CAPTULO 1

23

Reagentes
1. Claras de ovos de galinha
2. Glicerina (C3H8O3)
3. Salicilato de sdio (C7H5O3Na), timol (C10H14O), tintura de
mertiolato 1:1.000), formaldedo 37-40% (HCOH) (1:100)
Preparao
1. Colocar as claras de vrios ovos frescos em um prato fundo.
2. Bater as claras com um garfo ou com um batedor de ovos, at que
elas estejam brancas e viscosas.
3. Deixar em repouso por uma hora e em seguida retirar a espuma da
superfcie e transferir o lquido remanescente para uma proveta.
4. Adicionar ao lquido igual volume de glicerina (v/v) e 1g de salicilato
de sdio ou timol, ou 0,5ml de tintura de mertiolato ou formaldedo 37-40%,
para prevenir a proliferao de fungos, a cada 100ml da mistura.
5. Agitar vigorosamente a mistura e filtrar atravs de papel-filtro. A
filtrao lenta, sendo necessrio usar pequenas quantidades da mistura,
com trocas dirias do filtro.
6. Estocar em frasco com tampa esmerilhada temperatura de 4C
com data de expirao de trs meses.
Preservao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Uma gota do sedimento da amostra fecal misturada com uma gota
da albumina fixadora de Mayer para a preparao dos esfregaos permanentes.
3. Faulkner e Lillie13 substituram as claras por uma soluo a 5% de
ovos brancos secos em soluo e cloreto de sdio a 5%, com agitao eventual,
durante 24 horas.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO 1

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26

CAPTULO 1

CAPTULO

Exames Macroscpico e Microscpico


da Amostra Fecal Fresca e Preservada
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
A amostra fecal pode ser submetida ao diagnstico laboratorial
na forma de espcime fresco ou preservado. O espcime fresco oferece a oportunidade de exame e de avaliao macroscpica de todo o bolo fecal, enquanto o material preservado fornece somente informaes do material submetido ao exame
parasitolgico. Quando a rotina padro do laboratrio receber
o espcime fecal preservado em vrios preservadores, aconselhvel requisitar ao paciente uma pequena amostra no preservada para que a consistncia das fezes possa ser estudada.
O uso do micrmetro ocular deve ser uma prtica padro obrigatria no diagnstico parasitolgico. O tamanho uma importante caracterstica na identificao de ovos de helmintos, cistos e oocistos de protozorios.
Os mtodos envolvem procedimentos diretos, como, por
exemplo, exame direto a fresco para a pesquisa de ovos, larvas
e cistos nas fezes; exame do sangue para a pesquisa de
microfilrias ou colorao de esfregaos sangneos segundo
Giemsa; as tcnicas incluem condutas, reagentes e instrumentos, como, por exemplo, centrfugo-sedimentao pelo formaldedo-ter ou sedimentao espontnea. Dois pontos devem ser
considerados na escolha de uma tcnica para trabalhos de diagnstico ou para programas de controle: 1.) a tcnica escolhida no necessita ser a mais exata entre as existentes, mas o
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CAPTULO 2

27

seu grau de confiana deve ser conhecido, tendo sido o mesmo determinado pelo pessoal tcnico; 2.) a escolha da tcnica deve ser feita pelo pessoal
do laboratrio, considerando os critrios de exatido e preciso. Inmeros
mtodos e tcnicas tm sido descritos e muitas modificaes propostas. As
modificaes, na maioria das vezes, trazem excelentes resultados aos procedimentos originais, mas, com freqncia, elas simplesmente refletem
preferncias pessoais. Por esta razo, essencial que os propsitos e os
princpios que envolvem todos os passos de um procedimento sejam muito
bem conhecidos e entendidos. O tcnico deve estar familiarizado com vrios
mtodos e tcnicas, alm de conhecer suas vantagens e desvantagens. Os
procedimentos microscpicos incluem o exame direto a fresco de preparaes, tcnicas de concentrao, coloraes permanentes, tcnicas de cultivo e mtodos e tcnicas especiais para certas infeces7,11.
EXAME MACROSCPICO
As amostras fecais no preservadas devem ser examinadas
macroscopicamente para determinar a consistncia, o odor, a cor, a presena ou a ausncia de sangue, de muco, de proglotes e de vermes adultos ou
outras condies anormais. Conseqentemente, o exame macroscpico deve
sempre anteceder o exame microscpico. O material fecal varia quanto a
sua consistncia e, geralmente, classificado em fezes formadas, semiformadas,
pastosas ou lquidas (diarricas). A Fig. 2.1 ilustra os estgios morfolgicos
dos protozorios intestinais, provavelmente como ocorrem em relao s vrias
categorias de consistncia das fezes. Os trofozotos so usualmente encon-

Formadas

Cistos

Semiformadas

Pastosas

Lquidas

Trofozotos

Fig. 2.1 Distribuio de cistos e trofozotos em relao consistncia do material fecal.


(Adaptada de Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures for the Diagnosis of Intestinal
Parasites. 3rd ed. USDHHS PHS (CDC), 82-8282, 1982).

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28

CAPTULO 2

trados nas fezes lquidas, nas pastosas ou nas mucossanguinolentas, ao passo que os cistos so diagnosticados nas fezes formadas ou semiformadas.
Os ovos e as larvas de helmintos podem estar presentes em todos os tipos
de amostras fecais; entretanto, eles podem ser mais dificilmente encontrados em espcimes lquidos e, se presentes, em pequeno nmero. As formas
mveis de protozorios se degeneram mais rapidamente do que as formas
csticas; por esta razo, de extrema importncia que o estudo dos espcimes fecais seja realizado o mais rpido possvel. A consistncia das fezes
no interfere na distribuio dos ovos e das larvas de helmintos, apesar de
nas amostras lquidas haver uma diminuio relativa do nmero de ovos, devido
ao fator de diluio. As fezes devem ser distribudas no laboratrio quanto
a sua consistncia. O material fecal lquido ou pastoso deve ser examinado
primeiro, sendo seguido pelos espcimes semiformados e formados. Registrar a presena de sangue e muco nas amostras fecais, os quais podem indicar manifestaes patolgicas do trato gastrointestinal. O sangue oculto
nas fezes pode estar relacionado com uma infeco parasitria, ou ser um
resultado de outras condies anormais. A ingesto de diferentes produtos
qumicos, medicamentos ou alimentos pode atribuir s fezes coloraes variadas. O exame macroscpico pode ser realizado pela simples observao
ou pela tamizao, as quais, em muitos casos, so suficientes para estabelecer um diagnstico final.

SIMPLES OBSERVAO
Examinar e revolver com basto de vidro todo o material fecal evacuado. Anotar todas as caractersticas observadas e coletar os vermes adultos ou proglotes de tnias dejetadas. Usar luvas durante todas as etapas do
procedimento (Fig. 2.2).

T AMISAO
Emulsionar as fezes com gua e coar a emulso com peneira metlica.
Este procedimento deve ser realizado em uma pia utilizando-se um jato fraco de gua corrente. Vermes adultos, como Ascaris lumbricoides e Enterobius
vermicularis, so encontrados freqentemente misturados ou na superfcie
das fezes, como tambm as proglotes de tnias. Outros helmintos, como o
Trichuris trichiura, ancilostomdeos e Hymenolepis nana, so depositados
no bolo fecal aps o incio do tratamento. Freqentemente podero ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausncia dos ovos. Esses procedimentos macroscpicos so vantajosos para a demonstrao e
colheita de pequenos helmintos, de proglotes e de escleces. Usar luvas durante
todas as etapas do procedimento (Fig. 2.3).
IDENTIFICAO DE PROGLOTES DE TAENIA spp.
Trs mtodos so indicados para a identificao de proglotes de Taenia:
o do cido actico glacial, o de Campos e o da tinta da China.
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CAPTULO 2

29

Fig. 2.2 Exame macroscpico pela simples observao.

Fig. 2.3 Exame macroscpico pela tamisao.

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30

CAPTULO 2

MTODO

DO

CIDO ACTICO GLACIAL

Reagente
cido actico glacial (C 2H4O 2).
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar em uma placa de Petri, contendo cido actico glacial, a
proglote a ser identificada, durante 15 a 20 minutos.
3. Aps este perodo, comprimi-la entre duas lminas.
4. Examinar sob iluminao intensa.

MTODO

DE

C AMPOS 2

Reagente
Comprimidos de metoquina.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Dissolver trs comprimidos de metoquina em 5ml de gua destiladadeionizada.
3. Mergulhar nesta soluo, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada.
4. Aps este perodo, comprimi-la entre duas lminas.

A
B

Fig. 2.4 Proglotes grvidas: (A) Taenia solium; (B) Taenia saginata.(Adaptada de Schell,
S.C. Parasitology laboratory manual. New York: John Wiley & Sons, 1962).

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CAPTULO 2

31

5. Examinar sob iluminao intensa.

MTODO

DA

TINTA

DA

C HINA3

A injeo de tinta da China (tinta nanquim) nas proglotes grvidas das


tnias cora as ramificaes uterinas mostrando as diferenas entre as tnias. A T. solium possui em mdia 9 (7 a 13) ramificaes uterinas de cada
lado do tronco central do tero (tipo dendrtico), enquanto a T. saginata apresenta em mdia 18 (15 a 20) ramificaes uterinas (tipo dicotmico). Para
as duas tnias, o diagnstico s genrico, pois microscopicamente os ovos
so iguais. O diagnstico especfico requer a tamizao de todo o bolo fecal,
recolhimento das proglotes e a identificao pela morfologia das ramificaes uterinas. A proglote corada pela tinta da China pode ser preservada
indefinidamente em formaldedo a 10% (Fig. 2.4).
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Tinta da China (tinta nanquim)


Seringa e agulha hipodrmica
lcool etlico absoluto (C 2H 6O)
lcool etlico a 50%, 70%, 90% (v/v)
Xilol (C8H 10) ou toluol (C7H8)
Resina sinttica

Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar, durante vrias horas, a proglote em gua corrente fria (temperatura de geladeira) para o afrouxamento do segmento.
3. Secar a proglote (com tecido), colocando-a em uma lmina de microscopia. Transportar o material com pina. Injetar com seringa e agulha
hipodrmica a tinta da China atravs do poro genital.
4. Lavar, rapidamente, em gua corrente e secar a proglote, colocando-a entre duas lminas de microscopia, comprimindo e amarrando as extremidades com linha (quando a proglote no estiver seca, ela escorrega para
fora das lminas).
5. Desidratar a proglote atravs de vrias passagens em lcool (50%,
70%, 90% e lcool absoluto). Quando for necessrio, o segmento pode ficar aproximadamente 24 horas no lcool a 70%.
6. Clarificar a proglote atravs de duas passagens em xilol ou toluol.
7. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
8. Examinar em microscpio de dissecao. Contar as ramificaes
uterinas.
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32

CAPTULO 2

EXAME MICROSCPICO
O exame de esfregaos a fresco pelos mtodos diretos o mtodo mais
fcil e, talvez, o mais usado na rotina do laboratrio, permitindo visualizar
os estgios de diagnstico dos protozorios (trofozotos, cistos, oocistos e
esporos) e dos helmintos (ovos, larvas e pequenos adultos). Para uma diagnose
absoluta necessrio observar o parasito em um de seus estgios de evoluo. O simples exame microscpico , em muitos casos, suficiente para o
diagnstico. Entretanto, para a obteno de melhores resultados ser necessrio
o uso de tcnicas de concentrao, ou seja, processos mecnicos e/ou biolgicos. O exame microscpico dos espcimes fecais pode requerer uma
variedade de procedimentos, os quais dependem da consistncia das amostras enviadas, do tipo de preservantes usados na fixao dos espcimes e
dos sintomas clnicos ou queixas dos pacientes, que podem sugerir a presena de um determinado organismo (Tabela 2.1).
Pelos processos mecnicos, os elementos so concentrados por meio
da centrifugao, baseados nas propriedades fsicas, como a densidade dos
ovos e cistos, aderncia ao vidro etc. Nos processos biolgicos, os parasitos so concentrados ativamente de acordo com seu tropismo (hidrotropismo,
termotropismo e fototropismo). O exame microscpico das fezes, alm de
evidenciar os elementos fecais normais, pode revelar: a) ovos, larvas e pequenos adultos de helmintos intestinais; trofozotos, cistos, oocistos e esporos
de protozorios intestinais; b) hemcias (raramente encontradas, pois so lisadas
com rapidez pelas enzimas digestivas; embora a presena indique uma ulcerao ou problemas hemorrgicos); c) leuccitos (neutrfilos polimorfonucleares podem ser indicativos de inflamao); d) eosinfilos (geralmente
indicam a presena de uma resposta imune, que pode ou no ter relao
com uma infeco parasitria); e) macrfagos (podem estar presentes em
infeces bacterianas ou parasitrias); f) clulas epiteliais (resultam da descamao normal do trato intestinal); g) elementos inanimados como cristais
de Charcot-Leyden (os quais podem ser encontrados pela desintegrao de
eosinfilos e podem ocasionalmente estar correlacionados com infeces
parasitrias), cristais de oxalato de clcio, cristais de fosfato amonaco
magnesiano e cristais de origem medicamentosa; h) fungos (Candida spp.),
outras leveduras, clulas vegetais, gros de plen, esporos de fungos, fibras
vegetais ou musculares, filamentos de razes e plos de animais e i) ovos de
artrpodes, de nematides de plantas e de parasitos esprios.
Tabela 2.1
Elaborao dos Espcimes Fecais
Consistncia
da Amostra
Fecal

Exame Direto
a Fresco

Concentrao
para
Protozorios

Colorao
Permanente

Coloraes
Derivadas de
Ziehl-Neelsen

Formada
Semiformada
Pastosa
Lquida


s
s
s






s




s
s
s
s

Procedimentos:  = desnecessrio;  = recomendado; s = timo.

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CAPTULO 2

33

EXAME DIRETO A FRESCO


O exame direto a fresco um procedimento simples e eficiente para o
estudo das fezes, permitindo observar os trofozotos vivos dos protozorios.
Este procedimento coprolgico jamais deve ser omitido. As preparaes a
fresco so obtidas diretamente dos espcimes fecais e requerem o mnimo
de material (2mg) para cada mtodo de exame. Todos os estgios de diagnstico dos organismos, pelo uso de diferentes solues, podem ser determinados e identificados. Os esfregaos com fezes frescas e no fixadas so
rotineiramente preparados com as solues salina a 0,85% e de iodo (Fig.
2.6A). Entretanto, se o nmero de organismos for pequeno, o exame de
pequena quantidade de fezes usada para a preparao de esfregaos a fresco
pode ser insuficiente para revelar a presena de parasitos. Os esfregaos
devero ser sistemtica e completamente examinados atravs da objetiva
do microscpio de pequeno aumento (10X) e com pequena intensidade de
luz. A confirmao dos parasitos deve ser realizada com a objetiva de grande
aumento (40X) (Fig. 2.5). Quando forem usadas fezes preservadas, a formalina
atua como diluente, no sendo necessrio adicionar a soluo salina a 0,85%
s preparaes de esfregaos sem colorao 25,55 (Fig. 2.6C). Coloraes
temporrias podem ser utilizadas com as preparaes a fresco para auxiliar
na localizao e identificao de protozorios, sendo desnecessrios esses
corantes para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos15.

PREPARAES SALINAS
Nas preparaes sem colorao so pesquisadas a presena de cistos,
ovos e larvas, e a motilidade dos trofozotos, quando presentes. Entretanto,
no possvel estabelecer um diagnstico especfico, no caso de formas
trofozoticas, com base em um exame direto a fresco e temporrio, que tem
somente um valor de orientao. Nesse caso as fezes devero ser fixadas e
um esfregao fecal dever ser preparado. Para pesquisa de ovos, o exame
direto a fresco sem colorao oferece bons resultados, mas para a de cistos
e de larvas necessrio preparar um esfregao corado, tendo em vista o estudo
das caractersticas morfolgicas das diferentes espcies. O primeiro exame
das amostras fecais deve ser feito por meio de esfregaos salinos. Nunca deve
ser usada gua corrente ou destilada, pois os trofozotos so distorcidos, podendo ser deformados e rompidos. A soluo salina a 0,85% e a soluo de
Ringer apresentam resultados satisfatrios na preparao dos esfregaos.

Fig. 2.5 Pesquisa sistemtica e completa dos esfregaos a fresco.

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34

CAPTULO 2

Fig. 2.6 Exame direto a fresco de amostras fecais. A) gota de soluo salina 0,85% e
iodo em uma lmina; B) poro emulsificada de fezes no preservadas nos diluentes; C)
gotas de suspenso fecal preservada; D) densidade correta da preparao. (Adaptada de
Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures for the Diagnosis of Intestinal Parasites. 3rd
ed. USDHHS PHS (CDC), 82-8282, 1982).

Soluo Salina a 0,85%


Cloreto de sdio (NaCl)
gua destilada-deionizada

8,5g
1.000ml

Soluo de Ringer
Cloreto de sdio (NaCl)
Cloreto de potssio (KCl)
Cloreto de clcio (CaCl2)
Cloreto de magnsio (MgCl2)
Diidrogenofosfato de sdio (NaH2PO 4)
Hidrogenocarbonato de sdio (NaHCO3)
gua destilada-deionizada

8g
0,2g
0,2g
0,1g
0,1g
0,4g
1.000ml

Dissolver os quatro primeiros componentes em 900ml de gua destilada-deionizada e autoclavar (121C/15min). Dissolver o diidrogenofosfato
de sdio e o hidrogenocarbonato de sdio em 100ml de gua destilada-deionizada
e filtrar em Seitz ou Millipore. Misturar as duas solues em condies de
assepsia total.
Preparao dos Esfregaos Salinos
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. O procedimento usual para preparar um esfregao salino colocar
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CAPTULO 2

35

uma ou duas gotas de soluo salina a 0,85% em uma lmina de microscopia (Fig. 2.6A).
3. Remover uma pequena poro de fezes do recipiente e emulsificar
na salina, cobrindo a preparao com uma lamnula (Fig. 2.6B).
4. A suspenso no deve ser muito espessa, nem muito diluda; considera-se boa a suspenso que permite ler por transparncia os caracteres
comuns de um jornal (Fig. 2.6D).
5. Quando encontrada uma frao de sangue e muco na superfcie
da amostra fecal, um novo esfregao deve ser preparado e cuidadosamente
examinado.
Observaes
1. Ocasionalmente, estgios de alguns parasitos podem ser identificados em maior quantidade no sangue e no muco do que no restante da amostra; entretanto, todo o cuidado necessrio para no confundir leuccitos
ou clulas epiteliais com amebas.
2. As preparaes salinas apresentam duas importantes vantagens: 1.)
possibilitam o reconhecimento e a identificao dos organismos presentes e
estabelecem a intensidade do parasitismo; e 2.) servem como indicador para
uma tcnica a ser usada. As preparaes salinas esto limitadas ao diagnstico de praticamente todos os enteroparasitos e de alguns estgios de
amebas. Contudo, a identificao e a diferenciao das amebas intestinais
pelas preparaes salinas um processo de diagnstico difcil e no satisfatrio.
3. Quando cistos e trofozotos de protozorios estiverem presentes devero ser realizadas coloraes temporrias especficas para cada estgio.
Os ovos e as larvas so facilmente detectados e identificados nas preparaes salinas. As formas csticas e trofozoticas aparecem refringentes e os
trofozotos, se vivos, exibem caractersticas de locomoo.
4. Para evitar a dessecao na pesquisa de ovos e cistos, a soluo
salina pode ser substituda por gua glicerinada (uma parte de glicerina +
duas partes de gua) 67.
5. Algumas estruturas, tais como corpos cromatides nos cistos e eritrcitos nos trofozotos, so vistas com mais facilidade nas preparaes salinas
do que atravs de coloraes temporrias, enquanto os ncleos podem ser
invisveis.
O diagnstico de laboratrio diferencial entre a Entamoeba histolytica
e a Entamoeba dispar no pode ser realizado tomando como base a
morfologia (estudo de esfregaos fecais permanentes corados), a no
ser que sejam vistas hemcias ingeridas pelos trofozotos (E. histolytica) 30 . (A tendncia moderna voltar a concepo dualista,
revalidando o nome E. dispar para a espcie no patognica - Rey L.
Dicionrio de termos tcnicos de Medicina e Sade. Rio de Janeiro:
Guanabara-Koogan; 1999).

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36

CAPTULO 2

6. Os protozorios intestinais nunca devem ser identificados tomandose como referncia somente uma preparao direta a fresco; esfregaos com
coloraes permanentes devero ser examinados para que sejam estabelecidas a caracterizao morfolgica e a identificao especfica do organismo em estudo (Tabela 2.2).
Controle de Qualidade (CQ): Esfregaos Salinos
1. A soluo salina a 0,85% estocada em frasco de vidro com tampa
esmerilhada deve ser transferida diariamente ao frasco conta-gotas e controlada para a presena de organismos de vida livre, especialmente flagelados
e ciliados.
2. Procedimento usual para o CQ colocar uma ou duas gotas da soluo salina em uma lmina de microscopia, cobrindo a preparao com uma
lamnula.
3. A preparao deve ser examinada cuidadosamente ao microscpio.
A contaminao pode resultar da acidental remoo de pequena poro de
fezes durante a preparao da montagem salina.
4. Para evitar essa contaminao, colocar primeiro a soluo salina na
lmina.
COLORAES TEMPORRIAS
Os ovos e as larvas de helmintos so facilmente diagnosticados pelo
exame direto a fresco de esfregaos sem colorao, enquanto que os diferentes estgios dos protozorios so somente observados com o auxlio de
diferentes coloraes temporrias. Os ncleos dos trofozotos das amebas,
como os dos cistos, so indistinguveis ou invisveis no exame direto de
esfregaos salinos. Vrias solues corantes so indicadas para a preparao e o exame de esfregaos a fresco pelos mtodos diretos: as coloraes

Tabela 2.2
Uso das Objetivas do Microscpio na Avaliao
dos Parasitos nos Espcimes Fecais
Objetivas

Exame Direto a
Fresco para Ovos
e Larvas

Exame Direto a
Fresco para
Protozorios

Colorao
Permanente
para Protozorio

10X
20X

Triagem

Triagem
Triagem

40X

Triagem
Triagem
Triagem
Confirmao

50X, imerso
100X, imerso

No usada
No usada

Confirmao, a
identificao pode
requerer colorao
permanente
No usada

Triagem

Triagem
Triagem detalhada
e confirmao

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CAPTULO 2

37

para cistos, para trofozotos e para cistos e trofozotos de protozorios. As


solues de iodo recomendadas para corar cistos, so a de Lugol, de Dobell
e OConnor23, de DAntoni20 e de Donaldson24. As solues de iodo no so
usadas na colorao dos estgios vegetativos, desde que todos os organismos so mortos e distorcidos pelo corante.
Diferentes coloraes, como a de Quensel, descrita por Svensson 68; de
Velat, Weinstein e Otto72 e a de Nair57, so usadas na identificao de trofozotos
de amebas. Alm dessas solues corantes especficas para determinados
estgios de protozorios, outras coloraes temporrias so tambm empregadas para evidenciar cistos e trofozotos. As solues de Kohn43, de Bucki,
Wells e Vail 10 e de Sapero e Lawless64 permitem corar, simultaneamente,
quase todos os estgios dos protozorios intestinais. O estabelecimento da
identidade morfolgica das amebas, particularmente dos trofozotos, no pode
ser fixado atravs de coloraes temporrias, conseqentemente, so indicadas
coloraes permanentes, como a da hematoxilina frrica, segundo Heidenhain34 ou do tricrmico de Wheatley74, uma modificao da colorao de
Gomori32.
SOLUES DE IODO
As solues de iodo so indicadas, principalmente, para a colorao de
cistos, com o objetivo de determinar o nmero e a estrutura dos ncleos. A
soluo de iodo usada no mtodo de Gram no aconselhada para a colorao dos organismos parasitos. Os corantes no devem ser velhos, devendo apresentar uma correta intensidade de contraste. A soluo de iodo muito
concentrada absorvida to rapidamente, que os cistos tomam uma colorao marrom-escura uniforme. Entretanto, quando a concentrao dessa soluo
muito baixa, a soluo no suficientemente absorvida e os cistos tendem a harmonizar na sua periferia um matiz imperceptvel junto a uma colorao de fundo amarelo-limo. Nos corantes velhos existe uma tendncia
de sublimao do iodo. Alm disso, se uma gota do corante colocada e
deixada em uma lmina de microscopia por longo tempo, antes de as fezes
serem emulsificadas com a soluo corante, o resultado uma colorao
irregular ou uma supracolorao.

SOLUO

DE

IODO

DE

L UGOL

Reagentes
1. Iodo, cristais (I2).
2. Iodeto de potssio (KI).
Preparao da Soluo
Iodo, cristais

5g

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38

CAPTULO 2

Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

10g
100ml

Dissolver 10g de iodeto de potssio em gua. Adicionar lentamente


5g de cristais de iodo e agitar a mistura at a completa dissoluo. Filtrar e
estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao abrigo da luz.
Preparar novas solues depois de 10 a 14 dias. Antes do uso diluir na proporo de 1:5 em gua destilada-deionizada. Indicar a data de validade no
rtulo do frasco.

SOLUO

DE

I ODO

DE

D OBELL

OCONNOR

Reagentes
1. Iodo, cristais (I2)
2. Iodeto de potssio (KI)
Preparao da Soluo
Iodo, cristais
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

1g
2g
100ml

Dissolver 2g de iodeto de potssio em gua. Adicionar lentamente 1g


de cristais de iodo e agitar a mistura at a completa dissoluo. Filtrar e
estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao abrigo da luz.
Preparar novas solues depois de 10 a 14 dias. Indicar a data de validade
no rtulo do frasco.

SOLUO

DE

IODO

DE

DANTONI MODIFICADA

Reagentes
1. Iodo, cristais (I2)
2. Iodeto de potssio (KI)
Preparao da Soluo
Iodo, cristais
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

1,5g
1g
100ml

Dissolver 1g de iodeto de potssio em 100ml de gua. Adicionar lentamente 1,5g de cristais de iodo e agitar a mistura at a completa dissolu Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 2

39

o. Filtrar e estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao


abrigo da luz. Preparar novas solues depois de 10 a 14 dias. Indicar a
data de validade no rtulo do frasco.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao. O procedimento
usual para preparar um esfregao corado colocar uma ou duas gotas de
uma das solues de iodo em lmina de microscopia (Fig. 2.6A).
2. Depois, remover pequena poro de fezes do recipiente e emulsificar
no corante, cobrindo a preparao com uma lamnula (Fig. 2.6B).
3. A suspenso no deve ser muito espessa, nem muito diluda; considera-se boa a suspenso que permite ler por transparncia os caracteres
comuns de um jornal (Fig. 2.6D).
Caractersticas da Colorao: Solues de Iodo
Nos cistos, corretamente corados, o glicognio, se presente, exibe uma
colorao castanho-avermelhada, o citoplasma cora-se em amarelo e a
cromatina perifrica dos ncleos, em preto ou marrom. As caractersticas
dos ncleos so bem distintas, enquanto os corpos cromatides so pouco
visveis.
Controle de Qualidade (CQ): Solues de Iodo
1. Deve ser verificado diariamente se a soluo de iodo est transparente e no contaminada por bactrias ou fungos. A soluo de iodo deve
apresentar cor marrom forte (de ch-da-ndia ou de vinho do Porto), apresentando uma correta intensidade de contraste. Desprezar as solues fracas. Evitar a contaminao do frasco conta-gotas.
2. Nos cistos dos protozorios, corretamente corados pela soluo de
iodo, o glicognio, se presente, exibe uma colorao castanho-avermelhada,
o citoplasma cora-se em amarelo e a cromatina perifrica dos ncleos, em
preto ou marrom. As caractersticas dos ncleos so bem distintas, enquanto os corpos cromatides so pouco visveis.
3. Leuccitos humanos misturados com fezes negativas podem ser usados
como CQ da amostra fecal. Os leuccitos coram-se com a mesma colorao como so vistos os protozorios. O citoplasma dos leuccitos apresenta
colorao amarelo-ouro.
4. Uma amostra sabidamente positiva tambm pode ser utilizada para
CQ. A amostra para CQ deve ser examinada ao menos trimestralmente ou
sempre que for preparado um novo corante.
5. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
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40

CAPTULO 2

6. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir


o plano de ao para resultados fora de controle15.
SOLUO DE QUENSEL
Este corante e os resultados obtidos foram descritos por Svensson68 aps
a morte de Quensel11. Esta soluo no cora os cistos, mas diferencia os
ncleos dos trofozotos de trs gneros de amebas: Entamoeba, Iodamoeba
e Endolimax. O corante no adequado para o estudo morfolgico diferencial dos trofozotos da E. histolytica e da Entamoeba coli. Esse mtodo no cora os flagelados, incluindo a Dientamoeba fragilis, considerada
at h bem pouco, como sendo um amebdeo (famlia Dientamoebidae e hoje
pertencente ordem Trichomonadida)13,38. Esta colorao favorece a diferenciao dos cistos vivos e dos trofozotos redondos no fixados, j que
aqueles no so corados por esta soluo.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Sudan III, p (CI 26100) (C22H 16N 4O)


lcool etlico a 80% (C 2H 6O) (v/v)
Azul-de-metileno, p (CI 52015) (C 16H18ClN 3S.3H 2O)
Cloreto de cdmio, p (CdCl2)

Preparao das Solues


1. Solues Estoques
a. Soluo Alcolica Saturada de Sudan III
Sudan III, p
lcool etlico a 80%

1,6g
100ml

Adicionar o corante ao lcool. Agitar vigorosamente e deixar em repouso durante vrias horas.
b. Soluo Saturada Aquosa de Azul-de-metileno
Azul-de-metileno, p
gua destilada-deionizada

3,5g
100ml

Adicionar o corante gua. Agitar vigorosamente e deixar em repouso durante vrias horas. Filtrar e estocar em frasco com rolha esmerilhada.
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CAPTULO 2

41

c. Soluo de Cloreto de Cdmio


Cloreto de cdmio, p
gua destilada-deionizada

10g
100ml

Dissolver os cristais de cloreto de cdmio em gua. Filtrar e estocar


em frasco com rolha esmerilhada.
2. Corante de Quensel
Soluo alcolica saturada de Sudan III
Soluo aquosa saturada de azul-de-metileno
Soluo de cloreto de cdmio

20ml
30ml
50ml

REVISO: EXAME DIRETO A FRESCO


Princpio: Avaliar a carga parasitria dos pacientes infectados proporcionando um diagnstico rpido dos espcimes nas infeces macias,
permitindo observar os trofozotos vivos dos protozorios.
Amostra: Espcimes fecais frescos que no tenham sido refrigerados.
Reagentes: Soluo salina a 0,85%, soluo de iodo de Lugol ou soluo de iodo de DAntonini.
Exame: Esfregaos com fezes frescas, no fixados, preparados com
as solues salina a 0,85% e de iodo. Examinar os esfregaos com pequeno aumento (100X) entre lmina e lamnula (22 x 22mm); examinar
com grande aumento (400X) no mnimo 1/3 da lamnula (preparaes
salinas e coradas pela soluo de iodo).
Resultados: Os resultados devem ser considerados presuntivos; entretanto, alguns organismos so definitivamente diagnosticados (cistos
de Giardia lamblia e Entamoeba spp., ovos e larvas de helmintos e
oocistos de Isospora belli). Esses resultados so caracterizados como
preliminares, at que o diagnstico final esteja disponvel aps a realizao das tcnicas de concentrao e do exame de preparaes permanentes coradas.
Procedimento e Limitaes: Quando a soluo de iodo adicionada
s preparaes, os organismos so mortos e perdem a motilidade, entretanto o ncleo dos cistos realado. O exame direto a fresco no
necessrio para os espcimes colhidos com preservadores; usualmente
suficiente a concentrao e o exame de esfregaos permanentes corados. O exame direto a fresco normalmente examinado com pequeno aumento (100X) e com grande aumento (400X). Realizar a morfometria
com micrmetro ocular.
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42

CAPTULO 2

Preparao do Corante
1. Misturar, sob agitao, 20ml da soluo de Sudan III e 30ml da soluo de azul-de-metileno. Filtrar esta mistura em frasco que j contenha
50ml da soluo de cloreto de cdmio. Agitar, gentilmente, a mistura durante 15 a 20 minutos. Uma precipitao em flocos comea a se formar imediatamente e a soluo torna-se quase incolor.
2. Filtrar e desprezar o filtrado. Remover o papel-filtro com o precipitado, espalhar o resduo sobre outro pedao de papel-filtro e deixar secar durante toda a noite.
3. Transferir o precipitado para outro papel-filtro e lavar com 20 a
30ml de gua destilada-deionizada. Dissolver o precipitado lavado em
250ml de gua destilada-deionizada. Se houver precipitao depois de
vrios dias, filtrar novamente a soluo. Indicar a data de validade no
rtulo do frasco.
Colorao da Amostra
Emulsificar as fezes diretamente no corante de Quensel, ou colocar uma
gota de fezes emulsificada em soluo salina a 0,85% em uma gota do corante,
e misturar antes de colocar a lamnula sobre a preparao.
Caractersticas da Colorao
Depois de 10 a 20 minutos, o citoplasma dos trofozotos das amebas
cora-se em azul-claro e o ncleo em um matiz azul-escuro. O ncleo corado mostra as mesmas caractersticas morfolgicas que apresenta nas preparaes permanentes coradas pela hematoxilina. Aps 30 a 60 minutos os
organismos apresentam uma supracolorao e no so identificados. Os ncleos
da D. fragilis so bem visveis, apesar dessas estruturas no exibirem uma
boa colorao. O corante de Quensel tambm pode ser usado com amostras conservadas pelo formaldedo; entretanto, os detalhes no so facilmente
observados.
SOLUO TAMPONADA DE AZUL-DE-METILENO DE NAIR
Nair57 mostrou que a soluo corante tamponada de azul-de-metileno
revela visivelmente as caractersticas nucleares dos estgios das formas
trofozoticas. Essa soluo eficaz em pH baixo, entre 3,6 e 4,8, permitindo
uma penetrao mais ativa do corante nos organismos. O pH das solues
corantes tem sido o fator decisivo na evidenciao das caractersticas
morfolgicas do ncleo dos trofozotos de protozorios, por meio do exame
de preparaes a fresco. A soluo tamponada de azul-de-metileno pode ser
substituda pelo corante de Quensel56. Os resultados so os mesmos, contudo a soluo de Nair de mais fcil preparao.
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CAPTULO 2

43

Reagentes
1. cido actico glacial (C2H 4O2)
2. Acetato de sdio (NaC2H 3O 2)
ou Acetato de sdio triidratado (NaC2H3O 2.3H2O)
3. Azul-de-metileno (CI 52015) (C16H 18ClN 3S.3H 2O)
Preparao das Solues
Solues Estoques
1. Soluo I (cido Actico Glacial 0,2M)
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

12ml
1.000ml

Misturar cido actico e gua. Armazenar a soluo at o momento


do uso em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
2. Soluo II (Acetato de Sdio 0,2M)
Acetato de sdio, anidro
ou
Acetado de sdio, cristais
gua destilada-deionizada

16,4g
27,2g
1.000ml

Dissolver o acetato de sdio em 400ml de gua. Completar o volume.


Armazenar a soluo at o momento do uso em um frasco de vidro com
tampa esmerilhada.
3. Soluo Tampo de Acetato 0,2M (Gomori)
Para obter o pH especfico, misturar as quantidades indicadas de Solues I e II 0,2M e diluir com gua destilada-deionizada ao volume final de
100ml.
pH
desejado

Soluo I
C 2 H 4O 2
0,2M

Soluo II
NaC 2 H 3 O 2
0,2M

3,6
3,8

46,3ml
44,0ml

3,7ml
6,0ml

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44

CAPTULO 2

4,0
4,2
4,4
4,6
4,8

41,0ml
36,8ml
30,5ml
25,5ml
20,0ml

9,0ml
13,2ml
19,5ml
24,5ml
30,0ml

4. Soluo Corante
Dissolver 0,06g de azul-de-metileno em 100ml de soluo tamponada
de acetato pH 3,6. Melvin e Brooke56 e Garcia e Bruckner29,30 relatam resultados satisfatrios nesse pH.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Emulsificar uma pequena quantidade de fezes (2mg) ou o sedimento
de uma cultura em uma a duas gotas da soluo tamponada de azul-de-metileno
em lmina de microscopia.
3. Cobrir a preparao com uma lamnula e examinar.
Caractersticas da Colorao
Aps cinco a 10 minutos, o citoplasma dos trofozotos das amebas corase em azul-claro e o ncleo em azul-escuro. O ncleo corado apresenta as
mesmas caractersticas morfolgicas observadas nas coloraes permanentes pela hematoxilina frrica.
Controle de Qualidade (CQ): Exame Direto a Fresco
1. Deve ser verificado diariamente se a soluo salina a 0,85%, a soluo de iodo e a soluo de azul-de-metileno de Nair esto transparentes e
no contaminadas por bactrias ou fungos.
2. A soluo de iodo deve apresentar cor marrom forte do ch-da-ndia ou do vinho do Porto, mostrando uma correta intensidade de contraste.
Desprezar as solues fracas.
3. Nos cistos dos protozorios, corretamente corados pela soluo de
iodo, o glicognio, se presente, exibe uma colorao castanho-avermelhada,
o citoplasma cora-se em amarelo e a cromatina perifrica dos ncleos, em
preto ou marrom. As caractersticas dos ncleos so bem distintas e os corpos
cromatides so pouco visveis.
4. Leuccitos humanos misturados com fezes negativas podem ser usados
como CQ da amostra fecal. Os leuccitos coram-se com a mesma colorao como so vistos os protozorios. O citoplasma dos leuccitos apresenta
colorao amarelo-ouro.
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CAPTULO 2

45

5. Pela soluo tamponada de azul-de-metileno o citoplasma dos trofozotos


das amebas cora-se em azul-claro e o ncleo, em azul-escuro. O ncleo corado
apresenta as mesmas caractersticas morfolgicas observadas nas coloraes permanentes pela hematoxilina frrica.
6. Uma amostra sabidamente positiva tambm pode ser utilizada para
CQ. A amostra para CQ deve ser examinada ao menos trimestralmente ou
sempre que for preparado um novo corante.
7. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
8. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle.
SOLUO DE MERTIOLATO-IODO-FORMALDEDO (MIF)
A soluo corante-fixadora de mertiolato-iodo-formaldedo (MIF) foi introduzida por Sapero, Lawless e Strone63 e Sapero e Lawless 64. A soluo
MIF permite a colorao de cistos e trofozotos de protozorios pelo exame
direto a fresco e de ovos e larvas de helmintos encontrados nas fezes.
Reagentes
1. Formaldedo 37-40% (HCHO)
2. Soluo de iodo de Lugol (ver p. 38)
3. Tintura de Merthiolate (timerasol), n. 99, 1:1.000 (Lilly)
4. Cloreto de sdio (NaCl)
Preparao das Solues
1. Soluo Corante-Conservadora MIF
Soluo de iodo de Lugol
Formaldedo 37-40%
Tintura de Merthiolato, 1:1.000

1ml
1,5ml
7,5ml

1ml do corante suficiente para a colorao de 25 a 30 preparaes.


O corante-fixador deve ser preparado fresco diariamente.
2. Soluo Salina Isotnica (0,15M)
Cloreto de sdio
gua destilada-deionizada

8,767g
1.000ml

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46

CAPTULO 2

Dissolver o NaCl em uma pequena quantidade de gua, completando


aps o volume.
Colorao da Amostra (exame direto a fresco)
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Colocar em uma das extremidades da lmina de microscopia uma
ou duas gotas de soluo salina isotnica (0,15M) e uma gota de igual volume do corante-fixador MIF.
3. Emulsificar uma pequena quantidade de fezes frescas na soluo salina
isotnica (0,15M) e a outra, no corante-fixador MIF.
4. Cobrir cada uma das preparaes com uma lamnula e examinar. A
lamnula pode ser examinada algumas horas aps sem perdas na colorao
ou das caractersticas morfolgicas.
Caractersticas da Colorao
As reaes de colorao no exame direto, como tambm nas amostras
preservadas, so divididas em duas fases: 1.) fase do iodo, na qual os
trofozotos e os cistos se coram de verde-amarelo ou de marrom-amarelo;
2.) fase da eosina, a qual permanente e substitui a do iodo. Na fase do
iodo, o ncleo cora-se de marrom-escuro e na fase da eosina, de vermelhoescuro ao preto. O citoplasma dos trofozotos e dos cistos muda do verdeamarelo ou marrom na fase do iodo, para a cor da eosina (rosa ou vermelha) na segunda fase. Os elementos nucleares de todas as espcies, com
exceo da Dientamoeba, so muito bem definidos. O glicognio aparece
como uma rea marrom-escura na fase do iodo e uma rea sem cor na fase
da eosina. Os corpos cromatides so caractersticos em sua aparncia. Os
flagelos so observados nos trofozotos dos protozorios flagelados. Os ovos
de helmintos so tambm corados e mantm suas caractersticas normais.
Os detritos fecais coram-se em marrom-escuro mais do que os parasitos, o
sangue e os tecidos celulares. No ocorre deformao dos organismos, mas
para melhor contraste, um filtro azul dever ser usado no sistema de iluminao 56 .
EXAME DIRETO PARA A PESQUISA DE OVOS DE HELMINTOS

MTODO

DO

ESFREGAO E SPESSO

DE

CELOFANE

Nesse mtodo, desenvolvido por Kato e Miura42, um pedao de celofane substitui a lamnula de vidro. recomendado para inquritos coprolgicos,
por ser rpida e simples a preparao dos esfregaos fecais e pelo baixo
custo na pesquisa de ovos de helmintos (Fig. 2.7).
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
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CAPTULO 2

47

Fig. 2.7 Mtodo de Kato e Miura (esfregao espesso de celofane).

Reagentes e Materiais
1.
2.
3.
4.

Verde de malaquita (CI 4200) (C 23H 25N 2)2.3C2H2O 4


Fenol fundido a 44C (C6H 6O)
Glicerina (C3H8O 3)
Lamnulas de celofane de 40mm de espessura e 26 x 28mm
de tamanho

Preparao do Corante e das Lamnulas


1. Soluo de Verde de Malaquita
Soluo aquosa de verde de malaquita a 3%
Soluo aquosa de fenol a 6%
Glicerina

1ml
100ml
100ml

Embeber por mais de 24 horas, individualmente, as lamnulas de celofane no corante.


Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 60 a 70mg de fezes frescas (tamanho de um gro de feijopreto) em uma lmina de microscopia.
3. Cobrir as fezes com a lamnula de celofane aps a remoo do excesso do corante.
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48

CAPTULO 2

4. Comprimir a lamnula, com uma rolha de borracha macia, e espalhar


o material com uniformidade at as margens da cobertura de celofane.
5. Examinar ao microscpio.
Observaes
1. Os ovos podero romper-se pelo excesso de presso sobre a lamnula
de celofane44 .
2. Esses estgios de diagnstico so detectados com mais eficincia
quando a preparao deixada em repouso durante 30 a 60 minutos
temperatura de 25C com umidade relativa de 75%, ou 20 a 30 minutos
na estufa a 40C. Essa temperatura mantm as fezes secas e claras, enquanto os ovos conservam sua morfologia normal 65. Durante o vero ou
em regies tropicais, provavelmente devido a uma supracolorao, poder
haver uma deformao dos ovos na preparao45,54. A glicerina torna opaca
as preparaes.
3. Alguns ovos observados nos esfregaos preparados por este mtodo
mostram morfologia bastante diferente daqueles identificados nos esfregaos
salinos. As membranas finas dos ovos dos ancilostomdeos e dos
Trichostrongylus orientalis so vistas achatadas e arredondadas. Os ovos
de Ascaris e Enterobius no apresentam qualquer deformao morfolgica
das membranas em ambas as preparaes.
4. Com muita freqncia impossvel, pelo mtodo de Kato e Miura42,
a identificao especfica dos pequenos ovos de trematdeos, como
Metagonimus yokogawai e Clonorchis sinensis, devido indistinguvel
morfologia do oprculo e sua injuno com a membrana.
5. A intensidade de luz necessria durante o exame microscpico desse mtodo no mnimo duas vezes maior do que a requerida pelo exame
direto a fresco, por esta razo o verde de malaquita usado para propiciar
proteo aos olhos65.
TCNICAS DE CONCENTRAO
As tcnicas de concentrao figuram entre os procedimentos de rotina, como parte de um exame completo das fezes, para a pesquisa de parasitos e o diagnstico de um pequeno nmero de organismos que foram omitidos, quando foi usado somente o exame direto a fresco. Os trs principais
objetivos dessas tcnicas so: 1) aumentar o nmero de cistos, oocistos, ovos
ou larvas na preparao; 2) eliminar a maioria dos detritos fecais; e 3) apresentar os organismos em um estado inalterado, facilitando sua identificao. Essas tcnicas so indicadas para separar os cistos e oocistos de
protozorios e ovos de helmintos do excesso de detritos fecais atravs de
diferenas especficas de densidade 26. As tcnicas de concentrao se dividem em: flutuao e sedimentao, e cada uma destas se subdivide em
flutuao simples e centrfugo-flutuao; sedimentao simples e centrfugo-sedimentao.
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CAPTULO 2

49

TCNICAS DE FLUTUAO
As tcnicas de flutuao fundamentam-se no princpio da diferena de
densidade especfica entre os ovos de helmintos, cistos e oocistos de protozorios
e o material fecal, a fim de que esses organismos flutuem na superfcie dos
reagentes com densidade especfica 67 . Esse processo de concentrao
foi introduzido por Bass 6 para recuperar ovos de ancilostomdeos nas fezes. Os procedimentos de flutuao usam reagentes de alta densidade
para a concentrao dos ovos, cistos e oocistos de parasitos. Os ovos e
cistos usualmente apresentam uma densidade especfica que varia de 1,05
a 1,15g/ml; entretanto alguns ovos, como de Clonorchis e Opisthorchis e
outras espcies muito prximas, mostram uma densidade especfica superior a 1,20g/ml e no podem ser concentrados pelas tcnicas usuais de flutuao27.
As principais vantagens apresentadas pela flutuao so a formao na superfcie do tubo de uma membrana clara com poucos detritos fecais e a remoo seletiva de ovos e cistos, mesmo quando presentes em pequeno nmero no bolo fecal, resultando em quantidade maior de organismos de certas
espcies, quando comparado com o nmero de parasitos presentes nos
esfregaos salinos. A alta densidade dos reagentes a mais significativa
desvantagem dos procedimentos de flutuao. A parede dos ovos e dos cistos, com muita freqncia, entra em colapso e os parasitos tornam-se
distorcidos na aparncia, dificultando a identificao. Por essa razo, as
membranas devero ser colhidas e examinadas dentro de um perodo de 10
a 20 minutos.
A densidade especfica da maioria dos ovos, cistos e oocistos desconhecida. Esse fato provavelmente determinou o uso de diversas solues,
cada uma com diferentes densidades especficas, com o objetivo de recuperar na preparao todos os ovos no operculados e cistos. Os trofozotos
e os ovos operculados no so isolados atravs dessa tcnica; flutuam somente os pequenos ovos de trematdeos, como o Clonorchis e o Heterophyes.
Ovos pesados, como os de Ascaris, Taenia, Schistosoma, Fasciola e
Fasciolopis, no flutuam; alguns cistos delicados e as larvas so distorcidos.
As gorduras e os leos presentes nas fezes flutuam com os ovos e cistos,
tornando a preparao algumas vezes insatisfatria para o exame.
Nas tcnicas de flutuao so usadas principalmente as solues saturadas
de cloreto de sdio75, de sacarose 66, de sulfato de zinco26,27,59 e de sulfato
de magnsio60. A densidade especfica dessas solues saturadas variam de
1,18 a 1,26g/ml.

FLUTUAO

EM

SOLUO SATURADA

DE

CLORETO

DE

SDIO

A tcnica de Willis75 fundamenta-se na dupla propriedade que apresentam


certos ovos de helmintos de flutuarem na superfcie de uma soluo de densidade elevada e de aderirem ao vidro46. Este procedimento, simples e eficiente, est indicado para a pesquisa de ovos com densidade especfica baixa,
como os de ancilostomdeos e de Trichostrongylus orientalis, embora no
seja recomendado para os ovos pesados de trematdeos, ovos de E.
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50

CAPTULO 2

vermicularis e ovos infrteis de A. lumbricoides. Os cistos de protozorios


se retraem, ficando irreconhecveis.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagente
Cloreto de sdio (NaCl).
Preparao da Soluo
Soluo Saturada de Cloreto de Sdio, Densidade 1,20g/ml
A soluo saturada de cloreto de sdio (NaCl) com densidade especfica de 1,20g/ml preparada pela adio do NaCl em gua destilada-deionizada
ou corrente quente ou em ebulio, at que o excesso acrescentado no mais
se dissolva na soluo, (aproximadamente 40g de NaCl em 100ml de gua)67.
A densidade especfica crtica, devendo-se usar um densitmetro para
controlar e ajustar a soluo. Filtrar em papel-filtro.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar uma quantidade de fezes frescas de aproximadamente 1 a
2g, coletada de vrias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de
3cm de dimetro com capacidade aproximada de 20ml. Completar 1/4 da
capacidade do recipiente com soluo saturada de cloreto de sdio.
3. Suspender as fezes na soluo saturada salina at haver uma total
homogeneizao.
4. Completar o volume. Colocar uma lamnula (22 x 22mm) ou uma lmina
sobre a borda da pequena cuba.
5. A lamnula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45
minutos; no dever haver formao de bolhas de ar entre a lamnula e a
superfcie do lquido. A gota contendo os ovos se adere face inferior da
lamnula (Fig. 2.8).
6. Remover a lamnula e inverter rapidamente sua posio sobre uma
lmina. Examinar ao microscpio com objetiva de pequeno aumento.
Observaes
1. Os ovos no flutuam na superfcie do reagente quando a homogeneizao
do material fecal incompleta, havendo uma imperfeita separao dos ovos
e dos detritos fecais.
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CAPTULO 2

51

Fig. 2.8 Flutuao em soluo concentrada de cloreto de sdio. (Adaptada de Markell


EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. 7th ed. Philadelphia (Pa): WB Saunders Co.,
1992).

2. A flutuao dos ovos no se realiza quando o perodo de flutuao


muito curto (menos de 30 minutos) ou muito longo (mais de 60 minutos).
Nesse caso os ovos que flutuam na superfcie podem descer para o fundo
da pequena cuba 52,67.

FLUTUAO

EM

S OLUO

DE

S ULFATO

DE

Z INCO

A tcnica de Willis75 foi modificada por Faust e cols.27 e por Otto, Hewitt
e Strahan 59, na qual a soluo saturada de cloreto de sdio, de densidade
1,20g/ml, foi substituda pela soluo de sulfato de zinco com densidade de
1,18g/ml.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagente
Sulfato de zinco, cristais (ZnSO4).
Preparao da Soluo
Soluo de Sulfato de Zinco, Densidade 1,18g/ml
Sulfato de zinco, cristais
gua destilada-deionizada

330g
670ml

A densidade crtica, devendo ser ajustada com densitmetro pela


adio de sal ou de gua. Filtrar em papel-filtro. Burrows11 e Suzuki67 dis Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

52

CAPTULO 2

solvem 371g de ZnSO 4 em 1.000ml de gua; Ash e Orihel 3 e Garcia e


Bruckner29,30 aconselham 330g de ZnSO 4 em 670ml de gua.
Tcnica
Seguir o mesmo procedimento preconizado na tcnica da soluo saturada de cloreto de sdio75, substituindo o NaCl pelo ZnSO4.

FLUTUAO

EM

SOLUO

DE

SULFATO

DE

MAGNSIO

Na tcnica de Phillipson60 o reagente de flutuao usado composto


por sulfato de magnsio (MgSO4) e cloreto de sdio (NaCl). Essa soluo
saturada de alta densidade possibilita a flutuao dos ovos pesados.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Sulfato de magnsio (MgSO4)
2. Cloreto de sdio (NaCl)
Preparao da Soluo
1. Soluo de Sulfato de Magnsio e Cloreto de Sdio
Cloreto de sdio, cristais (NaCl)
Sulfato de magnsio, cristais (MgSO4)
gua destilada-deionizada

290g
185g
1.000ml

Dissolver o NaCl e o MgSO4 em gua quente. Agitar vigorosamente


e filtrar em papel-filtro.
Tcnica
Seguir o preconizado na tcnica Willis75, substituindo a soluo saturada de cloreto de sdio pela soluo MgSO4-NaCl.

CENTRFUGO -FLUTUAO

EM

S OLUO

DE

SULFATO

DE

Z INCO

A tcnica de Faust e cols.26 foi o primeiro procedimento desenvolvido


para o diagnstico de cistos de protozorios e de ovos e larvas de helmintos.
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CAPTULO 2

53

Ovos grandes de trematdeos, de cestides e infrteis de A. lumbricoides


no so concentrados. Essa tcnica imprpria para espcimes fecais que
contenham grande quantidade de gorduras. A soluo de sulfato de zinco
preparada na densidade de 1,18g/ml para fezes frescas. A tcnica pode ser
usada com fezes preservadas em formaldedo (5% ou 10%, tamponado ou
no tamponado), SAF e fixador APV; entretanto, a densidade especfica dever
ser ajustada em 1,20g/ml. O aumento da densidade poder resultar em uma
distoro adicional dos organismos11,17,29,30,33.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagente
Sulfato de zinco (ZnSO 4).
Preparao da Soluo
1. Soluo de Sulfato de Zinco, Densidade 1,18g/ml
Preparao (v. p. 52). Uma soluo a 33% (m/v) usualmente se aproxima da densidade correta.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 1 ou 2g de fezes frescas colhidas de vrias partes do bolo
fecal em frasco contendo 10ml de gua corrente. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua corrente, dobrada duas vezes,
e receber o filtrado em um tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo.
A suspenso pode ser filtrada atravs de filtro descartvel (Parasitofiltro ),
com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
3. Adicionar gua corrente at completar 2/3 da capacidade do tubo.
4. Centrifugar (650 x g/1min). Decantar o sobrenadante e adicionar 1
a 2ml de gua corrente ao sedimento, antes de ressuspend-lo. Completar
com gua corrente 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.
5. Repetir a etapa 3, at que o sobrenadante apresente-se relativamente claro.
6. Depois que o ltimo sobrenadante decantado, adicionar 1 a 2ml do
reagente e ressuspender o sedimento; completar com sulfato de zinco at
0,5cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g/1min).
7. Cuidadosamente, remover o tubo da centrfuga e, sem agitao, coloclo em uma estante em posio vertical.
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54

CAPTULO 2

8. Com uma ala de arame (dimetro de 5 a 7mm) tocar no centro da


membrana formada na superfcie, transferindo vrias aladas para uma lmina de microscopia. Pesquisar ovos, larvas e cistos (Fig. 2.9B).
9. Alguns pesquisadores preferem a sobreposio de uma lamnula na
borda do tubo remoo da pelcula com ala de arame (11,56). Depois de
concluda a etapa 4, com auxlio de pipeta, encher o tubo at a borda com
soluo de sulfato de zinco. Colocar uma lamnula (22 x 22mm) na superfcie do tubo, deixando-a em contato com o lquido durante oito a 10 minutos.
Remover a lamnula, invertendo sua posio e colocar a face com a gota
sobre uma lmina. Examinar para ovos, larvas e cistos (Fig. 2.9A).
Amostra
Material fecal preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
O material fecal preservado com soluo de formaldedo requer uma
alta densidade especfica para que os ovos, larvas e cistos flutuem. Dessa

Fig. 2.9 Flutuao em soluo de sulfato de zinco. A) Tcnica da lamnula; B) Tcnica


da ala de arame. (Adaptada de Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures for the
Diagnosis of Intestinal Parasites. 3rd ed. USDHHS PHS (CDC), 82-8282, 1982).

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CAPTULO 2

55

maneira dever ser usada uma soluo de sulfato de zinco com densidade
de 1,20g/ml. A tcnica do sulfato de zinco para espcimes fecais preservados pelo formaldedo foi descrita por Barlett e col.5.
Reagentes
1. Sulfato de zinco (ZnSO4)
2. Soluo de formaldedo a 10% (ver p. 9)
Preparao da Soluo
Soluo de Sulfato de Zinco, Densidade 1,20g/ml
Sulfato de zinco, cristais (ZnSO4)
gua destilada-deionizada

400g
600ml

Ajustar a densidade em 1,20g/ml com densitmetro, pela adio do


sal ou gua.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. A suspenso fecal formolizada dever ser aproximadamente uma parte
de fezes para duas a trs partes de soluo de formaldedo. Se a suspenso
for muito espessa, diluir com soluo de formaldedo a 10% para se aproximar da proporo.
3. Filtrar a suspenso fecal formolizada atravs de gaze, levemente
umedecida em gua corrente, dobrada duas vezes, de modo a obter 3/4 de
um tubo de 13 x 100mm. Adicionar ao tubo, se necessrio, gua corrente.
A suspenso pode ser filtrada atravs do filtro descartvel (Parasitofiltro)
com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
4. Seguir as etapas de 2 a 8, como foi descrito para o material fecal
no preservado, usando sulfato de zinco de densidade 1,20g/ml.
Observaes
1. Alguns ovos de trematdeos e de cestides podem estar presentes
em um exame completo; devero ser examinados a membrana e o sedimento.
2. Uma permanncia prolongada da suspenso de fezes na soluo de
sulfato de zinco, de alta densidade especfica, pode resultar em colapso e
distoro dos cistos e dos ovos de nematides com parede fina. Examinar a
preparao aps 20 minutos.
3. No usar gaze com mais de duas camadas de espessura; gaze mais
espessa pode reter o muco (contendo oocistos de Cryptosporidium e de
Cyclospora e/ou esporos de microspordios)30.
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56

CAPTULO 2

4. Tubo com fundo redondo mais apropriado do que tubo cnico de


centrfuga de 15ml.
5. A gua corrente poder ser substituda pela soluo salina a 0,85%
durante todo o procedimento, conquanto a adio de gua s fezes frescas
causa a ruptura dos cistos de Blastocystis hominis (corpo central). Alguns
autores preferem o uso de formalina a 5% e 10% em substituio gua
corrente em todas as etapas da lavagem. Com os espcimes preservados
com SAF a tcnica deve iniciar na etapa 2.
6. Examinar a membrana e o sedimento quando a centrfugo-flutuao
em soluo de sulfato de zinco for a nica tcnica de concentrao usada
para o diagnstico, assegurando, dessa maneira, a deteco de todos os
organismos 30.
Controle de Qualidade (CQ): Tcnicas de Flutuao
1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A soluo salina e
a soluo de sulfato de zinco devem apresentar aparncia clara sem contaminao visvel.
2. Trimestralmente ou sempre que a centrfuga for calibrada, amostras
fecais sabidamente positivas devem ser concentradas e os organismos identificados.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
4. A densidade da soluo de sulfato de zinco crtica, devendo ser
ajustada com densitmetro pela adio de sal ou gua.
5. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle 17,30.

TCNICAS DE SEDIMENTAO
Os dois principais objetivos das tcnicas de sedimentao so o aumento
do nmero de ovos operculados, no operculados, larvas ou cistos e a separao das gorduras e leos da maioria dos detritos. Nessas tcnicas, os
organismos so sedimentados igualmente pela gravidade ou centrifugao.
A sedimentao apresenta uma ao inversa, comparada com a flutuao.
Os cistos, oocistos, ovos e larvas so retidos no fundo do tubo, enquanto os
detritos so suspensos para a superfcie, no interferindo no diagnstico final. A maior desvantagem a grande quantidade de detritos fecais no sedimento, tornando a identificao dos organismos muito mais difcil do que pelos
procedimentos de flutuao. Algumas tcnicas de sedimentao usam o ter
etlico e solues de cido clordrico, cido actico, ou sulfato de sdio para
clarificar e liberar os organismos dos detritos fecais. O ter poderia conduzir
muitos ovos e cistos junto com os detritos, dificultando o diagnstico das infeces leves. As solues de cidos fortes podem deformar ovos e cistos.
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CAPTULO 2

57

As tcnicas de sedimentao foram desenvolvidas para o diagnstico


das enteroparasitoses, como a de Teleman (cido clordrico-ter) 69; Lutz
(gua corrente) 49; de Rivas (cido actico-ter) 22 ; Tomb e Helmy (soluo salina a 0,7%) 70; Hoffman, Pons e Janer (gua corrente) 37 ; Faust,
Ingalls e See (gua glicerinada a 0,5%) 28 ; Jahnes e Hodges (soluo de
etanol a 10%) 40 ; Weller e Dammin (cido clordrico-triton NE-ter) 73 ;
Loughlin e Stoll (cido clordrico-ter-xilol, AEX)47; Loughlin e Spitz (calgonter-xilol, CEX) 48 ; Hunter e cols. (sulfato de sdio-cido clordrico-tritonter, AMS III) 39; Ritchie (formalina-ter, FE) 61 ; Blagg e cols. (mertiolatoiodo-formaldedo, MIFC) 9; Oshima e cols. (Tween 80-soluo tampo de
citrato) 58 e Bailenger (acetato de sdio-cido actico) 4. Alguns autores recomendam o uso conjunto das tcnicas de flutuao e sedimentao na
rotina laboratorial; entretanto, esta conduta impraticvel para a maioria
dos laboratrios 11,71.

SEDIMENTAO ESPONTNEA
A tcnica de Lutz 49 ou de Hoffman, Pons e Janer 37 um procedimento
simples, indicado para a pesquisa de ovos, larvas e cistos. Fundamenta-se
na sedimentao espontnea em gua (combinao da gravidade e da sedimentao). Os ovos operculados e de esquistossoma so facilmente recuperados. O uso de grande quantidade de material fecal nesse processo, em
contraste com as pequenas quantidades usadas em outras tcnicas, favorece um diagnstico satisfatrio e seguro, mesmo quando o nmero de organismos presentes pequeno. A grande vantagem da tcnica de sedimentao em gua para a concentrao de cistos de protozorios e ovos e larvas
de helmintos, no material fecal, a necessidade mnima de vidraria, sendo
dispensvel o uso de reagentes e da centrifugao. A desvantagem desse
processo de diagnstico coprolgico a grande quantidade de detritos fecais
no sedimento, dificultando, com freqncia, a preparao e o exame da lmina. Faust, Ingalls e See28 recomendam substituir a gua corrente por uma
soluo aquosa de glicerina a 0,5% (v/v), para diminuir a tenso superficial
e aumentar o nmero de organismos.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar cerca de 5g de fezes frescas, colhidas de vrias partes do
bolo fecal, em copo graduado ou em beaker de 250ml. Completar o volume
de 50 a 60ml com gua corrente e misturar vigorosamente.
3. Preparar a suspenso juntando 100ml de gua corrente.
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58

CAPTULO 2

4. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua


corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em copo cnico com capacidade de 125ml. A suspenso pode ser filtrada atravs de filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido em gua
corrente (Fig. 2.10A).
5. Se necessrio, adicionar gua corrente at completar aproximadamente 3/4 do volume do copo cnico. Deixar a suspenso em repouso durante uma a duas horas (Fig. 2.10B).
6. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena poro do sedimento na camada inferior, depositando-o
sobre uma lmina. Se a preparao estiver muito espessa, diluir com uma
gota de soluo salina a 0,85% ou gua corrente. Colher amostras adicionais do centro e do fundo do sedimento (Fig. 2.10C).
7. Examinar ao microscpio a presena de ovos, larvas e cistos.
Observaes
1. Melvin e Brooke 56, Ash e Orihel 3 apresentam a seguinte conduta
depois de concluda a etapa 4: a) decantar com cuidado 2/3 do lquido
sobrenadante sem perder nenhuma poro do sedimento; b) ressuspender o
sedimento em gua corrente e deixar a suspenso em repouso por mais uma
hora.
2. Esse procedimento de lavagem pode ser repetido at que o lquido
sobrenadante fique relativamente claro. Aps, seguir as etapas 5 e 6 na tcnica
anteriormente descrita.

Fig. 2.10 Sedimentao espontnea. A) copo cnico de sedimentao com filtro descartvel (Parasitofiltro) com ala de segurana; B) fezes em suspenso; C) sedimentao aps
duas horas.

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CAPTULO 2

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Amostra
Material fecal preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
2. Soluo de formaldedo a 10% (ver p. 9)
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar o material fecal fixado pela soluo de formaldedo.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em copo cnico de sedimentao com capacidade de 125ml. A suspenso pode ser filtrada atravs
do filtro descartvel (Parasitofiltro ) com ala de segurana levemente
umedecido em gua corrente.
4. Se necessrio, adicionar gua corrente, at completar aproximadamente 3/4 do volume do copo cnico. Deixar a suspenso em repouso durante uma a duas horas.
5. Decantar com cuidado 2/3 do lquido sobrenadante, sem perder nenhuma poro do sedimento.
6. Ressuspender o sedimento em gua corrente e deixar a suspenso
em repouso por mais uma hora.
7. Esse procedimento de lavagem pode ser repetido at que o lquido
sobrenadante fique relativamente claro. Aps, seguir as etapas 5 e 6 da tcnica
descrita por Hoffman, Pons e Janer 37.
Amostra
Material fecal preservado pela soluo de mertiolato-iodo-formaldedo
(MIF).
O material fecal preservado pela soluo de MIF pode ser concentrado pela sedimentao espontnea.
Reagentes
1. Soluo I (Soluo estoque MF) (ver p. 19)
2. Soluo II (Soluo de Iodo de Lugol) (ver p. 38)
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
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60

CAPTULO 2

2. Misturar o material fecal fixado pelo MIF.


3. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em um copo cnico de
sedimentao com capacidade de 125ml. A suspenso pode ser filtrada atravs
de filtro descartvel (Parasitofiltro ), com ala de segurana, levemente
umedecido em gua corrente.
4. Adicionar gua corrente, se necessrio, at completar repouso durante uma a duas horas.
5. Decantar com cuidado 2/3 do lquido sobrenadante sem perder nenhuma poro do sedimento.
6. Ressuspender o sedimento com gua corrente, e deixar a suspenso
em repouso por mais uma hora.
7. Esse procedimento de lavagem pode ser repetido at que o lquido
sobrenadante fique relativamente claro.
8. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena poro do sedimento na camada inferior, depositando-o
sobre uma lmina. Se a preparao estiver muito espessa, diluir com uma
gota de soluo salina a 0,85% ou com gua corrente. Colher amostras adicionais
do centro e do fundo do sedimento.
9. Examinar ao microscpio para a presena de ovos, larvas e cistos.
Observaes
1. O filtrado pode ser recebido em tubo de centrfuga de 15ml com fundo
redondo e pode ser centrifugado (500-650 x g/1min).
2. Preparar as lminas para a pesquisa de parasitos com o sedimento.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO PELA FORMALINA-TER OU CENTRFUGOSEDIMENTAO PELA FORMALINA-ACETATO DE ETILA


Existem inmeras variaes nas tcnicas de sedimentao pelo emprego da centrifugao, todas elas so derivadas do procedimento original de
Telemann69. Ritchie61 apresentou, em 1948, uma tcnica eficiente para recuperar e identificar cistos de protozorios e ovos e larvas de helmintos,
incluindo ovos operculados e de esquistossoma em material fecal fresco,
preservado pelo formaldedo. Maldonado e Acosta-Matienzo50, Maldonado,
Acosta-Matienzo e Veliz-Herrera51 modificaram o mtodo original de Ritchie61
acrescentando formalina o Triton NE, um detergente no-inico, com o
objetivo de aumentar a eficincia da tcnica56. Alguns autores recomendam
substituir o ter etlico pelo acetato de etila3,16,56,75,76,77. Este reativo inflamvel, mas pode ser usado com espcimes conservados com formaldedo e
fixador APV.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
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CAPTULO 2

61

Reagentes
1.
2.
3.
4.

Soluo de formaldedo a 10% (v/v) (ver p. 9)


Acetato de etila (C 4H 8O 2)
ter etlico (C 4H 10O)
Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)

Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 1 ou 2g de fezes frescas colhidas de vrias partes do bolo
fecal em frasco contendo 10ml de gua corrente ou soluo salina a 0,85%.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em um tubo de centrfuga
de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs de filtro
descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido
em gua corrente.
4. Centrifugar (650 x g/1min).
5. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2ml de gua corrente ou
soluo salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspend-lo. Completar
com gua corrente (ou soluo salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar
e centrifugar (650 x g/1min).
6. Repetir a etapa 4, at que o sobrenadante se apresente relativamente claro.
7. Depois que o ltimo sobrenadante decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2ml de formalina a 10% (dar preferncia soluo tamponada
de formalina a 10%, pH neutro). Completar o volume da suspenso em 10ml
com formalina a 10%. Deixar em repouso durante cinco minutos.
8. Adicionar 3ml de ter ou acetato de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos. Remover a tampa com cuidado.
9. Centrifugar (500 x g/1min). Quatro camadas se formaro: 1.) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos; 2.) camada de formalina;
3.) tampo de detritos fecais; e 4.) camada de ter na superfcie (Fig. 2.11A).
10. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com
um estilete fino e, com cuidado, decantar as trs camadas superiores. Limpar com swab de algodo as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes (Fig. 2.11B).
11. Uma pequena quantidade do lquido que permanece nas paredes do
tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o lquido e o sedimento, preparando as lminas para a pesquisa de ovos, larvas e cistos (Fig.
2.11C, D).
Observaes
1. Ritchie e cols. 62 relataram que o pH da formalina afeta o encontro
dos ovos e cistos no sedimento. Ovos de A. lumbricoides e Schistosoma
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62

CAPTULO 2

4
3

D
A

Fig. 2.11 Centrfugo-sedimentao pela formalina-ter. A) Quatro camadas no tubo de


centrfuga; B) Limpeza das paredes do tubo com swab de algodo; C) Sedimento; D) Preparao da lmina. (Adaptada de Ash LR, Oriehl TC. Parasites: A Guide to Laboratory
Procedures and Identification. Chicago (Ill): ASCP Press, 1991).

japonicum so melhores recuperados em pH 10,0, enquanto os ancilostomdeos


so muito bem identificados nos valores de pH 4,0 e 7,0. Os ovos de T. trichiura
e cistos de protozorios aparentemente no so afetados pelas mudanas
do pH, mas os melhores resultados so obtidos no pH 7,0. Esses dados mostram
que a formalina no pH neutro mais eficaz do que a formalina no tamponada
no estudo dos parasitos27,56.
2. No usar gaze com mais de duas camadas de espessura; gaze mais
espessa pode reter o muco (contendo oocistos de Cryptosporidium e de
Cyclospora e/ou esporos de microspordios).
3. Tubo com fundo redondo mais apropriado do que tubo cnico de
centrfuga de 15ml. A gua corrente poder ser substituda pela soluo salina
a 0,85% durante todo o procedimento, conquanto a adio de gua s fezes
frescas causa a ruptura dos cistos de Blastocystis hominis (corpo central).
Alguns autores preferem o uso de formalina a 5 e 10% em substituio
gua corrente em todas as etapas da lavagem.
4. Com os espcimes preservados com SAF, a tcnica deve iniciar na
etapa 2. O acetato de etila mais eficiente do que ter etlico na pesquisa
de ovos de Taenia spp. ou H. nana ou cistos de G. lamblia, havendo menor tendncia para que esses ovos e cistos fiquem retidos no tampo de detritos
fecais. O acetato de etila no produz to bons resultados como o ter etlico
na extrao de gorduras ou do material mucide dos espcimes fecais.
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CAPTULO 2

63

5. Os resultados obtidos pelo exame direto (exame direto a fresco ou


concentrao dos espcimes fecais) usualmente devem ser confirmados pela
colorao permanente de esfregaos, pois alguns protozorios so muito
pequenos e de difcil identificao.
6. Coloraes especiais tambm so necessrias para a identificao
dos organismos. A confirmao particularmente importante nos casos de
E. histolytica em oposio a E. coli. Certos parasitos (G. lamblia, ancilostomdeos e, ocasionalmente, T. trichiura) preservados pelo fixador APV no
so satisfatoriamente concentrados como o material fecal preservado pelo
formaldedo.
7. A morfologia das larvas de Strongyloides stercoralis apresenta
problemas de identificao morfolgica, o que no ocorre com os espcimes preservados pelo formaldedo. Os oocistos de Isospora belli, por razes ainda desconhecidas, so rotineiramente perdidos e no identificados
no sedimento concentrado de espcimes preservados em fixador APV, o que
no ocorre quando as fezes so fixadas pela formalina.
Amostra
Material fecal preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Soluo de formaldedo a 10% (v/v) (ver p. 9)


Acetato de etila (C 4H 8O 2)
ter etlico (C 4H 10O)
Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)

Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar o material fecal fixado pela soluo de formaldedo.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em um tubo com fundo
redondo de centrfuga de 15ml. A suspenso pode ser filtrada atravs de
filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
4. Completar o volume em 10ml com gua corrente (ou soluo salina
a 0,85%). Centrifugar (500 x g/2min).
5. Decantar o sobrenadante e, se necessrio, realizar uma segunda lavagem em gua corrente (ou soluo salina a 0,85%).
6. Adicionar 3ml de ter etlico (ou acetato de etila). Fechar o tubo e
agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos. Remover a tampa
com cuidado.
7. Centrifugar (500 x g/2min). Quatro camadas se formaro (Fig. 2.11).
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64

CAPTULO 2

8. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com


estilete fino e com cuidado, decantar as trs camadas superiores. Limpar
com swab de algodo as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.
9. Uma pequena quantidade do lquido que permanece nas paredes do
tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o lquido e o sedimento e preparar as lminas para a pesquisa de ovos, larvas e cistos.
Amostra
Material fecal preservado pelo fixador lcool polivinlico (fixador APV).
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

Acetato de etila (C4H 8O 2)


ter etlico (C4H 10O)
Soluo de formaldedo a 10% (ver p. 9)
Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
Fixador lcool polivinlico (fixador APV) (ver p. 14)

Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar o material fecal preservado pelo fixador APV.
3. Transferir aproximadamente a metade do volume a um copo graduado ou beaker e adicionar o mesmo volume de soluo salina a 0,85%.
4. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes, e receber o filtrado em um tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs de
filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
5. Centrifugar (500 x g/2min).
6. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2ml de soluo salina a 0,85%
ao sedimento antes de ressuspend-lo. Completar 2/3 do volume do tubo com
salina a 0,85%, agitar e centrifugar (500 x g/2min).
7. Eliminar ou repetir a etapa 5, at que o sobrenadante se apresente
relativamente claro. O procedimento continua, como foi descrito na tcnica
original de Ritchie61, relatada anteriormente, iniciando na etapa 6.
Observaes
1. Garcia e Bruckner 30 recomendam, na etapa 7, no usar ter se o
sedimento do fundo do tubo for muito pequeno; completar a metade do volume do tubo com soluo de formaldedo a 10%; centrifugar e decantar,
examinando aps o sedimento remanescente.
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CAPTULO 2

65

2. Carroll, Cook e Turner14, comparando a tcnica da centrfugo-sedimentao em formaldedo-ter ou formaldedo-acetato de etila com o material preservado em soluo de formaldedo a 10% e em fixador APV, demonstraram que a concentrao mais eficaz quando os espcimes so
preservados em soluo de formaldedo a 10%.
Amostra
Material fecal preservado pela soluo de mertiolato-iodo-formaldedo
(MIF). O material fecal preservado pela soluo MIF pode ser concentrado
pela centrfugo-sedimentao (MIFC). A MIFC uma tcnica semelhante
centrfugo-sedimentao com formalina-ter61, exceto a soluo MIF que
substitui a formalina9. Esse procedimento indicado para a pesquisa de cistos de protozorios e ovos e larvas de helmintos.
Reagentes
1. Soluo I (Soluo estoque MF) (ver p. 19)
2. ter etlico (C 4H 10O)
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar o material fecal fixado com o MIF (ver observaes sobre
a instabilidade da soluo fixadora MIF).
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em um tubo de centrfuga
de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs de filtro
descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido
em gua corrente.
4. Completar o volume em 10ml com soluo preservadora MIF.
5. Adicionar 3ml de ter. Fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posio
invertida, no mnimo por um minuto. Remover a tampa com cuidado.
6. Centrifugar (500 x g/1min). Quatro camadas se formaro: 1.) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos; 2.) camada de soluo MIF;
3.) tampo de detritos fecais; e 4.) camada de ter na superfcie.
7. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com estilete
fino e com cuidado decantar as trs camadas superiores. Limpar as paredes
do tubo com swab de algodo, removendo os detritos remanescentes.
8. Com uma pipeta capilar, colher o sedimento e preparar uma lmina
para pesquisa de ovos, larvas e cistos.
Observaes
Esta tcnica, de acordo com os autores 9, revela trofozotos e cistos de
protozorios e ovos e larvas de helmintos.
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66

CAPTULO 2

Amostra
Material fecal preservado pela soluo fixadora acetato de sdio-cido
actico-formaldedo (SAF).
A soluo fixadora SAF, originalmente descrita por Junot41, usada como
preservadora de material fecal e, subseqentemente, aplicada em tcnica de
concentrao76. Esse procedimento realizado como a tcnica original de
Ritchie61 (centrfugo-sedimentao pela formalina) descrita anteriormente,
iniciando-se na etapa 2.
Amostra
Material fecal preservado pela soluo fixadora fenol-lcool-formaldedo
(PAF).
O fixador PAF foi descrito por Burrows12. As modificaes introduzidas
na tcnica de concentrao, com a adio de diferentes reagentes, como
soluo salina a 0,85%, Triton NE e ter, resultaram em um procedimento
muito bom para a identificao de parasitos. Esse procedimento realizado
como a tcnica original de Ritchie (centrfugo-sedimentao pela formalinater)61 descrita anteriormente, iniciando-se na etapa 2.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO PELO SULFATO DE SDIO-CIDO


CLORDRICO-TRITON-TER (AMS III)
Hunter e cols.39 desenvolveram uma tcnica de centrfugo-sedimentao que combina o sulfato de sdio, o cido clordrico, Triton e ter etlico
(AMS III), para a identificao de ovos de esquistossomo44. Esse procedimento indicado para o diagnstico de muitas outras espcies de helmintos.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1.
2.
3.
4.

ter etlico (C4H 10O)


Triton 80 (ou Triton NE)
cido clordrico a 37% (HCl)
Sulfato de sdio (Na2SO 4)

Preparao das Solues


1. Soluo A
cido clordrico a 37%
gua destilada-deionizada

45ml
55ml

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CAPTULO 2

67

2. Soluo B
Sulfato de sdio
gua destilada-deionizada

9,6g
100ml

3. Soluo AMS
Misturar, antes do uso, as solues A e B na proporo de 1:1. Ajustar a densidade em 1,08g/ml, com densitmetro, pela adio da soluo de
sulfato de sdio ou gua.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 1 ou 2g de fezes colhidas de vrias partes do bolo fecal em
frasco contendo 10ml de gua corrente.
3. Completar o volume de 15ml com gua corrente e filtrar a suspenso atravs de gaze, levemente umedecida com gua corrente, dobrada duas
vezes, e receber o filtrado em um tubo de centrfuga de 20 a 25ml com fundo
redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs do filtro descartvel
(Parasitofiltro ), com ala de segurana, levemente umedecido em gua
corrente.
4. Agitar e centrifugar (500 x g/1min).
5. Decantar o sobrenadante e adicionar ao sedimento 5ml da soluo
AMS, trs gotas de Triton 80 (ou Triton NE) e 5ml de ter. Fechar o tubo e
agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos. Remover a tampa
com cuidado.
6. Centrifugar (500 x g/2min).
7. Decantar o tampo de detritos e o lquido sobrenadante. Limpar com
swab de algodo as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.
8. Colher o sedimento com uma longa pipeta capilar e preparar as lminas para a pesquisa de parasitos 11,67.
Observaes
1. Essa tcnica apresenta um sedimento bastante claro, quando comparado com as outras tcnicas, sendo os ovos facilmente reconhecidos. Faust
e cols. 28 eliminaram o cido clordrico para evitar a destruio de alguns
ovos.
2. Maldonado e Acosta-Matienzo 50 relataram que este procedimento,
sem o cido clordrico, um excelente processo para a identificao de ovos
de Schistosoma mansoni. Os protozorios no so recuperados por esta
tcnica 67 .
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68

CAPTULO 2

CENTRFUGO-SEDIMENTAO PELO ACETATO DE SDIO -CIDO ACTICO


A tcnica de Bailenger 4,31,46 usada na rotina do Laboratoire de
Parasitologie, Hpital Charles Nicolle, 1, rue de Germont, 76031 Rouen, France.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Acetato de sdio anidro ou hidratado (C2H 3O2Na.3H 2O)
2. cido actico glacial (C2H 4O2)
3. ter etlico (C4H 10O)
Preparao da Soluo
Soluo de Bailenger
Acetato de sdio
cido actico
gua destilada-deionizada

15g
3,6ml
1.000ml

O lquido de diluio o tampo aceto-actico no pH 5,0. Ajustar o


pH, se necessrio, com cido actico.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar em frasco, contendo pequenas esferas de vidro, 20ml da soluo
de Bailenger e 2 ou 3g de fezes, coletadas de vrias partes do bolo fecal.
3. Agitar durante um minuto e filtrar a suspenso atravs de gaze levemente umedecida em gua corrente, dobrada duas vezes. A suspenso
pode ser filtrada atravs do filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de
segurana, levemente umedecido em gua corrente.
4. Transferir 4ml do filtrado para tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo e adicionar 2ml de ter. Fechar o tubo e agitar vigorosamente,
na posio invertida, no mnimo por um minuto. Remover a tampa com cuidado.
5. Centrifugar (500 x g/1min). Quatro camadas se formaro: 1.) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos; 2.) camada de acetato de
sdio; 3.) tampo de detritos; e 4.) camada de ter na superfcie.
6. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com
estilete ou com swab de algodo, removendo os detritos remanescentes.
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CAPTULO 2

69

7. Com pipeta capilar, colher o sedimento e preparar lmina para a


pesquisa de parasitos.
Observaes
Bailenger3 substituiu nesta tcnica a soluo de formaldedo a 10% pelo
lquido de diluio acetato-actico em pH 5,0, no qual, conforme o autor, os
parasitos so mais facilmente concentrados.
Controle de Qualidade (CQ): Tcnicas de Sedimentao
1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A formalina e a
soluo salina devem apresentar aparncia clara sem nenhuma contaminao visvel.
2. Trimestralmente ou sempre que a centrfuga for calibrada, amostras
fecais sabidamente positivas devem ser concentradas e os organismos identificados.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
4. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle 16,30.

CORANTE IODO-T RICRMICO

PARA

SEDIMENTO

A combinao da soluo de iodo de Lugol e do corante tricrmico


usada para corar o sedimento fecal proveniente das tcnicas de concentrao36. Os ovos e os cistos so corados de marrom-amarelo (iodo) e os detritos fecais coram-se em verde (tricrmico), produzindo um contraste que
facilita a identificao dos parasitos. Esse exame direto indicado como um
procedimento suplementar, mas no deve substituir o exame direto no corado do sedimento fecal concentrado.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Soluo de iodo de Lugol (ver p. 19)
2. Corante tricrmico (ver p. 105)
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CAPTULO 2

Colorao do Sedimento
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Misturar em um tubo de ensaio quatro gotas da soluo de iodo de
Lugol e igual volume do sedimento fecal concentrado. Agitar a mistura.
3. Transferir duas gotas da mistura, soluo de iodo de Lugol-sedimento fecal concentrado, para uma lmina de microscopia.
4. Adicionar uma gota do corante tricrmico mistura soluo de iodo
de Lugol-sedimento fecal concentrado.
5. Cobrir a preparao com uma lamnula (22 x 22mm) e examinar atravs
de pequeno aumento (100X) e de grande aumento (400X). A suspenso no
deve ser muito espessa, nem muito diluda; considera-se boa a suspenso
que permite ler por transparncia os caracteres comuns de um jornal.
Caractersticas da Colorao
Os trofozotos e/ou cistos de protozorios e alguns ovos e larvas de
helmintos so observados e identificados. Os cistos de protozorios apresentam problemas na identificao a nvel de espcie (depende dos detalhes e da clareza da morfologia). Os ovos de A. lumbricoides e Taenia spp.
tomam uma colorao marrom-escura, dificultando sua identificao, podendo
ser confundidos com detritos. Essa colorao apresenta um matiz mais escuro do que a colorao tradicional pela soluo de iodo de Lugol, conseqentemente deve haver um aumento da intensidade de iluminao do microscpio.
Controle de Qualidade (CQ): Corante Iodo-Tricrmico para
Sedimento
1. Deve ser verificado diariamente se a soluo de iodo est transparente e no contaminada com bactrias ou fungos.
2. A soluo de iodo deve apresentar cor marrom forte (ch da ndia
ou vinho do Porto), apresentando uma correta intensidade de contraste.
Desprezar as solues fracas.
3. Nos cistos dos protozorios, corretamente corados pela soluo de
iodo, o glicognio, se presente, exibe uma colorao castanho-avermelhada,
o citoplasma cora-se em amarelo e a cromatina perifrica dos ncleos, em
preto ou marrom. As caractersticas dos ncleos so bem distintas, enquanto os corpos cromatides so pouco visveis.
4. Leuccitos humanos misturados com fezes negativas podem ser usados
como CQ da amostra fecal. Os leuccitos coram-se com a mesma colorao como so vistos os protozorios. O citoplasma dos leuccitos apresenta
colorao amarelo-ouro.
5. Uma amostra sabidamente positiva tambm pode ser utilizada para
CQ. A amostra para CQ deve ser examinada ao menos trimestralmente ou
sempre que for preparado um novo corante.
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CAPTULO 2

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6. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada


12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
7. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle30.
Observaes
1. O corante iodo-tricrmico mais escuro do que as solues de iodo
usualmente usadas na rotina laboratorial (Lugol, Dobell e OConnor e DAntoni),
conseqentemente no indicado no exame direto de esfregaos. Esse procedimento particularmente importante porque os ovos de A. lumbricoides
e Taenia spp. adquirem uma supracolorao, podendo no ser reconhecidos como ovos de helmintos. Alguns protozorios, muito pequenos e de difcil identificao, podem ser facilmente omitidos.
2. Os resultados obtidos com o exame direto devem ser confirmados
pelas preparaes de esfregaos permanentes corados. A confirmao
importante nos casos da E. histolytica em oposio a E. coli; essa identificao deve ser reportada como preliminar. O resultado final ser apresentado aps a preparao de esfregaos permanentes corados.
3. Nas infeces macias pelo Cryptosporidium parvum so observados oocistos; entretanto, as modificaes da colorao de Ziehl-Neelsen
e/ou a pesquisa de anticorpos monoclonais so os procedimentos indicados
para o diagnstico desse organismo. Os oocistos de I. belli so tambm
identificados, enquanto os oocistos de Cyclospora cayetanensis no so
visualizados, sendo confundidos com detritos fecais.
4. Os esporos dos microspordios no so visveis atravs do exame direto.
So muito pequenos, com forma semelhante aos artefatos e detritos das fezes.
TCNICAS DE CONCENTRAO ESPECFICAS PARA
COCCDIOS
Inmeras tcnicas de concentrao so usadas com o objetivo de aumentar a sensibilidade do exame, como tambm diminuir os artefatos fecais.
Os organismos podero ter sua morfologia alterada pela desidratao atravs de lquidos hipertnicos usados nesses procedimentos, devendo o exame microscpico ser rpido. A membrana colhida nas tcnicas de flutuao
examinada sem fixao e colorao, em microscpio de contraste de fase,
ao passo que o sedimento colhido aps a realizao das tcnicas de sedimentao examinado sem colorao ou corado.

CENTRFUGO-FLUTUAO

EM

S OLUO

DE

SACAROSE

A tcnica de Sheather66, adaptada por Current18,19, recomendada para


a pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. em material fecal fresco
ou preservado em soluo de formaldedo.
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CAPTULO 2

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Sacarose (C 12 H 22 O 11 )
2. Fenol, cristais (C 6H6O)
3. Soluo de formaldedo a 10% (v/v) (ver p. 9)
Preparao da Soluo
Soluo de Sacarose de Sheather, densidade 1,2g/ml
Sacarose
Fenol (fundido a 44C)
gua destilada-deionizada

500g
6,5g
320ml

Ferver a soluo de sacarose at clarificar e adicionar, com cuidado,


o fenol. Deixar esfriar temperatura ambiente antes de usar.
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar 1 ou 2g de fezes formolizadas ou formadas colhidas de vrias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de gua corrente.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes, e receber o filtrado em um tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs do
filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
4. Adicionar a soluo de sacarose de Sheather at 3/4 do tubo (aproximadamente 10ml).
5. Agitar vigorosamente 1 a 2ml da suspenso fecal com 10ml da
soluo de sacarose. Completar o volume do tubo com a soluo de
sacarose.
6. Colocar uma lamnula (22 x 22mm) na borda do tubo, mantendo-a
em contato com a soluo de sacarose.
7. Centrifugar (500 x g/10min). Remover a lamnula, invertendo sua
posio, colocando a face com a gota sobre a lmina.
8. Examinar em microscpio de contraste de fase.
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CAPTULO 2

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Controle de Qualidade (CQ): Centrfugo-Flutuao em Soluo de


Sacarose
1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A soluo de
sacarose de Sheather deve ter aparncia clara sem nenhuma contaminao visvel.
2. Trimestralmente ou sempre que a centrfuga for calibrada, amostras
fecais sabidamente positivas devem ser concentradas e os organismos identificados.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. A densidade da soluo de sacarose crtica, devendo ser ajustada
com densitmetro pela adio de sal ou gua.
5. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle17.
Observaes
1. A combinao da flutuao em soluo de acar de Sheather com
a microscopia de contraste de fase um excelente procedimento para identificar e distinguir os oocistos das clulas de levedura contaminantes.
2. O C. parvum aparece como um corpo esfrico refringente, medindo
de 4 a 5m, contendo quatro grnulos escuros. A tcnica de Sheather 66,
adaptada por Current 15,16, no recomendada para os exames de rotina com
fezes frescas de pacientes com SIDA/AIDS, porque o lquido poder escorrer para fora do tubo e contaminar a centrfuga. Neste caso, os tubos de
centrfuga devero ter tampas para evitar tambm a formao de aerossis.
Recomenda-se trabalhar em capela de fluxo laminar vertical.
3. Para impedir a exposio desnecessria do material fecal, que pode
conter o vrus HIV e/ou outros patgenos, indicada uma modificao dessa tcnica de flutuao.
4. Manter a soluo de flutuao 1 a 3cm abaixo da borda do tubo,
transferir a pelcula formada na superfcie da soluo de Sheather para uma
lmina de microscopia, com o auxlio de ala de platina e, aps, colocar a
lamnula. Observar com microscpio de contraste de fase ou de campo claro. Alguns autores recomendam fixar a pelcula e corar pelos mtodos de
Giemsa, Henriksen e Pohlenz ou Kinyoun (a quente)35.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO PELO FORMALDEDO-TER MODIFICADO


A tcnica de Ritchie61, modificada por Allen e Ridley1, a que apresenta os melhores resultados para a pesquisa de oocistos. A concentrao
pode ser realizada a partir de fezes frescas ou formolizadas. Sendo a amostra
mucosa, ela dever ser fluidificada, sob agitao, com algumas gotas de
hidrxido de potssio a 10%.
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CAPTULO 2

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou preservado pela soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Soluo de formaldedo a 10% (v/v) (ver p. 9)
2. ter etlico (C4H 10O)
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Diluir 1 ou 2g de fezes frescas ou formolizadas em 7ml de soluo
de formaldedo a 10%.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze levemente umedecida em gua
corrente, dobrada duas vezes, e receber o filtrado em um tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs do
filtro descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido em gua corrente.
4. Adicionar 3ml de ter, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos. Remover a tampa com todo cuidado.
5. Centrifugar (500 x g/2min). Quatro camadas se formaro: 1.) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitos; 2.) camada de formalina;
3.) tampo de detritos fecais; e 4.) camada de ter na superfcie (Fig. 2.11A).
6. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com
estilete fino e com cuidado decantar as trs camadas superiores. Limpar com
swab de algodo as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes
(Fig. 2.11B).
7. Uma pequena quantidade de lquido permanece nas paredes do tubo,
escorrendo para o fundo junto ao sedimento. Misturar o lquido e o sedimento e preparar as lminas para a pesquisa de ovos, larvas e cistos (Fig.
2.11C e D). Corar o sedimento pelos mtodos de Giemsa ou por uma das
coloraes derivadas de Ziehl-Neelsen.
Controle de Qualidade (CQ): Centrfugo-Sedimentao pelo
Formaldedo-ter Modificado.
1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A formalina e a
soluo salina devem apresentar aparncia clara, sem nenhuma contaminao visvel.
2. Trimestralmente ou sempre que a centrfuga for calibrada, amostras
fecais sabidamente positivas devem ser concentradas e os organismos identificados.
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CAPTULO 2

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3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada


12 meses. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle 15,30.
Observaes
1. Adicionar 10 gotas de soluo de hidrxido de sdio (NaOH) a 10%
ao sedimento, quando este se apresentar mucide21,61.
2. No usar gaze com mais de duas camadas de espessura; gaze mais
espessa pode reter o muco (contendo oocistos de Cryptosporidium e de
Cyclospora e/ou esporos de microspordios). Tubo com fundo redondo mais
apropriado do que tubo cnico de centrfuga de 15ml.
3. A gua corrente poder ser substituda pela soluo salina a 0,85%
durante todo o procedimento, conquanto a adio de gua s fezes frescas
causa a ruptura dos cistos de B. hominis (corpo central).
4. Alguns autores preferem o uso de formalina em substituio gua
corrente em todas as etapas da lavagem. Com os espcimes preservados
com SAF, a tcnica deve iniciar na etapa 2.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO PELO HIDRXIDO

DE

POTSSIO

A tcnica de Berlin 8 indicada para a pesquisa de oocistos de


Cyclospora cayetanensis. A concentrao realizada a partir de fezes
frescas.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Soluo de hidrxido de potssio a 10% (KOH)
2. Soluo salina a 0,85% (ver p. 35).
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar cerca de 2g de fezes frescas, colhidas de vrias partes do
bolo fecal, em um tubo de centrfuga de 15ml de fundo redondo.
3. Adicionar 2ml de soluo de hidrxido de potssio a 10%, fechar o
tubo e agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos.
4. Deixar a suspenso em repouso durante cinco minutos temperatura ambiente. Adicionar 8 a 10ml de soluo salina a 0,85%, fechar o tubo e
agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 segundos.
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CAPTULO 2

5. Filtrar a suspenso atravs de gaze levemente umedecida em gua


corrente, dobrada duas vezes e receber o filtrado em um tubo de centrfuga
de 15ml com fundo redondo. A suspenso pode ser filtrada atravs do filtro
descartvel (Parasitofiltro), com ala de segurana, levemente umedecido
em gua corrente. Centrifugar (2.000rpm/2min).
6. Decantar com cuidado o lquido sobrenadante sem perder nenhuma
poro do sedimento. Ressuspender o sedimento com 10ml de soluo salina a 0,85%, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posio invertida, por
30 segundos.
7. Centrifugar (2.000rpm/2min).
8. Decantar com cuidado o lquido sobrenadante sem perder nenhuma
poro do sedimento.
9. Corar o sedimento por um dos mtodos derivados de Ziehl-Neelsen53.

REVISO: TCNICAS DE CONCENTRAO


Princpio: Concentrao dos parasitos presentes por meio da flutuao
e da sedimentao, com o objetivo de identificar e diagnosticar cistos
de protozorios, oocistos de coccdios, esporos de microspordios e ovos
e larvas de helmintos.
Amostra: Espcimes fecais frescos ou preservados em formalina, fixadorAPV, SAF e MIF.
Reagentes: Formalina a 5% e 10% (tamponada e no tamponada), ter,
acetato de etila, sulfato de zinco (densidade 1,18g/ml para fezes frescas e 1,20g/ml para fezes preservadas); soluo salina a 0,85% e solues de iodo de Lugol e DAntoni.
Exame: Examinar toda a lamnula (22 x 22mm) com pequeno aumento
(100X) (recomenda-se a preparao de esfregaos corados pela soluo de iodo); com grande aumento (400X), examinar no mnimo 1/3 da
lamnula (preparaes salinas e coradas pela soluo de iodo).
Resultados: Os resultados da concentrao, freqentemente, so considerados presuntivos; entretanto, alguns organismos so definitivamente
diagnosticados (cistos de G. lamblia e Entamoeba spp., ovos e larvas
de helmintos e oocistos de I. belli). Esses resultados so caracterizados como preliminares, at que o diagnstico final esteja disponvel, aps
a concentrao e o exame de preparaes permanentes coradas.
Procedimentos e Limitaes: Os procedimentos mais usados so as
tcnicas da sedimentao espontnea em gua e a centrfugo-sedimentao pela formalina-ter ou centrfugo-sedimentao pela formalina
acetato de etila. A centrfugo-flutuao em sulfato de zinco no detecta ovos operculados ou ovos pesados, a membrana e o sedimento devem ser examinados antes de reportar o resultado como negativo.
Esfregaos preparados a partir de fezes concentradas so normalmente examinados com pequeno aumento (100X) e com grande aumento
(400X). Realizar a morfometria com o micrmetro ocular.

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CAPTULO 2

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80

CAPTULO 2

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CAPTULO 2

81

CAPTULO

Preparao e Colorao de
Esfregaos Permanentes
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
O procedimento mais importante para exame e diagnstico
das infeces parasitrias por protozorios a preparao de
esfregaos fecais permanentes corados. Os esfregaos permanentes podem ser preparados com fezes frescas ou fezes preservadas pelos fixadores lcool polivinlico (fixador APV) e/ou
acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF). Os esfregaos
preparados com fezes preservadas pela formalina ou mertiolatoiodo-formaldedo (MIF) apresentam condies insatisfatrias.
Os esfregaos permanentes corados oferecem inmeras e importantes vantagens: a) permitem um minucioso estudo da morfologia dos organismos corados com a objetiva de imerso; b)
raros ou pequenos organismos omitidos no exame direto a fresco podem ser identificados com facilidade; c) o exame realizado adequadamente pelo microscopista; d) os esfregaos permanentes corados podem ser arquivados para estudos futuros
como material de referncia, e) os esfregaos positivos, quando necessrio, podem ser submetidos a especialistas para uma
identificao especfica dos organismos.
As coloraes permanentes so usadas para a identificao de trofozotos, ocasionalmente de cistos e para a confirmao das espcies. Pequenos protozorios so freqentemente
observados nos esfregaos corados; entretanto, estes organismos so facilmente omitidos, quando se usa somente exame direto

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CAPTULO 3

83

ou tcnicas de concentrao. Por esta razo, esfregaos corados so recomendados para cada amostra fecal enviada ao laboratrio para exame
parasitolgico de rotina.
A maioria dos mtodos de colorao deriva da hematoxilina. A colorao permanente, mais satisfatria e a mais comum, empregada para o estudo dos protozrios intestinais, o mtodo longo da hematoxilina frrica9. Vrias
modificaes desse procedimento foram desenvolvidas: como a hematoxilinatergitol4; hematoxilina frrica-cido fosfotngstico19 e a hematoxilina-cido
clordrico18. Para os trabalhos de rotina foram descritos mtodos rpidos no
derivados da hematoxilina, como o tricrmico de Wheatley20; modificao
da colorao de Gomori7; a fucsina cida-fast green 13; o preto de clorazol11,12
e as amostras preservadas com acetato de sdio-cido actico-formaldedo
(SAF) 21.
A maioria dos problemas encontrados na colorao permanente dos
esfregaos fecais para a pesquisa de trofozotos e cistos de protozorios ocorre
quando os espcimes so muito velhos, ou quando os esfregaos so muito
densos, ou as preparaes so coradas antes de estarem secas ou fixadas
inadequadamente 5.
Ao lado dos mtodos padres usados na colorao de esfregaos permanentes, a recente emergncia de diferentes coccdios e microspordios
intestinais, como importantes parasitos em indivduos com SIDA/AIDS ou
em outras sndromes da imunodeficincia adquirida, tem conduzido o laboratrio ao uso de procedimentos especficos de colorao para a identificao e diagnstico desses organismos. Vrios corantes derivados da fucsinafenicada tm se mostrado altamente eficientes para o diagnstico das infeces
pelos coccdios (Cryptosporidium parvum, Isospora belli e Cyclospora
cayetanensis) e pelos microspordios (Encephalitozoon intestinalis e
Enterocytozoon bieneusi). Ver Captulo 10 Mtodos de Colorao para
Coccdios Intestinais (Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis
e Isospora belli) e Captulo 11 Mtodos de Colorao para Microspordios
Intestinais (Encephalitozoon intestinalis e Enterocytozoon bieneusi).
COLORAES DERIVADAS DA HEMATOXILINA
As hematoxilinas so corantes nucleares, oferecendo vantagens por corar
principalmente os ncleos e evidenciar as estruturas internas muito delicadas. Dois procedimentos bsicos so observados durante a colorao: o
progressivo e o regressivo. No progressivo, o corante bem diludo e usado
por bastante tempo, at que o organismo adquira uma colorao prpria, de
acordo com o seu grau de cromofilia. No deve ser usado diferenciador.
No regressivo, o corante no diludo, ou pouco diludo. Cora-se com excesso,
para depois remover o corante com o diferenciador. mais rpido e mais
controlvel, alm de permitir a remoo das partculas do corante, que normalmente ficam aderidas superfcie do parasito3. O melhor processo de
colorao o clssico mtodo longo da hematoxilina frrica, segundo
Heidenhain 9 ou uma de suas modificaes. Esses procedimentos usam a
hematoxilina como corante e a soluo de sulfato frrico amoniacal

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CAPTULO 3

(NH4Fe[SO 4]2.12H2O) como mordente e diferenciador. Esse mtodo apresenta excelentes resultados de colorao quando todas as etapas do procedimento de colorao forem observadas, especialmente durante a diferenciao dos organismos. Os esfregaos podem ser preparados com
amostras frescas ou preservadas com o lquido de Schaudinn, fixador lcool polivinlico (fixador APV) ou fixador acetato de sdio-cido acticoformaldedo (SAF).

COLORAO PELA HEMATOXILINA F RRICA, SEGUNDO HEIDENHAIN,


M ODIFICADA POR B URROWS
A colorao pela hematoxilina frrica, segundo Heidenhain, modificada por Burrows3, indicada para a colorao de rotina de esfregaos fecais
para a pesquisa de protozorios intestinais. Em uma das faces da lamnula
(22 x 22mm), presa por uma de suas bordas a um pequeno pedao de borracha de forma semicircular (15mm de dimetro por 3mm de espessura),
emulsificar pequena quantidade de fezes frescas em uma gota de soluo
salina a 0,85%. A lamnula encaixada num entalhe feito na face plana do
suporte, por meio de bisturi fino ou com lmina de barbear. O suporte de
borracha tem por finalidade facilitar a manipulao do preparado durante os
diferentes tempos de fixao e colorao, alm de permitir identificar o material,
mediante a gravao de nmero numa das faces do referido fragmento de
borracha (Fig. 3.1).
Esse procedimento de fixao da amostra fecal poder ser realizado,
tambm, em lmina de microscopia. Para evitar a distoro dos protozorios
presentes, no se deve permitir que os esfregaos sequem durante todo o
tempo da colorao at a contagem final. Uma srie de placas de Petri
ou cubas de Coplin devero ser usadas para cada fase do processo de
colorao (Fig. 3.2).
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).

Fig. 3.1 Lamnula presa por uma de suas bordas a um pequeno pedao de borracha de
forma semicircular.

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CAPTULO 3

85

Fig. 3.2 Preparao de esfregao fecal para colorao permanente. (Adaptada de Markell
EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. 7th ed. Philadelphia (Pa): WB Saunders Co.,
1992.)

Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Fixador de Schaudinn (ver p. 11)


Soluo de almen de ferro a 2% [FeNH4(SO 4)2.12H 2O]
Hematoxilina (CI 75290-Merck) (C16H14O6)
Soluo corante de hematoxilina a 0,5%
lcool etlico a 50%, 70%, 95% (v/v) (C2H 6O)
lcool etlico absoluto + xilol (1:1)
Xilol (xileno) (C8H 10)
Resina sinttica (Cytoseal 60)

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CAPTULO 3

Preparao das Solues


1. Soluo de Sulfato Frrico Amoniacal a 2% (almen de ferro)
Sulfato frrico amoniacal
gua destilada-deionizada

2g
100ml

Dissolver os cristais violeta de sulfato frrico amoniacal (almen de


ferro III) em gua. Essa soluo mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada temperatura do refrigerador.
2. Soluo Corante de Hematoxilina a 0,5%
a. Soluo Estoque de Hematoxilina a 10%
Hematoxilina, forma cristalina
lcool etlico a 95% (v/v)

10g
100ml

Dissolver a hematoxilina em pequenas quantidades de lcool e, aps,


completar o volume at 100ml. Deixar amadurecer durante seis semanas,
antes de diluir para uso. Depois de amadurecido, o corante apresenta uma
colorao de vinho do Porto ou marrom-alaranjada forte. Estocar em frasco de vidro mbar com tampa esmerilhada.
b. Soluo Corante de Hematoxilina a 0,5%
Soluo estoque de hematoxilina, amadurecida
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

Adicionar gua na soluo estoque de hematoxilina e misturar. Essa


soluo diluda a 0,5% no estvel e deve ser preparada diariamente ou
quando for necessrio.
Colorao da Amostra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Usar luvas durante todas as etapas da colorao.


Fixador de Schaudinn, 10 minutos.
lcool etlico a 70% iodado, trs minutos.
lcool etlico a 70%, dois minutos.
lcool etlico a 50%, um minuto (pode ser omitido).
gua destilada, dois a trs minutos (duas lavagens).
Soluo de almen de ferro a 2% (mordente), 10 minutos.

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CAPTULO 3

87

8. gua destilada, um minuto.


9. Soluo corante de hematoxilina a 0,5%, cinco minutos.
10. gua destilada, um minuto.
11. Soluo de almen de ferro a 2% (diferenciador), um minuto.
12. gua corrente, dois minutos (duas lavagens).
13. Observar a diferenciao ao microscpico. Se necessrio repetir as
etapas 10 e 11, deixando tempos maiores.
14. Quando o grau de diferenciao desejado obtido, proceder etapa seguinte.
15. gua corrente, vrias lavagens, 30 minutos.
16. lcool etlico a 50%, dois minutos (pode ser omitida).
17. lcool etlico a 70%, um minuto.
18. lcool etlico a 95%, um minuto.
19. lcool etlico absoluto (1), um minuto.
20. lcool etlico absoluto (2), um minuto.
21. Partes iguais de lcool etlico absoluto e xilol, um minuto.
22. Xilol (duas lavagens), um minuto cada.
23. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
Observaes
Com a finalidade de garantir melhor fixao, as lamnulas so colocadas
na soluo fixadora de Schaudinn com a face do esfregao virada para baixo.
O fixador de Schaudinn ataca o metal, por isso usam-se pinas de madeira.

COLORAO PELA HEMATOXILINA FRRICA, SEGUNDO HEIDENHAIN,


MODIFICADA POR M ELVIN E B ROOKE (FNP)
A colorao pela hematoxilina frrica, segundo Heidenhain, modificada por Melvin e Brooke15, indicada para a colorao de rotina de esfregaos
fecais no preservados (FNP) para a pesquisa de protozorios intestinais.
O mtodo clssico fornece excelentes resultados e as fases podem ser consideravelmente reduzidas em tempo quando forem usados a quente o fixador,
o mordente e o corante, sem perda nos detalhes de colorao.
Amostra
Material fecal no preservado (FNP) (fezes frescas).
Reagentes
1. Fixador de Schaudinn (ver p. 11)
2. Soluo de lcool etlico a 70% (v/v) iodado

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CAPTULO 3

3. Soluo de almen de ferro a 4% [FeNH4(SO 4)2.12H 2O]


4. Soluo corante de hematoxilina a 0,5% (C16H14O 6)
5. Soluo de almen de ferro a 2% [FeNH4(SO 4)2.12H 2O]
6. Soluo saturada de cido pcrico (CI 10305) [C6H 2(OH)(NO2)3]
7. Soluo aquosa saturada de carbonato de ltio (Li2CO3)
8. Xilol (xileno) (C8H 10)
9. Fenol (C6H6O), fundido a 44C
10. Carbol-xilol (fenol-xileno)
11. lcool etlico a 50%, 70%, 95% (v/v) (C2H6O)
12. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de lcool Etlico a 70% (v/v) Iodado
Adicionar quantidade suficiente de cristais de iodo em uma soluo de
lcool etlico (C2H6O) ou isoproplico (C 3H 8O) a 70% (v/v) at obter uma
soluo concentrada escura. Para a soluo de trabalho diluir a soluo estoque
com lcool a 70%, at que seja obtida uma soluo de cor forte semelhante
ao vinho do Porto. A concentrao exata no importante, mas a soluo
no deve ser muito escura, j que o iodo poderia corar os protozorios e,
subseqentemente, interferir com a colorao da hematoxilina ou do tricrmico.
Entretanto, se a soluo for muito fraca, o mercrio dos fixadores no removido e os resduos interferem no exame da preparao final.
2. Soluo de Sulfato Frrico Amoniacal a 4% (almen de ferro)
Sulfato frrico amoniacal
gua destilada-deionizada

4g
100ml

Dissolver os cristais violeta de sulfato frrico amoniacal (almen de


ferro III) em gua. Essa soluo mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada temperatura do refrigerador.
3. Soluo de Sulfato Frrico Amoniacal a 2% (almen de ferro)
Diluir o mordente (soluo a 4%) na proporo de 1:1 (v/v) em gua
destilada-deionizada. Esta soluo diferenciadora se mantm estvel por uma
semana.
4. Soluo Corante de Hematoxilina a 0,5%
Soluo estoque de hematoxilina a 10%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

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CAPTULO 3

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5. Soluo Saturada de cido Pcrico


cido pcrico
gua destilada-deionizada

2g
100ml

Adicionar o cido pcrico gua. Agitar vigorosamente e deixar em


repouso durante vrios dias. Depois de quatro a cinco dias, alguns cristais
do cido pcrico podem permanecer no dissolvidos. Usar o lquido sobrenadante
lmpido ou filtrar a soluo. Essa soluo diferenciadora tem conservao
indefinida e no apresenta problemas de estocagem.
6. Soluo Aquosa Saturada de Carbonato de Ltio
Carbonato de ltio
gua destilada-deionizada

1 ou 2g
100ml

Dissolver o carbonato de ltio em gua at a completa dissoluo do


sal. Estocar em um frasco de vidro com tampa esmerilhada. A soluo tem
conservao indefinida.
7. Carbol-Xilol (Fenol-Xileno)
Adicionar um volume de fenol (C6H 6O), fundido a 44C, para trs volumes de xilol (C8H 10). Estocar a soluo carbol-xilol em um frasco de vidro com tampa esmerilhada. O fenol lquido que contm gua no poder
ser usado para a preparao da soluo carbol-xilol. A soluo estocada em
frasco hermtico, para evitar a hidratao, possui validade de 15 meses.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Fixador de Schaudinn, cinco minutos a 50C ou uma hora temperatura ambiente. O esfregao pode permanecer no fixador de Schaudinn
durante dois a trs dias.
3. Soluo de lcool etlico a 70% iodado, cinco minutos.
4. lcool etlico a 50%, trs minutos.
5. gua corrente, trs minutos.
6. Soluo de almen de ferro a 4% (mordente) 10-20 minutos a 4050C ou 12-24 horas temperatura ambiente.
7. gua destilada ou corrente, trs minutos (duas lavagens no total).
8. Soluo corante de hematoxilina a 0,5%, 5-10 minutos a 40-50C ou
12-24 horas temperatura ambiente.
9. gua destilada ou corrente, trs minutos (total).

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90

CAPTULO 3

10. Soluo de almen de ferro a 1%-2% (diferenciador), observar ao


microscpio, usualmente so requeridos 1-3 minutos ou mais ou
11. Soluo aquosa saturada de cido pcrico (diferenciador), 5-10 minutos; observar ao microscpio. Esta etapa crtica. O processo deve ser
controlado cuidadosamente. Em intervalos de meio, um, dois minutos ou mais,
dependendo da soluo diferenciadora usada, o esfregao deve ser removido da soluo, lavado vigorosamente em gua corrente, ou parar o procedimento de diferenciao e examinar ao microscpio com pequeno e grande
aumento. Repetir esta etapa at a obteno de resultados timos. A diferenciao estar completa quando so visveis os detalhes da estrutura dos
organismos, como os ncleos; ou, se os organismos no podem ser visualizados, devido a uma colorao de fundo mais cinzenta do que preta. O tempo
de diferenciao varia com a extenso do esfregao, com os organismos e
com outros fatores. Experincia e prtica so necessrias para obter bons
resultados. O cido pcrico diferencia mais lentamente do que o almen frrico,
o qual o preferido e mais facilmente controlvel.
12. gua corrente, 5-30 minutos, no mnimo (vrias mudanas).
13. lcool etlico a 70% e algumas gotas de soluo saturada de carbonato de ltio (para cada cuba de Coplin), trs minutos.
14. lcool etlico a 95%, cinco minutos.
15. Carbol-xilol, cinco minutos.
16. Xilol, trs minutos.
17. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).

COLORAO PELA HEMATOXILINA F RRICA, SEGUNDO HEIDENHAIN,


MODIFICADA POR M ELVIN E B ROOKE (FP)
A colorao pela hematoxilina frrica, segundo Heidenhain, modificada por Melvin e Brooke15, indicada para a colorao de rotina de esfregaos
fecais preservados (FP) para a pesquisa de protozorios intestinais. A colorao de esfregaos secos fixados pelo fixador APV essencialmente o mesmo
processo usado para os esfregaos fecais frescos. Exceto para uma variao no tempo requerido a certas etapas e a omisso da etapa 1, ou seja, a
fixao pelo lquido de Schaudinn, o uso da soluo fixadora APV torna uma
fixao adicional desnecessria.
Amostra
Material fecal preservado pelo fixador lcool polivinlico (fixador APV).
Reagentes
1. Fixador lcool polivinlico (fixador APV) (p. 14)
2. Soluo de lcool etlico a 70% iodado
3. lcool etlico a 50%, 70%, 95% (v/v) (C 2H6O)

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CAPTULO 3

91

4. Soluo de almen de ferro a 4% [FeNH 4(SO 4)2.12H 2O]


5. Soluo corante de hematoxilina a 0,5% (C 16H14O6)
6. Soluo saturada de cido pcrico [C6H 2(OH)(NO2)3]
7. Soluo aquosa saturada de carbonato de ltio (Li2CO3)
8. Carbol-xilol
9. Xilol (xileno) (C8H 10)
Preparaes das Solues
1. Soluo de lcool Etlico a 70% (v/v) Iodado
Adicionar quantidade suficiente de cristais de iodo em uma soluo de
lcool etlico (C2H6O) ou isoproplico (C 3H8O) a 70% (v/v) at obter uma
soluo concentrada escura. Para a soluo de trabalho diluir a soluo estoque
com lcool a 70%, at que seja obtida uma soluo de cor forte semelhante
ao vinho do Porto. A concentrao exata no importante, mas a soluo
no deve ser muito escura, j que o iodo poderia corar os protozorios e,
subseqentemente, interferir com a colorao da hematoxilina ou do tricrmico.
Entretanto, se a soluo for muito fraca, o mercrio dos fixadores no removido e os resduos interferem no exame da preparao final.
2. Soluo de Sulfato Frrico Amoniacal a 4% (almen de ferro)
Sulfato frrico amoniacal
gua destilada-deionizada

4g
100ml

Dissolver os cristais violeta de sulfato frrico amoniacal (almen de


ferro III) em gua. Essa soluo mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada temperatura do refrigerador.
3. Soluo Corante de Hematoxilina a 0,5%
Soluo estoque de hematoxilina a 10%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

4. Soluo Saturada de cido Pcrico


cido pcrico
gua destilada-deionizada

2g
100ml

Adicionar o cido pcrico gua. Agitar vigorosamente e deixar em


repouso durante vrios dias. Depois de quatro a cinco dias, alguns cristais

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92

CAPTULO 3

do cido pcrico podem permanecer no dissolvidos. Usar o lquido


sobrenadante lmpido ou filtrar a soluo. Essa soluo diferenciadora tem
conservao indefinida e no apresenta problemas de estocagem.
5. Soluo Aquosa Saturada de Carbonato de Ltio
Carbonato de ltio
gua destilada-deionizada

1 ou 2g
100ml

Dissolver o carbonato de ltio em gua at a completa dissoluo do


sal. Estocar em um frasco de vidro com tampa esmerilhada. A soluo tem
conservao indefinida.
6. Carbol-Xilol (Fenol-xileno)
Adicionar um volume de fenol (C 6H 6O), fundido a 44C, para trs
volumes de xilol (C 8H 10 ). Estocar a soluo carbol-xilol em um frasco
de vidro com tampa esmerilhada. O fenol lquido que contm gua no
poder ser usado para a preparao da soluo carbol-xilol. A soluo
estocada em frasco hermtico, para evitar a hidratao, possui validade
de 15 meses.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. lcool etlico a 70% iodado, 20 minutos.
3. lcool etlico a 50%, 10 minutos.
4. gua corrente, cinco minutos.
5. Soluo de almen de ferro a 4% (mordente), 8-12 horas.
6. gua destilada ou corrente, trs minutos (duas lavagens no total).
7. Soluo corante de hematoxilina a 0,5%, 8-12 horas (ou toda a
noite).
8. gua corrente, trs minutos (duas lavagens no total).
9. Soluo saturada de cido pcrico (diferenciador), 15-20 minutos, ou
etapa 9 do procedimento padro.
10. gua corrente, ou vrias lavagens, 30 minutos.
11. lcool etlico a 70% e mais algumas gotas de soluo saturada de
carbonato de ltio (para cada cuba de Coplin), 10 minutos.
12. lcool etlico a 95%, 10 minutos.
13. Carbol-xilol, 10 minutos.
14. Xilol, 10 minutos.
15. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
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CAPTULO 3

93

Caractersticas da Colorao (Hematoxilina Frrica,


Segundo Heidenhain)
Os organismos corados apresentam cor azulada ou cinzenta com estruturas nucleares pretas. Os corpos cromatides dos cistos das amebas
e incluses, tais como bactrias ou hemcias no citoplasma dos trofozotos,
coram-se de preto. O material de fundo, usualmente, cora-se em azulcinzento. As formas csticas e trofozoticas de protozorios geralmente
no so distorcidas, com exceo de Chilomastix e Trichomonas, que
se apresentam redondas e com aparncia atpica. Organismos no corados podem indicar uma fixao inadequada. Com fezes frescas a fixao pode ser melhorada pelo aquecimento do fixador at 56C e fixao
durante 5-10 minutos. A fixao temperatura ambiente ou a frio com
fixador fresco oferece mais dificuldades na colorao dos organismos.
Com exceo da Entamoeba coli, so suficientes 30 minutos de fixao
a frio. Para garantir uma completa fixao dos cistos da E. coli so
necessrias duas a trs horas temperatura ambiente ou 30 minutos a
56C. Os cistos imaturos e jovens so fixados mais facilmente do que
os cistos velhos; os trofozotos so freqentemente fixados em dois a trs
minutos. Leuccitos mononucleares e polimorfonucleares, Blastocystis
hominis, leveduras e fungos, podem dificultar o diagnstico, a menos que
o microscopista esteja treinado na diferenciao morfolgica de
protozorios. Os cistos de Entamoeba histolytica e E. coli, fixados pela
soluo fixadora APV e corados pela colorao anteriormente descrita,
podem se apresentar distorcidos.

COLORAO

PELA

HEMATOXILINA FRRICA -CIDO F OSFOTNGSTICO

O mtodo de Tompkins e Miller19 um procedimento rpido de colorao para propsitos de diagnstico. A diferenciao autolimitada e no
necessita ser controlada pelo microscpio como o mtodo clssico. A reao do corante similar descrita na colorao de Heidenhain, exceto no
que diz respeito s lminas, que apresentam uma aparncia azulada. Esse
procedimento produz melhores resultados com esfregaos fecais frescos do
que com preparaes de fezes preservadas com o fixador APV.
Amostra
Material fecal fresco ou preservado pelo fixador de Schaudinn.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Fixador de Schaudinn (ver p. 11)


Soluo de lcool etlico a 70% iodado
Soluo de almen de ferro a 4% [FeNH 4(SO 4)2.12H 2O]
Soluo corante de hematoxilina a 0,5% (C 16H14O6)

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94

CAPTULO 3

5. Soluo de cido fosfotngstico a 2% (24WO3.2H3PO 4.48H 2O)


6. Soluo aquosa saturada de carbonato de ltio (Li2CO3)
7. Carbol-xilol (fenol-xileno)
8. lcool etlico a 50%, 70%, 95% (v/v)
9. Xilol (xileno) (C8H 10)
10. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de lcool Etlico a 70% Iodado
Adicionar quantidade suficiente de cristais de iodo em uma soluo de
lcool etlico (C2H6O) ou isoproplico (C 3H 8O) a 70% (v/v) at obter uma
soluo concentrada escura. Para a soluo de trabalho diluir a soluo estoque
com lcool a 70%, at que seja obtida uma soluo forte semelhante ao vinho
do Porto. A concentrao exata no importante, mas a soluo no deve
ser muito escura, j que o iodo poderia corar os protozorios e, subseqentemente, interferir com a colorao da hematoxilina ou do tricrmico. Entretanto, se a soluo for muito fraca, o mercrio dos fixadores no removido e os resduos interferem no exame da preparao final.
2. Soluo de Sulfato Frrico Amoniacal a 4% (almen de ferro)
Sulfato frrico amoniacal
gua destilada-deionizada

4g
100ml

Dissolver os cristais violeta de sulfato frrico amoniacal (almen de


ferro III) em gua. Essa soluo mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada temperatura do refrigerador.
3. Soluo Corante de Hematoxilina a 0,5%
Soluo estoque de hematoxilina a 10%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

4. Soluo de cido Fosfotngstico a 2%


cido fosfotngstico
gua destilada-deionizada

2g
100ml

Dissolver o cido fosfotngstico em gua. Estocar em frasco de vidro com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
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CAPTULO 3

95

5. Soluo Aquosa Saturada de Carbonato de Ltio


Carbonato de ltio
gua destilada-deionizada

1 ou 2g
100ml

Dissolver o carbonato de ltio em gua at a completa dissoluo do


sal. Estocar em um frasco de vidro com tampa esmerilhada. A soluo tem
conservao indefinida.
6. Carbol-Xilol (Fenol-Xileno)
Adicionar um volume de fenol (C6H6O), fundido a 44C, para trs volumes de xilol (C8H10). Estocar a soluo carbol-xileno em um frasco de vidro
com tampa esmerilhada. O fenol lquido que contm gua no poder ser
usado para a preparao da soluo carbol-xileno. A soluo estocada em
frasco hermtico, para evitar a hidratao, possui validade de 15 meses.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Fixador de Schaudinn, cinco minutos a 50C, ou uma hora temperatura ambiente.
3. lcool etlico a 70% iodado, cinco minutos.
4. lcool etlico a 50%, trs minutos.
5. gua corrente, trs minutos.
6. Soluo de almen de ferro a 4% (mordente), 3-5 minutos temperatura ambiente.
7. gua destilada ou corrente, um minuto.
8. Soluo corante de hematoxilina a 0,5%, um minuto temperatura
ambiente.
9. gua destilada ou corrente, um minuto.
10. Soluo de cido fosfotngstico a 2% (diferenciador), dois ou mais
minutos.
11. gua corrente, cinco minutos (vrias lavagens).
12. lcool etlico a 70% e mais algumas gotas de soluo saturada de
carbonato de ltio (para cada cuba de Coplin), trs minutos.
13. lcool etlico a 95%, trs minutos.
14. Carbol-xilol, cinco minutos.
15. Xilol, trs minutos.
Caractersticas da Colorao
Os organismos coram-se como foi descrito na colorao da hematoxilinafrrica, segundo Heidenhain, mas as preparaes so mais azuis do que aquelas
obtidas pelo mtodo longo.

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96

CAPTULO 3

COLORAO

PELA

HEMATOXILINA FRRICA- CIDO C LORDRICO

O mtodo Spencer e Monroe, colorao pela hematoxilina frrica-cido clordrico 18, mais longo do que a colorao do tricrmico de Wheatley 20. O procedimento descrito no requer diferenciador, apesar da experincia mostrar que nas coloraes mais longas o uso da soluo de cido
clordrico a 0,5%, como descorante, melhora a diferenciao dos organismos.
Amostra
Material fecal fresco, ou preservado no fixador lcool polivinlico (fixador
APV), ou no fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF).
Reagentes
1. Fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF)
(ver p 21), ou fixador lcool polivinlico (fixador APV) (ver p. 14)
2. Soluo de iodo de DAntoni
3. Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290) (C16H14O6)
4. Soluo corante de trabalho de hematoxilina-frrica, Spencer-Monroe
5. lcool etlico a 70%, 95% (v/v) (C2H6O)
6. lcool etlico absoluto (C2H 6O)
7. cido clordrico (HCl)
8. Iodo, cristais (I2)
9. Iodeto de potssio (KI)
10. Sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH4)2(SO 4)2.6H 2O]
11. Sulfato frrico amoniacal [FeNH4(SO4)2.12H 2O)
12. Xilol (xileno) (C8H 10) ou toluol (tolueno) (C7H8)
13. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de Iodo de DAntoni
Iodo, cristais
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

1,5g
1g
100ml

Preparao
Dissolver 1g de iodeto de potssio em 100ml de gua. Adicionar lentamente 1,5g de cristais de iodo e agitar a mistura at a completa dissolu-

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CAPTULO 3

97

o. Filtrar e estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao


abrigo da luz. Preparar novas solues depois de 10 a 14 dias. Indicar a
data de validade no rtulo do frasco.
2. Soluo Corante de Trabalho de Hematoxilina Frrica
Soluo I
Hematoxilina, forma cristalina
lcool etlico absoluto

10g
1.000ml

Dissolver a hematoxilina no lcool etlico absoluto. Estocar em frasco


de vidro de cor mbar. Deixar amadurecer durante seis meses, ou durante uma semana exposta ao sol.
Soluo II
Sulfato ferroso amoniacal
Sulfato frrico amoniacal
cido clordrico concentrado
gua destilada-deionizada

10g
10g
10ml
1.000ml

Soluo de Trabalho
Misturar partes iguais das solues I e II. Esta soluo deve ser preparada todas as semanas.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar esfregaos com material fresco, ou preservado pelo SAF
(incio na etapa 4), ou fixador APV.
3. lcool etlico a 70%, cinco minutos.
4. lcool etlico a 70%, contendo soluo de iodo de DAntoni (cor de
vinho do Porto), dois a cinco minutos.
5. lcool etlico a 70%, cinco minutos.
6. gua corrente, 10 minutos.
7. Soluo corante de trabalho de hematoxilina frrica, quatro a cinco
minutos.
8. gua corrente, 10 minutos.
9. lcool etlico a 70%, cinco minutos.
10. lcool etlico a 95%, cinco minutos.
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98

CAPTULO 3

11. lcool etlico absoluto (1), cinco minutos.


12. lcool etlico absoluto (2), cinco minutos.
13. Xilol ou tolueno (1), cinco minutos.
14. Xilol ou tolueno (2), cinco minutos.
15. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
* Na etapa 4 inicia a colorao para os esfregaos fixados com o SAF.
Caractersticas da Colorao
Os organismos se coram de azul-cinzento ao preto, como tambm o
material de fundo. As estruturas nucleares, os corpos de incluso e o citoplasma adjacente apresentam-se em preto.
Controle de Qualidade: Hematoxilina Frrica
1. Ver o controle de qualidade (CQ) dos fixadores de Schaudinn, APV
e SAF.
2. Os espcimes fecais usados para o CQ podem ser igualmente fezes
fixadas positivas para protozorios, ou negativas, preservadas pelo fixador
APV, nas quais foram adicionados leuccitos humanos. Os esfregaos preparados para o CQ de espcimes positivos fixados com APV, ou contendo
leuccitos humanos, devem ser usados quando um novo lote do corante
preparado, ou, no mnimo, uma vez por semana. Culturas de protozorios
podem tambm ser usadas.
3. O esfregao para CQ deve ser includo quando for usado um novo
nmero de lote de reagente, ou forem adicionados novos reagentes nas cubas de Coplin. Depois da lavagem das cubas, o procedimento deve ser repetido no mnimo semanalmente.
4. Quando o xilol estiver turvo ou houver uma acumulao de gua no
fundo das cubas de Coplin, deve ser usado novo etanol e xilol a 100%.
5. As cubas de Coplin devem ser mantidas fechadas para evitar a
evaporao dos reagentes.
6. Dependendo do nmero de esfregaos corados, as solues corantes
bsicas devem ser trocadas quando necessrio.
7. Os organismos corados apresentam cor azulada ou cinzenta com estruturas nucleares pretas. Os corpos cromatides dos cistos das amebas e
incluses, tais como bactrias ou hemcias no citoplasma dos trofozotos, coramse de preto. O material de fundo, usualmente, cora-se em azul-cinzento.
8. Slides, fotografias e livros de referncia devem estar disposio
no laboratrio de Parasitologia.
9. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. Colocar as objetivas e as oculares originais no microscpio durante a calibrao. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
10. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio, seguir o plano de ao para resultados fora de controle2,5,8,16.

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CAPTULO 3

99

COLORAES PELO TRICRMICO


Alguns parasitologistas preferem outras coloraes do que a da
hematoxilina, porque elas exigem menores tempos. Entretanto, outros escolhem a hematoxilina, apesar da maior permanncia da preparao e do tempo requerido na colorao dos esfregaos. Os mtodos permanentes de
colorao, no derivados da hematoxilina, revelam o mximo de detalhes e
permitem uma identificao mais segura do que qualquer outro procedimento. A colorao da hematoxilina frrica um processo excelente, mas bastante difcil, o qual deve ser realizado por um tcnico experiente para a obteno
de bons resultados. A colorao do tricrmico recomendada para os trabalhos de rotina. Este um procedimento de colorao bastante simples e
os resultados obtidos so uniformes, mesmo com material fecal fresco, preservado com o fixador APV, ou com o lquido de Schaudinn. O mtodo do
tricrmico demonstra detalhes aceitveis do citoplasma e do ncleo.
Os mtodos do tricrmico de Wheatley 20, uma modificao da colorao de Gomori7 e o de Yang e Scholten 21 so procedimentos indicados para
os trabalhos de rotina. A colorao de Wheatley20 indicada para material
fecal fresco ou preservado, tanto quanto pelo lquido de Schaudinn e pelo
fixador APV, enquanto a de Yang e Scholten21 serve para fezes fixadas em
SAF.

MTODO DE WHEATLEY
O procedimento de Gomori7, modificado por Wheatley20, uma colorao rpida e simples, a qual fornece timos resultados para os propsitos
de rotina. Esse mtodo no necessita corar em excesso e diferenciar os
organismos para revelar os detalhes morfolgicos dos parasitos, como tambm no necessrio o uso de mordente antes da colorao. Burrows3 afirma,
tambm, que a colorao apresenta bons resultados com as amebas e flagelados
e para estes protozorios no requerida uma ao primria do mordente com
uma diferenciao ps-colorao. Entretanto, para trabalhos prticos, a descolorao e a diferenciao dos esfregaos apresentam melhores resultados.
A soluo de colorao estvel e pode ser usada vrias vezes, repondo-se
o volume pela adio da soluo estoque. A colorao do material fresco ou
preservado pelo fixador APV difere principalmente no aumento do tempo
necessrio pelos esfregaos fixados e na omisso das etapas de fixao, desde que a amostra j esteja fixada na soluo fixadora APV.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Fixador de Schaudinn (ver p. 11)
2. lcool etlico a 70%, 90%, 95% (v/v) (C 2H6O)

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100

CAPTULO 3

3. lcool etlico absoluto (C 2H 6O)


4. Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10N 2Na 2O 8S 2)
5. Light green SF (CI 42095) (C37H 34N 2O 9S 3Na 2)
6. Fast green FCF (CI 42053) (C 37H 34N 2Na 2O 10S 3)
7. cido fosfotngstico (24WO3.2H3PO4.48H2O)
8. cido actico glacial (C2H 4O2)
9. Carbol-Xilol (Fenol-xileno)
10. Xilol (Xileno) (C8H 10)
11. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Corante Tricrmico, segundo Brooke
Chromotrope 2R
Light green SF
Fast green FCF
cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

0,6g
0,15g
0,15g
0,7g
1ml
100ml

Colocar os componentes secos em um beaker e adicionar 1ml de cido


actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para amadurecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve ser diludo.
Apresenta uma cor prpura forte quase preta.
2. Soluo de lcool-cido
cido actico glacial
lcool etlico a 90% (v/v)

4,5ml
995,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Fixador de Schaudinn, cinco minutos a 50C, ou uma hora temperatura ambiente.
3. Soluo de lcool etlico a 70% iodado, um minuto.
4. lcool etlico a 70% (1), um minuto.
5. Corante tricrmico, 2-8 minutos.
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CAPTULO 3

101

6. Soluo lcool-cido, 5-10 segundos.


7. lcool etlico a 95% (1), lavar rapidamente.
8. lcool etlico a 95% (2), lavar rapidamente.
9. lcool etlico absoluto ou carbol-xileno, um minuto.
10. Xilol, 1-3 minutos.
11. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).

MTODO

DE

B ROOKE

O mtodo de colorao de esfregaos fecais de Brooke1 indicado para


a pesquisa de protozorios intestinais em esfregaos preservados pelo fixador
lcool polivinlico (fixador APV).
Amostra
Material fecal preservado pelo fixador lcool polivinlico (fixador APV).
Reagentes
1. Fixador lcool polivinlico (fixador APV) (ver p. 14)
2. Soluo de lcool etlico a 70% iodado
3. Corante tricrmico, segundo Brooke
4. Soluo de lcool-cido
5. lcool etlico a 70%, 95% (v/v) (C2H 6O)
6. lcool isoproplico (C3H8O)
7. Carbol-xilol
8. Fenol (C6H6O), fundido a 44C
9. Xilol (xileno) (C8H 10)
10. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de lcool Etlico a 70% Iodado
Adicionar quantidade suficiente de cristais de iodo em uma soluo de
lcool etlico (C2H6O) ou isoproplico (C 3H8O) a 70% (v/v) at obter uma
soluo concentrada escura. Para a soluo de trabalho diluir a soluo estoque
com lcool a 70% at que seja obtida uma soluo de cor forte semelhante
ao vinho do Porto. A concentrao exata no importante, mas a soluo
no deve ser muito escura, j que o iodo poderia corar os protozorios e,
subseqentemente, interferir com a colorao da hematoxilina ou do tricrmico.
Entretanto, se a soluo for muito fraca, o mercrio dos fixadores no removido e os resduos interferem no exame da preparao final.

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102

CAPTULO 3

2. Corante Tricrmico, segundo Brooke


Chromotrope 2R
Light green SF
Fast green FCF
cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

0,6g
0,15g
0,15g
0,7g
1ml
100ml

Colocar os componentes secos em um beaker e adicionar 1ml de cido


actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para amadurecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve ser diludo.
Apresenta uma cor prpura forte, quase preta.
3. Soluo de lcool-cido
lcool etlico a 90% (v/v)
cido actico glacial

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
4. Carbol-Xilol
Adicionar um volume de fenol (C6H 6O), fundido a 44C, para trs volumes de xilol (C8H10). Estocar a soluo carbol-xileno em um frasco de vidro
com tampa esmerilhada. O fenol lquido que contm gua no poder ser
usado para a preparao da soluo carbol-xileno. A soluo estocada em
frasco hermtico, para evitar a hidratao, possui validade de 15 meses.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Soluo de lcool etlico a 70% iodado, 10 a 20 minutos.
3. lcool etlico a 70% (1), 3-5 minutos.
4. lcool etlico a 70% (2), 3-5 minutos.
5. Corante tricrmico, 6-8 minutos.
6. Soluo de lcool etlico a 90% acidificado.
7. lcool etlico a 95% (1), lavar para remover o cido descorado.
8. lcool etlico a 95% (2), cinco minutos.
9. Carbol-Xilol, 5-10 minutos.
10. Xilol, 10 minutos.
11. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
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CAPTULO 3

103

Caractersticas da Colorao
O citoplasma dos cistos e trofozotos realmente fixados e bem corados
tomam a cor verde-azulada, com um matiz purpreo. Ocasionalmente, os cistos
da E. coli podem apresentar uma colorao mais levemente prpura do que
os cistos das outras espcies. A cromatina nuclear, corpos cromatides, clulas
vermelhas e bactrias coram-se de vermelho ou prpura-escuro. As outras
partculas, como leveduras e fungos, geralmente adquirem um matiz verde,
mas freqentemente ocorrem reaes na gradao de cores das partculas
ingeridas. O material de fundo, usualmente, cora-se em verde, contrastando, portanto, com o protozorio. Cistos no corados e aqueles predominantemente vermelhos so com mais freqncia associados com uma fixao
incompleta. Colorao insatisfatria de organismos, obtida de espcimes
submetidos ao fixador APV, indica, usualmente, fixao incompleta associada com emulsificao insuficiente. Uma emulsificao vigorosa das fezes
pastosas produz um rendimento decisivo na colorao dos cistos e dos
trofozotos. Formas degenerativas coram-se em verde-claro, enquanto organismos fracamente ou muito corados tambm podem apresentar-se em
verde. Ovos e larvas tomam a cor vermelha e contrastam fortemente com
o verde do segundo plano. A membrana muito fina de alguns ovos, com muita
freqncia, se rompe durante a montagem com as resinas sintticas, pois
alguns estgios de diagnsticos podem ser retidos, especialmente se o esfregao
examinado imediatamente. Leuccitos mononucleares, polimorfonucleares
e B. hominis apresentam os mesmos problemas de diagnstico mostrados
quando corados pela hematoxilina. Como os protozorios, as clulas de pus
e de tecidos apresentam-se em vermelho e o citoplasma em verde. Entretanto, o citoplasma dessas clulas exibe uma cor mais esverdeada do que a
dos protozorios.
Observaes
1. As amostras fecais frescas podero ser fixadas no lquido de
Schaudinn ou no fixador APV. Preparar, sempre, dois esfregaos. O material fecal conservado no fixador APV poder ser fixado logo aps a colheita ou imediatamente antes da colorao pelo tricrmico.
2. Os esfregaos sempre devero ser drenados entre uma soluo e
outra. Quando uma lmina removida de uma soluo, contatar a extremidade em papel toalha, durante 2-4 segundos para remover o excesso do lquido. Aps, continuar a colorao. Este procedimento obrigatrio para
evitar que as solues se tornem contaminadas com material lquido anterior e propiciar no final uma colorao de difcil observao.
3. O contato entre o lcool-cido (etapa 5) e o esfregao determina a
continuidade da descolorao. Por isso o tempo dever ser de alguns segundos entre a remoo do lcool-cido e a lavagem no lcool a 95% (etapa 6). Uma descolorao rpida no lcool-cido (10 segundos) pode causar
uma diferenciao incompleta; necessria uma descolorao longa, principalmente com as formas trofozoticas grandes como as da E. coli.

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104

CAPTULO 3

MTODO

DE

YANG

SCHOLTEN

O mtodo de colorao de esfregaos fecais de Yang e Scholten 21


indicado para a pesquisa de protozorios intestinais em esfregaos preservados pelo fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF).
Amostra
Material fecal fresco ou preservado no fixador acetato de sdio-cido
actico-formaldedo (SAF).
Reagentes
1. Fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF)
(ver p.21)
2. Soluo de iodo de DAntoni
3. Corante tricrmico
4. Soluo de lcool etlico a 90% (v/v) acidificado com
1% de cido actico glacial
5. lcool etlico a 70% (v/v) (C 2H 6O)
6. lcool etlico absoluto (C2H 6O)
7. cido actico glacial (C2H 4O 2)
8. Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10 N 2Na 2O 8S 2)
9. Light green SF (CI 42095) (C 37H 34N 2O 9S 3Na 2)
10. cido fosfotngstico (24WO3.2H 3PO4.48H 2O)
11. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Fixador Acetato de Sdio-cido Actico-Formaldedo (SAF) (ver p.
21)
2. Soluo de Iodo de DAntoni (ver p. 39)
Corante Tricrmico, segundo Garcia e Bruckner 5
Chromotrope 2R
Light green SF
cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

0,6g
0,3g
0,7g
1ml
100ml

Colocar os componentes secos em um beaker e adicionar 1ml de cido


actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para ama-

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CAPTULO 3

105

durecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve ser diludo.


Apresenta uma cor prpura forte quase preta.
Preparao da Amostra
1. Agitar vigorosamente a mistura SAF-fezes e filtrar a suspenso atravs
de gaze, levemente umedecida com gua corrente, dobrada duas vezes, e
coletar o filtrado em tubo de centrfuga de 15ml com fundo redondo.
2. Centrifugar (500 x g/1min), decantar o lquido sobrenadante e preparar o esfregao com o sedimento (0,5-1,0ml). Se necessrio, ressuspender
o sedimento com soluo salina a 0,85%. O esfregao SAF-fezes pode tambm
ser ps-fixado no lquido de Schaudinn antes da colorao.
3. Depois de seco, o esfregao poder ser colocado diretamente no lcool
etlico a 70% (etapa 4 do processo de colorao). A etapa lcool-iodo poder ser eliminada.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas em todas as etapas da colorao.
2. Preparar um esfregao fresco com fixador SAF.
3. lcool etlico a 70%, cinco minutos.
4. lcool etlico a 70% iodado, 2-5 minutos, contendo gotas da soluo de iodo de DAntoni (cor de vinho do Porto).
5. lcool etlico a 70% (1), cinco minutos, nesta etapa inicia-se a colorao dos esfregaos fixados com SAF.
6. lcool etlico a 70% (2), 2-5 minutos.
7. Corante tricrmico, 10 minutos.
8. Soluo de lcool etlico a 90%, acidificado com soluo de 1% de
cido actico, trs segundos.
9. lcool etlico absoluto, lavar.
10. lcool etlico absoluto (1), 2-5 minutos.
11. lcool etlico absoluto (2), 2-5 minutos.
12. Xilol ou Toluol (1), 2-5 minutos.
13. Xilol ou Toluol (2), 2-5 minutos. Nesta fase o esfregao poder
permanecer em contato com os reagentes por vrias horas ou por toda a
noite.
14. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
Controle de Qualidade: Coloraes pelo Tricrmico
1. Ver o controle de qualidade (CQ) dos fixadores de Schaudinn, APV
e SAF.
2. Os espcimes fecais usados para o CQ podem ser igualmente fezes
fixadas positivas para protozorios, ou negativas, preservadas pelo fixador
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106

CAPTULO 3

APV, nas quais foram adicionados leuccitos humanos. Os esfregaos preparados para o CQ de espcimes positivos fixados com APV, ou contendo
leuccitos, devem ser usados quando um novo corante preparado, ou no
mnimo uma vez por semana. Culturas de protozorios podem tambm ser
usadas.
3. O esfregao para CQ deve ser includo quando for usado um novo
nmero de lote do reagente ou forem adicionados novos reagentes nas cubas de Coplin. Depois da lavagem das cubas o procedimento deve ser repetido no mnimo semanalmente.
4. Quando o xilol estiver turvo ou houver uma acumulao de gua no
fundo das cubas de Coplin, usar novo etanol e xilol a 100%.
5. As cubas de Coplin devem ser mantidas fechadas para evitar a
evaporao dos reagentes.
6. Dependendo do nmero de esfregaos corados, as solues corantes
bsicas devem ser trocadas quando necessrio.
7. O citoplasma dos cistos e trofozotos realmente fixados e bem corados tomam a cor verde-azulada, com um matiz purpreo. Ocasionalmente,
os cistos da E. coli podem apresentar uma colorao mais levemente prpura do que os cistos das outras espcies. A cromatina nuclear, corpos
cromatides, clulas vermelhas e bactrias coram-se de vermelho ou prpura-escuro. As outras partculas, como leveduras e fungos, geralmente adquirem
um matiz verde, mas freqentemente ocorrem reaes na gradao de cores das partculas ingeridas. O material de fundo usualmente cora-se em verde,
contrastando, portanto, com os protozorios. O contraste mais evidente do
que o obtido com a colorao pela hematoxilina frrica, o qual tende a corar o material em verde-cinza.
8. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
9. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio, seguir o plano de ao para resultados fora de controle.
10. Slides, fotografias e livros de referncia devem estar disposio
no laboratrio de Parasitologia8,10,14.
OUTROS MTODOS DE COLORAO

COLORAO

PELA

TIONINA

A colorao pela tionina um procedimento que oferece bons resultados na colorao de trofozotos e cistos de amebas. O corante de fcil
preparao, prtico e seguro.
Amostra
Material fecal preservado pelo acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF) ou pelo fenol-lcool etlico-formaldedo (PAF).
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CAPTULO 3

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Reagentes
1. Tionina, forma cristalina (CI 52000) (C12H9N 3S.C2H4O 2)
2. Fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF) (ver
p. 21) ou pelo fenol-lcool etlico-formaldedo (PAF) (ver p. 23)
Preparao da Soluo
Tionina, forma cristalina
gua destilada-deionizada

10mg
100ml

Dissolver a tionina em gua. Filtrar e estocar na geladeira em frasco


de vidro com tampa esmerilhada.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas em todas as etapas da colorao.
2. Colocar uma gota do corante tionina em uma lmina de microscopia.
3. Remover uma pequena poro de fezes do recipiente e emulsificar
no corante.
4. Deixar alguns minutos em repouso e cobrir a preparao com uma
lamnula.
5. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
Caractersticas da Colorao
As amebas coradas apresentam cor violcea. Nos cistos corretamente
corados, o citoplasma exibe uma colorao violceo-clara e a cromatina
nuclear evidenciada por uma colorao mais acentuada. Nos trofozotos,
as incluses citoplasmticas, bactrias e hemcias, coram-se em rseo, enquanto os detritos e as bactrias, oriundas das formas no-invasivas, em violceo
intenso. O citoplasma apresenta-se diferenciado em ectoplasma, corandose em violceo-claro e o endoplasma, finamente granuloso, com vacolos,
ncelo e restos de substncias alimentares, em violceo-escuro. O ncleo
realmente fixado e bem corado toma a cor purprea, observando-se a distribuio uniforme dos gros de cromatina na periferia da membrana nuclear 3.

SOLUO

DE

F ENOL

DE

KOHN

A soluo de fenol de Kohn11 mais um procedimento de evidenciao


do que de colorao, pois as estruturas nucleares so acentuadas sem apresentarem uma diferenciao de cor5,6.

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CAPTULO 3

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Fenol (C6H 6O)
2. cido actico glacial (C2H 4O2)
Preparao
1. Soluo I
Fenol (fundido a 44C)
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

1ml
0,6ml
50ml

2. Soluo II
Fenol (fundido a 44C)
gua destilada-deionizada

0,9ml
50,0ml

Colorao da amostra
1. Usar luvas em todas as etapas da colorao.
2. Emulsificar uma pequena quantidade de fezes com uma ou duas gotas
da Soluo I e da Soluo II em uma lmina de microscopia.
3. Cobrir com uma lamnula e examinar.
Observaes
1. A Soluo I indicada para a colorao de cistos, e a Soluo II,
para trofozotos.
2. Burrows5 recomenda o uso da Soluo II para a colorao das formas csticas e trofozoticas.
3. O cido actico glacial da Soluo I coagula o citoplasma dos cistos e o ncleo no salientado to bem como com a Soluo II.

COLORAO

PELO

CORANTE C HLORAZOL BLACK E

A colorao permanente pelo Chlorazol black E, desenvolvida por Kohn12,


um procedimento simples que permite obter em uma nica soluo a preservao e a colorao do material fecal. Esse fixador-corante usado para

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CAPTULO 3

109

espcimes frescos, no sendo recomendado para material fecal preservado


pelo fixador APV, porque na colorao no est includa a etapa do lcooliodado que remove o cloreto de mercrio II, um dos componentes encontrados no lquido de Schaudinn e no fixador APV. Os esfregaos devem ser
lavados com a soluo de lcool etlico a 70% iodado para remover o HgCl2,
caso contrrio o reagente interfere com a colorao e subseqente exame
microscpico. A diluio tima e o tempo de colorao devem ser determinados para cada bateria do fixador-corante. O corante modificado16 usado para a colorao de protozorios em amostras fecais ou em tecidos. A
soluo-estoque apresenta conservao indefinida, enquanto a validade da
soluo de trabalho depende do nmero de esfregaos fixados e corados em
um perodo de 30 dias. Aproximadamente 20 esfregaos so corados satisfatoriamente em 50ml de corante na cuba de Coplin. Quando os esfregaos
exibem cor vermelha, a soluo deve ser trocada. Entretanto, esse fixadorcorante no usado com freqncia na rotina, por existirem outras opes
de fixao e colorao.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas).
Reagentes
1. Chlorazol black E (p) (CI 30235) (C 34H 25N 9O 7S 2Na 2)
2. lcool etlico (C 2H6O)
3. Soluo de lcool etlico a 95% (v/v)
4. lcool metlico (CH4O)
5. cido actico glacial (C 2H 4O2)
6. cido fosfotngstico (24WO 3.2H3PO4.48H2O)
7. Fenol, fundido a 44C (C 6H6O)
8. Xilol (C8H 10)
9. Carbol-xilol (fenol-xileno) (ver p. 90)
10. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo Bsica
Soluo de lcool etlico a 90% (v/v)
lcool metlico
cido actico glacial
Fenol, fundido a 44C
Soluo aquosa de cido fosfotngstico a 1% (m/v)
gua destilada-deionizada

170ml
160ml
20ml
20ml
12ml
618ml

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CAPTULO 3

2. Soluo Estoque do Corante


Chlorazol black E (p)
Soluo bsica

5g
1.000ml

Preparao do Corante
Adicionar, em um almofariz, 5g do corante a 100ml de soluo bsica
e deixar em repouso por cinco minutos. Lentamente, sob agitao contnua,
adicionar todo o volume da soluo bsica. Estocar em frasco com tampa
esmerilhada. Deixar amadurecer durante quatro a seis semanas. Um precipitado preto se formar aps alguns dias. O lquido sobrenadante, o fixadorcorante, apresenta cor cereja-preta. Filtrar o corante em papel-filtro (Whatman
n. 12). Estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao abrigo
da luz, da umidade e da poeira.
1. Determinao da Diluio tima e do Tempo de Colorao
A diluio tima e o tempo de colorao devem ser determinados para
cada bateria do fixador-corante. As sries de diluies e os perodos de colorao
apresentados abaixo so recomendados para esse propsito.
Soluo Corante

Soluo Bsica

Horas

No diluda
1
2
1
1

0
1
1
2
3

2
2
2
2
4

a 3
a 4 ou por toda a noite
a 4
ou por toda a noite
ou por toda a noite

A colorao por toda a noite produz excelentes resultados; entretanto,


os esfregaos deixados em contato com a soluo corante por vrios dias resulta
em uma supracolorao. Na triagem os esfregaos devero ser corados com
cada diluio, de acordo com o mtodo descrito abaixo, observando-se a diluio tima e o tempo selecionado para a rotina de colorao com a bateria
de corante. A escolha do uso da combinao satisfatria de diluio e do tempo
depende da rotina e da urgncia do diagnstico. A mdia da diluio mais
comumente usada 1:2, por duas horas ou por toda a noite; entretanto, para
melhores resultados dever ser determinada a combinao exata.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas em todas as etapas da colorao.
2. Diluio fixador-corante, duas horas ou por toda a noite
(usar na rotina diluio e tempo predeterminado).
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CAPTULO 3

111

3. Soluo de lcool etlico a 95%, 10 a 15 segundos


ou
4. lcool etlico a 100%, cinco minutos.
5. Xilol, cinco minutos.
6. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
Caractersticas da Colorao
Os trofozotos dos protozorios corados apresentam cor verde ou verde-acinzentada; os organismos nas fezes velhas coram-se do cinza ao preto. Os ncleos, corpos cromatides, cariossoma e a membrana celular exibem cor verde-escura preta. As hemcias no citoplasma coram-se do rosa
ao preto. As formas csticas da E. coli mostram a cor rosa ou verde e
raramente os cistos da E. histolytica apresentam-se corados em rosa-plido12.

COLORAO

PELO

CORANTE POLYCHROME IV

O corante Polychrome IV uma combinao da fixao e da colorao, podendo substituir o corante tricrmico na colorao de esfregaos fecais
preservados por mertiolato-iodo-formaldedo (MIF), fixador lcool polivinlico
(fixador APV) ou acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF). O corante
e o procedimento de colorao no foram ainda divulgados, sendo
comercializados pela Devetc Inc., P.O. Box 10275, Bradenton FL 34282 e
Scientific Device Laboratory Inc., P.O. Box 88, Glenview, IL, 60025, USA.
O corante Polychrome IV usado principalmente na colorao de esfregaos
permanentes de material fecal preservado pelo MIF17.
REVISO: ESFREGAOS PERMANENTES CORADOS
Princpio: Produzir contraste de colorao entre os artefatos do fundo
da preparao e os parasitos presentes; permitir o exame e o reconhecimento dos detalhes morfolgicos do organismo atravs do exame com
objetiva de imerso (100X), totalizando um aumento de 1.000X. Indicado para identificar e diagnosticar protozorios intestinais.
Amostra: Amostras fecais frescas ou preservadas pelo formaldedo,
fixador APV, SAF ou MIF.
Reagentes: Coloraes pelo tricrmico, hematoxilina frrica, hematoxilina frrica modificada, Polychrome IV ou Chlorazol preto E e suas
solues associadas; solues desidratantes (alcois e xilol); e resinas
sintticas ou Blsamo do Canad.
Exame: Examinar no mnimo 300 campos com objetiva de imerso; um nmero adicional de campos poder ser requerido se um organismo suspeito
foi identificado pelo exame direto a fresco ou no sedimento concentrado.

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112

CAPTULO 3

Resultado: A maioria dos protozorios suspeitos e/ou as clulas humanas so identificados e confirmados atravs do exame de esfregaos
permanentes corados. Esse resultado deve ser expresso como final; o
exame direto a fresco ou o exame do sedimento concentrado fornecem
resultados preliminares.
Observaes e Limitaes: O tricrmico e a hematoxilina frrica so
os corantes mais comumente usados. Ovos e larvas de helmintos no
so identificados atravs dos esfregaos permanentes corados; oocistos
de coccdios e esporos de microspordios requerem mtodos especficos de colorao para serem identificados e diagnosticados. Os esfregaos
permanentes corados so normalmente examinados atravs da objetiva
de imerso (100X), objetivas de pequeno e de grande aumento no so
recomendadas. O propsito principal desse mtodo a identificao e
diagnstico dos protozorios intestinais (trofozotos e cistos). Realizar
a morfometria com micrmetro ocular.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO 3

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CAPTULO 3

CAPTULO

Isolamento e Cultura de Larvas


de Nematides
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
As larvas de Strongyloides stercoralis so usualmente as
nicas larvas encontradas nos espcimes fecais. Dependendo dos
movimentos de trnsito do intestino e das condies do paciente, larvas rabditides e, raramente, larvas filariides podero estar
presentes. Quando houver demora na realizao do exame
parasitolgico das fezes, podero ser identificados e diagnosticados ovos embrionados e larvas de ancilostomdeos3.
A cultura das fezes para o isolamento de larvas til para:
a) revelar a presena de larvas, quando esses organismos esto
em pequeno nmero e no so detectados pelas tcnicas de
concentrao; b) estabelecer se a infeco devida ao S.
stercoralis ou aos ancilostomdeos, pelo estudo das caractersticas morfolgicas fundamentais das larvas rabditides, e permitir a ecloso dos ovos e a libertao das larvas de primeiro
estdio (L1) dos ancilostomdeos, e c) favorecer o desenvolvimento das larvas ao estdio filariide para uma diferenciao
morfolgica ulterior2,3,13.
O uso de certos mtodos de cultura-fecal (coprocultura) so
indicados para a deteco de infeces discretas dos
ancilostomdeos, do S. stercoralis e do Trichostrongylus spp.
como tambm para a identificao especfica dos parasitos. Essas
tcnicas so utilizadas para a obteno de um grande nmero
de larvas infectantes para fins de pesquisa.
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CAPTULO 4

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MTODO DE B AERMANN-M ORAES


O mtodo original de Baermann4, concebido para a pesquisa de larvas
no solo, foi modificado e adaptado por Moraes12 para a pesquisa desses estdios
de evoluo nas fezes humanas. Esse procedimento fundamenta-se no termo hidrotropismo positivo das larvas de nematides.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). Fezes armazenadas sob
refrigerao no devem ser utilizadas.
Aparelho
O aparelho constitudo de funil de vidro ou de plstico de 10 a 12cm
de dimetro, tendo a haste ligada a um tubo de borracha (5 a 10cm de comprimento) fechado com uma pina de Mohr (Fig. 4.1A). O conjunto colocado em suporte apropriado. Colocar sobre o funil uma tela metlica ou usar
um coador de plstico (Fig. 4.1B). Um pedao de gaze dobrada duas vezes
colocado sobre a tela de metal (Fig. 4.1C). A gaze pode ser substituda
pelo filtro descartvel com ala de segurana (Parasitofiltro).
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Encher o funil com gua corrente, aquecida a 40-45C.
3. Abrir a pina de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de
gua para evitar a formao de bolhas de ar na haste e no tubo de borracha.

Fig. 4.1 Aparelho de Baermann: (a) Funil e tubo de borracha com pina de Mohr; (b)
Funil com peneira de arame; (c) Gaze contendo fezes. (Segundo Pessa SB, Martins AV.
Pessa. Parasitologia Mdica. 11 a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982.)

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116

CAPTULO 4

4. Colocar 8 a 10g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada duas vezes e, se necessrio, juntar mais gua, at que as fezes fiquem
submersas. A gaze pode ser substituda pelo filtro descartvel com ala de
segurana (Parasitofiltro ).
5. Deixar em repouso durante 120 minutos.
6. Abrir a pina e coletar parte do lquido em vidro de relgio; examinar ao microscpio estereoscpio (aumentos 20 a 30X). Deixar em repouso
durante alguns minutos, pois, desta forma, as larvas migraro para o centro
do vidro de relgio, ou proceder de acordo com o item 7.
7. Coletar em tubo cnico de centrfuga. Centrifugar (500 x g/1min) e
examinar o sedimento entre lmina e lamnula. Corar a preparao com soluo
de iodo de Lugol para a identificao das caractersticas morfolgicas das
larvas e examinar ao microscpio com aumento de 20X14.
Observaes
1. Este mtodo indicado para a pesquisa de larvas de S. stercoralis
e de ancilostomdeos. As amostras lquidas submetidas ao mtodo de
Baermann-Moraes4,12 devero ser misturadas com pedaos de leno de papel
ou papel higinico ou com farinha de milho6.
2. Freqentemente a observao das caractersticas morfolgicas
dificultada pelo movimento das larvas. Para matar as larvas e estudar esses organismos, aquecer levemente ou adicionar uma gota de soluo de iodo
de Lugol ou de formaldedo a 10% suspenso colhida.
3. Esse mtodo permite o isolamento de larvas parasitas e de vida livre
de nematides. Quando o material fecal foi contaminado com terra ou gua
contendo larvas de vida livre, a diferenciao entre esses organismos realizada pela resistncia que as larvas parasitas apresentam s solues levemente cidas (adicionar 0,3ml de cido clordrico concentrado para cada
10ml de gua contendo as larvas. Ajustar o volume para obter uma diluio
final de 1:30 de cido). As larvas de vida livre dos nematides so mortas
nesta soluo cida, enquanto os espcimes parasitos permanecem vivos durante
24 horas17.
4. Todo cuidado necessrio durante o transporte do lquido para prevenir
infeco. Fezes preservadas ou amostras obtidas aps a administrao de brio
no devem ser usadas neste mtodo. Fezes armazenadas sob refrigerao no
devero ser usadas. Larvas de certas espcies so sensveis ao frio.

MTODO

DE

R UGAI, M ATTOS

BRISOLA

Esse mtodo fundamenta-se no termo hidrotropismo positivo das larvas de nematides16.


Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). Fezes armazenadas sob
refrigerao no devero ser utilizadas.
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CAPTULO 4

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Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze
dobrada duas vezes, e repuxar as extremidades para trs (Fig. 4.2).
3. Encher, com aproximadamente 70 a 100ml de gua corrente aquecida a 40-45C, um copo cnico de sedimentao (capacidade 125ml).
4. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cnico
de sedimentao, de modo que o lquido alcance toda a extenso da abertura do recipiente, cuidando para no formar bolhas de ar.
5. Deixar em repouso durante 120 minutos.
6. Colher o sedimento, no fundo do copo cnico, com pipeta capilar longa.
Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo cnico antes da
colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente para
evitar o revolvimento do lquido.
7. Examinar o sedimento entre lmina e lamnula. Corar a preparao
com soluo de iodo de Lugol15.
Observaes
1. Esse mtodo indicado para a pesquisa de larvas de S. stercoralis.
2. Freqentemente a observao das caractersticas morfolgicas
dificultada pelo movimento das larvas.
3. Aquecer levemente ou adicionar uma gota de soluo de iodo de Lugol
ou de formaldedo suspenso colhida para matar as larvas e estudar esses
organismos.

nvel da gua

Fig. 4.2 Mtodo de Rugai, Mattos e Brisola para a extrao de larvas de Strongyloides
stercoralis (Segundo Rey L. Parasitologia. 2 a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991).

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118

CAPTULO 4

CULTURA NO PAPEL -FILTRO

EM

TUBO DE ENSAIO

O mtodo de Harada e Mori7 baseia-se na identificao microscpica


de larvas de nematides que emergem de amostras fecais cultivadas no
papel-filtro em tubo de ensaio. Sasa e cols. 17 e Hsieh 8 modificaram o procedimento, objetivando facilitar o exame de grande nmero de amostras em
inquritos epidemiolgicos de ancilostomdeos e de parasitos relacionados
com o homem e com os animais domsticos. O procedimento especialmente til no diagnstico de infeces humanas pelo Necator americanus, Ancylostoma duodenale, S. stercoralis e Trichostrongylus orientalis 11,14,21 .
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). Fezes armazenadas sob
refrigerao no devero ser utilizadas.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Preparar uma fita de papel-filtro de 15 x 1cm ou 15 x 2cm, com uma
dobradura no meio.
3. Espalhar 0,5g de fezes frescas no papel-filtro, formando um esfregao
fecal fino e uniforme, em um dos lados da fita, exceto nas reas de 4cm
distante de ambas as extremidades. Um esfregao fecal espesso na fita pode
resultar em decrscimo na mdia de ecloso.
4. Introduzir a fita de papel-filtro em tubo de ensaio de 18 x 180mm ou
20 x 200mm (Fig. 4.3), ou em um tubo cnico de centrfuga de 17 x 120mm
de maneira que a gua no contate as fezes (Fig. 4.4).
5. Fechar o tubo com rolha de borracha, conservando-o na posio vertical
durante 10 a 14 dias, temperatura de 25-30C. Papel de celofane ou de
polietileno, fixado por meio de um anel de borracha, pode substituir a rolha
de borracha, para prevenir a dessecao.
6. No fim do perodo de incubao, colher, com longa pipeta capilar, a
gua do fundo do tubo, a fim de observar se existem larvas filariides ou
examinar em microscpio invertido.
7. Em caso positivo, retirar a rolha e, em seguida, o papel-filtro.
8. Colocar o tubo em banho de gua a 50C durante 15min (para matar as larvas) e transferir a gua para um tubo de centrifugao de 15ml e
centrifugar (500 x g por um minuto). Decantar e colocar as larvas em uma
lmina e examinar com pequeno aumento.
Observaes
1. Os ovos de Necator americanus nas fezes morrem aps 24 horas,
quando as fezes so armazenadas a 0C. Por essa razo, os espcimes fecais
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CAPTULO 4

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fezes

gua

papel-filtro
Fig. 4.3 Mtodo de Harada e Mori para a cultura de larvas de nematides nas fezes (em
tubo de ensaio). (Adaptada de Pessa SB, Martins AV. Pessa. Parasitologia Mdica. 11 a
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982.)

que sero examinados por esse mtodo devem ser mantidos, at o momento do exame, temperatura de 10-25C, sob condies timas de umidade.

fita de
papel-filtro

fezes

gua

Fig. 4.4 Mtodo de Harada e Mori para a cultura de larvas de nematides nas fezes (em
tubo de centrfuga). (Segundo Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures for the Diagnosis
of Intestinal Parasites. 3rd ed. USDHHS PHS (CDC), 82-8282, 1982.)

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CAPTULO 4

2. Durante o inverno a mdia de isolamento de larvas menor do que


nas outras estaes. A dessecao resulta na deteriorao das culturas. Se
o esfregao ficar imerso na gua, mesmo parcialmente, as bactrias e leveduras proliferaro no substrato, havendo uma conseqente deficincia do
oxignio dissolvido; as larvas emergentes so mortas e a deteco torna-se
impossvel.
3. Quando pequenas quantidades de gua so usadas, poucas larvas
emergem, devido dessecao e o uso de grande quantidade de gua favorece a contaminao, devido ao contato com as fezes. O volume timo de
4 a 5ml. A temperatura ideal da cultura varia entre 25-30C. Os melhores
resultados foram obtidos a 28C.
4. Geralmente as larvas emergem na gua ao redor do terceiro dia.
5. Freqentemente a observao das caractersticas morfolgicas
dificultada pelo movimento das larvas. Para matar as larvas e estudar esses organismos, aquecer levemente ou adicionar uma gota de soluo de iodo
de Lugol ou de formaldedo suspenso colhida. Esse mtodo permite o
isolamento de larvas de nematides parasitos e de vida livre.
6. Quando o material fecal foi contaminado com terra ou gua contendo larvas de vida livre, a diferenciao entre esses organismos realizada
pela resistncia que as larvas parasitas apresentam s solues levemente cidas
(adicionar 0,3ml de cido clordrico concentrado para cada 10ml de gua contendo as larvas, ajustar o volume para obter uma diluio final de 1:30 de cido.)
As larvas de vida livre dos nematides so mortas nesta soluo cida, enquanto as espcies parasitas permanecem vivas durante 24 horas19.
7. Todo cuidado necessrio para prevenir infeco durante o transporte do lquido e da tira de papel-filtro, uma vez que as larvas infectantes
podem migrar na tira de papel-filtro, para cima ou para baixo.

CULTURA NO PAPEL-FILTRO EM PLACA DE PETRI


Esse mtodo alternativo de cultura, para o isolamento de larvas de
nematides, foi originalmente descrito por Little10. Como nos mtodos previamente descritos, a umidade necessria fornecida pelo papel-filtro
embebido em gua. Este mtodo apresenta a vantagem de permitir ao
parasitologista a observao das larvas de nematides e estdios de vida livre
de S. stercoralis na massa fecal ou na gua, pelo exame direto com microscpio invertido, sem a preparao prvia de uma lmina.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). Fezes armazenadas sob
refrigerao no devero ser utilizadas.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
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CAPTULO 4

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2. Preparar uma fita de papel-filtro de 25 x 73mm.


3. Espalhar 1 a 2g de fezes frescas no centro da fita de papel-filtro.
4. Colocar a fita sobre uma lmina de vidro para microscopia (25 x 73mm).
Deixar a lmina na posio inclinada, aproximadamente 10, em um lado da
placa de Petri ou em um pequeno cristalizador, apoiada em basto de vidro
ou em tubo de vidro.
5. Adicionar gua destilada-deionizada ou fervida, de maneira que um
quarto da lmina esteja mergulhado na gua. Fechar a placa de Petri, deixando temperatura ambiente (24 a 28C) e adicionar gua, quando necessrio, para manter o nvel original (Fig. 4.5).
6. Conservar a lmina na posio inclinada durante 10 dias. Examinar,
diariamente, pelo microscpio invertido ou colher, com pipeta capilar, a gua
do fundo da placa, a fim de observar se existem larvas filariides.
7. No fim do perodo de incubao, preparar um esfregao e uma lmina e examinar com pequeno aumento.
8. Estudar as caractersticas morfolgicas de cada larva isolada.
Observaes
1. Freqentemente, a observao das caractersticas morfolgicas
dificultada pelo movimento das larvas. Para matar as larvas e estudar esses organismos, aquecer levemente ou adicionar uma gota de soluo de iodo
de Lugol ou de formaldedo suspenso colhida. Essa tcnica permite o
isolamento de larvas de nematides parasitos e de vida livre.
2. Quando o material fecal for contaminado com terra ou gua contendo larvas de vida livre, a diferenciao entre esses organismos realiza-

Fig. 4.5 Mtodo de cultura no papel-filtro, em um pequeno cristalizador, para a identificao de larvas de nematides.

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CAPTULO 4

da pela resistncia que as larvas parasitas apresentam s solues levemente cidas (adicionar 0,3ml de cido clordrico concentrado para cada 10ml
de gua contendo as larvas e ajustar o volume para obter uma diluio final
de 1:30 de cido). As larvas de vida livre dos nematides so mortas nesta
soluo cida, enquanto as espcies parasitas permanecem vivas durante 24
horas 20 .
3. As larvas infectantes podem ser encontradas a qualquer momento
depois do quarto dia de incubao. Todo o cuidado necessrio para prevenir infeco durante o transporte do lquido e da tira de papel-fitro j que
as larvas infectantes podem migrar na tira de papel-filtro, para cima ou para
baixo.

CULTURA DE LARVAS EM CARVO


O mtodo de cultura de larvas em carvo um procedimento indicado
para o isolamento de larvas infectantes de ancilostomdeos, S. stercoralis e
Trichostrongylus. A mistura do material fecal e o carvo granulado semelhante s condies encontradas no solo na natureza.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). Fezes armazenadas sob
refrigerao no devem ser utilizadas.
Reagentes
1. Carvo granulado n. 40
2. Nistatina
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar 20 a 40g de fezes com gua destilada at que se produza
uma suspenso fecal espessa.
3. Transferir a suspenso fecal para uma placa para cristalizao (100
x 50mm) (Pyrex n. 3.140) e completar at a metade com carvo granulado
vegetal.
4. Misturar a suspenso, com abaixador de lngua de madeira, at que
a mesma fique uniformemente misturada com o carvo granulado, agora mido.
Adicionar quantidade suficiente de gua para produzir umidade adequada.
Evitar a formao de camada de gua no fundo da placa de cristalizao.
A superfcie da cultura deve brilhar quando a umidade estiver na quantidade exata.
5. Fechar a cuba, deixando-a no escuro, temperatura ambiente (25 a
28C) por cinco a seis dias.
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6. Supervisionar diariamente a cultura para controlar a umidade. Se a


superfcie no estiver brilhante, aspergir a superfcie com gua.
7. Para concentrar as larvas infectantes, preparar um chumao de gaze
com 10 a 12 camadas, com o mesmo dimetro da cuba de cristalizao. Molhar
levemente o chumao de gaze com gua destilada (no deixar a gua gotejar), colocando-o, com o auxlio de pinas, sobre a superfcie do carvo. No
tocar as mos ou os dedos na superfcie do carvo na placa de cristalizao.
8. Expor a placa coberta luz (lmpada de 75 watts), posicionada aproximadamente 15 a 20cm acima da tampa de gaze da placa com a cultura.
9. Depois de 30 minutos, remover com todo cuidado a tampa-chumao
de gaze com duas pinas.
10. Transferir o chumao de gaze para o interior do copo cnico de
sedimentao, de modo que a gua, previamente colocada no copo cnico,
cubra toda a gaze.
11. Deixar em repouso durante 60 minutos.
12. Colher o sedimento, no fundo do copo cnico, com pipeta capilar
longa.
13. Examinar o sedimento entre lmina e lamnula. Corar a preparao
com soluo de Lugol.
Observaes
1. As fezes de certos animais podem conter fungos. Por essa razo,
aconselhvel adicionar pequena quantidade de nistatina diluda suspenso
fecal para evitar o crescimento demasiado desses organismos, o que viria a
ser nocivo para as larvas.
2. Aproximadamente cinco a seis dias depois que a cultura foi preparada, larvas de ancilostomdeos e de Strongyloides adquirem o estdio
infectante. Transferir com todo o cuidado o chumao de gaze, porque as
larvas de S. stercoralis freqentemente migram para a superfcie do chumao onde se encontram as gotas condensadas. Essas gotas podem estar
cheias de larvas.

CULTURA DE LARVAS DE STRONGYLOIDES STERCORALIS EM PLACA DE GAR


A cultura em gar, mtodo de Arakaki e Koga 1, para o isolamento de
larvas de Strongyloides stercoralis, um excelente procedimento para o
diagnstico da estrongiloidase. Esse procedimento mais sensvel do que
os outros mtodos de diagnstico. As fezes so colocadas em placas de Petri,
seladas para prevenir uma infeco acidental e deixadas por dois dias
temperatura ambiente. As larvas movem-se lentamente sobre o gar, arrastando as bactrias, criando uma visvel trilha na superfcie do gar. As placas so examinadas ao microscpio para confirmao da presena dos organismos, depois a superfcie do gar lavada com formalina a 10%. A
confirmao final da identificao das larvas realizada pelo exame direto
do sedimento concentrado lavado3,9.
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CAPTULO 4

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) e/ou contedo duodenal
fresco. Os espcimes armazenados sob refrigerao no devem ser utilizados.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

gar (Difco)
Extrato de carne (Difco)
Peptona (Difco)
Cloreto de sdio (NaCl)
Formaldedo a 10% (ver p. 9)

Meio de Cultura
gar
Extrato de carne
Peptona
Cloreto de sdio
gua destilada-deionizada

15g
0,5g
1g
0,5g
100ml

Dissolver os ingredientes em 100ml de gua e distribuir em placas de


Petri estreis descartveis, 95 x 15mm, na razo de 20ml por placa.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Repicar aproximadamente 2g de fezes ou de contedo duodenal em
placa de gar em uma superfcie de aproximadamente 1cm de dimetro.
3. Tampar e lacrar as placas de gar com fita de celofane adesiva e
transparente para prevenir uma acidental infeco.
4. Deixar as placas de gar durante dois dias temperatura ambiente
(24 a 28C) ou incubar temperatura de 26 a 33C por dois dias.
5. Examinar as placas de gar depois de dois dias de incubao, atravs da tampa, no microscpio invertido, para confirmar a presena das larvas na superfcie do gar. (As larvas movimentam-se sobre o gar, carregando as bactrias e criando verdadeiras trilhas sobre o substrato slido.)
6. Furar a tampa da placa. Lavar a superfcie do gar pela adio, atravs
do orifcio, de 10ml de soluo de formaldedo a 10%. Deixar em repouso
durante 30 minutos.
7. Remover a fita de celofane adesiva e transparente e a tampa da placa
de gar. Transferir todo o volume da suspenso de formalina a 10% para
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CAPTULO 4

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um tubo cnico de centrfuga de 15ml com o auxlio de um funil (evitar que


o lquido escorra para fora do tubo e contamine a centrfuga).
8. Centrifugar (500 x g/5min) o lavado formolizado colhido da superfcie do gar.
9. Examinar o sedimento concentrado entre lmina e lamnula para a
presena de larvas rabditides e/ou filariides (aumento 400X).
10. Corar a preparao com soluo de iodo de Lugol. Esse procedimento muito sensvel, devendo ser extensivamente usado.
Observaes
1. Quando as larvas so de difcil observao atravs do exame microscpico, como tambm as caractersticas morfolgicas, matar as larvas
dentro da placa de Petri com soluo de formalina a 10% e examinar o
sedimento formolizado concentrado. As larvas infectantes podem ser encontradas depois do primeiro ou segundo dia de incubao ou aps o primeiro
dia nas infeces macias.
2. Quando as larvas infectantes estiverem presentes no gar, todas as
placas devem ser transportadas com cuidado, uma vez que a fita de celofane adesiva e transparente pode ser removida.
3. As placas de Petri no devem ser invertidas, elas devem ser mantidas na sua posio normal, com a tampa para cima. Para a realizao desse procedimento as fezes devem ser frescas.
4. No usar amostras fecais preservadas ou espcimes obtidos aps
a administrao do contraste sulfato de brio. Essa tcnica bem-sucedida, mesmo quando algumas larvas estiverem presentes no espcime fecal.
As larvas no sobrevivem nas fezes frescas muito velhas.
Controle de Qualidade: Isolamento e Cultura de Larvas de
Nematides (Mtodos de Baermann e Moraes; Rugai, Mattos e
Brisola; Harada e Mori; Arakaki-Koga e Little)
1. Para obter excelentes resultados com os mtodos, seguir os procedimentos de colheita e de transporte dos espcimes fecais para o exame
parasitolgico.
2. Examinar, quando possvel, amostras positivas e negativas de fezes
(de animais de laboratrio) para ter certeza de que o procedimento utilizado
preciso.
3. Rever diagramas de larvas para confirmar a identificao.
4. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
5. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle18-20.
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CAPTULO 4

REVISO: CULTURA DE LARVAS DE NEMATIDES


Princpio: A cultura das fezes para o isolamento de larvas til para:
a) revelar a presena de larvas, quando esses organismos esto em pequeno
nmero e no so detectados pelas tcnicas de concentrao; b) estabelecer se a infeco devida ao S. stercoralis ou aos ancilostomdeos,
por meio do estudo das caractersticas morfolgicas fundamentais das
larvas rabditides e permitir a ecloso dos ovos e a libertao das larvas de primeiro estdio (L1) dos ancilostomdeos, e c) favorecer o desenvolvimento das larvas ao estdio filariide para uma diferenciao
morfolgica ulterior.
Espcimes: Amostras fecais frescas. Fezes armazenadas sob refrigerao no devem ser utilizadas.
Exame: Observar diariamente o lquido de cultura para a presena de
larvas e manter as culturas por 10 dias antes de relatar o resultado final.
Resultados: O insucesso para isolar larvas no descarta a possibilidade de infeco; entretanto, a probabilidade de infeco provavelmente menor quando os resultados so negativos.
Observaes e Limitaes: Usar luvas durante todas as etapas do
procedimento, todo o cuidado necessrio para prevenir infeco durante o transporte do lquido da cultura para exame. Manter o sistema
de cultura hidratado; principalmente durante os dois primeiros dias, quando
uma certa quantidade de gua evapora e a dessecao resulta na deteriorao das culturas.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Strongyloides stercoralis infection. J Parasitol, 76:425, 1990.

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Garcia LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology. 3 th ed. Washington (DC):
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CAPTULO 4

127

9.

Koga K, Kasuya S, Khamboonruang C et al. A modified agar plate method for detection
of Strongyloides stercoralis. Am J Trop Med Hyg, 45:518, 1991.

10. Little MD. Comparative morphology of six species of Strongyloides (Nematoda) and
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11. Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures for the Diagnosis of Intestinal Parasites.
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12. Moraes RG. Contribuio para o estudo do Strongyloides stercoralis e da estrongiloidase
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HD ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM Press,
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HD ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM Press,
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CAPTULO 4

CAPTULO

Demonstrao e Quantificao
de Ovos nas Fezes
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
Os nicos parasitos humanos para os quais possvel
correlacionar a produo de ovos com a carga parasitria so Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura, ancilostomdeos (Necator
americanus e Ancylostoma duodenale) e Schistosoma mansoni.
O conhecimento da carga parasitria til para determinar a intensidade da infeco, decidir pela medicao e avaliar a eficcia
dos medicamentos administrados. No se deve esquecer que a estimativa da contagem dos ovos varia em relao direta com a acuidade
do procedimento. Quando dois ou mais espcimes fecais so comparados, o mesmo microscopista deve excetuar a tcnica de todas
as amostras e realizar mltiplas contagens. A intensidade de uma
infeco determinada pelo nmero de ovos encontrados.
Os mtodos quantitativos foram desenvolvidos com esse
propsito. Ovos por grama (OPG) o nmero de ovos por grama de fezes e pode ser definido como um ndice de densidade
dos ovos nas fezes. Ovos por dia (OPD) so obtidos pela multiplicao do OPG pelo peso total (g) do material fecal de 24
horas. Ovos por dia por fmea (OPDPF) o resultado da diviso OPD pelo nmero de vermes fmeas albergadas pelo hospedeiro 28.
OPD = OPG x g
OPDPF = OPD n. de vermes
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CAPTULO 5

129

Conhecendo-se o OPG, pode-se calcular o nmero de vermes e estimar quantitativamente o efeito do controle das parasitoses, como tambm a
eficcia dos anti-helmnticos. Os mtodos quantitativos de Stoll25, Stoll e
Hausheer26, Kato e Miura 16, Beaver 3,4, Bell 5, Barbosa2, Martin e Beaver21,
Katz, Chaves e Pelegrino19 e Teesdale e Amin29 foram introduzidos objetivando estudar a intensidade das infeces.

MTODO DE STOLL

HAUSHEER

Stoll introduziu o mtodo da contagem de ovos, o qual foi modificado e


simplificado por Stoll e Hausheer26. A soluo de hidrxido de sdio 0,1M
saponifica as gorduras, libertando os ovos dos detritos fecais, mantendo a
suspenso clara. O frasco do tipo Erlenmeyer e, para facilitar a adio
da soluo de hidrxido de sdio e do material fecal, dois nveis esto gravados ao longo do gargalo, correspondendo a 56 e 60ml (Fig. 5.1).
Pipetas de Stoll (com bulbo de borracha) graduadas em 0,075 e 0,15ml
so usadas para a colheita da suspenso.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). No usar fezes preservadas.
Reagentes
Soluo de Hidrxido de Sdio 0,1M
Hidrxido de sdio (NaOH)
gua destilada-deionizada q.s.p.

4g
1.000ml

60
56

Fig. 5.1 Frasco e pipeta de Stoll. (Adaptada de Melvin DM, Brooke MM. Laboratory Procedures
for the Diagnosis of Intestinal Parasites. 3rd ed. USDHHS PHS (CDC), 82-8282, 1982.)

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CAPTULO 5

Dissolver o NaOH em pequena quantidade de gua em beaker de


um litro. Completar o volume. No necessrio padronizar a soluo para
a contagem de ovos.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Completar o volume at 56ml do frasco de Stoll com soluo de
hidrxido de sdio 0,1M, correspondendo ao nvel inferior.
3. Adicionar fezes at que o lquido atinja o nvel superior, correspondente a 60ml.
4. Introduzir no frasco 10 a 20 esferas de vidro (3 a 4mm de dimetro) e fechar com rolha de borracha.
5. Agitar vigorosamente o frasco na posio invertida durante um minuto,
se as fezes forem slidas, para obter uma soluo homognea. Deixar em
repouso por aproximadamente 12 horas.
6. Colher no centro do frasco, aps agitao, 0,075 ou 0,15ml da suspenso.
7. Colocar no centro de uma lmina de microscopia o contedo da pipeta.
Cobrir a gota com uma lamnula de 22 x 44mm.
8. Examinar sistematicamente a preparao com objetiva de pequeno
aumento. Contar o nmero de ovos e multiplicar por 100, se a amostra foi
de 0,15ml, e por 200, se foi de 0,075ml. O resultado fornecer o nmero de
ovos/ml ou de ovos/g (OPG).
Observaes
1. A estimativa de ovos/grama varia de acordo com a consistncia das
fezes usadas na preparao.
2. As seguintes correes devero ser feitas conforme a natureza das
fezes: semipastosas multiplicar pelo fator 1,5; pastosas, por 2,0; pastosasdiarricas, por 3,0; e diarricas, por 4,022,25,28.
3. A contagem de ovos em amostras lquidas, geralmente, no de
confiana. Entretanto, as contagens mais acuradas so realizadas em fezes
slidas ou semipastosas.
4. A contagem dever ser realizada no mnimo trs vezes, devendo ser
sempre coletado o mesmo nmero de amostras da preparao. Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura, ancilostomdeos (Necator americanus,
Ancylostoma duodenale) e Schistosoma mansoni so os nicos parasitos
humanos para os quais possvel correlacionar a produo de ovos com o
nmero de vermes adultos.
5. Em certas situaes, de extrema importncia informaes referentes carga parasitria; quando existe, por exemplo, a necessidade de
determinar a intensidade da infeco, preciso decidir sobre uma possvel
quimioterapia e estimar a eficcia do frmaco administrado13,21.
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CAPTULO 5

131

MTODO

DE

STOLL M ODIFICADO

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). No usar fezes preservadas.
Reagentes
Soluo de Hidrxido de Sdio 0,1M
Hidrxido de sdio (NaOH)

4g

gua destilada-deionizada q.s.p.

1.000ml

Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Completar o volume at 14ml do tubo de centrfuga de 15ml com
soluo de hidrxido de sdio 0,1M, correspondendo ao nvel inferior.
3. Adicionar fezes at que o nvel do lquido atinja o nvel superior,
correspondendo a 15ml.
4. Fechar o tubo com rolha de borracha.
5. Quando as fezes forem slidas, para obter uma soluo homognea,
agitar vigorosamente o tubo na posio invertida durante um minuto. Deixar
em repouso por aproximadamente 12 horas.
6. Colher no centro do tubo, aps agitao, exatamente 0,15ml da suspenso.
7. Colocar no centro de uma lmina de microscopia o contedo da pipeta.
Cobrir a gota com uma lamnula de 22 x 44mm (torna-se mais fcil fazer a
contagem sem a lamnula, visto que, ocasionalmente, os ovos podem escorrer para fora da mesma).
8. Examinar sistematicamente a preparao com objetiva de pequeno
aumento. Contar o nmero de ovos e multiplicar por 100. O resultado fornecer o nmero de ovos/ml ou ovos/g (OPG). Correes devero ser feitas conforme a natureza das fezes, como foi descrito no mtodo original de
Stoll.

MTODOS COPROLGICOS QUANTITATIVOS ESPECFICOS


DIAGNSTICO DO SCHISTOSOMA MANSONI 1,8,9,11,12,23,24,31

PARA O

Diferentes mtodos coprolgicos quantitativos so indicados para o diagnstico da esquistossomose mansnica; os mais utilizados so os de Bell5,
de Barbosa 2, de Kato-Katz 17,18,19 e de Teesdale 29 .
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132

CAPTULO 5

MTODO DE BELL
O mtodo coprolgico quantitativo de Bell5 indicado para o diagnstico da esquistossomose mansnica.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). No usar fezes preservadas.
Aparelho de Bell
O aparelho constitudo de duas peneiras de nilon superpostas. O mtodo
baseia-se na filtrao sob vcuo da suspenso de fezes atravs de duas telas
de nilon (500m e 350m de abertura, respectivamente). Esse conjunto de
peneiras colocado sobre um funil de Buchner, de porcelana, com o fundo
perfurado em crivo, sobre o qual colocado um filtro de papel (Whatman
541) que retm os ovos de S. mansoni. Os ovos so facilmente visualizados e contados ao microscpio quando o sedimento corado pela soluo
saturada de ninhidrina (C9H6O 4)15.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher e pesar as fezes emitidas em 24 horas. Colocar o material
fecal total em copo graduado ou em beaker de 2.000ml. Completar o volume de 100ml com soluo de formaldedo a 10% e misturar vigorosamente.
3. Completar o volume da suspenso juntando 900ml de gua corrente.
4. Homogeneizar toda a suspenso com um misturador eltrico durante
15 minutos.
5. Colher exatamente 50ml da suspenso. Com seringa de 10ml, aspirar 1ml da suspenso de fezes e transferir para a primeira peneira (tela de
500m).
6. Lavar a seringa e a tela vrias vezes, pela passagem de 10ml de
gua corrente. Filtrar, sob vcuo, a suspenso.
7. Os ovos de S. mansoni so retidos no papel-filtro (Whatman 541)
colocado sobre um funil de Buchner de porcelana.
8. Retirar e mergulhar, durante 10 minutos, o papel-filtro do funil de
Buchner na soluo saturada de ninhidrina.
9. Deixar o filtro secar durante a noite temperatura de 37C ou durante 10 minutos a 60C.
10. Examinar sistematicamente a preparao com objetiva de pequeno
aumento. Contar todos os ovos contidos no papel-filtro. Bell recomenda recortar
o papel-filtro na forma de uma lmina de microscopia, a qual coberta com
uma lamnula.
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CAPTULO 5

133

MTODO

DE

BARBOSA

O mtodo descrito por Barbosa2 o resultado da modificao da tcnica de sedimentao espontnea.


Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). No usar fezes preservadas.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar cerca de 5g de fezes, coletadas de vrias partes do bolo fecal,
em copo graduado ou em beaker de 250ml. Completar o volume de 50ml
com gua corrente.
3. Filtrar a suspenso atravs de gaze levemente umedecida, dobrada
duas vezes e receber o filtrado em uma proveta graduada com tampa de
50ml.
4. Deixar em repouso durante 60 minutos.
5. Decantar com cuidado o lquido sobrenadante, sem perder nenhuma
poro do sedimento.
6. Determinar o volume do sedimento e agitar vigorosamente a proveta na posio invertida durante um minuto.
7. Colher com pipeta graduada 0,1ml do sedimento.
8. Examinar sistematicamente a preparao com objetiva de pequeno
aumento. Contar o nmero de ovos.
9. Calcular o nmero de ovos por grama de fezes (OPG) de S. mansoni
com a seguinte frmula:
N. de ovos por lmina x Volume do sedimento a
Volume do sedimento x Peso da amostra de fezes

MTODO DE KATO-KATZ
O mtodo do esfregao espesso de celofane, introduzido por Kato e
Miura 16 , aperfeioado e avaliado por Kato 17 , e estudado por Komiya e
Kobayashi20, Martin e Beaver21, Chaia e cols.7, Katz, Coelho e Pellegrino 18
e modificado por Katz, Chaves e Pellegrino19 amplamente usado na rotina
para determinar quantitativamente o nmero de ovos. De acordo com esses
autores, este mtodo um procedimento simples e muito eficiente para detectar ovos de helmintos nas fezes principalmente de Schistosoma, entretanto, no indicado para o diagnstico de larvas de helmintos e protozorios.
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134

CAPTULO 5

O mtodo modificado de Kato-Katz quantifica uma pequena poro de


fezes, combinando um carto retangular de papelo (ou plstico), com pequeno orifcio central 19 e o esfregao espesso de fezes16,17. O procedimento
demonstra possuir excelente sensibilidade e reprodutibilidade.
A grande vantagem do mtodo o uso de significativa poro de fezes
(50 a 60mg), a qual examinada diretamente sem o emprego de outros
procedimentos de concentrao. O mtodo usa lamnulas de celofane, previamente mergulhadas em soluo aquosa de glicerina e verde de malaquita.
A intensidade de luz necessria durante o exame microscpico desse mtodo no mnimo duas vezes maior do que a requerida pelo exame direto a
fresco, por esta razo o verde de malaquita usado para propiciar proteo
aos olhos30 e tornar os ovos mais visveis.
No mtodo de Kato-Katz obrigatrio o uso de amostras fecais frescas ou refrigeradas (por um perodo de tempo pequeno), no possibilitando
o uso de espcimes preservados pelos fixadores tradicionais, os quais promovem liquefao e diluio, afetando, possivelmente, as propriedades de
clarificao da mistura de glicerina, prejudicando a execuo do mtodo.
A adio de azida sdica (NaN3), em p s amostras fecais constituiuse em excelente procedimento para impedir alteraes da morfologia dos ovos,
evitar a embriognese e diminuir a atividade dos microrganismos presentes
nas fezes, sem alterar a concentrao dos ovos6,14. A azida sdica, p, preserva as amostras fecais permitindo o exame pelo mtodo de Kato-Katz6,14.
A azida sdica txica e deve ser transportada com cuidado.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas). No usar fezes preservadas.
Reagentes
1. Verde de malaquita (CI 42000) [C 23H 25N 2)2.3C 2H2O 4]
2. Fenol fundido a 44C (C6H 6O)
3. Glicerina (C3H8O 3)
Soluo Aquosa Glicerinada de Verde de Malaquita
Soluo aquosa de verde de malaquita a 3% (m/v)
1ml
Soluo aquosa de fenol a 6% (m/v)
100ml
Glicerina
100ml
Material
1. Lamnula de celofane molhvel de espessura mdia e 20 x 26mm
em tamanho.
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CAPTULO 5

135

2. Lmina comum de microscopia (26 x 76mm).


3. Tela de metal (60 ou 80 malhas) ou de nilon (105 malhas).
4. Carto retangular (3cm x 4cm x 1,37mm) com um orifcio central
de 6mm de dimetro.
5. Palito de madeira ou de plstico.
6. Papel absorvente.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente.
3. Comprimir a tela metlica ou de nilon sobre as fezes, fazendo com
que parte passe atravs das malhas (Fig. 5.2A).
4. Remover as fezes que passam atravs das malhas e transferi-las para
o orifcio do carto, colocado sobre a lmina (Fig. 5.2B).
5. Depois de encher o orifcio central, remover com cuidado o carto,
deixando as fezes na lmina.
6. Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane, invertendo e pressionando a lmina sobre o papel absorvente (Fig. 5.2C).
7. Deixar a preparao em repouso (clarificao) durante 30 minutos
a 34-40C ou temperatura ambiente por uma a duas horas.
8. Examinar a preparao ao microscpio (Fig. 5.3).
Clculo
O nmero de ovos presentes no material fecal (lmina) multiplicado pelo
fator 24 resulta, aproximadamente, no nmero total de ovos por grama (OPG)
de fezes.
Observaes
1. A lamnula de papel celofane permevel deve ser previamente tratada, por no mnimo 24 horas, com soluo de verde de malaquita em glicerina.
2. Com a evaporao da gua, a glicerina age sobre o esfregao fecal,
clarificando-o. Essa tcnica, alm de simples, permite a estocagem da lmi-

Fig. 5.2 Mtodo de Kato-Katz.

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136

CAPTULO 5

Fig. 5.3 Preparaes de ovos de helmintos pelo mtodo de Kato-Katz; A) Ascaris


lumbricoides; B) Trichuris trichiura; C) Schistosoma mansoni. Barra = 25mm. (Imagens
reproduzidas do Beach Aids for the Diagnostic of Intestinal Helminths, Programme on Intestinal Helminths, Division of Communicable Diseases, WHO, Genebra.)

na preparada para leitura posterior, tornando possvel a adoo de esquemas de superviso do diagnstico laboratorial e facilitando seu emprego em
condies de trabalho de campo15.
3. Nessas circunstncias, de acordo com Coura e Conceio10, impese facilidades operacionais.
4. desaconselhvel, entretanto, seu uso em amostras fecais diarricas15.
5. Suzuki e Sanbe27 empregaram um carto retangular de papelo (3cm
x 4cm x 1,42mm) com um orifcio central de 7mm de dimetro. O clculo
de OPG o resultado da multiplicao do nmero de ovos presentes na
preparao pelo fator 18,5.

MTODO DE TEESDALE E AMIN


Esse mtodo descrito por Teesdale e Amin29 assemelha-se ao mtodo
de Kato-Katz sob o aspecto metodolgico, diferindo deste pelo fato de se
obter o esfregao das fezes a serem examinadas atravs de presso entre
duas lminas de microscopia15.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO 5

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CAPTULO 5

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CAPTULO 5

139

CAPTULO

Artefatos que Podem Ser Confundidos


com Organismos Parasitos
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
Os problemas encontrados na diferenciao dos enteroparasitos dos detritos fecais, que se assemelham entre si, so
um fato comum para o pessoal do laboratrio de Parasitologia,
em particular para aqueles que no possuem experincia no diagnstico parasitolgico. As fezes consistem em vrios elementos,
entre os quais esto includos: a) restos de alimentos no digeridos; b) material alimentar digerido; c) clulas epiteliais, muco
e outras secrees do trato intestinal, e d) vrios tipos de microrganismos, tais como bactrias e leveduras. Considerando a
relao entre detritos alimentares e parasitos, no surpresa que
muitos resduos sejam responsveis por uma incorreta identificao de trofozotos e cistos de protozorios e ovos e larvas de
helmintos. Treinamento apropriado, observncia dos protocolos,
controle de qualidade, bibliografia referencial e instrutores capacitados minimizaro a identificao dos erros.
Diferentes espcies de elementos microscpicos encontrados em secrees e excrees do homem so erroneamente
identificados e confundidos com parasitos humanos. Esses
pseudoparasitos apresentam caractersticas semelhantes s dos
parasitos, como tambm aos seus estgios de desenvolvimento,
embora no sejam parasitos ou parasitem o hospedeiro em questo.
O melhor termo seria pseudo-simbiontes5; o termo pseudoparasitos tem sido usado por alguns autores para designar or Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 6

141

ganismos comensais, tais como a Entamoeba coli 5. Muitos objetos, como


pequenas clulas intestinais, fragmentos de carne e de vegetais ingeridos como
alimento e plen contaminando os alimentos, podem assemelhar-se morfologicamente aos ovos de parasitos humanos nas fezes. caros e seus ovos
so freqentemente encontrados nas fezes humanas. Eles podem ser diferenciados dos ovos dos parasitos por suas formas distintas, superfcie irregular de sua casca, ou pela estrutura semelhante casca e pelo contedo
que difere das clulas dos ovos segmentados e no segmentados. Muitas
vezes torna-se difcil distinguir os ovos de zooparasitos ou fitoparasitos daqueles dos parasitos humanos10.
Freqentemente, fragmentos de alimentos, clulas vegetais, gros de plen,
leuccitos, clulas de tecido animal e outros artefatos presentes nas fezes
podem assemelhar-se a certas espcies de parasitos, mas um cuidadoso exame
revelar caractersticas que determinaro o diagnstico do parasito (Fig. 6.1)2.
Os exames macroscpico e microscpico das fezes podem ser dificultados pela
presena de artefatos, que se assemelham aos parasitos (trofozotos, cistos,
ovos, larvas de vermes adultos). Muitos desses artefatos surgem de uma grande
lista de produtos vegetais e animais que so ingeridos diariamente pelo homem. Clulas humanas de origem intestinal podem, na sua aparncia, imitar
protozorios patognicos ou comensais. Infeces esprias com parasitos
humanos e de origem animal acontecem aps a ingesto de carne contaminada ou infectada. Na realidade, um material fecal inadequadamente colhido, velho ou mal preservado oferece outros mecanismos pelos quais os espcimes podem ser contaminados com organismos desconhecidos. Gradwohl
e Kouri3 dividiram os pseudoparasitos microscpicos em dois grupos: 1) elementos em trnsito e 2) elementos derivados de contaminao externa.

ELEMENTOS EM TRNSITO
Neste grupo esto includos todos os pseudoparasitos microscpicos
encontrados nas fezes, os quais so simples elementos de trnsito atravs
do trato digestivo. Esses elementos so ingeridos junto aos alimentos e igualmente passam com ou sem modificaes, sendo eliminados com as fezes.
Ovos e larvas de nematides de animais ou de vegetais so ingeridos pelo
homem com os alimentos de origem animal ou vegetal, passando atravs do
trato alimentar sem causar parasitismo. A variedade e regularidade de material vegetal encontrado nas fezes pode causar confuso. Os ovos de
nematides parasitos de razes de plantas no so digeridos e, freqentemente,
so encontrados nas fezes humanas. Esses ovos de nematides dos gneros Meloidogyne, Heterodera, Pratylenchus etc. tm casca fina e hialina,
sendo achatados em um lado, com forma elipside-alongada (ovide), com
as extremidades arredondadas e apresentando embries em vrios estdios
de desenvolvimento. Exemplos: ovos de Heterodera marioni (Fig. 6.2), ovos
embrionados de Heterodera radicicola, ovos de Heterodera glycines, ovos
de Meloidogyne hapla, ovos de Meloidogyne javanica, ovos de
Meloidogyne incognita e ovos de Meloidogyne sp. (Fig. 6.3). Os ovos de
Meloidogyne sp. podem ser confundidos com os ovos de Trichostrongylus,
de ancilostomdeos ou com ovos infrteis de Ascaris lumbricoides. Entre
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142

CAPTULO 6

os vegetais comestveis que podem se apresentar parasitados por Meloidogyne


no Brasil esto cenoura, batatinha, margarito, mandioquinha, rabanete,
aipo, nabo etc. 6,7. Larvas de Anguillula aceti, ingeridas no vinagre com
azeite e em certos lquidos fermentados, ovos e adultos de caros, especialmente Tyroglyphus sp., Tyrophagus dimidiatus (Fig. 6.4), Cheyletus e
Tarsonemus, so freqentemente encontrados nas fezes humanas pelo exame parasitolgico das fezes. Aceita-se que estes caros so ingeridos acidentalmente com os alimentos, mas existem dvidas se eles so patognicos
ou no quando deglutidos3,10. A mais freqente ocorrncia de dpteros e de
seus ovos nas fezes humanas a da Carpoglyphus lactus, provavelmente
habitante da pasta de soja ou do acar10. Miase intestinal ou o desenvolvimento de larvas de moscas no intestino pode ocorrer no homem. Com muita
freqncia, so encontradas nas fezes partes ou todo o corpo do inseto, como
resultado de sua ingesto com os alimentos. Larvas vivas nos espcimes fecais
podem indicar uma miase ou uma contaminao do espcime. Neste caso,
importante acertar o mtodo de colheita das amostras fecais, particularmente se elas forem obtidas fora do hospital ou do laboratrio2,4,5. Ocasionalmente, ovos do nematide Capillaria e de certos trematdeos, como a
Fasciola hepatica2,8,9, podem ser acidentalmente ingeridos e passar inalterados atravs do trato gastrintestinal. Leuccitos, fungos, leveduras e clulas epiteliais podem ser confundidos com protozorios, enquanto certas
concrees intestinais, clulas vegetais, fibras de carne, vasos espiralados,
plos de plantas, grnulos, gros de plen, cristais, bolhas de ar e de leo
so facilmente confundidos com ovos e larvas de helmintos (Fig. 6.1). Os
gros de plen e estruturas similares so regulares em forma e freqentemente
esto presentes em grande nmero. Sua regularidade e abundncia pode sugerir
que eles sejam alguma forma evolutiva de um parasito. A Fig. 6.5 mostra
estruturas, encontradas nas fezes de pacientes submetidos a uma dieta suplementar com Australian bee pollen, com morfologia semelhante aos ovos
de Trichuris trichiura 2,5.

ELEMENTOS DERIVADOS DE CONTAMINAO EXTERNA


O material fecal pode ser contaminado por elementos microscpicos
lanados aos espcimes fecais aps a colheita. Essa contaminao externa
devida vidraria suja, como tambm a certas amebas e ciliados de vida
livre; larvas de dpteros; leveduras e gros de plen.
Protozorios
Algumas clulas e outros organismos podem facilmente ser confundidos com protozorios intestinais (Tabela 6.1)2.
Amebas: Ocasionalmente as amebas de vida livre so encontradas nas
fezes ou como contaminantes na gua. Morfologicamente os trofozotos desses
organismos diferem das amebas parasitas por possurem um ou mais vacolos
contrteis e uma fina membrana cstica. Outra caracterstica diferencial est
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CAPTULO 6

143

Fig. 6.1 Artefatos encontrados nas fezes humanas, que podem causar confuso no diagnstico parasitolgico. 1) Pr-cisto de Entamoeba histolytica; 2) Macrfago; 3) Leuccito,
neutrfilo polimorfonuclear; 4) Clula epitelial escamosa, obtida atravs de aspirado retal;
5) Clula plasmtica, obtida atravs de aspirado retal; 6) Blastocystis hominis (classificado
como protozorio); 7) Clulas de levedura; 8) Unidades separadas de miclio de Monilia;
9,10) Condia de fungo Alternaria e Helminthosporium; 11) Cristais de Charcot-Leyden; 12)
Cristais de colesterol; 13) Partculas de casena parcialmente digeridas; 14) Bolha de ar;
15) Gota de leo; 16a, 16b) Diatomceas; 17a) Pinheiro; 17b) Violeta africana; 17c) Hibiscus;
17d) Slvia; 17e) Losna; 17f) Phleum pratense; 18) Cabelo de planta; 19) Fragmento de
fibra de algodo; 20) Cabelo de mamfero; 21-32) Resduos de alimentos; 21) Msculo de
carne bovina ou suna; 22) Carne de caranguejo; 23) Carne de peixe; 24) Gro de trigo; 25)
Semente de cereal; 26) Vagem de feijo; 27) Feixe fibrovascular de tubos de conduo; 28)
Gro de amido de batata Irlandesa; 29) Amido de arroz; 30) Amido de pacova; 31) Amido
de batata-doce; 32) Parede celular de material lenhoso. 1-12 x 1.125; 16a x 700; 16b x 200;
17-20 x ca. 300; 21-21 x ca. 240; 28-31 x ca. 750; 32 x 200. Observao: O Blastocystis
hominis est classificado como ameba. (Desenhos originais de Faust EC. In: Faust EC, Beaver
PC, Jung RC. Animal Agents and Vectors of Human Diseases. 3 rd ed. Philadelphia: Lea &
Febiger, 1968.)

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144

CAPTULO 6

Fig. 6.2 Ovo embrionado de Heterodera marioni. (Segundo Gradwohl RBH, Kour P. Clinical
Laboratory Methods and Diagnosis. Parasitology and Tropical Medicine. 4th ed. St. Louis:
CV Mosby Co., 1948. v.3.)

relacionada com as exigncias culturais; enquanto que os organismos de


vida livre crescem facilmente nos meios de cultura, as amebas patognicas

Fig. 6.3 Ovo de Meloidogyne sp. (Famlia Heteroderidae) nas fezes humanas. A) ovo
morulado; B) ovo embrionado. (Segundo Pessa SB, Martins AV. Pessa. Parasitologia Mdica. 11 a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982.)

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CAPTULO 6

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Fig. 6.4 Ovo e adulto de Tyrophagus dimidiatus. (Segundo Suzuki N. Human Helminth
Eggs. Tokyo: JAPC & JOICFP, 1981.)

necessitam de meios de cultura mais complexos para o seu desenvolvimento in vitro. As amebas isoladas do material fecal so Entamoeba moshkovkii,
Naeglaria gruberi, Hartmanella hyalina, Sappnia diploidea, Vahlkampfia
punctata e V. lobospinosa. Na colheita dos espcimes a contaminao das

Fig. 6.5 A) Ovo de Trichuris trichiura; B, C, D) Artefatos semelhantes a ovos, nas fezes de
pessoas que ingeriram Australian bee pollen. (Segundo Markell EK, Voge M, John DT. Medical
Parasitology. 7th ed. Philadelphia: WB Saunders Co., 1992.)

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CAPTULO 6

amostras fecais pode ser evitada pelo uso de recipientes limpos e secos e
pelo emprego da soluo salina ou do formaldedo na diluio e na preservao das fezes e/ou para a fixao rpida ou o exame do material fecal
imediatamente aps a passagem. Alguns protozorios, tais como Entamoeba
coli, podem apresentar fungos no citoplasma (Sphaerita spp.) e no ncleo
(Nucleophaga spp.). A Sphaerita spp. (algumas vezes chamada Polyphaga
spp.) mede aproximadamente 0,5 a 1,0m, com forma de cachos aglomerados 2 .
Flagelados: Os flagelados aquticos de vida livre podem ser identificados nas fezes contaminadas com gua ou na soluo salina e so dificilmente diferenciados dos flagelados entricos. Amostras fecais contaminadas com urina podem conter Trichomonas vaginalis e a urina contaminada
com fezes pode apresentar Trichomonas hominis.
Ciliados: Como as amebas e os flagelados, os ciliados de vida livre so
freqentemente encontrados na gua estagnada, no esgoto e no solo, e podem ser observados no material fecal contaminado com gua e soluo salina.
Os organismos reportados so a Uronema nigricans, Lembus pusillus e o
Balantiophorus minutis (erroneamente chamado Balantidium minutum).
Algumas espcies apresentam-se com caractersticas morfolgicas semelhantes ao Balantidium coli 2.
Coccdios
Cryptosporidium spp.: O C. parvum mede aproximadamente 4 a 6m
de dimetro e se sobrepe em tamanho a diversos elementos, incluindo fungos e artefatos, que so encontrados nas amostras fecais. Os oocistos e os
esporozotos so transparentes e de difcil visualizao em esfregaos nocorados e somente so identificados atravs das coloraes especficas derivadas de Ziehl-Neelsen. Os oocistos so facilmente confundidos com artefatos quando a colorao no foi bem realizada e pela morfologia no
uniforme2.
Isospora belli: Quando a parede cstica da Giardia lamblia se retrai,
o flagelado pode se assemelhar a oocistos da Isospora belli na forma imatura (no esporulados contendo um esporoblasto). Os oocistos maduros depois da excreo se dividem formando dois esporoblastos. Embora seja erro
freqente, a maneira mais fcil de diferenciar os dois organismos pelo
tamanho. Os cistos da G. lamblia medem aproximadamente 11 a 14m de
comprimento por 7 a 10m de largura, enquanto os oocistos da I. belli, 20
a 33m de comprimento por 10 a 19m de largura. Essa situao mostra a importncia da morfometria dos organismos para impedir um diagnstico errado 2.
Microspordios: Os esporos dos microspordios humanos medem aproximadamente 1 a 4m, variando entre 1 e 2m. Os esporos so arredonda Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 6

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dos ou ovais e podem se assemelhar a clulas de leveduras e a bactrias.


Embora os organismos sejam corados pelas modificaes do mtodo do
tricrmico e do Gram-Chromotrope a colorao usualmente plida. O
tamanho dos organismos e a colorao se aproximam com os das leveduras
ou com as bactrias presentes no espcime. A parede dos esporos dos
microspordios apresenta colorao do rosa ao vermelho; entretanto, algumas bactrias e artefatos coram-se de rosa-vermelho. O tamanho e a forma dos outros componentes fecais so de grande importncia na diferenciao dos esporos de outras estruturas. Os esfregaos devem ser preparados
finos para facilitar a penetrao do corante2.
Leishmania e Trypanosoma: Nos esfregaos estirados, corados pelo
mtodo de Giemsa, as formas amastigotas da Leishmania donovani so
encontradas dentro dos moncitos. O material nuclear cora-se em vermelho-prpura-escuro, o citoplasma em azul-claro e o cinetoplasto, quando presente, em azulado-purpreo. As formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi,
com localizao extracelular (mveis no exame direto a fresco) coradas pelo
mtodo de Giemsa, apresentam reaes de colorao semelhantes s da L.
donovani, mostrando um visvel cinetoplasto. A forma amastigota da leishmania
pode assemelhar-se ao Histoplasma capsulatum quando a pequena barra
da estrutura do cinetoplasto no facilmente visvel2.
Helmintos 2
Vermes adultos: Muitas variedades de vegetais parcialmente digeridos ou fibras de frutas so semelhantes na aparncia aos nematides adultos ou a proglotes de tnias. Esse episdio comum com as pessoas nas
quais o tempo do trnsito intestinal diminuiu devido administrao de purgantes. Nematides adultos de vida livre podem ser identificados nas amostras fecais contaminadas com terra ou gua 2.
Ovos de helmintos: Uma multiplicidade enorme de clulas de plantas, algas, gros de plen e condios de fungos so rotineiramente vistos nas
fezes e podem assemelhar-se ao Ascaris lumbricoides, Taenia spp.,
Clonorchis sinensis e a outros ovos de helmintos. Vegetais contaminados
com ovos de insetos ou infectados com nematides de plantas so a principal fonte de ovos com caractersticas similares, no tamanho e na forma, com
as estruturas patognicas. Pode ocorrer e resultar uma infeco espria pela
ingesto de uma grande quantidade de helmintos e de seus ovos por meio
de produtos animais, como, por exemplo, carne de mamferos, de peixes, de
aves ou de outros hospedeiros. Entre outras, so citadas infeces pela
Fasciola hepatica, Dicroelium dendriticum e Capillaria hepatica 2 .
Larvas de helmintos: Diferentes espcies de plantas e plos de razes
mostram uma superficial semelhana no tamanho e na forma com larvas de
nematides. Entretanto, a maioria dessas estruturas vegetais so claras e
refrteis, carecendo de simetria e de rgos internos identificveis.
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148

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Microfilrias: Para assegurar que as solues corantes no estejam


contaminadas com artefatos ou com organismos de vida livre, controlar, quando
possvel, todo o procedimento de colorao antes de usar os diferentes corantes
para o diagnstico da filariose no sangue. Pedaos de fibras de algodo, ciscos
e outros componentes da poeira podem imitar as microfilrias quando corados. Entretanto, os artefatos no contm internamente nenhum ncleo2.
Sangue
Os artefatos presentes em esfregaos estirados e espessos do sangue
podem ser confundidos com parasitos, apresentar resultados imprprios e/
ou um tratamento desnecessrio do paciente. Esses artefatos so usualmente
de dois tipos: a) elementos celulares normais, tais como plaquetas, as quais
podem ser confundidas com parasitos da malria quando superpostos nas
hemcias; b) contaminao com fungos, bactrias ou fibras de celulose durante o procedimento de colorao, os quais podem levar suspeita de uma
fungemia, uma bacteremia ou uma parasitemia por malria ou microfilria.
As plaquetas tendem a uma uniformidade de colorao, no apresentam
estrutura interna, coram-se em vermelho e azul, mas as cores tendem ao
prpura. Outras estruturas internas das hemcias, como os corpos de HowellJoly e anis de Cabot, podem apresentar problemas na identificao1,2.
Artefatos dos Lquidos Orgnicos
A aparncia dos tufos de clios soltos encontrados em uma variedade
de lquidos orgnicos (especialmente lquidos do peritnio e da cavidade
amnitica) tem sido relatada durante anos. Esses tufos so estruturas ciliadas remanescentes do epitlio que ocorrem como parte normal da queda em
uma variedade de rgos (trato respiratrio e seio maxilar, ventrculos do
crebro, lquido cefalorraquidiano e trato geniturinrio do homem e da mulher). No exame direto a fresco, estes tufos de clios variam de 10 a 15m
de dimetro e exibem movimentos rtmicos, podendo ser facilmente confundidos com protozorios ciliados e flagelados, incluindo o Trichomonas spp.,
o Balantidium coli, a G. lamblia e o Chilomastix mesnili. Entretanto, o
exame direto a fresco ou o estudo de preparaes permanentes coradas
mostram pequenas estruturas internas remanescentes desses organismos 2.
Clulas Humanas
As clulas humanas que mais freqentemente causam problemas na
identificao so os neutrfilos polimorfonucleares (PMN) e os macrfagos
(Tabela 6.1) 2.
Polimorfonucleares (PMN): Estas clulas encontram-se presentes em
pacientes com infeco especfica do intestino. Esses elementos devem ser
reportados e quantificados (raros, poucos, moderados e muitos). Grande nmero
de PMN so encontrados em pacientes com disenteria bacilar e podem tambm
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CAPTULO 6

149

Tabela 6.1
Artefatos que se Assemelham com Organismos Parasitos
Material Clnico e Artefatos
Fezes
Amebas de vida livre, flagelados e ciliados
Helmintos de vida livre, ovos de helmintos
ou ovos de insetos
Clulas de leveduras

Bactrias
Fungos
Resduos de plantas
Clulas

Semelhana

Amebas parasitas, flagelados e ciliados


Ovos de helmintos, larvas ou vermes
adultos
Cryptosporidium spp., Cyclospora spp.,
microspordios, ovos de helmintos e
cistos de protozorios
Esporos de microspordios
Ovos de helmintos

Plos de razes
Gros de plen
Cristais em suco de abacaxi

Cistos de protozorios, ovos de


helmintos
Larvas de nematides
Ovos de helmintos (Ascaris ou Taenia)
Cristais de Charcot-Leyden

Clulas humanas
Neutrfilo polimorfonuclear (PMN)
Sangue recm-colhido (clulas frescas)
Sangue velho (clulas desintegradas)
Macrfago
Clulas epiteliais

PMNs normal em esfregao de sangue


Cistos de Entamoeba histolytica
Trofozotos de Entamoeba histolytica
Trofozotos de amebas

Sangue
Plaquetas
Incluses anormais das hemcias (corpos
de Howell-Jelly, anel de Cabot)
Contaminantes
Leveduras
Bactrias
Plantas ou fibras de poeira
Precipitado de corante

Parasitemia fngica
Bacteremia
Microfilrias
Malria, Babesia spp.

Lquidos orgnicos
Tufos de clios desintegrados

Protozorios ciliados ou flagelados

Espcimes do trato respiratrio


Leveduras
Urina
Trichomonas hominis (contaminada
com fezes)
Bactrias

Parasitos da malria, Babesia spp.


Parasitos da malria, Babesia spp.

Pneumocystis carinii, Cryptosporidium


spp.
Trichomonas vaginalis
Esporos de microspordios

Adaptado de Garcia e Bruckner, 19972.

estar presentes em pacientes com amebase intestinal e colite ulcerativa. Estas


clulas devem ser diferenciadas da Entamoeba histolytica 2.
Macrfagos: Os macrfagos (moncitos) so clulas grandes, mononucleares e as clulas fagocitadas assemelham-se aos trofozotos da E.
histolytica. Esses elementos celulares podem ser encontrados em pacientes com amebase intestinal e colite ulcerativa e devem ser diferenciados
da ameba 2.
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150

CAPTULO 6

Eosinfilos: A identificao dos eosinfilos no material fecal usualmente


indica a presena de uma resposta imune do hospedeiro. Esta resposta alrgica
pode ser causada por uma infeco parasitria ou por outros antgenos, tais
como plen ou alimentos. Os eosinfilos possuem o mesmo tamanho dos PMN
e so caracterizados pela presena de grandes grnulos corados em prpura (tricrmico) e usualmente com ncleo bilobado, o qual pode estar obscurecido por grnulos2.
Linfcitos: Os linfcitos apresentam um grande e denso ncleo corado em negro rodeado por um escasso citoplasma. Eles so aproximadamente 2/3 em tamanho dos PMN.
Hemcias: Em preparaes concentradas (material fecal) podero estar
presentes algumas hemcias. Estas clulas medem aproximadamente 7,5m
(nas preparaes a fresco) e quando presentes nas fezes so uma indicao de lcera (parastica ou no-especfica) ou de outro problema vascular
ou hemorrgico. Em esfregaos corados pelo mtodo do tricrmico as hemcias apresentam-se redondas ou alongadas (distoro pode ocorrer durante a preparao do esfregao) coradas em vermelho-prpura. Elas no
apresentam grnulos ou incluses e algumas so menores de 7,5m2.
Cristais de Charcot-Leyden
Os cristais de Charcot-Leyden (CL) so formados pela desintegrao
dos produtos dos eosinfilos e dos basfilos, podendo estar presentes nas
fezes ou no escarro, sozinhos ou juntos com os eosinfilos. Os cristais so
estruturas finas com as extremidades pontiagudas; pela colorao do tricrmico
coram-se em vermelho-prpura. No mesmo material fecal podero ser vistos vrios cristais de CL com diferentes tamanhos. A presena dos cristais
indica uma resposta imune, mas a causa principal atribuda a uma infeco parasitria. A presena dos eosinfilos e/ou dos cristais de CL nas fezes pode no estar correlacionada com o aumento da eosinofilia na corrente sangnea. A identificao de cristais de CL nos lquidos orgnicos e nas
secrees considerada como um indicador de eosinofilia associado a uma
inflamao alrgica. Cristais semelhantes aos de CL so encontrados no suco
do abacaxi, na fruta fresca, conservada e/ou enlatada2.
Elementos No-humanos Encontrados nas Fezes
(Clulas de Leveduras)
Inmeras clulas de leveduras redondas e ovais, medindo aproximadamente 4 a 8m, podem ser encontradas no material fecal. No exame direto
a fresco esses organismos assemelham-se a pequenos cistos (Endolimax
nana ou Entamoeba hartmanni) apresentando uma colorao irregular (do
vermelho ao verde pelo corante tricrmico), sem mostrar incluses. Entretanto, quando presentes, essas incluses assemelham-se ao cariossoma dos
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pequenos protozorios. A pesquisa de leveduras em brotamento e/ou de pseudohifas de extrema importncia (os espcimes frescos preservados imediatamente aps a colheita apresentam grande relevncia clnica). A presena de pseudomiclios pode ser uma indicao de patogenicidade de um
determinado fungo (usualmente Candida spp.). Um grande nmero de leveduras em brotamento em espcimes frescos ou preservados indica uma
potencial fonte de infeco sistmica, particularmente em pacientes imunocomprometidos2.
Infeces Esprias
Infeces esprias ocorrem quando o homem ingere fgado de diferentes animais. Os ovos so digeridos livremente quando o fgado comido,
passando esses estgios inalterados junto com as fezes durante vrios dias.
Inmeros exames parasitolgicos das fezes para a pesquisa de ovos e de
parasitos devem ser realizados para excluir uma infeco verdadeira. Ovos
de Fasciola hepatica, Dicrocoelium dendriticum ou Capilaria hepatica esto
presentes no fgado de bovinos, de ovinos e de roedores, respectivamente.
Ocasionalmente, ovos raros so encontrados nas fezes e podem representar uma infeco espria adquirida pela ingesto de carne de peixes, de
pssaros e de outros animais vertebrados e invertebrados2.
Larvas de Insetos
No comum o encontro de larvas de insetos nas fezes, mas a contaminao ocorre como resultado da ingesto de larvas ou de insetos junto
com os alimentos. A presena de larvas vivas sugere uma miase ou provavelmente uma contaminao do material fecal. Nesta situao importante
saber quando o espcime foi colhido e se foi submetido ao laboratrio fresco ou preservado. Fezes obtidas de privadas (latrinas) no podem ser aproveitadas, no somente devido ao risco de contaminao, mas porque a gua
e a urina poderiam destruir as formas trofozoticas2.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

Faust EC, Beaver PC, Jung RC. Animal Agents and Vectors of Human Diseases. 3rd ed.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1968.

2.

Garcia LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology. 3rd ed. Washington (DC):
ASM Press,1997.

3.

Gradwohl RBH, Kour P. Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. Parasitology and
Tropical Medicine. 4th ed. St. Louis: CV Mosby Co., v.3, 1948.

4.

Insenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington, DC: ASM Press,
v.2, 1992.

5.

Markell EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. 7th ed. Philadelphia: WB Saunders
Co., 1992.

6.

Pessa SB. Parasitologia Mdica. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1967.
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152

CAPTULO 6

7.

Pessa SB, Martins AV. Pessa. Parasitologia Mdica. 11a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982.

8.

Rey L. Parasitologia. 2a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991.

9.

Rey L. Base da Parasitologia Mdica. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1992.

10. Suzuki N. Human Helminth Eggs. Tokyo: JAPC & JOICFP, 1981.

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CAPTULO 6

153

CAPTULO

Expresso dos Resultados no Exame


Parasitolgico das Fezes
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
O resultado do exame parasitolgico das fezes tem como
objetivo cinco propsitos principais: fornecer informaes teis
ao diagnstico; servir como guia para o tratamento; acompanhar e
determinar a eficincia do tratamento; trazer informaes de valor
para estudos epidemiolgicos; e fornecer os elementos bsicos para
corrigir as deficincias nos programas de profilaxia do meio ambiente. Todos os parasitos patognicos ou no-patognicos
devero ser reportados nos seus nomes cientficos, dando
nfase ao estgio de diagnstico identificado.
Os nomes cientficos obedecem s regras de nomenclatura binria, sendo formados por um nome genrico e um nome
especfico. Os nomes cientficos so sempre grifados, ou
escritos em itlico ou em negrito 4. Exemplos:
Ovos de Ascaris lumbricoides,
Ovos de Ascaris lumbricoides, ou
Ovos de Ascaris lumbricoides.
Cistos de Giardia lamblia,
Cistos de Giardia lamblia, ou
Cistos de Giardia lamblia.

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Larvas de Strongyloides stercoralis,


Larvas de Strongyloides stercoralis, ou
Larvas de Strongyloides stercoralis.
Quando no forem encontrados parasitos no exame, o resultado dever ser referido como:
No foram vistos ovos, larvas e cistos de parasitos
ou
No foram vistos ovos, larvas e cistos de parasitos no material
enviado.
Todos os helmintos so estimados como patognicos ou potencialmente
patognicos. Entretanto, alguns protozorios intestinais so considerados como
comensais ou no-patognicos. Mesmo assim, os estgios de diagnstico desses
parasitos devero ser referidos no resultado enviado ao clnico. Eventualmente protozorios, em especial as amebas, quando no forem especificamente identificados, devero ficar por um determinado tempo sem um diagnstico definitivo, pois um resultado equivocado no poder ser informado
ao clnico.
A Entamoeba histolytica usada para designar a existncia de
zimodemos patognicos, enquanto que E. dispar agora usada para
designar a existncia de zimodemos no-patognicos. Entretanto,
apesar de os trofozotos (E. histolytica) conterem hemcias ingeridas,
os dois organismos no podem ser diferenciados tomando como base
a morfologia no estudo de esfregaos fecais permanentes corados 1,2.
Recomendam-se os seguintes laudos:
Organismos semelhantes a Entamoeba histolytica
ou
Ameba com caractersticas morfolgicas semelhantes a Entamoeba
histolytica
ou
Ameba no identificada presente no material enviado.
Uma observao poder acompanhar os resultados enviados ao clnico:
Ameba em identificao atravs de colorao permanente (hematoxilina frrica ou pelo tricrmico)
ou
Trofozotos de Entamoeba histolytica/E. dispar.

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Trofozotos, cistos, oocistos e esporos de protozorios, ovos e larvas de


helmintos tambm podero apresentar problemas na sua identificao e,
conseqentemente, o resultado dever ser o seguinte:
Flagelados e/ou ciliados no identificados.
Ovos e/ou larvas de nematides no identificados.
Ovos de cestides e de trematdeos no identificados.
Oocistos de coccdios no identificados.
Esporos de microspordios no identificados.
Existe unanimidade entre os autores nas informaes que devero constar
nos resultados a serem enviadas ao clnico, como gnero e espcie e estgio de diagnstico (ovos, larvas, cistos, oocistos e/ou esporos). Quanto
quantificao, alguns parasitologistas so de opinio que as infeces pelos
trematdeos intestinais devero ser expressas quantitativamente, e tambm
quando forem encontrados e identificados os parasitos Trichuris trichiura
e Blastocystis hominis 1,2,3. No resultado deve constar se a tcnica usada
ou no indicada para a pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis (Fig.
7.1).

EXAME PARASITOLGICO DAS FEZES


Paciente ___________________________________Data_______
Mdico____________________________________N.__________
RESULTADO
Positivo
Ovos de Ascaris lumbricoides
Larvas de Strongyloides stercoralis
Cistos de Giardia lamblia
Negativo
No foram vistos ovos, larvas e cistos de parasitos.
Observao: A tcnica usada no indicada para a pesquisa de ovos
de Enterobius vermicularis.
Fig. 7.1 Modelo de laudo para o exame parasitolgico das fezes.

CAPTULO 7

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157

EXPRESSO

DOS

RESULTADOS

Exame Macroscpico
1.
2.
3.
4.

Vermes adultos de Ascaris lumbricoides.


Vermes adultos de Enterobius vermicularis.
Proglotes grvidas de Taenia saginata.
Sangue fresco presente no material fecal.

Observaes
1. Informar a presena de helmintos adultos ou pedaos de vermes e
de sangue fresco no material fecal.
2. A morfologia e o tamanho so importantes fatores para a identificao dos espcimes adultos de E. vermicularis, A. lumbricoides e proglotes
de tnias.
Exame Microscpico
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Trofozotos de Giardia lamblia.


Cistos de Entamoeba coli.
Ovos de Ascaris lumbricoides.
Larvas de Strongyloides stercoralis.
Oocistos de Isospora belli.
Oocistos de Cryptosporidium parvum.
Moderada presena de cristas de Charcot-Leyden.
Regular presena de hemcias.
Moderada presena de neutrfilos polimorfonucleares.

Observaes
1. Os artefatos e/ou outras estruturas podero ser observadas e identificadas (os cristais e as clulas devem ser quantificados; entretanto, a
quantificao avaliada quando os esfregaos permanentes corados so
examinados, aumento 1.000X) (Tabelas 7.1 e 7.2).
2. Quantificar o nmero de Blastocystis hominis (raros, poucos, moderados e muitos). No quantificar os outros protozorios.
3. Anotar e quantificar a presena de clulas humanas.
4. Informar e quantificar as clulas de levedura (exemplo: moderadas
clulas de levedura em brotamento e poucas pseudo-hifas).
5. A Tabela 7.1 pode ser usada para a quantificao de esfregaos
permanentes corados, com lente de imerso (objetiva de 100X, aumento total
1.000X).

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6. Apesar de alguns autores terem mudado a espcie para Giardia


intestinalis ou Giardia duodenalis, no existe, entretanto, concordncia entre
os parasitologistas. Por essa razo, o registro do protozorio mantido como
Giardia lamblia.
7. Para a quantificao de protozorios e helmintos poder ser usada
a Tabela 7.2.
ANEXO

PARASITOS DO SANGUE, DO TRATO GENITURINRIO E EXAME


P ROTOZORIOS

DE

Parasitos do Sangue
1.
2.
3.
4.
5.

Trofozotos e gametcitos de Plasmodium falciparum.


Trofozotos, gametcitos e esquizontes de Plasmodium vivax.
Tripomastigotas de Trypanosoma cruzi.
Amastigotas de Leishmania donovani.
Microfilrias de Wuchereria bancrofti.

Observaes
1. Informar o gnero e a espcie da microfilria presente.
2. Quando as caractersticas morfolgicas forem insuficientes para
permitir a identificao do gnero e/ou da espcie, o resultado deve ser
reportado como segue:
Presena de microfilria com bainha.
Presena de microfilria sem bainha.
Presena de microfilria.
Parasitos do Trato Geniturinrio
Presena de Trichomonas vaginalis.
No foram vistos Trichomonas vaginalis.

Tabela 7.1
Quantificao de Parasitos, Clulas Humanas, Leveduras e Artefatos1

Quantidade

Nmero por 10 Campos com Objetiva de


Imerso (100X)

Poucos
Moderados
Muitos

2
3-9
10

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Tabela 7.2
Quantificao dos Organismosa1
Quantificao
Quantidade

Protozorios

Helmintos

Raros
Poucos
Moderados
Muitos

2-5/pl b
1/5-10 plga
1-2/plga a -3 plga
Vrios/plga

2-5/plc
1/5-10 plpa
1-2/plpa
Vrios/plpa

Essa quantificao (baseada em lamnula 22 x 22mm) usada pelo Centers for Disease
Control and Prevention Proficiency Testing Program (EUA), Microbiology-Parasitology, 1985.
Abreviaes: pl. = pesquisa em lamnula de 22 x 22mm; plga = pesquisa total do campo
microscpico (aumento 400X); plpa = pesquisa total do campo microscpico com pequeno
aumento (100X).
b
Pesquisa total do campo microscpico com grande aumento (400X).
c
Pesquisa total do campo microscpico com pequeno aumento (100X).

Observaes: No reportar o estgio do organismo, quando no for


conhecida a forma cstica, somente a trofozotica.
Exame Cultural de Protozorios
Presena de Entamoeba histolytica.
No foi isolada Entamoeba histolytica.
Positivo para Trichomonas vaginalis.
Positivo para Leishmania spp.
Negativo para Leishmania spp.
Positivo para Trypanosoma cruzi.
Negativo para Trypanosoma cruzi.

REVISO: FORMA CORRETA DE EXPRESSAR OS


RESULTADOS
1. Todos os parasitos patognicos ou no-patognicos devem ser reportados nos seus nomes cientficos, dando nfase ao estgio de diagnstico identificado.
2. Os nomes das espcies seguem a nomenclatura binria, sendo formados por um nome genrico e um nome especfico. Os nomes cientficos so sempre grifados, ou escritos em itlico ou em negrito.
3. Geralmente os protozorios e os helmintos no so quantificados. Entretanto, o estgio de diagnstico especfico (por exemplo: trofozotos,
cistos, oocistos, esporos, ovos e larvas) deve ser indicado.
4. Excees quanto quantificao seriam para o Blastocystis hominis
(existe uma associao entre o nmero e os sintomas) e o Trichuris
trichiura.

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5. Cristais de Charcot-Leyden devem ser informados e quantificados.


6. Quando os espcimes so frescos ou recentemente preservados, as
leveduras devem ser mencionadas e quantificadas.
7. A Entamoeba histolytica usada para designar a existncia de
zimodemos patognicos, enquanto que E. dispar agora usada para
designar a existncia de zimodemos no-patognicos. (A tendncia moderna voltar a essa concepo dualista, revalidando o nome E. dispar
para a espcie no-patognica5.)

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

Garcia LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology. 3rd ed. Washington (DC):
ASM Press, 1997.

2.

Garcia LS. Pratical Guide to Diagnostic Prarasitology. Washington (DC): ASM Press,
1999.

3.

Insenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM


Press, v.2, 1992.

4.

Neves DP. Parasitologia Humana. 10a ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2000.

5.

Rey L. Dicionrio de termos tcnicos de Medicina e Sade. Rio Janeiro: Guanabara Koogan,
1999.

CAPTULO 7

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161

2
Exame de Aspirados,
dos Tecidos, da Urina,
das Secrees e de
Material de Bipsia

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164

CAPTULO 8

CAPTULO

Exame de Outros Espcimes do Trato


Intestinal e Sistema Urogenital
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
Uma variedade de procedimentos so indicados para a identificao e diagnstico dos parasitos na regio perianal (fita
gomada), no intestino delgado (aspirado duodenal), no intestino
grosso (sigmoidoscopia), no estmago (endoscopia) e no sistema urogenital. Entretanto, existe a possibilidade dos parasitos
ocorrerem em outros locais, diferentes de seu hbitat usual.
PESQUISA DE ENTEROBIUS VERMICULARIS
Os vermes adultos de E. vermicularis vivem no ceco, clon, apndice e na regio anal. A maioria dos autores afirmam
que as fmeas grvidas no realizam ovoposio. Os ovos so
libertados pelo rompimento (ao mecnica) ou dessecao do
parasito. Faust e Russell22 relataram que os ovos so detectados nas fezes em no mais de 5% dos indivduos infectados.
Como os ovos so depositados fora do corpo, na regio perianal,
o diagnstico realizado atravs dos swabs anais. Hall34 descreveu o swab anal NIH (National Institute of Health) e mostrou sua superioridade sobre os outros processos de diagnstico. Graham32 reportou o mtodo da fita de celofane adesiva e
transparente, o qual foi modificado por Jacobs 41 e Beaver 5 e
introduzido na rotina do diagnstico dessa parasitose por Brooke,
Donaldson e Mitchell 6. Os swabs anais so indicados para a
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CAPTULO 8

165

pesquisa na regio anal e perianal de ovos de E. vermicularis e com menos


freqncia ovos de Taenia spp. Os mtodos usados para a identificao
dos ovos de E. vermicularis so: o mtodo modificado da fita de celofane
adesiva e transparente 5,6,34,41 , e o mtodo do swab da vaselina-parafina
(VASPAR) 61 .

MTODO DA FITA DE CELOFANE ADESIVA E TRANSPARENTE


O mtodo da fita de celofane adesiva e transparente de Brooke,
Donaldson e Mitchell 10 foi desenvolvido para o diagnstico de ovos de E.
vermicularis e, eventualmente, de ovos de Taenia spp.
Amostra e Colheita
Os ovos so mais facilmente colhidos se o exame for realizado algumas horas aps o paciente ter se deitado, ou pela manh, antes de defecar
ou banhar-se. A colheita deve ser realizada em dias consecutivos (no mnimo uma srie de quatro a seis colheitas) antes que o paciente venha a ser
considerado livre da infeco.
Reagentes
1. Fita de celofane adesiva e transparente (sinonmia: fita Durex
ou Scotch tape; no usar fita Magic transparente).
2. Toluol (tolueno) (C7H8), ou xilol (xileno) (C8H10) ou iodo-xilol.
Preparao e Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar um pedao da fita de celofane adesiva e transparente (fita
gomada transparente), com 12cm de comprimento e 20mm de largura, em
uma lmina de microscopia. Colocar etiquetas (1,0 x 2,5cm) nas extremidades da fita que excedam o tamanho da lmina (Fig. 8.1A).
3. Para obter a amostra da regio perianal, retirar a fita celofane adesiva da lmina e fazer com que esta contorne um abaixador de lngua de
madeira, ficando a superfcie gomada voltada para fora (Fig. 8.1B).
4. Pressionar firmemente o swab anal contra as pregas da direita e da
esquerda da regio anal e perianal (Fig. 8.1C).
5. Recolocar a fita de celofane adesiva na lmina, com a face gomada
para baixo, evitando a formao de pregas ou bolhas (Fig. 8.1D, E).
6. Identificar a etiqueta com o nome do paciente, nmero do exame e
data.
7. Levantar cuidadosamente a fita gomada e colocar uma gota de tolueno,
ou xileno, ou iodo-xilol, e pressionar a fita sobre a lmina. A preparao ficar
clara ou levemente corada pelo iodo-xilol, tornando os ovos bem visveis.
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166

CAPTULO 8

Examinar a lmina com pequeno aumento (10X ou 15X) e com baixa intensidade luminosa.
Se os ovos no forem encontrados na rea central, examinar toda a
preparao antes de reportar que no foram vistos ovos de parasitos.
Controle de Qualidade (CQ)
1. O laboratrio dever manter lminas permanentes com ovos e vermes adultos de E. vermicularis para comparar a morfologia. Desenhos e
fotografias do parasito devero tambm estar disposio do pessoal tcnico para que possa ser estabelecida a comparao com os espcimes clnicos.
2. Participar de programas de controle de qualidade que incluam parasitos desconhecidos.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
4. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle12.
Observaes
1. Como os ovos so depositados fora do corpo, esporadicamente na
regio perianal, o diagnstico realizado atravs dos swabs anais.
2. Os ovos do E. vermicularis so parcialmente embrionados quando
depositados, completando rapidamente o seu desenvolvimento para larvas
infectantes de primeiro estdio em quatro a seis horas. Freqentemente, no
momento da colheita pela fita de celofane adesiva e transparente os ovos
esto completamente embrionados.
3. Quando as fmeas libertam seus ovos no ceco ou no apndice, eles
so encontrados na superfcie da massa fecal. Quando um exame direto a
fresco for preparado com fezes dessa rea, um grande nmero de ovos poder
ser encontrado nesse local especfico, o que no ocorre em outras reas do
bolo fecal. Por essa razo, esfregaos a fresco e, igualmente, tcnicas de
concentrao no so recomendados para o diagnstico de rotina da
enterobase.
4. Sem a colheita de mltiplos esfregaos perianais (colhidos consecutivamente a cada manh) no possvel determinar se o paciente positivo
ou negativo para a infeco.
5. Ocasionalmente, familiares trazem para a identificao um verme adulto
colhido da regio perianal ou da superfcie das fezes. A identificao do verme
adulto (quase sempre uma fmea) confirma a infeco.
6. Quando as preparaes forem estocadas antes do exame, no adicionar tolueno ou xileno at o momento da pesquisa, pois um contato prolongado com os reagentes poder causar uma degenerao dos organismos. Antes
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CAPTULO 8

167

do exame as lminas podero ser armazenadas no refrigerador, por vrios


dias ou semanas, sem degradao dos ovos.
7. Atravs desse mtodo, alm dos ovos tpicos, podem ser vistos uma
ou duas fmeas de Enterobius e, eventualmente, ovos de Taenia spp. (Fig.8.1).
8. Antes de considerar o paciente livre de infeco devero ser realizados quatro ou seis exames em dias consecutivos. Os adultos colhidos da
regio perianal ou da superfcie das fezes confirmam a infeco.
9. Quando os ovos no forem encontrados na rea central, examinar
toda a preparao antes de reportar que no foram vistos ovos ou adultos
do parasito.
10. Quando a fita de celofane adesiva e transparente estiver opaca e
foi usada para a colheita, colocar uma gota do leo de inverso sobre ela,
ficando a fita suficientemente clara para prosseguir o exame microscpico.
11. A lmina de microscopia com a fita de celofane adesiva e transparente com ovos infectantes deve ser transportada com cuidado, desde que

Fig. 8.1 Mtodo da fita de celofane adesiva e transparente para a colheita de ovos de
Enterobius vermicularis. (Adaptada de Ash LR, Oriehl TC. Parasites: A Guide to Laboratory
Procedures and Identification. Chicago (Ill): ASCP Press, 1991.)

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168

CAPTULO 8

esses espcimes representam uma fonte em potencial de infec o 2 , 1 2 , 2 9 , 3 0 , 6 1 ,64 .

MTODO DO SWAB

DE

VASELINA E PARAFINA (VASPAR)

O mtodo do VASPAR foi desenvolvido por Markey61 para o diagnstico


de ovos de Enterobius vermicularis e, eventualmente, ovos de Taenia spp.
Amostra e Colheita
Os ovos so mais facilmente colhidos se o exame for realizado algumas horas aps o paciente ter se deitado, ou, pela manh, antes de defecar
ou banhar-se.
Reagentes
1. Parafina lquida
2. Vaselina lquida
3. Xilol (xileno) (C8H 10)
Preparao e Mtodo
1. Mergulhar o swab de algodo em mistura de quatro partes de vaselina e uma parte de parafina (4:1).
2. Colocar o swab de algodo revestido com a camada de vaselinaparafina em tubo de ensaio (13 x 100mm) fechado com uma bucha de algodo. Armazenar no refrigerador (3-5C).
3. Esfregar sutilmente o swab na superfcie perianal e introduzir pequena poro no orifcio anal.
4. Repor o swab no tubo.
5. Encher 1/3 do tubo com xilol ou com quantidade suficiente para cobrir
o swab. Deixar em repouso por cinco minutos.
6. Remover o swab e centrifugar (500 x g/1min).
7. Com pipeta capilar, colher o sobrenadante. Transferir vrias gotas
para uma lmina de microscopia. No necessrio cobrir a preparao com
lamnula. Para evitar a expanso do material em uma grande rea, colocar
as gotas no centro de um anel desenhado com lpis de cera e examinar
imediatamente. O anel pode ser dissolvido com o xilol.
Controle de Qualidade (CQ)
1. O laboratrio dever manter lminas permanentes com ovos e vermes adultos de E. vermicularis para comparar a morfologia. Desenhos e
fotografias do parasito devero tambm estar disposio do pessoal tc Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 8

169

nico para que possa ser estabelecida a comparao com os espcimes clnicos.
2. Participar de programas de controle de qualidade que incluam parasitos desconhecidos.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
4. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle12.
Observaes
1. As fmeas do E. vermicularis depositam esporadicamente os ovos
na regio perianal.
2. Sem a colheita de mltiplos esfregaos perianais (colhidos, consecutivamente, a cada manh) no possvel determinar se o paciente positivo ou negativo para a infeco.
3. Ocasionalmente, familiares trazem para a identificao um adulto colhido
da regio perianal ou da superfcie das fezes.
4. A identificao do verme adulto (quase sempre uma fmea) confirma a infeco. Os ovos do E. vermicularis so usualmente infectantes.
5. O swab de vaselina e parafina (VASPAR) uma alternativa de
segurana.
ASPIRADO DUODENAL
O estudo do lquido duodenal um procedimento que revela com freqncia organismos, mesmo quando o exame parasitolgico das fezes negativo.
Por essa razo, quando um diagnstico no pode ser estabelecido pelo exame fecal, dever ser colhido o material de drenagem duodenal. Estudos
comparativos de vrias tcnicas usadas para o diagnstico da giardase
mostraram que o exame do fluido duodenal mais seguro do que o exame
das fezes no diagnstico dessa infeco. O contedo duodenal dever ser
estudado nos casos suspeitos, quando o parasito no encontrado nas fezes, depois de um razovel nmero de exames coprolgicos. Um nmero maior
de casos detectado quando so combinados os resultados de um aspirado
duodenal e os de mltiplos exames das fezes. A G. lamblia pode ocasionalmente ser encontrada nas fezes, quando no diagnosticada no aspirado
duodenal. Este fato enfatiza o ponto de que o exame do fluido duodenal poder
complementar, mas no substituir, o exame das fezes. A centrifugao do
lquido duodenal aumenta a sensibilidade do exame2,29,30.

MTODO

DA

C PSULA D UODENAL (ENTERO TEST)

Diagnstico de larvas de Strongyloides stercoralis, trofozotos de


Giardia lamblia, oocistos de Isospora belli e Cryptosporidium parvum,
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CAPTULO 8

ovos de Fasciola hepatica e, raramente, ovos de Clonorchis sinensis e


Opisthorchis viverrini.
A tcnica da cpsula duodenal (Entero Test)4,83, produzida pela Health
Development Corporation, 2411 Pulgas Avenue, Palo Alto, Califrnia, EUA,
um novo procedimento para a colheita do contedo duodenal com o mximo de simplicidade e o mnimo de desconforto para o paciente. Diversos
autores4,30,50 mostraram que esse mtodo comparvel em eficincia com
intubao duodenal para a recuperao dos trofozotos de G. lamblia. Esse
dispositivo consiste de um fio de nilon, com 140cm de comprimento para
adultos e 90cm para crianas, unido a uma esfera de metal com 1g de peso,
embebida em borracha de silicone. O fio fica enrolado dentro de uma cpsula de gelatina (nmero 00) revestida com borracha de silicone, tendo uma
das extremidades livre (Fig. 8.2). A ponta livre do fio fixada com esparadrapo no rosto do paciente. A cpsula administrada via oral, com o paciente em jejum. A gelatina se dissolve no estmago e o fio, com o peso, chega
por peristalse ao duodeno. Em mais de 90% dos casos relatados, a linha fica
completamente distendida em quatro horas. Aps, o fio gentilmente retirado pela ponta livre. Usualmente, a metade da parte distal da linha saturada
com muco corado com bile. Normalmente, so obtidas quatro a cinco gotas
de material duodenal. A amostra deve ser examinada imediatamente pelo
exame direto a fresco para a pesquisa de organismos mveis. A soluo de
iodo dever ser adicionada preparao, para facilitar a identificao dos
parasitos, ou preservada em soluo de formaldedo a 5% ou 10%. O pH
da extremidade distal deve ser controlado para garantir a passagem ao duodeno.
Usar luvas durante todas as etapas do procedimento. Os espcimes so
examinados pelo exame direto a fresco ou atravs de preparaes permanentes coradas 4,14,28,29,50,80,88 .
Reagentes
1. Fixador de Schaudinn (ver p. 11)
2. Fixador lcool polivinlico (fixador-APV) (ver p. 14)
3. Soluo de formaldedo a 10% (ver p. 9)
Colheita da Amostra
1. O mdico deve informar ao laboratrio quando a cpsula foi engolida
pelo paciente. O fio de nilon fica completamente distendido em quatro horas.
Aps, o fio gentilmente retirado pela ponta livre, sendo cuidadosamente
colocado em um recipiente seguro com tampa e transportado em um saco
de plstico. No usar placa de Petri porque a tampa no atarraxada.
2. O espcime deve ser transportado imediatamente ao laboratrio e
examinado dentro de uma hora.
3. Para manter a linha mida, caso haja atraso no transporte do material
ao laboratrio, adicionar pequena quantidade de soluo salina fisiolgica.
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CAPTULO 8

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Procedimento
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Registrar a cor do fio. A colorao amarela da bile indica que a linha atingiu o duodeno.
3. Colher todo o muco aderido linha em um tubo com tampa de rosca
(screw-capped), comprimindo o fio do meio at o fim com leve presso entre
as pontas de uma pina.
4. Usualmente a metade da parte distal da linha saturada com muco
corado com bile. Normalmente, so obtidas quatro a cinco gotas de material duodenal.
5. Colocar uma gota do muco entre lmina e lamnula (22 x 22mm).
6. Adicionar uma gota da soluo salina a 0,85% caso o muco esteja
muito viscoso. Para a pesquisa de larvas ou de trofozotos mveis, examinar toda a preparao com aumento de 100X, observando cuidadosamente
o muco onde a G. lamblia pode estar enredada.
7. Quando houver suficiente material, preparar esfregao permanente
corado, mergulhando a preparao no fixador de Schaudinn. Caso esse procedimento no seja possvel, colocar a lmina do exame direto a fresco diretamente no fixador de Schaudinn depositado na cuba de Coplin. A lamnula
flutuar, depositando-se na superfcie do fixador. Aps a fixao, preparar
um esfregao permanente corado. Os tempos de fixao e de colorao so
idnticos aos usados para as amostras fecais (ver Captulo 3).
8. Examinar o muco com grande aumento, j que a G. lamblia mais
facilmente detectada pela agitao dos flagelos do que pela mobilidade.
9. Quando o material contm muito muco ou lquido, misturar diretamente na lmina uma ou duas gotas da amostra com trs a quatro gotas do
fixador APV. Antes da colorao, deixar o esfregao secar temperatura
ambiente por duas horas. Os tempos de fixao e colorao so idnticos
aos usados para as amostras fecais (ver Captulo 3).
10. Para a pesquisa de C. parvum e I. belli preparar vrias lminas
com gotas do muco, corando aps os esfregaos com um dos corantes derivados de Ziehl-Neelsen.
11. Examinar as preparaes permanentes coradas com objetivas de
imerso (97 a 100X), com o mximo de intensidade luminosa.
12. Quando larvas de Strongyloides estiverem presentes, preservar o
restante do material em soluo de formaldedo a 10%, para propsitos de
ensino e de treinamento 14,29,30,61.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Verificar o CQ do lquido de Schaudinn, fixador APV e soluo de
formaldedo a 10%.
2. Controlar semanalmente os preservadores ou quando for usado um
novo nmero de lote dos reagentes. Os preservadores devem estar claros
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CAPTULO 8

sem contaminao visvel. Para testar a eficcia dos preservadores, usar fezes
frescas positivas para protozorios ou negativas para parasitos misturados
com leuccitos. Cultura de protozorios tambm pode ser empregada no CQ.
3. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
4. Slides coloridos, fotografias e livros de referncia devem estar
disposio no laboratrio de Parasitologia.
5. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle14.
Observaes
1. Muitos organismos so identificados no muco; por essa razo, de
extrema importncia examinar o espcime com grande aumento (400X) e
com baixa intensidade luminosa, para que a agitao dos flagelos da G. lamblia
possa ser identificada.
2. Quando o material colhido do duodeno, atravs da cpsula Entero

Test normalmente examinado em preparaes a fresco, alguns organismos (C. parvum e I. belli) no so identificados sem a preparao de
esfregaos permanentes corados (Fig. 8.2).
3. As coloraes do tricrmico e da hematoxilina frrica so usadas
para a identificao de trofozotos de protozorios.
4. Os oocistos no apresentam bons resultados na identificao com
os corantes de rotina. Usar coloraes adicionais quando um organismo suspeito

Fig. 8.2 Cpsula duodenal Entero Test para a colheita do contedo duodenal (Segundo
Burke JA. The clinical and laboratory diagnosis of giardiasis. CRC Cr Rev Clin Lab Sci,
7:373-391, 1977).

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CAPTULO 8

173

observado. Os oocistos de C. parvum e I. belli so identificados atravs


de esfregaos permanentes corados pelos derivados de Ziehl-Neelsen (ver
Captulo 10).
5. Os ovos e larvas de helmintos no so facilmente identificados nos
esfregaos permanentes corados, mas so visveis pelo exame direto a fresco.
6. Quando os resultados so negativos atravs do exame direto a fresco, realizado antes do exame dos esfregaos permanentes corados, o relatrio enviado ao mdico considerado preliminar (baseado somente no exame
direto).
7. Quantificar os ovos do C. sinensis quando o organismo for eventualmente identificado. Os protozorios, em geral, no so quantificados no
relatrio enviado pelo laboratrio ao mdico (exceo: Blastocystis hominis);
entretanto, as clulas humanas, as clulas de levedura e os artefatos, como
cristais de Charcot-Leyden, so normalmente informados e quantificados 14,29,30 .
SIGMOIDOSCOPIA
O material obtido pela sigmoidoscopia trouxe a oportunidade de diagnosticar e monitorar o curso da amebase e da esquistossomose por
Schistosoma mansoni. Quando o exame das fezes negativo para casos
suspeitos de amebase, as amostras podero ser obtidas do intestino pela
retossigmoidoscopia. Entretanto, a sigmoidoscopia no substitui o exame
parasitolgico das fezes. Todo paciente, antes de ser submetido a essa conduta, dever realizar no mnimo trs exames de fezes para a confirmao
do diagnstico. No mnimo seis reas da mucosa devero ser colhidas e
examinadas. As amostras devero ser processadas ou fixadas imediatamente
aps a colheita. Os procedimentos indicados para o diagnstico so: a) exame direto a fresco; b) colorao pela hematoxilina frrica ou tricrmico e
c) imunofluorescncia direta (monoclonais) (IFD) ou enzima imunoensaio (EIE).
As principais vantagens da bipsia da mucosa retal para o diagnstico da
esquistossomose por Schistosoma mansoni so: a) maior sensibilidade do
mtodo; b) capacidade de determinar a viabilidade dos ovos pela observao dos movimentos das larvas e c) verificao rpida do efeito da quimioterapia 29,30,60 .

MATERIAL

DE

SIGMOIDOSCOPIA: E XAME DIRETO

F RESCO

Diagnstico de trofozotos de Entamoeba histolytica e ovos de


Schistosoma mansoni.
O primeiro exame das amostras deve ser feito por meio de esfregaos
salinos. O exame direto a fresco usado para diagnosticar parasitos mveis que vivem no clon (E. histolytica). As amostras devem ser colhidas
de reas especficas com ulceraes e, na ausncia de leses especficas, colher
da mucosa ao acaso. Examinar o esfregao com pequeno aumento (100X)
para a presena de trofozotos mveis e/ou clulas humanas. Com grande
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174

CAPTULO 8

aumento (400X) os organismos so identificados pelo tamanho, nmero e


estrutura do ncleo, pela aparncia do citoplasma e motilidade (somente nas
preparaes salinas). A soluo salina a 0,85% apresenta resultados
satisfatrios na preparao de esfregaos, os quais so considerados preliminares. Os organismos nunca devem ser identificados tomando como referncia somente uma preparao direta a fresco; esfregaos com colorao permanente devero ser examinados para que seja estabelecida a
caracterizao morfolgica e a identificao especfica do organismo em estudo 26,30,60,64 .
Amostra e Colheita
Os espcimes colhidos so: o revestimento da mucosa, o muco, as fezes e/ou a combinao dos trs. As amostras devem ser colhidas pelo mdico. O exame imediato realizado no quarto do paciente e/ou enviado ao
laboratrio para subseqente exame. A preparao da montagem salina
depende do tipo do espcime. Quando o material transportado ao laboratrio, adicionar ao espcime uma pequena quantidade de soluo salina fisiolgica (0,5 a 1,0ml) para impedir que a amostra desidrate e seque. Os espcimes devem ser transportados imediatamente ao laboratrio aps a colheita,
dentro de um perodo de 30 minutos. Quando os critrios indicados para a colheita
no puderem ser observados, as amostras devero ser preservadas e esfregaos
permanentes corados devero ser preparados e examinados26.
Reagentes
1. Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
2. Soluo de iodo de Lugol ou de DAntoni (ver p. 39)
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar uma ou duas gotas de soluo salina a 0,85% em uma extremidade da lmina de microscopia e uma gota de soluo de iodo (Lugol
ou DAntoni) na outra extremidade.
3. Uma ou duas gotas do espcime misturada na salina e na soluo
de iodo. Cobrir a preparao com uma lamnula (22 x 22mm). A quantidade
da salina ser determinada pelo espcime (menos salina se o material muito
lquido).
4. Examinar a preparao com objetiva de pequeno aumento (10X) e
com pequena intensidade luminosa. Esfregaos com colorao permanente
devem ser examinados para confirmar o diagnstico preliminar27.
Controle de Qualidade (CQ)
1. As solues salina e de iodo devem ser controladas diariamente no
momento do uso. A soluo salina deve estar clara, sem contaminao por
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CAPTULO 8

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bactrias e fungos. A soluo de iodo deve conservar a cor castanho-escuro (ch-da-ndia ou vinho do Porto), apresentando uma correta intensidade
de contraste. Desprezar as solues fracas.
2. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
3. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio, seguir
o plano de ao para resultados fora de controle27.
Observaes
Vrias reas da mucosa devem ser examinadas; recomendada a preparao de seis esfregaos. Este mtodo no indicado como exame de
rotina para a pesquisa de cistos de protozorios e ovos de helmintos.

MATERIAL

DE

SIGMOIDOSCOPIA : ESFREGAOS PERMANENTES CORADOS

Diagnstico de trofozotos e/ou cistos de Entamoeba histolytica e ovos


de Schistosoma mansoni, ovos e larvas de helmintos e oocistos de coccdios.
As coloraes permanentes so usadas para a identificao de trofozotos,
ocasionalmente de cistos e para confirmao das espcies. Essas preparaes so indicadas para diagnosticar parasitos que vivem no clon (E.
histolytica). Colher amostras de reas especficas com ulceraes; na ausncia de leses especficas, colher amostras da mucosa ao acaso. Atravs
do exame de esfregaos permanentes corados (1.000X) so detectados
trofozotos e/ou cistos de protozorios, oocistos de coccdios, ovos e larvas
de helmintos, e/ou clulas humanas. Os esfregaos para a pesquisa de
protozorios so corados pela hematoxilina frrica ou pelo tricrmico, enquanto os coccdios, pelas coloraes derivadas de Ziehl-Neelsen. Esfregaos
permanentes corados devero ser examinados para que seja estabelecida a
caracterizao morfolgica e a identificao especfica do organismo em
estudo 27,30.
Amostra e Colheita
Os espcimes colhidos so: o revestimento da mucosa, o muco, as fezes e/ou a combinao dos trs. As amostras so colhidas pelo mdico. Quando
o material transportado ao laboratrio adicionar ao espcime uma pequena quantidade de soluo salina fisiolgica (0,5 a 1,0ml) para impedir que a
amostra desidrate e seque. Os espcimes devem ser transportados imediatamente aps a colheita ao laboratrio, dentro de um perodo de 30 minutos.
Quando os critrios indicados para a colheita no puderem ser observados,
as amostras devero ser preservadas e esfregaos permanentes corados
devero ser preparados e examinados 27,30.
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CAPTULO 8

Reagentes
1. Fixador de Schaudinn (ver p. 11)
2. Fixador lcool polivinlico (Fixador-APV) (ver p. 14)
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Quando o espcime no contm sangue e/ou muco ou no est mido,
estirar gentilmente uma ou duas gotas do material do paciente sobre uma
lmina de microscopia e mergulhar, imediatamente aps, durante 30 minutos no fixador de Schaudinn. Terminada a fixao, os esfregaos esto prontos
para serem corados, montados e examinados (ver coloraes pela hematoxilina
frrica e pelo tricrmico).
3. Quando o espcime contm sangue e muco e no est mido, colocar trs a quatro gotas do fixador APV em uma lmina de microscopia e
misturar uma ou duas gotas do material colhido do paciente com o fixador.
Preparar um esfregao fino, estirando a mistura sobre um tero da superfcie da lmina e depois coloc-lo na posio horizontal para secar temperatura ambiente (duas horas). Terminada a fixao, os esfregaos esto prontos
para serem corados, montados e examinados (ver coloraes pela hematoxilina
frrica e pelo tricrmico).
4. Examinar no mnimo 300 campos dos esfregaos corados, com
objetiva de imerso (97 a 100X) e com o mximo de intensidade luminosa.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Controlar semanalmente os preservadores ou quando for usado um
novo lote dos reagentes. A eficcia dos preservadores determinada pelo
uso de fezes frescas positivas para protozorios, ou negativas, na qual foram adicionados leuccitos humanos. Culturas de protozorios podem tambm ser usadas.
2. O fixador de Schaudinn deve estar claro e lmpido, sem a flutuao
de detritos ou cristais. O fixador pode ser usado quando alguns cristais precipitam no fundo da cuba de Coplin.
3. O fixador APV deve estar claro e lmpido. O fixador pode ser usado quando alguns cristais precipitarem no fundo da cuba de Coplin.
4. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
5. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle27.
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CAPTULO 8

177

Observaes
1. Os espcimes colhidos pela sigmoidoscopia so indicados para auxiliar na diferenciao entre uma doena inflamatria do intestino e a
amebase.
2. Os espcimes devem ser corados imediatamente aps a colheita, para
preservar a morfologia e impedir a desintegrao dos trofozotos das amebas
e a distoro das clulas humanas.
3. As fezes do paciente devero ser submetidas ao exame parasitolgico
de rotina. Colher, em dias separados, uma srie de trs espcimes em no
mais de 10 dias ou uma srie de seis amostras fecais28,29,30.
ENDOSCOPIA
Diagnstico de larvas de Anisakis spp. e de Phocanema decipiens.
O correto diagnstico e o tratamento da anisaquase gstrica tm sido
facilitados pela gastrofibroscopia, como, tambm, pelos progressos das tcnicas em medicina eletrnica. O aumento do nmero de infeces humanas
est diretamente relacionado com a ingesto de peixe cru (sashimi, sushi,
salada do Tahiti, seviche, herring verde e outros pratos preparados com peixe
cru). Os organismos causadores dessa infeco so os estdios larvais dos
gneros Anisakis, Phocanema e provavelmente outros parasitos. O exame
endoscpico fornece um diagnstico definitivo da anisaquase gstrica40,86.
O diagnstico imunolgico de extrema importncia para a identificao clnica
dessa parasitose. Inmeros procedimentos sorolgicos so usados para o
diagnstico da anisaquase gstrica, como a imunodifuso (Ouchterlony), a
imunoeletroforese (IEF), a imunofluorescncia (RIF), a reao de fixao
do complemento (RFC), a hemaglutinao indireta (HA) e o ELISA. Os
resultados positivos dos testes sorolgicos mostram que a anisaquase est
diretamente relacionada com a sobrevivncia dos vermes no paciente. A
endoscopia recomendada para demonstrar o nematide mergulhado na parede
do estmago. Esse parasito pode ser removido sem a cirurgia. Nessa
helmintase os ovos so facilmente detectados pelo exame parasitolgico das
fezes 40,86 .
SISTEMA UROGENITAL
Diagnstico de ovos de Schistosoma haematobium, trofozotos de
Trichomonas vaginalis, microfilrias de Onchocerca volvulus e Wuchereria
bancrofti.
Secreo Urogenital: O T. vaginalis diagnosticado na secreo
urogenital do homem e da mulher. No homem deve ser examinado tambm
o material uretral, o smen, o sedimento centrifugado da urina matinal, a
secreo prosttica e o material subprepucial. Na mulher, o material usu Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

178

CAPTULO 8

almente colhido na vagina e quando houver sinais clnicos devero ser examinados a uretra, as grandes glndulas vestibulares (ou glndulas de Bartholin)
e as parauretrais 28,39,42,45,54,64 .
Urina: Ovos e larvas de helmintos e alguns protozorios que infectam
o homem so eventualmente diagnosticados na urina, podendo ou no produzir seqelas patolgicas no trato urinrio. O exame do sedimento urinrio
indicado para o diagnstico de infeces causadas pelo T. vaginalis, S.
haematobium e da O. volvulus 2,24,48,49.

TCNICA

DA

TRPLICE C ONCENTRAO

DA

URINA

Reagentes e Material
1. Timerosal (C 9H 9HgO 2SNa).
2. Funil de Baermann de vidro ou de plstico de 10 a 12cm de
dimetro, tendo a haste ligada a um tubo de ltex (5 a 10cm
de comprimento) fechado com uma pina de Mohr (Fig. 4.1a).
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Coletar a urina e marcar o volume. Adicionar 1ml de timerosal para
cada 100ml de urina.
3. Encher o funil, ligado a um tubo de ltex fechado com uma pina de
Mohr, com a urina.
4. Deixar a preparao em repouso durante toda a noite.
5. Abrir a pina e coletar 20 a 30ml da urina e centrifugar (400 x g/3
a 5min).
6. Desprezar o sobrenadante e examinar o sedimento, ao microscpio,
entre lmina e lamnula para a presena de microfilrias2.

TCNICA DA URINA CONCENTRADA PELA CENTRIFUGAO


Diagnstico de trofozotos de T. vaginalis, ovos de S. haematobium e
microfilrias.
Ovos e larvas de helmintos e alguns protozorios que infectam o homem so eventualmente diagnosticados na urina, podendo ou no produzir
seqelas patolgicas no trato urinrio. O exame do sedimento urinrio indicado para o diagnstico de infeces causadas pelo T. vaginalis, S. haematobium 72 e de certas filrias. As microfilrias so diagnosticadas na urina de pacientes com quilria, com infeces macias ou recentemente tratados
com dietilcarbamazina (DEC).
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CAPTULO 8

179

Colheita da Amostra
1. T. vaginalis
O diagnstico realizado na urina recente, preferentemente na primeira mico matinal. A urina deve ser enviada ao laboratrio imediatamente
aps a colheita. O T. vaginalis perde sua mobilidade caracterstica quando
a urina permanece em temperatura ambiente fria ou de refrigerador. O organismo torna-se redondo, imvel e eventualmente morre. Quando o paciente portador de infeco intestinal pelo Trichomonas hominis e a
amostra urogenital foi contaminada com material fecal, um resultado falsopositivo pode ser relatado porque o T. vaginalis e o T. hominis so semelhantes quanto forma (piriforme, ovide ou elipside 30,39,42 (ver Captulo 25).
2. S. haematobium
Os ovos de S. haematobium so detectados com maior freqncia
na urina colhida aps o meio-dia, do que nas primeiras pores matinais.
Quando colhida urina de 24 horas, no usar preservadores. Rejeitar toda
a urina de 24 horas que tiver mais de 48 horas de estocagem. O pico da
ovoposio ocorre entre o meio-dia e as 15 horas. Nas amostras com sangue
e pus, os ovos so observados com maior intensidade na poro terminal
da mico. Sendo a passagem dos ovos do esquistossomo intermitente, as
colheitas das amostras devem ser realizadas durante trs dias consecutivos. Clinicamente importante determinar a viabilidade dos ovos. O sedimento urinrio deve ser examinado para a pesquisa de ovos em preparaes diretas a fresco (aumento de 400X). Ovos de S. mansoni e S.
japonicum so eventualmente identificados na urina. A morfologia desses ovos deve ser examinada com cuidado para estabelecer a identificao
morfolgica das espcies2,30,60,64.
3. Filrias
As microfilrias so diagnosticadas na urina de pacientes com quilria,
com infeces macias ou recentemente tratadas com dietilcarbamazina
(DEC). As microfilrias so identificadas atravs de esfregaos corados
(sedimento urinrio). Quando colhida urina de 24 horas, no usar
preservadores. Rejeitar toda a urina de 24 horas que tiver mais de 48 horas
de estocagem. Quando as microfilrias so diagnosticadas, a identificao
das espcies realizada atravs de esfregaos sangneos espessos corados2,30,60,64 (ver Captulos 18 e 19).
Reagente
1. Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
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180

CAPTULO 8

Controle de Qualidade (CQ)


1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A soluo salina
deve apresentar aparncia clara sem contaminao visvel.
2. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
3. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle9.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Quando colhida urina de 24 horas, deixar a amostra sedimentar
em copo cnico durante duas horas. Decantar com cuidado o sobrenadante.
Aproximadamente 10 a 20ml de sedimento so depositados. Quando recebida a urina da primeira mico matinal, usar toda a amostra.
3. Colocar o sedimento urinrio em um tubo de centrfuga.
4. Centrifugar (500 x g/5min).
5. Decantar o sobrenadante.
6. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, misturar e colher uma pequena poro do sedimento.
7. Colocar uma ou duas gotas do sedimento em uma lmina de microscopia, cobrindo a preparao com uma lamnula.
8. Examinar ao microscpico com aumentos de 100X e 400X2,9.
Observaes
Quando a urina microscopicamente examinada, confirmar se no houve
contaminao fecal pela presena de artefatos, fragmentos de vegetais etc.
Esse tipo de contaminao raro, provavelmente est limitado s amostras
de urina.

TCNICA DA URINA CONCENTRADA PELA MEMBRANA FILTRANTE


(NUCLEPORE)
As microfilrias so diagnosticadas na urina de pacientes com infeces macias ou em pacientes recentemente tratados com dietilcarbamazina
(DEC). Os ovos de S. haematobium tambm so diagnosticados na urina.
As microfilrias e os ovos de S. haematobium so facilmente recuperados
pela passagem da urina atravs de uma membrana filtrante, e observados
pela microscopia ptica2,10,30,68 (ver Captulos18 e 19).
Diagnstico de Ovos de S. haematobium e microfilrias.
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CAPTULO 8

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1. S. haematobium
Os ovos de S. haematobium so detectados com maior freqncia na
urina colhida aps o meio-dia, do que nas primeiras pores matinais. Quando
colhida urina de 24 horas, no usar preservadores. O pico da ovoposio
ocorre entre o meio-dia e as 15 horas. Nas amostras com sangue e pus, os
ovos so observados com maior intensidade na poro terminal da mico.
Sendo a passagem dos ovos do Schistosoma intermitente, as colheitas das
amostras devem ser realizadas durante trs dias consecutivos.
2. Filrias
As microfilrias so diagnosticadas na urina de pacientes com quilria,
com infeces macias ou recentemente tratados com dietilcarbamazina
(DEC). Quando colhida urina matinal ou de 24 horas, no usar preservadores.
Reagentes e Materiais
1. Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
2. Corantes: Giemsa (ver p. 821), hematoxilina de Delafield
(ver p. 396) ou hematoxilina de Harris (ver p. 402)
3. lcool metlico absoluto (CH4O), livre de acetona
4. lcool etlico absoluto (C2H 6O)
5. Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290) (C16H 14O6)
6. Tolueno (C 7H8)
7. Sulfato de alumnio e potssio (almen potssico)
[KAl(SO 4) 2.12H 2O]
8. xido de mercrio II (HgO)
9. cido actico glacial (C2H 4O2)
10. Seringa plstica de 10ml
11. Agulha calibre 25 (0,5 x 16mm)
12. Seringa plstica de 10ml
13. Filtro Nuclepore ou Millipore com 25mm de dimetro
e 8mm, 5mm e 3mm de porosidade
14. Porta-filtro com adaptador para seringa (swinney filter adapter)
15. Resina sinttica (Cytoseal 60).
Hematoxilina de Harris, segundo Mallory 57
Preparao do Corante
Hematoxilina, forma cristalina
1g
lcool etlico absoluto
10ml
Sulfato de alumnio e potssio (almen potssico) 20g

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CAPTULO 8

gua destilada-deionizada
xido de mercrio II
cido actico glacial

200ml
0,5g
3-4 gotas

Misturar os componentes com cuidado, a reao pode ser explosiva.


Dissolver a hematoxilina no lcool etlico e o almen potssico na gua. Aquecer
at a ebulio. Adicionar a soluo de hematoxilina e aquecer a ebulio
por 30 segundos. Adicionar o xido de mercrio. Esfriar rapidamente. Acrescentar 3-4 gotas de cido actico. Armazenar em frasco mbar com tampa
esmerilhada durante um a dois meses.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Quando usada urina colhida aps o meio-dia, iniciar na etapa 3.
3. Para urina de 24 horas colhida para o diagnstico de S. haematobium
deixar a amostra sedimentar em copo cnico durante duas horas. Decantar
com cuidado o sobrenadante. Aproximadamente 10 a 20ml de sedimento so
depositados. Quando recebida a urina da primeira mico matinal, usar
toda a amostra.
4. Misturar completamente a urina.
5. Transferir 10ml de urina para uma seringa. Quando a urina for turva, usar menos de 10ml da amostra.
6. Colocar a membrana filtrante Nuclepore ou Millipore de 25mm
de dimetro no porta-filtro, com adaptador para seringa e agulha. Usar
membrana filtrante de 8m de porosidade para S. haematobium; 5m para
Wuchereria bancrofti, Brugia malayi e Loa loa e 3m para as espcies
de Mansonella.
7. Forar, com cuidado, a passagem da urina atravs da membrana, usando
presso regular e contnua.
8. Lavar a membrana filtrante trs vezes, pela passagem de 10ml de
soluo salina a 0,85%.
9. Repetir a etapa 6, mas encher a seringa com ar em lugar da soluo
salina a 0,85%. Forar com cuidado a passagem do ar atravs da membrana.
10. Remover o adaptador da seringa e retirar a membrana filtrante do
adaptador com uma pina, colocando-a sobre lmina de microscopia.
11. Adicionar com pipeta de Pasteur uma gota de soluo salina a 0,85%
sobre o filtro.
12. Examinar o filtro para pesquisa de microfilrias vivas e ovos com o
aumento de 100X.
13. Imergir a membrana no corante de Giemsa, ou na hematoxilina de
Delafield (ver p. 396) ou na hematoxilina de Harris (ver p. 402). A membrana pode ser corada como os esfregaos sangneos estirados.
14. Deixar a membrana secar e montar em resina sinttica10.
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CAPTULO 8

183

Controle de Qualidade (CQ)


1. Verificar os reagentes sempre que forem usados. A soluo salina
deve apresentar aparncia clara sem nenhuma contaminao visvel.
2. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
3. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle10.
Observaes
1. A identificao das espcies das microfilrias realizada pela preparao de esfregaos permanentes corados. Ash e Orihel2 mergulham a membrana filtrante na hematoxina de Harris57 durante cinco a 10 minutos lavando-a aps em gua corrente.
2. Usar o teste da ecloso de ovos para determinar a viabilidade dos
ovos de Schistosoma. Eventualmente, ovos de outros Schistosoma podem
ser identificados na urina.
PESQUISA DE TRICHOMONAS VAGINALIS
As quatro espcies de tricomonas encontradas no homem so
Trichomonas vaginalis, Trichomonas tenax, Trichomonas hominis e
Trichomitus fecalis. A espcie T. vaginalis, patognica, foi descrita pela
primeira vez, em 1836, por Donn21, que a isolou de uma mulher com vaginite.
Marchand, em 1894 (58), e, independentemente, Miura 65 e Dock 20 observaram esse flagelado na uretrite de um homem. O T. tenax, comensal, vive na
cavidade bucal humana, e tambm de chimpanzs e macacos. O T. hominis,
comensal, habita o trato intestinal humano. O T. fecalis foi encontrado em
uma nica pessoa, no existindo certeza se o homem seria seu hospedeiro
primrio31,37,46. O T. vaginalis diagnosticado na secreo urogenital do homem
e da mulher.
O T. vaginalis um dos patgenos mais freqentemente encontrados nas doenas sexualmente transmissveis. Estima-se que 3 milhes de
mulheres nos EUA e 180 milhes no mundo so infectadas anualmente37,39, o que corresponde a 1/3 de todas as vaginites diagnosticadas. Apesar
de ter sido a doena caracterizada e o protozorio descrito em 1836 por
Donn, o diagnstico clnico e laboratorial da tricomonase, especialmente no homem, continua apresentando inmeras dificuldades 31,46 . Um
diagnstico clnico diferencial dessa doena, tanto no homem como na
mulher, dificilmente poder ser realizado atravs de sintomas e sinais especficos. A investigao laboratorial essencial na diagnose dessa
patogenia, permitindo, tambm, diferenciar a tricomonase de outras doenas sexualmente transmissveis. O tratamento da tricomonase es Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

184

CAPTULO 8

pecfico e eficiente. Por isso, torna-se importante a identificao e o


tratamento das pessoas infectadas, evitando assim a transmisso sexual
do parasito.

AMOSTRA
Homem
Secreo uretral, primeira urina matinal (sedimento centrifugado da urina
matinal), secreo prosttica, smen, raspado da mucosa uretral e lavado
prepucial (material subprepucial).
Mulher
Secreo vaginal e primeira urina matinal. Quando houver sinais clnicos devero ser examinadas a uretra, as grandes glndulas vestibulares e
as parauretrais.

COLHEITA DA AMOSTRA
Homem
Para que os procedimentos de diagnstico tenham sucesso, os homens
devero comparecer ao local da colheita, pela manh, sem terem urinado
no dia e nem tomado qualquer medicamento tricomonicida h mais de 15
dias. O material uretral colhido com uma ala de platina (Fig. 8.3) ou com
swab de algodo no absorvente ou de polister ou de Dacron69. O organismo mais facilmente encontrado no smen do que na urina ou em esfregaos
uretrais. Uma amostra fresca poder ser obtida pela masturbao em um
recipiente limpo e estril. Tambm deve ser examinado o sedimento
centrifugado (500 x g/5min) dos primeiros 20ml da urina matinal, colhida com
ou sem massagem prosttica. A secreo prosttica (Fig. 8.4) e o material
subprepucial so coletados com um swab molhado em soluo salina isotnica
(0,15M) tpida (ver p. 201).

Fig. 8.3 Colheita de secreo uretral com uma ala de platina.

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CAPTULO 8

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B
Prstata

Vescula seminal
R

Fig. 8.4 Massagem prosttica. D = diafragma prosttico; O = osso pbico; B = bexiga;


R = reto. (Segundo Moura RADA. Colheita de Material para Exame de Laboratrio. Assegurando a qualidade dos servios no laboratrio clnico. So Paulo: Editora Atheneu, 1998.)

Mulher
As mulheres no devero realizar a higiene vaginal, durante um perodo de 18 a 24 horas antes da colheita do material e no devem ter feito uso
de medicamentos tricomonicidas, tanto vaginais (gelias e cremes) como orais,
h mais de 15 dias. A vagina o local mais facilmente infectado e os tricomonas
so mais abundantes durante os primeiros dias aps a menstruao. O material usualmente colhido na vagina com swab de algodo no absorvente,
com o auxlio de um espculo no lubrificado. Embora a quantidade de exsudato
absorvido possa ser pequena; os melhores resultados so obtidos com swab
de algodo no absorvente ou de polister ou de Dacron69. Apesar de o trato
urinrio baixo poder ser, raramente, colonizado pelo T. vaginalis, o exame
da urina ou de esfregaos uretrais no indicado para a pesquisa do protozorio,

Fig. 8.5 Colheita de material na vagina com swab de algodo no absorvente com o
auxlio de um espculo no lubrificado.

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186

CAPTULO 8

exceto em mulheres com sintomas de infeco urinria. Quando houver sinais clnicos, devero ser examinadas a uretra, as grandes glndulas vestibulares e as parauretrais. O perodo mais favorvel para colher o fluido vaginal
do saco posterior, quando o diagnstico apresenta dificuldades, entre o quarto
e o quinto dia ps-menstrual. Devero ser colhidos, sempre, dois swabs de
cada paciente para facilitar os exames direto e cultural (Fig. 8.5).
Soluo Salina Isotnica (0,15M)
Cloreto de sdio (NaCl)
gua destilada-deionizada

8,767g
1.000ml

Dissolver o NaCl em uma pequena quantidade de gua, completando


aps o volume. Armazenar temperatura ambiente.

PRESERVAO

DA

AMOSTRA

O T. vaginalis suscetvel desidratao e s mudanas do potencial


de oxidorreduo. O material colhido de pacientes que no for examinado
em preparaes a fresco imediatamente aps a colheita ou inoculado em meios
de cultura, dever ser preservado em lquidos ou em meios de transporte.
Reagentes
1. Glicose (C6H12O6)
2. Cloreto de sdio (NaCl)
3. Cloreto de potssio (KCl)
4. Cloreto de clcio (CaCl2.2H2O)
5. Cloreto de magnsio (MgCl2)
6. Diidrogenofosfato de potssio (KH2PO 4)
7. Diidrogenofosfato de sdio (NaH2PO 4)
8. Hidrogenofosfato dissdico anidro (Na2HPO4)
9. Hidrogenocarbonato de sdio (NaHCO3)
10. Tioglicolato de sdio
11. Glicerofosfato de sdio (C 3H7O 6PNa 2)
12. Azul-de-metileno (CI 52015) (C 16H18ClN 3S.3H 2O)
13. Carvo, p
14. gar (Difco)
Preservao Temporria
Lquidos de Transporte: A soluo salina isotnica (0,15M) glicosada
a 0,2% mantm os tricomonas viveis durante vrias horas temperatura
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CAPTULO 8

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de 37C, no havendo qualquer alterao na morfologia e na mobilidade. As


solues de Ringer e de Locke tambm podem ser usadas.
1. Soluo Salina Isotnica Glicosada a 0,2% (m/v)
Glicose
Soluo salina isotnica (0,15M)

2g
1.000ml

Dissolver a glicose na soluo salina isotnica (ver p. 201).


2. Soluo de Ringer
Cloreto de sdio
Cloreto de potssio
Cloreto de clcio
Cloreto de magnsio
Diidrogenofosfato de sdio
Hidrogenocarbonato de sdio
gua destilada-deionizada

8g
0,2g
0,2g
0,1g
0,1g
0,4g
1.000ml

Dissolver os quatro primeiros componentes em 900ml de gua


desmineralizada e autoclavar (121C/15min). Dissolver o NaH 2PO 4 e o
NaHCO3 em 100ml de gua destilada e filtrar em Seitz ou Millipore. Misturar as duas solues em condies de assepsia total.
3. Soluo de Locke
Cloreto de sdio
Hidrogenocarbonato de sdio
Cloreto de potssio
Cloreto de clcio
Glicose
gua destilada-deionizada

9g
0,2g
0,42g
0,25g
2g
1.000ml

Dissolver o CaCl2 em pequena quantidade e gua e depois adicionar


o sais remanescentes.
Meios de Transporte: Os meios de Stuart 75,82 e de Amies1 modificados mantm os organismos por um perodo de 24 horas. Aps esse perodo
h um significante declnio no nmero de parasitos. Nas primeiras 24 horas da preservao, a temperatura no tem influncia nas culturas subseqentes do protozorio, mas, aps esse perodo, sobrevivem melhor quando
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188

CAPTULO 8

o meio mantido a 4C ou a 36C. Os meios de transporte diluem o nmero de parasitos na amostra original, o que deve ser considerado quando os
resultados forem negativos, atravs do exame de preparaes a fresco e/ou
pelo exame cultural.
1. Meio de Stuart 75,82
Tioglicolato de sdio
Glicerofosfato de sdio
Cloreto de clcio
Azul-de-metileno
gar
gua destilada-deionizada
pH 7,5

1g
10g
0,1g
0,002g
3g
1.000ml

Preparao e Colheita
1. Dissolver os ingredientes em 1.000ml de gua e distribuir em tubos
com rosca (screw-capped) 13 x 100mm, Pyrex n. 9825, na razo de 7ml
por tubo.
2. Autoclavar (121C/15min). Deixar o tubos solidificarem na posio
vertical. O meio solidificado mostra geralmente uma zona azul de aerobiose
at a 1/3 da altura do meio. Quando essa zona ultrapassar mais da metade
do meio, no deve ser utilizado para os fins previstos.
3. A incorporao do material a examinar ao substrato se realiza atravs de swabs, estreis e secos, preparados com algodo no absorvente ou
de polister, previamente mergulhados em soluo tampo de fosfato de
Srensen 0,067M, pH 7,4 (ver p. 817).
4. Os swabs so introduzidos no meio de transporte, at a metade de
seu tamanho. Os tubos so fechados hermeticamente e conservados sob
refrigerao (4 a 5C) at o momento do exame microscpico e da inoculao nos meios de cultura.
2. Meio de Amies
Cloreto de sdio
Cloreto de potssio
Cloreto de magnsio
Diidrogenofosfato de potssio
Hidrogenofosfato dissdico anidro
Tioglicolato de sdio
Carvo, p
gar (Difco)
gua destilada-deionizada
pH 7,4

3g
0,20g
0,10g
0,20g
1,15g
1g
10g
4g
1.000ml

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CAPTULO 8

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Preparao e Colheita
1. Dissolver os componentes em 1.000ml de gua tpida.
2. Distribuir o meio em tubos com tampa de rosca (screw-capped) 13
x 10mm, Pyrex n. 9825, na razo de 7ml por tubo.
3. Fechar os tubos e autoclavar (121C/15min).
4. Antes da solidificao do carvo, agitar e inverter os tubos a fim de
obter uma perfeita homogeneizao. Reapertar as tampas se necessrio.
5. Usar swabs estreis e secos, de algodo ou de polister, previamente mergulhados na soluo tampo de fosfato de Srensen pH 7,4 (ver p.
813).
6. Os swabs so introduzidos no meio de transporte, at a metade de
seu tamanho. Os tubos so fechados hermeticamente e mantidos sob refrigerao (4-5C) at o momento do exame microscpico e da inoculao nos
meios de cultura.
Preservao Permanente
A soluo do fixador lcool polivinlico (APV) preserva os microrganismos fixados sem que haja alteraes na sua morfologia, estando assim
esses organismos preparados para serem corados pelos mtodos de Leishman,
Giemsa, e pela hematoxilina frrica, segundo Heidenhain. Os protozorios e
o sedimento de cultura fixados com o fixador APV podem ser armazenados
por meses ou anos para serem usados como material de referncia e/ou para
o ensino. O fixador APV mantm-se em condies satisfatrias para o uso,
por um perodo de seis meses a um ano, enquanto permanecer em recipiente de vidro ou de plstico opaco, hermeticamente fechados.
EXAME MICROSCPICO
O exame microscpico convencional de preparaes a fresco e de
esfregaos fixados e corados, junto com os mtodos culturais, so os procedimentos laboratoriais mais comumente empregados no diagnstico da
tricomonase urogenital44,55,63. Apesar de o exame microscpico direto do lquido
prosttico e do sedimento urinrio no apresentar problemas na sua observao, a densidade dos leuccitos polimorfonucleares e as clulas epiteliais
do exsudato vaginal tendem a dificultar e a obscurecer a pesquisa do
protozorio, principalmente a visualizao dos movimentos dos flagelos 71.
O diagnstico da tricomonase, tradicionalmente, depende da observao
microscpica do protozorio mvel, atravs do exame direto de esfregaos
a fresco com auxlio da microscopia de campo claro e/ou de campo escuro e/ou de contraste de fase, como, tambm, pela microscopia de esfregaos
fixados e corados. Esses mtodos requerem o mnimo de equipamento e
so especficos para a pesquisa desse protozorio. Quando esse estudo apresentar resultados negativos, ele deve ser complementado pelo exame cultural.
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190

CAPTULO 8

EXAME DIRETO A FRESCO


Preparaes No-coradas: A microscopia da secreo vaginal ou
cervical dos exsudatos uretrais e do lquido prosttico diludos em soluo
salina isotnica (0,15M) tpida (ver p. 201) o exame de rotina usual para
a identificao do flagelado. Esse mtodo tem uma baixa sensibilidade quando
comparado com os mtodos culturais. O protozorio perde sua mobilidade
caracterstica quando as preparaes permanecem em temperatura ambiente fria, tornando-se necessria uma observao microscpica rpida. O
nmero de tricomonas por unidade de volume de exsudato vaginal varia de
paciente para paciente, tornando-se necessria uma pesquisa cuidadosa e
prolongada, quando poucos organismos esto presentes. As duchas vaginais
baixam consideravelmente a sensibilidade dos esfregaos microscpicos a
fresco, no ocorrendo o mesmo com os procedimentos culturais. Robertson
e cols.76 descreveram um mtodo de concentrao (sedimento concentrado)
que aumentou a sensibilidade da pesquisa de T. vaginalis no exsudato vaginal. Inmeros erros ocorrem no diagnstico do flagelado em preparaes
a fresco. Nas infeces discretas, o nmero de protozorios to pequeno
que o exame pode ser considerado negativo. Por outro lado, os leuccitos
podem estar em movimento devido s espiroquetas, s bactrias flageladas,
aos espermatozides e/ou s clulas ciliadas aderidas a eles, simulando, assim,
um tricomona. Coutts, Silva-Inzunza e Tallman16 recomendam a observao
de esfregaos a fresco pela microscopia de campo escuro. Entretanto,
Roberston e cols.76 concluram que a microscopia de contraste de fase do
sedimento centrifugado do exsudato vaginal mais sensvel e mais precisa
do que a microscopia de campo claro no estudo das preparaes frescas.
Em montagens a fresco, o flagelado mantm sua mobilidade por vrias horas, quando mantido temperatura de 20C entre lmina e lamnula selada
com parafina. Temperaturas que excedem a 44C matam imediatamente o
parasito; por esta razo, os esfregaos nunca devero ser aquecidos na chama
direta do bico de Bunsen. A presso da lamnula inmeras vezes causa
mudanas na forma do organismo e, eventualmente, o protozorio flagelado
desenvolve formaes semelhantes a pseudpodes7.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Misturar em uma lmina de microscopia ou em um tubo de hemlise, uma ou duas gotas (< 1,0ml) de soluo salina isotnica (0,15M) tpida
e uma pequena quantidade da amostra.
3. Quando o espcime no pode ser examinado imediatamente, colocar
o swab nos meios de transporte de Stuart ou de Amies, que mantm os
organismos viveis por aproximadamente 24 horas.
4. Coletar a urina em recipiente limpo e estril. Centrifugar a urina (500
x g/5min) e examinar o sedimento para T. vaginalis. No necessrio
acrescentar soluo salina ao sedimento urinrio. Manter os espcimes
temperatura ambiente.
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CAPTULO 8

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5. A temperatura de refrigerador (4-5C) inibe a motilidade, apresentando efeito deletrio sobre os organismos. O retorno temperatura ambiente no reverte esse efeito destruidor das caractersticas morfolgicas.
6. Rejeitar qualquer amostra com mais de 24 horas.
7. Misturar a soluo salina e a amostra com a ponta da pipeta ou com
a ponta da lamnula. Cobrir a preparao com lamnula (18 x 18mm).
8. Examinar a preparao a fresco, para a pesquisa de organismos
flagelados mveis, com objetiva de pequeno aumento (10X) e pouca iluminao. As estruturas suspeitas devem ser examinadas com objetiva de grande
aumento (40X). Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
9. Os organismos so usualmente um pouco maiores do que os leuccitos polimorfonucleares7.
Controle de Qualidade (CQ): Exame Direto a Fresco
1. Verificar diariamente os reagentes usados no exame direto a fresco.
2. A soluo salina isotnica (0,15M) deve estar clara e sem contaminao visvel.
3. A soluo de iodo deve estar transparente e no contaminada por
bactrias e fungos e deve conservar a cor marrom forte (ch da ndia ou
vinho do Porto) com cristais no fundo do frasco. Desprezar a soluo que
no apresentar essas caractersticas.
4. A soluo Vaginal Identification of Pathogens (VIP) deve estar
clara e sem contaminao visvel.
5. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
6. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle7.
Observaes
1. No deixar os espcimes temperatura ambiente por um longo perodo (usualmente > 1 hora). Os organismos tornam-se redondos, perdem a
motilidade e eventualmente morrem. A motilidade pode ser ocasionalmente
intensificada a 37C, mas esta temperatura no revive os organismos mortos.
2. Quando um esfregao seco enviado ao laboratrio, o mesmo pode
ser salvo pela fixao (lcool metlico) e subseqente colorao (corante de
Giemsa diludo a 1:20 e durante 20 minutos).
3. O organismo corado pode apresentar dificuldades de observao,
entretanto se o protozorio for identificado como T. vaginalis, essa informao apresenta relevncia clnica.
4. O exame direto a fresco revela os organismos em 75% a 85%28,30
dos pacientes infectados. Amostras urogenitais podem ser contaminadas por
material fecal de pacientes infectados com T. hominis, conseqentemente,
um resultado falso-positivo pode ser reportado.
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CAPTULO 8

5. O T. hominis e o T. vaginalis so semelhantes na forma. Entretanto, a posio da membrana ondulante permite uma diferenciao morfolgica entre esses dois protozorios flagelados (Tabela 6.1).
6. Mtodos alternativos de diagnstico, como a cultura, deteco de
antgenos monoclonais66, esfregaos permanentes corados e colheita de uma
segunda amostra para exame, devero ser usados.

PREPARAES CORADAS
Com o objetivo de aumentar a sensibilidade do exame microscpico direto,
vrios corantes so adicionados s montagens salinas. Apesar dos tricomonas
no se corarem com a safranina, o verde de malaquita, o azul-de-metileno e
com o azul cresil brilhante, os elementos celulares tomam os corantes e
contrastam com os organismos vivos no corados; somente os flagelados mortos
so corados intensamente. Esses corantes, entretanto, no tm se mostrado
convincentes na melhoria do grau de identificao dos tricomonas nas secrees e no devem ser recomendados para a rotina laboratorial. Coutts e
Silva-Inzunza15 sugeriram a colorao vital com soluo aquosa de fluorescena
adicionada s preparaes salinas para melhorar a pesquisa do parasito no
material fresco. Barchet3 desenvolveu o mtodo Vaginal Indentification of
Pathogens (VIP), para corar os tricomonas no material obtido de pacientes. Este procedimento de colorao com o cristal violeta diludo no tampo
de fosfato de Srenson (pH 6,0) especialmente til quando os organismos
esto em pequeno nmero e so freqentemente atpicos. A sensibilidade
dos esfregaos microscpicos a fresco geralmente baixa, mas a especificidade
alta.

CORANTE VAGINAL IDENTIFICATION OF PATHOGENS (VIP)


Em 1972, Barchet 3 desenvolveu o mtodo Vaginal Identification of
Pathogens (VIP) para corar tricomonas no material obtido de pacientes.
Este procedimento de colorao com cristal violeta diludo no tampo de fosfato
de Srenson (pH 6,0) especialmente til quando os organismos esto em
pequeno nmero e so freqentemente atpicos.
Amostra
Homem
Secreo uretral, primeira urina matinal (sedimento centrifugado da urina
matinal), secreo prosttica, smen, raspado da mucosa uretral e lavado
prepucial (material subprepucial).
Mulher
Secreo vaginal e primeira urina matinal. Quando houver sinais clnicos devero ser examinadas a uretra, as grandes glndulas vestibulares e
as parauretrais.
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CAPTULO 8

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Reagentes
1. Cristal violeta, cristais (CI 42555) (C25H30ClN 3)
2. Soluo tampo de Srensen (ver p. 816)
Preparao das Solues
Soluo Estoque
Cristal violeta, cristais

200mg

Soluo tampo de Srensen, pH 6,0

100ml

Dissolver o cristal violeta em 100ml de soluo tampo. Aquecer em


banho de gua a 60C durante duas horas. Filtrar em filtro bacteriolgico
Millipore . Armazenar sob refrigerao (4 a 5C), em frasco opaco hermeticamente fechado. Validade: um ano.
Corante
Soluo estoque

10ml

Soluo tampo de Srensen, pH 6,0

40ml

Misturar as solues. Aquecer em banho de gua a 60C durante uma


hora. Preparar o corante mensalmente.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar em uma lmina de microscopia duas gotas do corante VIP
e igual volume de exsudato. Cobrir com lamnula e examinar com objetiva
de pequeno aumento (10X).
Caractersticas da Colorao
A colorao a fresco VIP um acurado e eficiente mtodo para o
diagnstico das vaginites. Os tricomonas mveis com atividade intensa so
facilmente diagnosticados; neste caso, a colorao no favorece o reconhecimento dos flagelados. A identificao dificultada diante de organismos
imveis; pacientes submetidos a uma ducha recente e teraputica ineficiente.
O efeito do corante entre os tricomonas mveis varivel. No entanto, nos
menos ativos ou presumivelmente mortos, o ncleo apresenta-se corado em
azul intenso3.
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CAPTULO 8

COLORAO

PELA

SOLUO

DE

IODO

DE

DANTONI

Reagente
1. Soluo de Iodo de DAntoni (ver p. 39)
Dissolver 1g de iodeto de potssio em 100ml de gua. Adicionar lentamente 1,5g de cristais de iodo e agitar a mistura at a completa dissoluo.
Filtrar e estocar em frasco de cor mbar com tampa esmerilhada, ao abrigo
da luz. Preparar novas solues depois de 10 a 14 dias. Indicar a data de
validade no rtulo do frasco.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar uma ou duas gotas de soluo de iodo de DAntoni e igual
volume de exsudato ou de sedimento urinrio, cobrindo a preparao com
uma lamnula.
3. Examinar o esfregao a fresco com objetiva de pequeno aumento
(10X) e pouca iluminao.
4. As estruturas suspeitas devem ser examinadas com objetiva de grande
aumento (40X). O axstilo dos organismos imveis so corados pela soluo de iodo, evidenciando a presena do trofozoto de T. vaginalis.
Preparaes Fixadas e Coradas
Devido s limitaes do exame microscpico direto, uma variedade de
mtodos de colorao tem sido indicada para o diagnstico do T. vaginalis
no homem e na mulher. Os principais so: alaranjado de acridina 11,25,49,70,78,87,
Giemsa 8,49,62,79 , Leishman 38,48 , Diff-Quik 49,59, Fontana 67 , Gram 18,81, cido
peridico de Schiff 77 , imunoperoxidase 35 , hematoxilina frrica 42 e Papanicolaou45. No entanto, poucos estudos foram realizados com o objetivo de
comparar a cultura com as preparaes fixadas e coradas 84. Recomendase simultaneamente o emprego de vrios exames microscpicos de preparaes fixadas e coradas para a obteno de melhores resultados. Em
contraste com os outros procedimentos de colorao, a identificao de
tricomonas pela tcnica de Papanicolaou para esfregaos de secrees
cervicais e vaginais tem sido usada com muita freqncia, embora uma
srie de bices e erros sejam atribudos ao diagnstico dos esfregaos
citolgicos corados por esta tcnica45,73,74. O alaranjado de acridina 33 um
corante fluorescente dos cidos nuclicos, sendo usado para diferenciar nas
clulas o DNA do RNA66. A colorao pelo alaranjado de acridina de esfregaos vaginais para a pesquisa de tricomonas apresenta resultados favorveis quando comparado com o exame direto a fresco. Entretanto, no
existe consenso entre os diferentes autores no uso desse procedimento na rotina laboratorial para o diagnstico do T. vaginalis53. Nos esfregaos
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CAPTULO 8

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vaginais corados os organismos apresentam freqentemente dificuldades


na diferenciao do organismo de outras clulas do trato geniturinrio.
A especificidade do mtodo um problema que ainda suscita srias dvidas.

COLORAO

DE

GIEMSA

Esfregaos fixados do exsudato vaginal corados pelo mtodo de Giemsa


tm sido usados, exaustivamente, nos ltimos 50 anos para o diagnstico do
T. vaginalis. Alguns autores 8,49,62 afirmam que maior nmero de infeces
so identificadas pelo exame microscpico de esfregaos corados pelos
derivados de Romanowsky do que pela microscopia do exame direto a fresco e que em alguns grupos a sensibilidade desse mtodo de diagnstico se
aproxima do exame cultural35.
Reagentes e Preparao (ver p.296)
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Em uma lmina de microscopia, misturar uma ou duas gotas de soluo salina isotnica (0,15M) e uma pequena quantidade da amostra. No
necessrio acrescentar soluo salina ao sedimento de urina.
3. Preparar o esfregao. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar o esfregao com lcool metlico durante cinco minutos (usar
cuba de Coplin nesta fase da colorao).
5. Corar o esfregao durante 45 minutos com a soluo de Giemsa diluda
a 5% em tampo de fosfato pH 7,2 (usar cuba de Coplin nesta fase da
colorao).
6. Lavar o esfregao com gua corrente (para remover o excesso da
soluo corante). Deixar secar temperatura ambiente na posio vertical.
7. Examinar o esfregao com objetiva de imerso (100X).
8. Os organismos so usualmente um pouco maiores do que leuccitos
polimorfonucleares.
Observaes
1. A fixao e a colorao so usualmente realizadas na cuba de Coplin.
2. A soluo corante de Giemsa deve ser preparada fresca diariamente.
3. Em nosso laboratrio usado com grande sucesso para a colorao
dos tricomonas em exsudatos e em culturas o mtodo de Giemsa, no qual a
soluo corante diluda a 5% em tampo de fosfatos pH 7,2. Jirovec e
Petr42 coraram o esfregao durante 60 minutos com a soluo de Giemsa
diluda (1:10) em tampo de fosfato pH 7,2.
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CAPTULO 8

4. Os espcimes devem ser examinados dentro de uma hora aps a


colheita. Depois de uma hora os organismos perdem a mobilidade, principalmente quando comeam secar e a morfologia dos esfregaos permanentes corados apresenta dificuldades na sua observao.
5. Quando um esfregao seco enviado ao laboratrio, o mesmo pode
ser salvo pela fixao (lcool metlico) e subseqente colorao pelo corante
de Giemsa (ver mtodo anteriormente descrito).
6. O organismo corado pode apresentar dificuldades de observao;
entretanto, se o protozorio for identificado como T. vaginalis, essa informao apresenta relevncia clnica.
7. As amostras urogenitais podem ser contaminadas por material fecal
de pacientes infectados com T. hominis; conseqentemente, um resultado
falso-positivo pode ser reportado.
8. O T. hominis e o T. vaginalis so semelhantes na forma. Entretanto, a posio da membrana ondulante permite uma diferenciao morfolgica entre esses dois protozorios flagelados38.
Caractersticas da Colorao
O protozorio pode apresentar forma alongada, fusiforme ou oval, corando-se em azul brilhante, com pequeno e excntrico ncleo escuro (violeta-avermelhado). O axstilo e os flagelos so perfeitamente observados. A
membrana ondulante e os flagelos coram-se de violeta-escuro (Fig. 8.6).
Controle de Qualidade (CQ): Colorao de Giemsa
1. Verificar diariamente os reagentes usados no exame direto a fresco.
2. A soluo salina isotnica (0,15M) deve estar clara e sem contaminao visvel.
3. Corante de Giemsa: preparar esfregao estirado sangneo para controle
de qualidade do corante de Giemsa. Avaliar microscopicamente as reaes
de colorao das plaquetas, eritrcitos e leuccitos.

Fig. 8.6 Trofozotos de Trichomonas vaginalis corados pelo mtodo de Giemsa. (Adaptada
de Pappas PW, Wardrop SM e Oklahoma State University, College of Veterinary Medicine;
1999. Disponvel em <URL: http://calvin.biosci.ohio-state-edu/~zoology> [1997 Jan 24].)

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CAPTULO 8

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4. Soluo tampo de fosfato: verificar diariamente se as solues tampo


de fosfato pH 6,6-7,2 e a gua tamponada esto claras, sem vestgios de
contaminao e de precipitao. O pH deve ser testado antes da preparao do corante.
5. Antes do uso, controlar a soluo de Giemsa a 5% em tampo fosfato, pH 7,2.
6. Rever o controle de qualidade do corante de Giemsa, antes da pesquisa dos organismos.
7. Manter criopreservada uma cultura padro de T. vaginalis (ATCC
30.001). Cultivar semanalmente essa amostra. Corar uma lmina preparada
com a cultura-padro em paralelo com a lmina do material colhido do paciente. Os resultados somente sero aceitos quando o controle de qualidade
dos organismos da cultura padro esto bem corados.
8. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. As objetivas e as oculares originais devem ser colocadas no microscpio durante a calibrao. A morfometria deve ser realizada com
micrmetro ocular.
9. Os resultados do CQ devem ser registrados. Quando necessrio seguir
o plano de ao para resultados fora de controle8.
EXAME DAS CULTURAS
Muitos meios de cultura lquidos ou semi-slidos tm sido descritos
para o isolamento e manuteno axnica do T. vaginalis 17,42,56. Depois que
foi possvel cultivar amostras de tricomonas pela adio de penicilina e
estreptomicina aos meios, o diagnstico, o isolamento e a manuteno de
tricomonas tornou-se fcil e as culturas puderam ser padronizadas, facilitando o diagnstico laboratorial da tricomonase e o controle dos resultados da teraputica. A cultura o mtodo mais sensvel para o diagnstico
da tricomonase; entretanto, so necessrios trs a quatro dias para determinar a existncia de crescimento. A cultura axnica do organismo
imprescindvel para o diagnstico e para estudos bioqumicos, fisiolgicos, metablicos, imunolgicos e da ultra-estrutura do parasito, como tambm para a triagem de medicamentos in vitro. A cultura axnica de
tricomonas permite o estudo e o entendimento do processo patolgico pela
inoculao em animais de experimentao com organismos que cresceram
em culturas e, desse modo, simular a ocorrncia do processo natural da
doena em laboratrio. Para o diagnstico de laboratrio indispensvel
o estudo simultneo da cultura, do exame direto a fresco e de esfregaos
permanentes corados. Quando o exame microscpico positivo, a teraputica apropriada poder ser administrada ao paciente antes mesmo do
resultado da cultura. Os principais meios de cultura usados so: o de Johnson
e Trussell 43 e Trussell e Johnson 85 (CPLM), o de Kupferberg, Johnson e
Sprince48 (STS), o de Diamond19 (TYM), o de Feinberg-Whittington23 o TYM
modificado por Hollander 36,53 e Kulda e cols. 47,53 , e o meio CMRL 1055
modificado51,52,53. Ver, no Captulo 25, Cultivo de Protozorios: Trichomonas
vaginalis.
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CAPTULO 8

IMUNODIAGNSTICO
O diagnstico imunolgico da tricomonase urogenital tornou-se possvel quando o parasito pde ser cultivado in vitro. O imunodiagnstico atravs de reaes de aglutinao direta (AD), hemaglutinao indireta (HA),
fixao do complemento (RFC), imunofluorescncia indireta (RIFI), imunofluorescncia direta (IFD), usando anticorpos monoclonais e tcnicas
imunoenzimticas (EIE), tem contribudo para aumentar o ndice de certeza
dos resultados 37,39 .
Esses procedimentos no substituem os exames parasitolgico e cultural, mas podem complet-los, quando negativos. O imunodiagnstico tem
significado maior nos casos de pacientes assintomticos, permitindo uma triagem
adequada com a possibilidade de um tratamento precoce e uma diminuio
do risco de transmisso. Estudos comparativos mostraram haver uma expressiva relao entre os resultados obtidos na deteco direta de T. vaginalis
pelos anticorpos monoclonais fluorescentes e o exame direto a fresco, como
tambm na pesquisa do organismo atravs de esfregaos corados permanentes e pelo exame cultural 45. A especificidade dos testes imunolgicos
varivel, por essa razo cuidados devero ser observados contra o termo
falso-positivo para descrever uma reao positiva em paciente aparentemente no-infectado, visto que os anticorpos dos tricomonas podem persistir por um longo perodo aps o tratamento ou aps uma cura espontnea.
Estudos adicionais devero ser realizados com novos antgenos para investigar as diferenas existentes entre as cepas do parasito. Os testes imunolgicos no so rotineiramente usados no diagnstico dessa protozoose, apesar
da relativa especificidade e sensibilidade dos diferentes procedimentos30,74.
Observaes
1. A diferenciao clnica das diferentes formas das infeces vaginais irrealizvel e o diagnstico acurado da tricomonase em pacientes de
ambos os sexos depende da demonstrao do organismo nos espcimes
genitais.
2. Isoladamente, a sintomatologia insuficiente para se fazer o diagnstico do tipo de infeco.
3. A sensibilidade dos vrios mtodos e tcnicas est sumarizada na
Tabela 8.1 73,74. Os tricomonas so identificados na secreo vaginal atravs do exame direto a fresco, que detecta os flagelados em mais de
60% das mulheres infectadas. O T. vaginalis mais facilmente reconhecido pelas suas caractersticas de movimento. O exame direto a fresco
tambm revela grande nmero de leuccitos, apesar das mulheres assintomticas apresentarem pequeno nmero de clulas brancas sangneas.
4. Na infeco pelos tricomonas as clulas epiteliais aparecem normais
no exame direto a fresco e a flora bacteriana consiste em bacilos ou em
coco-bacilos. A cultura do endocrvix usualmente positiva, os espcimes da
regio endocervical no devem ser usados para o diagnstico microscpico
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CAPTULO 8

199

Tabela 8.1
Sensibilidade dos Mtodos e Tcnicas Usados para a Identificao
de Trichomonas vaginalis nos Espcimes Vaginais 73,74
Procedimentos

Sensibilidade

Exame direto a fresco


Imunofluorescncia
Colorao de Gram
Colorao pelo alaranjado de acridina
Colorao de Giemsa
Fixao do Ltex
ELISA
Citologia Cervical
Cultura

49-80%
64-90%
< 1%
~66%
35-60%
56-90%
77-93%
60-70%
85-90%

da tricomonase, porque somente pequeno nmero de organismos esto presentes naquele lugar.
5. O exame direto a fresco do material obtido com ala de platina da
uretra anterior de homens revela o organismo em 50% a 90% das infeces. Enquanto a cultura do material de raspado da uretra apresenta uma
sensibilidade de aproximadamente 80%, o exame das culturas do sedimento
da primeira urina mostra o organismo em 70% dos casos. A massagem prosttica antes da coleta da urina possivelmente aumenta a sensibilidade para
95%. A cultura continua sendo a mais sensvel tcnica (> 95%) para o diagnstico da tricomonase74.
6. As coloraes de Gram, Giemsa, Pappenhein e o alaranjado de
acridina apresentam resultados inferiores ao exame direto a fresco no diagnstico da tricomonase em pacientes de ambos os sexos. O mtodo de
Papanicolaou apresenta uma sensibilidade de 56% a 78%; entretanto, considera-se a possibilidade de resultados falso-positivos com o mtodo de
Papanicolaou. Quando a citologia vaginal pelo mtodo de Papanicolaou for
sugestiva de tricomonase, deve-se sempre recorrer ao exame direto ou a
outro mtodo para confirmar o diagnstico. Nos casos de vaginite inflamatria com exame direto negativo para T. vaginalis, faz-se necessrio o
emprego do exame cultural74.
7. As tcnicas da imunofluorescncia indireta, aglutinao do ltex e
ELISA so mais sensveis do que o exame direto a fresco (80-90%); entretanto, menos sensveis do que o exame cultural. O imunodiagnstico apresenta problemas relacionados com a falta de especificidade, principalmente
nas populaes de alto risco, nas quais os anticorpos podem existir antes da
infeco. A sensibilidade tambm baixa74. Lossick54 e Lossick e Went 55
relatam que 69% a 70% das infeces pelo tricomonas podem ser diagnosticadas pelo exame direto a fresco. A sensibilidade desse exame varia
de 40% a 60%, quando realizado por microscopista com razovel experincia e atinge os ndices de 60% a 90% quando executado por microscopista
altamente treinado.
8. O exame direto a fresco um exame rpido, com especificidade virtual
de 100%. Os autores concordam que a cultura (85% a 90%) das secrees
um excelente procedimento para o diagnstico do T. vaginalis.
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200

CAPTULO 8

9. O uso de anticorpos monoclonais e sondas de DNA para a deteco


de T. vaginalis tem sido relatado como eficiente para o diagnstico desse
protozorio13. Os testes imunoenzimticos esto sendo desenvolvidos para a
deteco de anticorpos de T. vaginalis em swabs vaginais. O valor preditivo
desses testes positivos foi de 82% e dos testes negativos, 99,3%74.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO 8

205

CAPTULO

Escarro, Aspirados, Material de Bipsia


e Exame dos Tecidos
Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
O exame do escarro, de aspirado e de material de bipsia
para o diagnstico das infeces parasitrias de extrema importncia, particularmente quando os mtodos e as tcnicas de
rotina no foram eficientes para a demonstrao dos organismos (Tabela 9.1).
ESCARRO
Diagnstico de larvas de Ascaris lumbricoides, Strongyloides stercoralis e de ancilostomdeos, ovos de Paragonimus
westermani, esclex de Echinococcus granulosus, trofozotos
de Entamoeba histolytica, Entamoeba gingivalis, Trichomonas
tenax, oocistos de Cryptosporidium parvum e o organismo
Pneumocystis carinii (fungo) 1,6,8.
Os organismos detectados no escarro podem causar pneumonia, pneumonite ou a sndrome de Loeffler, devido migrao das larvas de A. lumbricoides, S. stercoralis e ancilostomdeos. O homem freqentemente infectado por nematides,
cujos estgios de larva habitualmente realizam migraes extraintestinais; as larvas de A. lumbricoides (de segundo e terceiro
estdios) ou de ancilostomdeos (de terceiro estdio) so even Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 9

207

tualmente encontradas no escarro. Infeces humanas pelo P. westermani


ou por outras espcies desse gnero ocorrem na frica, sia e Amrica
Latina, sendo diagnosticadas pelo encontro dos ovos no escarro, como tambm nas fezes. Nessas infeces o escarro freqentemente viscoso, tingido com sangue e com manchas marrons. As manchas so aglomeraes
de ovos do P. westermani de cor marrom-amarelado. Nos casos de autoinfeco interna pelo S. stercoralis, quando grande nmero de larvas de
terceiro estdio esto migrando atravs dos tecidos, esses organismos so
identificados no escarro. Outros parasitos raramente ocorrem no escarro.
Nos casos de abscesso heptico amebiano os organismos chegam aos pulmes atravs do diafragma, entrando pelos brnquios, sendo os trofozotos
da E. histolytica encontrados no escarro. Quando o escarro examinado
atravs do exame direto a fresco, habitantes da cavidade bucal ocasionalmente so identificados como trofozotos no-patognicos da ameba comensal
E. gingivalis ou trofozotos do flagelado T. tenax. Os trofozotos da E.
gingivalis devem ser corretamente diferenciados da E. histolytica. A E.
gingivalis fagocita leuccitos polimorfonucleares, enquanto a E. histolytica
apresenta hemcias no citoplasma. Em pacientes portadores da hidatidose,
ocasionalmente so encontrados no escarro esclex do E. granulosus devido ao rompimento do cisto hidtico.

ESCARRO EXPECTORADO : E XAME DIRETO A FRESCO


PERMANENTES CORADAS

PREPARAES

Os parasitos dos pulmes, organismos grandes e mveis so detectados pelo exame direto a fresco. Os esfregaos so examinados com ou sem
a adio da soluo de iodo de Lugol ou de DAntoni. A colorao pelo
tricrmico usada para diferenciar a E. histolytica da E. gingivalis e a
colorao de Giemsa indicada para definir os estgios de larva dos vermes. O C. parvum dificilmente identificado atravs do exame direto a fresco,
sendo a criptosporidiose pulmonar diagnosticada pelo emprego de esfregaos
permanentes corados pelos derivados de Ziehl-Neelsen (mtodos a quente
e/ou a frio)2,3.
Reagentes
1. Perxido de hidrognio (H2O 2)
2. Soluo de hidrxido de sdio a 3% (NaOH) agente mucoltico
3. Solues de iodo (ver p. 38)
a. Soluo de iodo de Lugol
b. Soluo de iodo de DAntoni
4. Colorao do tricrmico (ver p. 100)
a. Fixador de Schaudinn (ver p. 11)
b. Fixador APV (ver p. 14)
c. Soluo de formaldedo a 10% (ver p. 9)
d. Corante do tricrmico
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208

CAPTULO 9

5. Colorao de Giemsa (ver p. 296)


a. Corante de Giemsa
b. Soluo tampo de fosfato, pH 6,8 a 7,2
c. Soluo triton tamponada a 0,01% (v/v)
Colheita, Amostra e Preparao
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. O escarro colhido para a pesquisa e diagnstico de parasitos deve
representar uma amostra profunda, incluindo o material do trato respiratrio
inferior, o qual mais apropriado do que a amostra superficial, constituda
principalmente pela saliva. Para garantir uma boa amostra, colher cedo pela
manh, aps o paciente ter lavado a boca com perxido de hidrognio (gua
oxigenada).
3. Transportar o espcime ao laboratrio, imediatamente aps a colheita, em recipiente limpo e com tampa. Selecionar as reas mucosas tingidas
pelo sangue.
4. Quando o espcime apresentar viscosidade uniforme, a seguinte rotina deve se observada aps o exame macroscpico:
a. Colocar cerca de 1ml de escarro em tubo cnico de centrfuga de
15ml.
b. Quando o material viscoso, adicionar igual volume de hidrxido de
sdio a 3%.
c. Deixar a suspenso em repouso temperatura ambiente por 15 minutos.
d. Adicionar 2ml de soluo tampo de fosfato (pH 6,8 ou 0,067M).
e. Centrifugar (1.000 x g/5min).
f. Decantar o sobrenadante. Usar o sedimento para o exame direto a
fresco e a preparao de esfregaos permanentes corados.
g. Quando o material no pode ser examinado imediatamente aps a
colheita, preserv-lo com formaldedo a 10%, ou se houver suspeita de
protozorios, fixar o espcime pelo APV fixador.
Controle de Qualidade (CQ)
1. As solues salina e de iodo devem ser controladas, diariamente, no
momento do uso. A soluo salina deve estar clara, sem evidente contaminao por bactrias e fungos. A soluo de iodo dever apresentar cor marrom
forte (ch-da-ndia ou vinho do Porto). Desprezar as solues fracas.
2. A soluo de hidrxido de sdio a 3% deve estar clara e livre de
contaminao. Preparar nova soluo de trabalho quando estiver turva.
3. Ver p. 21 CQ dos preservadores.
4. Cada novo lote da soluo do corante de Giemsa a 5% ou do tampo de fosfato, pH 7,2, deve ser controlado pela colorao de uma amostra
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CAPTULO 9

209

sangnea, na qual os glbulos vermelhos apresentam cor cinzenta, enquanto ncleo e citoplasma dos leuccitos, a colorao vermelho-prpura e azul,
respectivamente.
5. O microscpio e a centrfuga devem ser calibrados a cada 12 meses.
6. Manter a temperatura do refrigerador em 4C (variao: 2 a 8C),
local onde a soluo mucoltica de trabalho ser estocada.
7. Estocar as solues corantes no escuro e a soluo concentrada de
Giemsa em frasco de vidro com tampa esmerilhada. A fixao e a colorao so usualmente realizadas na cuba de Coplin. A soluo corante de Giemsa
deve ser preparada fresca diariamente.
8. Todos os dados obtidos no CQ devem ser registrados 2,3.
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher escarro expectorado (no tratado com o agente mucoltico).
a. Com uma pipeta de Pasteur, colocar uma ou duas gotas (50l) de
escarro em uma extremidade de uma lmina de microscopia, cobrindo-a com
uma lamnula (22 x 22mm).
b. Colocar uma segunda gota de escarro na outra extremidade e adicionar uma gota de soluo salina a 0,85% cobrindo a preparao com uma
lamnula (22 x 22mm).
3. Remover uma pequena poro do escarro no tratado e ressuspender
em 100ml de salina, cobrindo a suspenso com uma lamnula.
4. Examinar a preparao salina ao microscpio com pequena intensidade luminosa e objetiva de 10X, para a identificao de ovos, larvas, oocistos
e trofozotos de amebas.
5. Quando os resultados forem inconclusivos, preparar esfregaos permanentes corados:
a. Colocar no centro de trs lminas de microscopia uma pequena gota
do sedimento do escarro. Com a ponta de uma lmina e com movimentos circulares, contnuos, criar uma rea de aproximadamente 2cm de dimetro.
b. Fixar uma lmina, ainda mida, no lquido de Schaudinn e deixar as
outras duas preparaes secarem temperatura ambiente.
c. Corar o esfregao fixado em Schaudinn pelo mtodo do tricrmico
(ver p. 100).
d. Fixar os outros dois esfregaos estirados com lcool metlico. Corar,
respectivamente, um esfregao com a soluo de Giemsa (ver p. 296) e o
outro com um dos corantes derivados de Ziehl-Neelsen (ver p. 232).
6. Examinar os esfregaos com objetiva de imerso (100X).
Observaes
1. As larvas de helmintos so mais facilmente identificadas no exame
direto a fresco, sem colorao e/ou coradas pela soluo de iodo de Lugol
ou de DAntoni.
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210

CAPTULO 9

2. Os trofozotos de protozorios so geralmente identificados atravs


dos esfregaos permanentes corados pelo tricrmico, enquanto que os oocistos
so diagnosticados atravs de preparaes coradas pelos derivados de ZiehlNeelsen.
3. Quando existe suspeita de oocistos de C. parvum, centrifugar o escarro (500 x g/10min). Caso contrrio, os oocistos no sero encontrados
no sedimento usado para a preparao de esfregaos corados.
ASPIRADOS
O exame do material de aspirados e de broncoscopia para o diagnstico das infeces parasitrias extremamente valioso quando os exames
laboratoriais de rotina no foram conclusivos e eficientes para a demonstrao dos organismos. Os aspirados mais comumente processados no laboratrio de Parasitologia incluem o aspirado pela fibroscopia e o aspirado duodenal. Os aspirados incluem amostras lquidas coletadas de diferentes
stios anatmicos. A tcnica mais rpida e segura para colheita do material pulmonar e que mais freqentemente conduz ao diagnstico, a do
lavado broncoalveolar (LBA), atravs de fibroscopia 3,4 . Os diferentes
espcimes devem ser transportados imediatamente aps a colheita ao laboratrio. Os organismos nunca devem ser identificados tomando como referncia somente uma preparao direta a fresco, esfregaos com colorao permanente devero ser examinados para que sejam estabelecidas
a caracterizao morfolgica e a identificao especfica do organismo em
estudo 1,4,6.
Aspirado pela fibroscopia: quando os espcimes so colhidos e enviados ao laboratrio para a preparao de esfregaos permanentes corados,
os seguintes mtodos de colorao so indicados para a colorao e diagnstico dos diferentes parasitos: Giemsa ou Leishmann para Toxoplasma
gondii, hematoxilina frrica ou tricrmico para amebas, soluo de nitrato
de prata-metenamina para P. carinii (fungo), coloraes derivadas de ZiehlNeelsen para C. parvum e tricrmico modificado para microspordios 4.
Aspirado de cistos e abscessos: a pesquisa de amebas em aspirados requer a concentrao pela centrifugao, digesto (estreptoquinase),
exame direto a fresco para a pesquisa de organismos mveis, exame cultural e o estudo microscpico das preparaes coradas, pela hematoxilina frrica
ou pelo tricrmico4.
Aspirado duodenal: o estudo do lquido duodenal um procedimento
que revela com freqncia organismos como S. stercoralis, G. lamblia e
C. parvum, quando o exame parasitolgico das fezes negativo. O aspirado deve ser concentrado pela centrifugao antes do exame direto a fresco
para a pesquisa de organismos mveis e da preparao de esfregaos permanentes corados (ver Captulo 8)4.
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CAPTULO 9

211

Aspirado da medula ssea: no aspirado so evidenciadas as formas


amastigotas da Leishmania spp., geralmente intracelulares, do Trypanosoma
cruzi e do Plasmodium spp. Esses parasitos podem ser visualizados atravs do exame de preparaes permanentes coradas pela colorao de Giemsa,
Leishmann ou Wright 4.
Colheita de lavado broncoalveolar: a tcnica mais rpida e segura
para colheita do material pulmonar e que mais freqentemente conduz ao
diagnstico da pneumocistose a do lavado broncoalveolar (LBA) atravs
da fibroscopia. As amostras so usualmente concentradas pela centrifugao
antes do exame microscpico de preparaes permanentes coradas. Os
organismos mais freqentemente detectados so P. carinii (fungo), T. gondii
e C. parvum 4 .

FGADO

P ULMO

Diagnstico de trofozotos de Entamoeba histolytica, Pneumocystis


carinii (fungo) (ver Captulo 37) e cisto hidtico (Echinococcus granulosus) 1,6 .
Os exames do aspirado dos abscessos do fgado e dos pulmes podem
revelar trofozotos da E. histolytica. O material do aspirado deve ser examinado diretamente atravs do exame direto a fresco, pela preparao de
esfregaos permanentes corados ou pela inoculao em meios de cultura
apropriados. Preferencialmente, o material deve ser colhido na margem do
abscesso e no no centro da necrose. As amebas ocorrem com maior freqncia na poro esverdeada do material e, com menor freqncia, no aspirado
da parede do abscesso. O material colhido do abscesso heptico apresenta
dificuldades de manipulao e de preparao. Os organismos no exibem
movimentos amebides caractersticos por estarem freqentemente presos
ao pus viscoso e/ou aos detritos. A Amoebiasis Research Unit, Durban, frica
do Sul, recomenda o uso de enzimas proteolticas para libertar as amebas
do material de aspirado. O exame direto a fresco e a preparao de esfregaos
permanentes corados so indicados para o exame do material colhido perto
da parede do abscesso. Os diferentes espcimes devem ser enviados ao
laboratrio imediatamente aps a colheita. Devido localizao profunda dos
cistos hidticos (E. granulosus) nos rgos, e sendo a bipsia usualmente
contra-indicada, os testes imunolgicos so usados na confirmao ou excluso do diagnstico suspeito pela cintilografia, ultra-sonografia, tomografia ou radiologia. O aspirado (lquido hidtico) usualmente contm areia hidtica
(esclex intactos e/ou degenerados, ganchos e corpsculos calcrios).

NDULOS LINFTICOS, M EDULA SSEA

B AO

Diagnstico de Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei


rhodesiense, Leishmania donovani e Toxoplasma gondii 1,6.
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212

CAPTULO 9

O exame do aspirado de ndulos linfticos, medula ssea e bao conduz


ao diagnstico do T. (b) gambiense, T. (b) rhodesiense e L. donovani.
O material colhido de ndulos linfticos, medula ssea e bao pode ser
examinado atravs do exame direto a fresco para a identificao das formas
tripomastigotas mveis na fase aguda das tripanossomases africanas.
Esfregaos permanentes, preparados com o material colhido dos ndulos linfticos, fixados pelo lcool metlico e corados pelo mtodo de Giemsa
so indicados para a identificao das formas tripomastigotas. A L.
donovani (complexo) pode ser visualizada nos tecidos do sistema reticuloendotelial onde se incluem bao, medula ssea, linfonodos (alm do
fgado, mucosa intestinal e sangue perifrico), atravs do exame direto
a fresco e pelo exame de preparaes permanentes coradas por diferentes mtodos de colorao (Giemsa, Leishmann ou Wright). O material colhido pelo aspirado da medula ssea ou do bao pode ser inoculado
em meios de cultura. Esfregaos em lmina por aposio de material colhido
de ndulos linfticos e corado pelos mtodos de Giemsa e/ou Leishmann
so indicados para a demonstrao da leishmaniose e da toxoplasmose
humana.

LCERAS CUTNEAS
Diagnstico de Leishmania spp. (leishmaniose tegumentar americana) .
1,6

Apesar da ampla variedade de formas clnicas encontradas em pacientes com leishmaniose tegumentar americana (LTA), esta agrupada em trs
tipos bsicos: leshmaniose cutnea (LC), leishmaniose cutaneomucosa (LCM)
e leishmaniose cutnea difusa (LCD). As formas amastigotas da leishmaniose
so demonstradas pelo exame de esfregaos permanentes corados de preparados histopatolgicos de bipsias das bordas das lceras, corados pelos
mtodos de Giemsa, Leishmann e/ou Wright. O material no deve ser colhido da superfcie ou das reas necrticas da lcera (ver Captulo 14).

BIPSIA

OU

CURETAGEM

NAS

BORDAS

DAS

L ESES

Observaes
1. Fazer bipsia ou curetagem nas bordas das leses.
2. Retirar um fragmento com o qual feito esfregao em lmina por
aposio, e corar pelo mtodo de Giemsa e/ou Leishmann (o material colhido pressionado entre duas lminas, formando-se o esfregao quando as
lminas so separadas).
3. Deixar secar temperatura ambiente e corar como os esfregaos
estirados sangneos.
4. Uma poro do material colhido poder ser inoculada em meios de
cultura apropriados (ver Captulo 14)5.
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CAPTULO 9

213

LQUIDO C EFALORRAQUIDIANO
Diagnstico de amebas de vida livre (Naegleria fowleri e Acantamoeba
spp.) tripanossomos africanos (Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e larvas de Angiostrongylus cantonensis 1,6,8
(ver Captulos 13, 17 e 21)1,6.
O primeiro caso de meningoencefalite humana causada por ameba de
vida livre foi diagnosticado (post mortem) e descrito, em 1967, na Austrlia. A partir da numerosos casos fatais foram diagnosticados nos mais diversos pases: Austrlia, Blgica, Repblica Tcheca, Inglaterra, ndia, Nova
Guin, Nova Zelndia, Nigria, EUA, Panam, Porto Rico, Venezuela e Brasil.
Essas amebas so freqentemente encontradas no solo e na gua de lagos
e rios.
As formas trofozoticas so ativas e alimentam-se de bactrias; os cistos so encontrados no solo seco ou na poeira. A N. fowleri, comum em
lagos e brejos, apresenta em certos perodos de seu ciclo de vida livre formas flageladas. Estas entrariam em contato mais facilmente com os banhistas. J as espcies Acanthamoeba no apresentam formas flageladas, o que
explica o menor nmero de casos humanos provocados por essas ltimas
amebas. As formas flageladas movem-se ativamente na gua e, ao entrarem em contato com a mucosa nasal, transformam-se em trofozotos ativos;
da, via epitlio neuroolfativo, atingem o crebro, onde se disseminam por
via sangnea.
A meningoencefalite rara; entretanto, o exame do lquido cefalorraquidiano pode revelar amebas, usualmente, N. fowleri. Para a identificao
do organismo colocar uma ou duas gotas do sedimento no centrifugado do
lquido da espinha entre lmina e lamnula e pesquisar a presena de amebas
mveis; tambm devem ser preparados esfregaos permanentes corados pelo
mtodo de Giemsa e/ou Wright. O exsudato do lquido da espinha deve ser
examinado pela microscopia ptica e/ou pela microscopia de contraste de
fase. As amebas de vida livre no lquido cefalorraquidiano devem ser diferenciadas de outras clulas sangneas mveis (leuccitos) ou de clulas de
tecidos, as quais so usualmente menores em tamanho. Nos esfregaos
permanentes corados do lquido cefalorraquidiano, as amebas so rapidamente
identificadas pelas caractersticas do ncleo, as quais no possuem cromatina
nuclear, apresentando um grande cariossoma. A aparncia do lquido da espinha
varia de turva a purulenta (com ou sem hemcias), com algumas centenas
de leuccitos a um nmero superior a 20.000 leuccitos (principalmente
neutrfilos). A ausncia de bactrias nesse tipo de lquido espinhal, chama
a ateno da possibilidade de uma meningoencefalite por ameba. Quando o
lquido espinhal colocado em uma cmara de contagem, todos os organismos que sedimentam na base da cmara, tendem a tomar a forma arredondada, por esta razo, melhor o exame do lquido entre lmina e lamnula
do que em cmara de contagem. Atravs do exame direto a fresco e pelos
esfregaos permanentes corados as formas tripomastigotas so demonstradas nos estgios finais da tripanossomase africana.
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214

CAPTULO 9

A meningite eosinoflica uma infeco zoontica do homem, transmitida pelo A. cantonensis, verme dos pulmes de ratos. Freqentemente, a
aspirao do lquido cerebroespinal determina a etiologia da meningite, pelo
encontro de vermes adultos imaturos do parasito no lquido. A presena do
verme e de grande nmero de eosinfilos em esfregaos permanentes corados indicao de infeco com esse verme.
O material de ndulos linfticos, bao, fgado, medula ssea, lquido
cefalorraquidiano e olhos ou nasofaringe, quando examinado para a presena de parasitos, deve ser processado da maneira a seguir.

LQUIDO CEFALORRAQUIDIANO C OLHIDO

POR

ASPIRAO

Observaes
1. Colocar uma ou duas gotas de soluo salina a 0,85% em uma lmina de microscopia e misturar igual volume de material lquido colhido por
aspirao, cobrindo a preparao com uma lamnula.
2. A suspenso no deve ser muito espessa, nem muito diluda. O lquido cefalorraquidiano no deve ser diludo antes do exame.
3. Examinar a preparao salina com os aumentos de 100X e 400X para
a presena de organismos mveis.
EXAME DOS TECIDOS
As amostras de tecidos, colhidas para a identificao de parasitos, so
enviadas ao laboratrio em diferentes formas: a) espcimes frescos, material de bipsias usado para o exame direto a fresco; b) preparaes prensadas; c) esfregaos em lmina por aposio, e d) tecidos triturados para a
semeadura em meios de cultura apropriados ou para a inoculao em animais de experimentao. O material de bipsia ou tecidos removidos durante cirurgia ou em necrpsia podem ser fixados e examinados atravs de
coloraes histolgicas.

PELE
Diagnstico de Leishmania spp. (leishmaniose tegumentar americana),
Entamoeba histolytica (amebase secundria), Acanthamoeba spp. (amebase
primria), microfilria de Onchocerca volvulus e microfilria de Mansonella
streptocerca 1,6,7 (ver Captulos 14, 18, 19 e 21).
Fragmentos de pele com suspeita de parasitismo por leishmania ou ameba
podem ser fixados, processados e corados como os outros espcimes de tecidos.
Para o diagnstico da leishmaniose cutnea e mucocutnea, aps a anestesia local, fazer bipsia ou curetagem nas bordas da leso. Retirar um fragmento com o qual feito o esfregao em lmina por aposio, corado pelos
mtodos de Giemsa ou Leishmann. A cultura realizada a partir de frag Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 9

215

mentos do tecido triturado inoculado no meio de cultivo MacNeal, Novy e


Nicolle (NNN) associado ao meio LIT (Liver Infusion Triptose). O mtodo de escolha para o diagnstico das infeces humanas com O. volvulus
e M. streptocerca o uso de pedaos superficiais da pele. As microfilrias
de ambas as espcies ocorrem principalmente na pele; entretanto, a microfilria
O. volvulus em raras ocasies encontrada no sangue e ocasionalmente
na urina. Os melhores resultados so obtidos pela retirada de um fragmento
superficial de pele (retalho cutneo) na regio do corpo mais afetada. As
microfilrias da O. volvulus podem estar nos capilares sangneos do retalho cutneo, dificultando o diagnstico1. O diagnstico da amebase cutnea
pode ser realizado pela retirada de fragmentos cutneos da pele e subseqente colorao pelo mtodo da hematoxilina-eosina (HE).

MTODO DO FRAGMENTO SUPERFICIAL DA PELE (RETALHO CUTNEO)


Reagentes
1. Soluo salina fisiolgica a 0,85% (ver p. 35)
2. Corante de Giemsa (ver p. 296)
3. lcool metlico absoluto, livre de acetona (CH 4O)
Mtodo
1. Em uma lmina de microscopia colocar o fragmento da pele e uma
ou duas gotas de soluo salina a 0,85%, cobrindo a preparao com uma
lamnula ou com uma placa de Petri para prevenir a evaporao.
2. Examinar a preparao depois de 30 a 60 minutos. As microfilrias
abandonam o fragmento de pele, sendo vistas ao microscpio movimentando-se ativamente. De preferncia, a observao dever ser realizada com
aumentos de 10X, ou em microscpio de dissecao.
3. Deixar o lquido que contm as filrias secar temperatura ambiente. Fixar a preparao com lcool metlico absoluto e corar pelo mtodo de
Giemsa. As microfilrias devem ser estudadas para que seja estabelecida a
caracterizao morfolgica e a identificao especfica dos organismos, para
o diagnstico diferencial entre O. volvulus e M. streptocerca (ver Captulos 18 e 19).

TECIDOS M USCULAR

SUBCUTNEO

Diagnstico de larvas de Trichinella spiralis, vermes adultos de


Onchocerca volvulus, vermes adultos de Mansonella streptocerca 1,6.
A triquinelose humana geralmente diagnosticada pela observao clnica da sintomatologia, pelo estudo epidemiolgico do consumo dos alimentos e pelos testes imunolgicos. Entretanto, freqentemente a confirmao
da infeco realizada pela demonstrao direta das larvas nos tecidos. A
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216

CAPTULO 9

presena das larvas nos tecidos demonstrada de trs maneiras: a) comprimir um pequeno pedao de msculo fresco entre duas lminas de microscopia
e examinar ao microscpio com pequeno aumento, ou em microscpio de
dissecao; b) digesto do tecido fresco para libertar a larva, e c) demonstrao da larva atravs de corte histolgico do msculo. Os tecidos musculares que mais freqentemente contm a larva so a lngua, msculo masseter
e outros tecidos musculares metabolicamente ativos.

RETO E BEXIGA
Diagnstico de ovos de Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum
e Schistosoma haematobium 1,6 .
Devido s dificuldades em demonstrar ovos de S. mansoni e de S.
japonicum em infeces leves e em crnicas antigas, o exame do material
de bipsia do reto indicado para o diagnstico da esquistossomose intestinal e japnica. A bipsia retal foi proposta como tcnica de diagnstico
anatomopatolgico da esquistossomose, em 1943, tendo sido, posteriormente, padronizada para permitir anlise mais precisa da atividade da infeco
por diferentes equistossomas. A retirada de pequeno fragmento da mucosa
retal, na altura das vlvulas de Houston, permite o diagnstico da esquistossomose mansnica, por meio da identificao dos ovos do trematdeo com
maior freqncia do que quando se utiliza apenas um exame coproscpico
pela tcnica da sedimentao espontnea ou de Kato-Katz. A bipsia retal
tem sido utilizada apenas na avaliao da atividade de drogas antiesquistossomas.
O exame do tecido da mucosa da bexiga pode revelar ovos de S.
haematobium quando os ovos no podem ser demonstrados na urina. Em
bipsia do reto, a viabilidade dos ovos pode ser demonstrada pelo estudo dos
miracdios presentes nos ovos.

RASPADOS

M ATERIAL

DE

BIPSIA

DA

CRNEA

Mtodo de colorao para o diagnstico da ceratite pela Acanthamoeba


spp. .
1,6

Esse mtodo foi desenvolvido para a colorao de esfregaos para o


diagnstico de ceratite, uvete e ulceraes da crnea que esto associadas
com a Acanthamoeba spp. O diagnstico rpido da ceratite envolve o uso
de calcofluor branco, corante quimiofluorescente (Fluorescent Brightener
28 Sigma), com afinidade para polmeros polissacardicos dos cistos da
ameba. Este mtodo mostrou ser um procedimento excelente para o exame
de raspados e de material de bipsia da crnea (ver Captulo 21).
Reagentes
1. lcool metlico absoluto (CH4O), livre de acetona
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CAPTULO 9

217

2. Soluo corante
Calcofluor branco (C 40 H 44N 12 O 10S 2 )
Azul de Evans (CI 23860) (C34H 24N 6O 14S4Na 4)
gua destilada-deionizada

0,1g
0,1ml
100ml

Tabela 9.1
Coloraes para a Identificao de Parasitos de Diferentes Tecidos
(Esfregaos Preparados por Aposio)
Tecido

Provvel Parasito

Corante

Pulmes

Pneumocystis carinii
(classificado como fungo)
Microspordios

Giemsa, nitrato de prata metenamina,


calcofluor, reagentes imunoespecficos
Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME
Giemsa, reagentes imunoespecficos
Coloraes derivadas de ZiehlNeelsen*
Giemsa
Giemsa
Coloraes derivadas de ZiehlNeelsen, reagentes imunoespecficos
Giemsa e tricrmico
Giemsa e tricrmico
Giemsa e tricrmico
Giemsa e tricrmico
Giemsa e reagente imunoespecfico
Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME
Giemsa
Giemsa
Giemsa
Giemsa e tricrmico
Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME
Giemsa e tricrmico
Giemsa e tricrmico

Toxoplasma gondii
Cryptosporidium parvum
Fgado

Toxoplasma gondii
Leishmania donovani
Cryptosporidium parvum

Crebro

Naegleria sp.
Acanthamoeba sp.
Balamuthia mandrillaris
Entamoeba histolytica
Toxoplasma gondii
Microscopordios
(Encephalitozoon sp.)
Leishmania spp.
Onchocerca volvulus
Mansonella streptocerca
Acanthamoeba sp.
Microspordios

Pele

Nasofaringe,
cavidade sinovial

Acanthamoeba sp.
Naegleria sp.
Intestino
Intestino delgado

Cryptosporidium parvum
(tambm no intestino
grosso)
Jejuno
Microspordios
(Enterocytozoon bieneusi,
Encephalitozoon
intestinalis)
Duodeno
Giardia lamblia
Clon
Entamoeba histolytica
Crnea, conjuntiva Vrios gneros de
microspordios
Acanthamoeba sp.
Msculos

Trichinella spiralis
Microspordios
(Plestophora sp.)

Coloraes derivadas de ZiehlNeelsen, reagentes imunoespecficos


Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME

Giemsa e tricrmico
Giemsa e tricrmico
Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME
Giemsa, tricrmico e calcofluor para
cistos
Exame direto a fresco, preparao
por aposio
Tricrmico modificado (colorao de
Gram + Chromotrope), ME

Adaptado: Garcia e Bruckner 6; ME = microscopia eletrnica; *Coloraes pelos derivados


de Ziehl-Neelsen = acid fast stain.

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218

CAPTULO 9

Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar em lmina de microscopia o material colhido do raspado da
crnea. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Fixar o esfregao com lcool metlico absoluto durante trs a cinco
minutos.
4. Corar o esfregao durante cinco minutos com a soluo corante.
5. Virar as lminas sobre uma toalha de papel, para que o excesso do
corante seja retirado.
6. Cobrir os esfregaos com lamnula e examinar atravs da microscopia de fluorescncia. Os cistos da ameba apresentam a colorao quimiofluorescente azul-claro (os trofozotos no so corados).
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

Ash LR, Oriehl TC. Parasites: a guide to laboratory procedures and identification. Chicago
(Ill): ASCP Press, 1991.

2.

Barlett MS. Expectorated sputum: Direct and stained preparations. In: Insenberg HD
ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM Press, 7.7.1.17.7.1.4. v.2, 1992.

3.

Barlett MS. Indiced sputum: Stained preparation for detection of Pneumocystis carinii.
In: Insenberg HD ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC):
ASM Press, 7.7.2.1-7.7.2.8. v.2, 1992.

4.

Barlett MS. Aspirates and bronchospy specimes. In: Insenberg HD ed. Clinical
Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM Press, 7.7.3.1-7.7.3.6. v.2,
1992.

5.

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Garcia LS, Bruckner DA. Diagnostic Medical Parasitology. 3nd ed. Washington (DC):
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Melvin DM, Brooke MM. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites.
3rd ed. HHS publication N. (CDC)82-8282. Atlanta: Laboratory Training and Consultation
Division, Centers for Disease Control, 1982.

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Markell EK, John DT, Krotoski, WA. Markell and Voges Medical parasitology. 8th ed.
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6.

Wittner M. ed. The Microsporidia and Microsporidiosis. Washington, DC: ASM Press,
1999.

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220

CAPTULO 9

3
Parasitos Emergentes
e Oportunistas

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222

CAPTULO 10

CAPTULO

10

Mtodos de Colorao para


Coccdios Intestinais
Geraldo Attilio De Carli
Hrcules Moura

CONSIDERAES GERAIS
Os coccdios intestinais dos gneros Cryptosporidium,
Cyclospora, Isospora e Sarcocystis so parasitos intracelulares obrigatrios que habitam a mucosa do intestino delgado do
homem. Os gneros Cryptosporidium e Cyclospora constituem dois grupos de protozorios parasitos, responsveis por gastroenterite transitria. A criptosporidiose uma antropozoonose,
muito bem conhecida pelos veterinrios, que veio fazer parte da
patologia humana, causando problemas graves e prolongados em
imunodeficientes, notadamente em doentes acometidos pela sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS). As manifestaes da criptosporidiose podem ser agrupadas em dois tipos, dependendo do estado do portador: gastroenterite transitria
em pacientes imunocompetentes, e manifestaes persistentes,
com sinais e sintomas clnicos marcados em pacientes imunodeprimidos 29. O gnero Cyclospora encontrado nas fezes de
pacientes imunodeprimidos29, de aidticos e de viajantes provenientes de pases em desenvolvimento e/ou de regies tropicais
tem sido caracterizado por moderada severa fadiga, nuseas,
anorexia, mialgia, perda de peso e intensa diarria. Durante os
ltimos anos, a ciclosporose tem sido descrita em vrios surtos
de diarria nas Amricas Central e do Sul, no Caribe, na frica, em Bangladesh, no sul e oeste da sia, na Austrlia, na
Inglaterra e na Europa oriental. As rotas de transmisso da
ciclosporose ainda so desconhecidas; e, provavelmente, a principal
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CAPTULO 10

223

a fecal-oral, diretamente e, ou via gua. A infeco por I. belli ou isosporose


tem sido diagnosticada em pacientes com SIDA/AIDS. A maioria dos
protozorios intestinais transmitida atravs da contaminao fecal dos alimentos e lquidos. Entretanto, o homem infectado pelo Sarcocystis hominis
e pelo Sarcocystis suihominis pela ingesto, respectiva, de carne de bovinos ou de sunos, crua ou malcozida, contaminada com sarcocistos maduros
contendo bradizotos. As infeces pelo gnero Sarcocystis ocorre em uma
variedade de hospedeiros, incluindo o homem. A sarcocistose no uma doena
muito bem conhecida no homem. Os hospedeiros imunocomprometidos
infectados pelas espcies S. hominis e S. suihominis apresentam febre, diarria
grave, dor abdominal e perda de peso. Os oocistos maduros e os esporocistos
livres desses coccdios so transparentes e de difcil visualizao em esfregaos
no corados, necessitando de colorao especial para serem identificados.
A morfologia dessas formas similar. Os estgios de diagnstico (oocistos)
dos coccdios so diferenciados pelo tamanho e a morfologia deve ser cuidadosamente examinada pela microscopia ptica. Os oocistos podem no
conter o esporocisto (como o Cryptosporidium), mas todas as espcies
possuem as formas de esporozotos. A morfologia comparada entre os estgios de diagnstico dos microspordios e dos coccdios apresentada na
forma de diagrama na Fig. 10.1.

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM
At 1978, os oocistos do Cryptosporidium spp. no eram pesquisados
nas fezes dos hospedeiros humanos infectados. Conseqentemente, o diagnstico biolgico dependia da evidenciao histolgica desse organismo nos
tecidos. Mtodos e tcnicas especiais para identificar os oocistos nas fezes

Microspordio

Cryptosporidium

Cyclospora

Isospora

5m

Caractersticas

Microspordio

Cryptosporidium

Cyclospora

Isospora

Tamanho do oocisto (m)


No de esporocistos
No de esporozotos/esporocisto
Tamanho do esporo (m)

1-5

4-5
0
4 (por oocisto)

8-10
2
2

20-30x10-19
2
4

Fig. 10.1 Morfologia comparada entre os estgios de diagnstico dos microspordios e


coccdios. (Adaptada de Collins R. Protozoan parasites of the intestinal tract: A review of
coccidia and microsporidia. JAOA, 10:593-598, 1997.)

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224

CAPTULO 10

de bezerros infectados1,33 e no homem2,7,22-24,27,56,58 trouxeram a oportunidade de diagnosticar e monitorar o curso da criptosporidiose com rapidez e
acuidade. A presena de oocistos de C. parvum nas fezes de pessoas
imunodeficientes e a participao evidente do parasito na sintomatologia da
sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS) exigem do laboratrio o conhecimento dos mtodos e das tcnicas necessrias para um diagnstico biolgico rpido e confivel de uma nova parasitose atribuda a uma
protozoose intestinal humana. O diagnstico definitivo da criptosporidiose baseiase na demonstrao dos oocistos nas fezes. Entretanto, inmeras dificuldades so encontradas na realizao desse diagnstico (Figs. 10.2 e 10.3).
Nos indivduos imunocompetentes, os parasitos so identificados nas fezes
trs dias aps a contaminao e o tempo de emisso curto (duas ou trs
semanas), no havendo abundncia. Nos pacientes imunodeprimidos, a permanncia dos oocistos pode ser indefinida, correspondendo aos perodos de
diarria. Esta diarria aquosa acarreta a diluio dos parasitos e a acelerao das evacuaes, com presena de muco e de numerosos restos de vegetais que podem mascarar a pesquisa. A emisso dos oocistos descontnua,
sendo necessria a realizao de vrias colheitas e exames a cada trs dias
antes de concluir pela ausncia do protozorio. Sendo os parasitos raros, as
leveduras, ao contrrio, com muita freqncia so abundantes e devero ser
diferenciadas do Cryptosporidium, que tem o mesmo tamanho.
Em razo do risco de contaminao do operador, necessrio tomar
precaues durante a manipulao (usar luvas durante todas as etapas dos
procedimentos de colorao, descontaminar o material e incinerar os resduos). Quando as fezes forem provenientes de pacientes com SIDA/AIDS,
os laboratrios devero tomar os mesmos cuidados usados para a hepatite.
Considervel experincia requerida com as tcnicas de concentrao e
com os mtodos de colorao para a obteno de um diagnstico exato. Os
mtodos de colorao derivados da fucsina-fenicada foram modificados e
aperfeioados. Os mtodos modificados de Ziehl-Neelsen (a quente) e o de

Fig. 10.2 Oocistos de Cryptosporidium parvum, em exame direto a fresco, pela microscopia de contraste de fase ou do contraste diferencial de interferncia (DIC). Os oocistos
so arredondados (variando entre 4,2 e 5,4 m de dimetro). Os esporozotos so visveis
nos oocistos indicando que ocorreu a esporulao. (Cortesia DPDx, the CDC website for
parasitology diagnosis, EUA.)

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CAPTULO 10

225

Fig. 10.3 Cryptosporidium spp.: A) Mucosa do trato intestinal revestida por oocistos de
Cryptosporidium; B) Meronte rompido mostrando merozotos (Microfotografias pelo microscpio eletrnico de varredura (MEV) Segundo Gardiner et al. An Atlas of Protozoa Parasites
in Animal Tissues. USDA, Agriculture Handbook n. 651; 1988 (on line). Disponvel em URL:
http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasit (1999 Set 3).

Kinyoun (a frio) foram descritos somente em 198327,38. Modificaes adicionais incluram a incorporao do dimetilsulfxido (DMSO) colorao de
Ziehl-Neelsen13,50 e a adio do tergitol modificao a frio do procedimento
de Kinyoun39. Uma das vantagens dos mtodos derivados de Ziehl-Neelsen
a facilidade de identificao de outros parasitos (p. ex.: Isospora e
Cyclospora) no esfregao fecal, os quais no seriam diagnosticados atravs de testes especficos, como a imunofluorescncia e/ou a enzimaimunoensaio. Mtodos alternativos de microscopia ptica incluem: a colorao negativa17,22,34,49; a colorao a quente da safranina-azul-de-metileno8,9;
a colorao modificada de Kohn 5; a colorao modificada de Koster 36; a
anilina-carbometil violeta e a tartrazina40. Os mtodos de colorao pelos
fluorocromos incluem: a auramina O47; a auramina-rodamina27,38, a auraminafucsina-fenicada 16 ; alaranjado de acridina 27,38 ; a mepacrine 59 , a diaminofenilidona (DAPI) e o iodeto de propdio37. Os mtodos de colorao pelos
fluorocromos exibem um potencial de alta sensibilidade, comparvel aos
mtodos derivados da fucsina-fenicada, mas devido inespecificidade qumica de todos os mtodos de colorao, resultados falso-positivos so freqentes e numerosos oocistos podem no ser corados. Alguns investigadores utilizam como procedimento de triagem a microscopia de contraste de
fase ou do contraste diferencial de interferncia (DIC ou Nomarski) para a
observao direta de espcimes fecais frescos ou concentrados 4,20,30,57
(Figs.10.4 e 10.5) (Tabelas 10.1 e 10.2).

CYCLOSPORA CAYETANENSIS
A Cyclospora cayetanensis, coccdio protista, um protozorio patognico para o homem. A ciclosporose caracterizada por moderada
severa fadiga, nuseas, anorexia, mialgia, perda de peso e intensa diarria 10,43-45,54. Os oocistos da Cyclospora cayetanensis so excretados de
forma intermitente, espordica e raramente em pequeno nmero. Os oocistos
no so esporulados quando excretados nas fezes, eles necessitam de uma
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226

CAPTULO 10

Fig. 10.4 Desenho de oocisto de Criptosporidium spp.

a duas semanas em condies ideais de temperatura para se tornarem


esporulados. Os oocistos esporulados so arredondados, com 8 a 10m de
dimetro. Cada oocisto esporulado possui dois esporocistos ovais (4,0 x
6,3m) e cada esporocisto apresenta dois esporozotos (1,2 x 9,0m)45. Os
oocistos possuem uma evidente e bem definida parede cstica e mostram
internamente agrupamentos de glbulos refrteis, rodeados por uma
membrana espessa. Esses glbulos internos coram-se de castanho pela
soluo de iodo. Os oocistos da Cyclospora so duas vezes maiores em
tamanho do que os estgios de diagnstico de C. parvum (arredondados,
esfricos ou ovais, com 4 a 5m de dimetro) e um tero menores do que
a I. belli (elipsides, 20 a 30 x 10 a 19m) 6,45 (Tabelas 10.1 e 10.2). A
morfometria com o micrmetro ocular indispensvel para a identificao
das espcies31. Devido s limitaes do exame microscpico de preparaes a fresco, vrios mtodos de colorao favorecem o diagnstico de
Cyclospora cayetanensis. Os oocistos de Cyclospora so diagnosticados
pela colorao de preparaes fixadas e coradas pelos derivados de ZiehlNeelsen 25,39,57, pela safranina modificada 8,60, pela autofluorescncia (ao
da luz ultravioleta UV) 12,18 e pela utilizao da reao em cadeia da

Fig. 10.5 Oocisto de Cryptosporidium parvum corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen


modificado. A seta indica oocisto com quatro esporozotos. Aumento 1.000X. (Cortesia da
Dra. Regina Maura Bueno Franco. Departamento de Parasitologia, IB/UNICAMP, Campinas,
SP.)

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CAPTULO 10

227

polimerase (PCR)48. As variaes da colorao de Ziehl-Neelsen no so


to eficazes para essa espcie como para os outros coccdios intestinais
(C. parvum e I. belli) (Figs. 10.4 e 10.8).
Curiosa e inexplicavelmente, a Cyclospora exibe marcada variabilidade de colorao quando corada pelos derivados de Ziehl-Neelsen, mas alguns oocistos no so visualizados. Os oocistos coram-se do rosa ao vermelho, ao prpura intenso sobre um fundo azul de intensidade de cor varivel
(Fig. 10.9). Entretanto, os oocistos no apresentam morfologia interna bem
definida, mostrando intensidade de cor varivel. Essa variabilidade de colorao deixa de ser um problema nas infeces macias, porque sempre sero
observados vrios oocistos corados. Foram relatados casos em que todos
os oocistos presentes no esfregao fecal no foram corados6,25,30.
Em preparaes coradas pelos derivados de Ziehl-Neelsen os oocistos
so uniformes no tamanho, permanecendo com a mesma grandeza como foram
descritos no exame direto a fresco. Entretanto, com mais freqncia do que
nas preparaes a fresco, os oocistos no so perfeitamente arredondados.
A parede dos oocistos apresenta uma tpica aparncia rugosa ou ondulada
e colapso ou distoro em um ou em vrios lados25,30. Dependendo do grau
de colorao, os oocistos podem variar em cor, desde organismos incolores,
ou de colorao vermelha clara, a um intenso e brilhante prpura avermelhado.
Essa variabilidade na intensidade de colorao, apesar de ser uma das caractersticas da Cyclospora, tem indubitavelmente levado a muitos erros no
diagnstico de laboratrio18,19. Na colorao da hematoxilina frrica modificada pela incorporao do corante de Kinyoun (soluo de fucsina-fenicada),
os oocistos da Cyclospora cayetanensis aparecem arredondados de colorao rosa ao vermelho prpura sobre um fundo cinza da preparao 46,51,52.
A colorao da safranina, desenvolvida para a identificao de oocistos de
Cryptosporidium em esfregaos fecais, foi modificada pela incluso do
aquecimento em forno de microondas 8,18,32,60. A incluso do aquecimento
em forno de microondas ao procedimento de colorao resultou em uma colorao uniforme dos oocistos. Esse procedimento de colorao no somente superior s coloraes derivadas de Ziehl-Neelsen, mas mais rpido, seguro e de fcil realizao. Os oocistos da Cyclospora cayetanensis
corados pela safranina modificada exibem as seguintes caractersticas:
tamanho de 8 a 10m de dimetro, parede rugosa e a colorao varia do
vermelho a um brilhante vermelho-alaranjado. A parede dos oocistos permanece autofluorescente, sendo mais evidente quando observada pelo microscpio de contraste diferencial de interferncia (DIC ou Nomarsky)30
(Fig.10.9).
A demonstrao dos oocistos pelo exame direto a fresco aumentada
ou intensificada pela microscopia de epifluorescncia12. Os oocistos exibem
marcada autofluorescncia, a qual facilmente observada pelo microscopista.
A autofluorescncia dos oocistos de C. parvum to tnue que no exibe
valor no diagnstico desse coccdio. Entretanto, os oocistos de I. belli apresentam uma brilhante e visvel autofluorescncia 6,12,30,57. Os oocistos da
Cyclospora autofluorescem em verde forte (filtro de excitao de 450 a
490 DM) ou em azul intenso (filtro de excitao de 365DM), quando submetidos ao da luz ultravioleta (UV). A fluorescncia inespecfica re Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

228

CAPTULO 10

duzida pela adio de uma gota de soluo de iodo de DAntoni antes do


exame. As amostras fecais frescas fixadas pelo lcool metlico ou preservadas pelo SAF so usadas na microscopia de fluorescncia pela luz ultravioleta
(UV) (Figs. 10.7 e 10.9) (Tabelas 10.1 e 10.2).
Os oocistos no se coram pelo tricrmico, mas aparecem como esferas torcidas, claras, plidas e arredondadas, como tambm no se coram pela
hematoxilina frrica, Grocott-Gomori, prata-metenamina, iodo ou cido peridico de Schiff (PAS)30,60.

ISOSPORA BELLI
A infeco pela I. belli, ou isosporose, tem sido diagnosticada em pacientes com SIDA/AIDS. Os sintomas incluem diarria, nuseas, febre, cefalia
e perda de peso. A doena pode persistir por meses ou anos. Em preparaes fixadas e coradas, o oocisto tipicamente elipside, medindo em mdia 20 a 30m de comprimento e 10 a 19m de largura, com as extremidades afuniladas (regies polares), apresentando uma dupla parede lisa e hialina
(Tabelas 10.1 e 10.2). Quando excretados nas fezes, os oocistos so imaturos (no esporulados) contendo um esporoblasto. Depois da excreo os
oocistos maduros dividem-se formando dois esporoblastos. Os esporoblastos
segregam cada qual uma membrana resistente em torno de si, transformando-se em esporocistos, com quatro esporozotos dentro de cada um. Os
oocistos da I. belli so diagnosticados pelo exame direto a fresco, pela
colorao de preparaes fixadas e coradas pelos derivados de Ziehl-Neelsen,
pela microscopia de contraste diferencial de interferncia (DIC ou Nomarsky)
e pela epifluorescncia. Os oocistos autofluorescem em azul intenso (filtro
de excitao de 330 a 380 DM) quando submetidos ao da luz ultravioleta
(UV) 6,11,30 (Figs.10.7 e 10.8).
MTODOS DE COLORAO
Os mtodos recomendados para a colorao de oocistos de C. parvum,
Cyclospora cayetanensis e I. belli no so indicados para amostras fecais
preservadas pelo fixador lcool-polivinlico (fixador APV). As coloraes de
rotina, como tricrmico e hematoxilina frrica, no apresentam bons resul-

Tabela 10.1
Coccdios Intestinais Humanos: Estgio de Diagnstico, Forma e Tamanho
Espcie

Estgio de
Diagnstico

Forma

Tamanho ( m)

Cryptosporidium parvum
Cyclospora cayetanensis
Isospora belli
Sarcocystis
S. hominis
S. suihominis

Oocisto
Oocisto
Oocisto
Esporocisto

Esfrico ou oval
Esfrico
Elipside
Ovide

3-6 (mdia 4-5)


8-9 (mdia 8-10)
20-30 x 10-19
9-16 x 7,5-12
(15-19 x 15-20)

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CAPTULO 10

229

tados na identificao destes coccdios. A colorao de Ziehl-Neelsen e suas


variaes so os procedimentos que oferecem os melhores resultados (Fig.
10.4) (Tabela 10.3).
Nota: Coloraes derivadas de Ziehl-Neelsen = acid fast stain.

MTODO DE HENRIKSEN-POHLENZ
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou preservadas em soluo salina de formaldedo a 10%.
Outras amostras, como contedo duodenal, biliar e pulmonar (escarro, lavado broncoalveolar e material de bipsia) favorecem com freqncia a colorao e o diagnstico de oocistos das espcies C. parvum e I. belli.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

lcool metlico (CH4O)


lcool etlico (C2H6O)
Fucsina bsica (CI 42500) (C19H19N3O)
Fenol (fundido a 44C) (C6H6O)
cido sulfrico concentrado (H2SO4)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2H2O4]
Resina sinttica (Cytoseal 60, Mounting Medium, Low Viscosity)

Preparao das Solues


1. Corante de Kinyoun (soluo de fucsina-fenicada)
a. Soluo A
Fucsina bsica
lcool etlico a 95% (v/v)

1,5g
100ml

b. Soluo B
Fenol (fundido a 44C)
gua destilada-deionizada q.s.p.

5g
100ml

c. Soluo Corante
Soluo A
Soluo B

10ml
90ml
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230

CAPTULO 10

Filtrar a soluo e armazenar temperatura ambiente at o momento


do uso. Estvel por um ano.
2. Soluo Aquosa de cido Sulfrico a 2%
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo Aquosa de Verde de Malaquita a 5%
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao com fezes frescas ou preservadas.
3. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar com lcool metlico por cinco minutos e deixar secar temperatura ambiente (cubas de Coplin podero ser usadas nessa fase do processo de colorao).
5. Corar com o corante de Kinyoun (a frio) durante uma hora (cubas
de Coplin podero ser usadas nessa fase do processo de colorao).
6. Escorrer o corante e lavar com gua corrente.
7. Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 2%.
8. Lavar com gua corrente.
9. Corar o fundo com soluo de verde de malaquita a 5% por oito minutos
(Cubas de Coplin podero ser usadas nessa fase do processo de colorao).
10. Lavar com gua corrente e secar.
11. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
Caractersticas da Colorao
Os oocistos de Cryptosporidium aparecem arredondados com 3 a 5m,
de colorao vermelha intensa e brilhante ou rosa sobre um fundo azulesverdeado da preparao. A parede espessa, o citoplasma finamente
granulado com uma zona central clara. Os corpos residuais e os esporozotos
so corados em castanho. As leveduras e as bactrias aparecem uniformemente coradas em azul-esverdeado24 (Figs. 10.7 e 10.8).
Observaes
1. A diferenciao depende do corante, de ensaios preliminares sobre
fezes positivas para adaptar a concentrao do cido a ser utilizada e da
definio dos tempos de diferenciao.
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CAPTULO 10

231

2. Current23 usa a soluo aquosa de cido sulfrico a 10% na etapa 6


e os corantes light green SF yellowish (CI 42095) ou azul-de-metileno a
0,3% diludos em gua destilada-deionizada na etapa 8.
3. Outros autores preferem lavar o esfregao na etapa 7 com lcool
etlico a 50% (v/v). Alguns procedimentos usam o mtodo a quente. Entretanto, a colorao a frio apresenta os melhores resultados.
4. O escarro dever ser tratado com soluo de formaldedo a 10% e
processado como as amostras fecais.
5. Cubas de Coplin devero ser usadas em todas as etapas do procedimento de colorao.

MTODO MODIFICADO

DE

KINYOUN (A FRIO)

O mtodo de Kinyoun modificado (a frio), no requer o aquecimento


da fucsina-fenicada usada na colorao. Esse mtodo indicado para a
colorao de C. parvum e I. belli. A Cyclospora cayetanensis tem sido
descrita como cido-resistente-varivel, sendo recomendadas modificaes
dessa colorao para demonstrar estes organismos30,38,41,53 (Fig.10.5A) (ver
anexo deste Captulo).
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a
10%. Garcia e Bruckner30 usam fezes preservadas em SAF. Outras amostras, como contedo duodenal, biliar e pulmonar (escarro, lavado broncoalveolar e material de bipsia) favorecem com freqncia a colorao e o diagnstico dos oocistos das espcies C. parvum e I. belli.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

lcool metlico (CH4O)


lcool etlico (C2H6O)
Fucsina bsica (CI 42500) (C19H19N3O)
Fenol (fundido a 44C) (C6H6O)
cido sulfrico concentrado (H2SO4)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2H2O4]
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Preparao das Solues


1. Corante de Kinyoun (Soluo de fucsina-fenicada)
Fucsina bsica
Fenol, fundido a 44C

4g
8ml

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232

CAPTULO 10

lcool etlico a 95% (v/v)


gua destilada-deionizada q.s.p.

20ml
100ml

Dissolver a fucsina bsica no lcool etlico e adicionar a gua destilada, lentamente, com agitao. Adicionar 8ml de fenol ao corante, com uma
pipeta com bulbo de borracha.
Nota: O corante Fuchsin-Carbol (Kinyoun Acid Fast) pode ser adquirido comercialmente (WWR Scientific Products, EUA).
2. Soluo lcool-cido (v/v)
lcool etlico
cido sulfrico

90ml
10ml

Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.


3. Soluo Aquosa de Verde de Malaquita a 3% (m/v)
Verde de malaquita
gua destilada-deionizada

3g
100ml

Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.


Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao com uma a duas gotas de fezes frescas ou
preservadas. Deixar secar temperatura de 60C no aquecedor de lminas
(slide warmer). No preparar esfregaos espessos. As amostras fecais
formolizadas podero ser concentradas pela centrifugao (500 x g/10min).
3. Fixar com lcool metlico por 30 segundos (deixar secar temperatura ambiente).
4. Corar com o corante de Kinyoun por um minuto. Lavar rapidamente
com gua destilada e drenar.
5. Diferenciar com soluo lcool-cido por dois minutos. Lavar rapidamente com gua destilada e drenar.
6. Corar o fundo da preparao com soluo de verde de malaquita a
3% por dois minutos.
7. Lavar rapidamente com gua destilada e drenar.
8. Deixar o esfregao secar e montar com resina sinttica (Cytoseal
60).
9. Examinar 200 a 300 campos do esfregao com objetiva de imerso
(100X).
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CAPTULO 10

233

Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do procedimento de colorao.
Controle de Qualidade
Incluir ao mtodo de colorao uma lmina-controle com C. parvum,
preparada com amostra fecal preservada pela soluo salina de formaldedo a 10%. Os oocistos apresentam colorao do rosa ao vermelho sobre um
fundo uniformemente corado em verde.
Caractersticas da Colorao
Os oocistos do C. parvum e da I. belli apresentam colorao do rosa
ao vermelho, ao prpura intenso. Alguns dos quatro esporozotos podem ser
vistos nos oocistos do Cryptosporidium. Os oocistos imaturos da Isospora
aparecem corados, enquanto os oocistos maduros mostram os dois esporocistos
corados, usualmente do rosa ao prpura, com uma zona clara entre os
esporocistos corados e a parede do oocisto. O fundo da preparao corado em verde. Os organismos presentes freqentemente apresentam, entre
eles, uma intensidade de cor varivel. Quando presentes, os oocistos de
Cyclospora cayetanensis com tamanho de aproximadamente 10m (variando de 8-9m), assemelham-se aos do C. parvum, os oocistos no apresentam morfologia interna bem definida e a intensidade de cor tende a ser
mais varivel do que aquela vista no Cryptosporidium e na Isospora. Quando
o paciente for portador de uma grande infeco com microspordios (doente imunocomprometido) pequenos esporos (1 a 2m) podero ser vistos, mas
no sero facilmente identificados como as bactrias e as pequenas clulas
de leveduras51 (Figs. 10.7 e 10.8).
Observaes
1. Os organismos, como as bactrias lcool-cido-resistentes e algumas Nocardia spp., coram-se de vermelho. Os esfregaos devem ser finos, pois esfregaos espessos no so convenientemente descorados. Aps
a etapa 3 aconselhvel aquecer os esfregaos fixados a 70C por 10 minutos. Algumas amostras fecais, devido a sua consistncia mucide, requerem o tratamento com hidrxido de potssio (KOH) a 10%. As coloraes
(solues de iodo) usadas no exame parasitolgico das fezes no so indicadas para corar oocistos, como, tambm, a colorao da hematoxilina frrica
e do tricrmico no so procedimentos seguros e recomendados.
2. A modificao da colorao de Kinyoun (a frio) no indicada para
corar amostras fecais preservadas pelo fixador lcool polivinlico (fixador
APV). Entretanto, amostras fecais preservadas com o fixador acetato de
sdio-cido actico-formaldedo (SAF) apresentam timos resultados nos
processos de colorao.
3. As tcnicas de concentrao de rotina (formalina-ter ou formalinaacetato de etila) podem ser usadas para isolar oocistos de Isospora.
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234

CAPTULO 10

4. Adicionar 10 gotas de KOH a 10% ao sedimento fecal e agitar at


a total homogeneizao. Lavar com soluo de formaldedo a 10% e centrifugar
(500 x g/10min). Sem decantar o sobrenadante, retirar uma gota do sedimento e preparar um esfregao fino. A possibilidade de encontrar oocistos
aumenta pelo exame de amostras fecais mltiplas, em razo da intermitncia
da passagem desses organismos a partir do hospedeiro. Alguns autores recomendam, no mnimo, a colheita de trs amostras em dias alternados.
5. Normalmente so usadas concentraes fracas de cido sulfrico
(1% a 3%). Concentraes fortes do cido removem demasiadamente o
corante. As amostras fecais devem ser centrifugadas em tubos com tampa de rosca.
6. A colorao dos organismos cido-resistentes pode ser acelerada pela
adio de um detergente ou de um agente antiumidade. O tergitol n. 7 (Sigma
Chemical Co.) indicado para esta modificao da colorao. Adicionar
uma gota de tergitol n. 7 para cada 30 a 40ml do corante de Kinyoun.
7. A colorao de fundo da preparao depende do corante usado: azulde- metileno concede a cor azul aos organismos que no se coram pela fucsinafenicada, enquanto que o verde de malaquita cora o fundo em verde e o
cido pcrico, em amarelo. A concentrao do material fecal essencial para
a demonstrao dos organismos32.
8. Cubas de Coplin devero ser usadas em todas as etapas do procedimento de colorao.
9. Alguns autores30 substituem o verde de malaquita pelo azul-de-metileno
(ver Anexo deste Captulo).

MTODO MODIFICADO DE ZIEHL-NEELSEN (A QUENTE)


O mtodo de Ziehl-Neelsen modificado requer o aquecimento da fucsinafenicada usada na colorao. A Cyclospora cayetanensis tem sido descrita como cido-resistente-varivel, sendo recomendadas as modificaes da
colorao de Ziehl-Neelsen para demonstrar esse organismo 26,28,30.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a
10%. Outras amostras, como contudo duodenal, biliar e pulmonar (escarro, lavado broncoalveolar e material de bipsia) favorecem com freqncia
a colorao e o diagnstico dos oocistos das espcies C. parvum e I. belli.
Reagentes
1. lcool etlico (C2H 6O)
2. Fenol, fundido a 44C (C6H6O)
3. Fucsina bsica (CI 42500) (C19H 19N3O)
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CAPTULO 10

235

4. cido sulfrico, concentrado (H2SO4)


5. Azul-de-metileno (CI 52015-Sigma) (C16H18ClN3S.3H2O)
6. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de Fucsina-fenicada
a. Soluo A
Fucsina bsica
lcool etlico a 95% (v/v)

0,3g
10ml

b. Soluo B
Fenol (fundido a 44C)
gua destilada-deionizada q.s.p

5g
100ml

c. Soluo Corante
Misturar as solues A e B e armazenar temperatura ambiente at
o momento do uso. Estvel por um ano.
2. Soluo Aquosa de cido Sulfrico a 5% (v/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo Aquosa de Azul-de-metileno a 0,3% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao com fezes frescas ou preservadas.
3. Deixar secar temperatura ambiente ou pelo aquecimento.
4. Corar com fucsina-fenicada, aquecendo a lmina at a emisso de
vapores por cinco minutos.
5. Escorrer o corante e lavar com gua corrente.
6. Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 5% por 30 segundos.
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236

CAPTULO 10

7. Lavar com gua corrente. Drenar.


8. Corar o fundo com soluo de azul-de-metileno a 0,3% por um minuto.
9. Lavar com gua corrente e secar.
10. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
Com essas modificaes do mtodo de Ziehl-Neelsen os oocistos do
C. parvum e da I. belli apresentam a colorao do rosa ao vermelho ao
prpura intenso; sendo visveis alguns dos quatro esporozotos nos oocistos
do Cryptosporidium. Os oocistos imaturos da Isospora aparecem completamente corados, enquanto os oocistos maduros mostram os dois esporocistos
corados, usualmente do rosa ao prpura, com uma zona clara entre os
esporocistos corados e a parede do oocisto. O fundo da preparao corado em azul. Os organismos presentes freqentemente apresentam, entre eles,
uma variao na intensidade de cor. Quando presentes, os Cyclospora
cayetanensis, com tamanho de aproximadamente 10m, assemelham-se ao
C. parvum, os oocistos no apresentam morfologia interna bem definida, e
a intensidade de cor tende a ser mais varivel do que quela vista no
Cryptosporidium e na Isospora (Figs. 10.7 e 10.8).
Observaes
1. No deixar o corante ferver e secar durante o processo de colorao. Aquecer a lmina at a emisso de vapores. Aps a etapa 2 aconselhvel aquecer os esfregaos fixados a 70C por 10 minutos.
2. Podero ser usadas diferentes concentraes de cido sulfrico (0,25%
a 10%); entretanto, o tempo de diferenciao varia de acordo com a concentrao usada. Habitualmente, so empregadas solues de 1% a 5%. Ver
observaes referentes ao mtodo modificado de Kinyoun.
Mtodo Modificado da Safranina (a Quente)
O mtodo modificado da safranina (a quente) indicado para a colorao da Cyclospora cayetanensis, C. parvum e I. belli. Os oocistos da
Cyclospora em amostras clnicas so rotineiramente demonstrados pelo
mtodo modificado de Kinyoun (a frio). Entretanto, os oocistos corados por
esse mtodo apresentam uma variabilidade de colorao desde organismos
no corados aos totalmente corados, podendo conduzir a uma possvel falsa
identificao. O mtodo modificado da safranina produz uma colorao uniforme dos oocistos. O corante deve ser aquecido at ferver, quando for usada
placa de aquecimento (slide warmer) ou forno de microondas.
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CAPTULO 10

237

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a
10%.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

lcool metlico (CH4O)


cido clordrico (HCl)
Safranina O (CI 50240- Sigma) (C20H19N4Cl)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2H2O4]
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Preparao das Solues


1. Soluo Aquosa de Safranina a 1% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
2. Soluo Aquosa de Verde de Malaquita a 3% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo cido-lcool (v/v)
cido clordrico
lcool metlico

3ml
97ml

Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.


Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao com uma a duas gotas de fezes frescas ou
preservadas. Deixar secar temperatura de 60C em aquecedor de lmina
(slide warmer). No preparar esfregaos espessos.
3. Fixar com cido-lcool por trs a cinco minutos.
4. Lavar rapidamente com gua destilada e drenar.
5. Corar com a safranina a 1% por um minuto. Aquecer o esfregao
em aquecedor de lmina (slide warmer) at a emisso de vapores, no deixar
secar o corante.
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238

CAPTULO 10

6. Lavar rapidamente com gua destilada e drenar.


7. Corar o fundo com soluo de verde de malaquita a 3% por dois
minutos.
8. Lavar com gua destilada. Secar o esfregao e montar com resina
sinttica (Cytoseal 60).
9. Examinar 200 a 300 campos do esfregao com objetiva de imerso
(100X).
Caractersticas de Colorao
Os oocistos aparecem arredondados corados em brilhante vermelhoalaranjado sobre um fundo uniforme corado em verde.
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do processo de colorao.
Controle de Qualidade (CQ)
Incluir ao mtodo de colorao uma lmina-controle com C. parvum,
preparada com amostra fecal preservada pela soluo salina de formaldedo a 10%. Os oocistos aparecem arredondados corados em brilhante vermelho-alaranjado sobre um fundo uniformemente corado em verde.

MTODO MODIFICADO DE ZIEHL-NEELSEN-DIMETILSULFXIDO (DMSO)


O mtodo modificado de Ziehl-Neelsen pela adio de dimetilsulfxido
(DMSO) foi descrito por Pahjola e cols.50 para a colorao de esfregaos
fecais frescos. Os oocistos apresentam uma colorao em relevo, facilmente
distinguida do material do fundo da preparao.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento de fezes
frescas.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Fucsina bsica (CI 42500) (C19H 19N3O)


Fenol fundido a 44C (C6H6O)
lcool etlico (C2H 6O)
Glicerina (C3H8O3)
Dimetilsulfxido (DMSO) (C2H6SO)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2H2O4]
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CAPTULO 10

239

7. cido actico glacial (C2H4O2)


8. lcool metlico absoluto (CH4O)
Preparao das Solues
1. Corante Fenol-Fucsina-DMSO
Fucsina bsica
lcool etlico a 95%
Fenol fundido (44C)
Glicerina
DMSO
gua destilada-deionizada

4g
25ml
12ml
25ml
25ml
75ml

Dissolver 4g de fucsina bsica em 25ml de lcool etlico a 95%. Adicionar lentamente com agitao 12ml de fenol fundido a 44C ao corante
(soluo fucsina-lcool etlico). Acrescentar 25ml de glicerina, 25ml de DMSO
e 75ml de gua destilada-deionizada soluo fucsina-lcool etlico. Misturar. Deixar a soluo em repouso por 30 minutos. Filtrar. Estocar em frasco de vidro mbar com tampa esmerilhada temperatura ambiente.
2. Soluo Aquosa de Verde de Malaquita a 2% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo Diferenciadora e Corante (Fundo da Preparao)
Soluo aquosa de verde de malaquita a 2%
Glicerina
cido actico glacial

22ml
50ml
30ml

Misturar lentamente, sob agitao contnua, 22ml de soluo aquosa


de verde de malaquita a 2%, 50ml de glicerina e 30ml de cido actico glacial. Estocar em frasco de vidro mbar com tampa esmerilhada temperatura ambiente.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar os esfregaos com fezes frescas. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Fixar os esfregaos durante cinco a 10 minutos com lcool metlico.
Deixar secar temperatura ambiente.
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240

CAPTULO 10

4. Corar os esfregaos durante cinco minutos com a soluo corante


fenol-fucsina-DMSO.
5. Escorrer o corante. Lavar os esfregaos com gua corrente at que
o corante no seja mais removido. Usualmente so necessrios 10 a 30
segundos.
6. Imergir os esfregaos por um minuto na soluo diferenciadora ou
at que aparea a cor verde no fundo da preparao.
7. Lavar os esfregaos com gua corrente durante 10 segundos. Escorrer e deixar secar temperatura ambiente na posio vertical.
8. Adicionar leo de imerso diretamente sobre o esfregao corado e
examinar com objetivas de pequeno aumento e de grande aumento (100X).
Ler no mnimo 100 campos. Os esfregaos no devem ser montados com
resina sinttica ou blsamo do Canad, como, tambm, a preparao no
deve ser coberta com uma lamnula.
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
Os oocistos do C. parvum apresentam colorao do rosa ao vermelho.
O fundo da preparao corado em verde plido. As leveduras aparecem
uniformemente coradas em azul-esverdeado (Figs. 10.7 e 10.8).
Controle de Qualidade
Mtodos de colorao derivados de Ziehl-Neelsen: Henriksen-Pohlenz;
Kinyoun modificado (a frio); Ziehl-Neelsen modificado (a quente) e ZiehlNeelsen modificado (DMSO).
1. Incluir ao mtodo de colorao uma lmina-controle com C. parvum,
preparada com amostra fecal preservada pela soluo salina de formaldedo a 10%. Quando os oocistos do Cryptosporidium apresentarem uma boa
colorao, os organismos I. belli (20-30m x 10-19m) e Cyclospora
cayetanensis (8-10m) tambm tomaro o corante.
2. Os oocistos do C. parvum apresentam colorao do rosa ao vermelho, ao prpura intenso, com dimetro de aproximadamente 4 a 6m, com
quatro esporozotos internos. O fundo da preparao corado em azul.
3. Conferir a aderncia (macroscopicamente) dos espcimes lmina.
4. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. Colocar as objetivas e as oculares originais no microscpio durante a Calibrao. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
5. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio seguir o plano de ao para resultados fora de controle31,50,51.
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CAPTULO 10

241

MTODO DE HEINE
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou fezes preservadas em
soluo salina de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Fucsina bsica (CI 42500) (C19H19N3O)
2. Fenol, fundido a 44C (C6H6O)
3. Corante de Kinyoun
Fucsina bsica
4g
Fenol, fundido a 44C
8ml
lcool etlico a 95% (v/v)
20ml
gua destilada-deionizada q.s.p. 100ml
Dissolver a fucsina bsica no lcool etlico e adicionar a gua destilada, lentamente, com agitao. Adicionar 8ml de fenol ao corante, com uma
pipeta com bulbo de borracha.
Nota: O corante Fuchsin-Carbol (Kinyoun Acid Fast) pode ser adquirido comercialmente (WWR Scientific Products, EUA).
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Misturar em lmina de microscopia um volume igual de fezes frescas ou formolizadas e do corante de Kinyoun.
3. Preparar esfregao fino e deixar secar temperatura ambiente.
4. Adicionar leo de imerso diretamente sobre o esfregao corado e
cobrir com lamnula.
5. Observar atravs do microscpio de contraste de fase ou de fundo
claro.
Caractersticas da Colorao
Para evitar a retrao dos oocistos necessrio observar a preparao dentro de 10 minutos que se seguem secagem do esfregao. Esse mtodo
coloca em evidncia somente os oocistos, os quais, pela microscopia de fundo
claro, so observados sem colorao, mas muito refringentes, sobre o fundo
rosa. De preferncia, a observao dever ser realizada pela microscopia
de contraste de fase. Os oocistos aparecem brilhantes sobre o fundo cinza
da preparao. Os outros elementos no parasitas so corados de vermelho24,34 (Fig. 10.6).
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242

CAPTULO 10

Fig. 10.6 As setas indicam oocistos de Cryptosporidium parvum corados pelo mtodo
de Heine. (Cortesia do Dr. Denis Lemeteil, Facult Mixte de Medicine et de Pharmacie de
Rouen, Rouen, Frana.)

Observaes
1. Usando as variaes derivadas de Ziehl-Neelsen, a colorao dos
organismos, do rosa ao vermelho, depende da penetrao do corante (o calor
aumenta a penetrao), da espessura do esfregao e da idade da amostra.
2. Os organismos podem perder ou no a capacidade de absorver o corante
depois de longo tempo fixados em soluo salina de formaldedo a 10%.
3. Uma colorao de fundo uniforme, azul, verde etc., depende dos
corantes usados. A pesquisa dos oocistos se torna difcil em pacientes que
no apresentam a tpica diarria aquosa.
Colorao Negativa pela Fucsina-Fenicada
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a 10%.
Reagentes
1. Fucsina bsica (CI 42500) (C19H 19N3O)
2. Fenol, fundido a 44C (C6H6O)
3. Corante de Kinyoun
Fucsina bsica
Fenol, fundido a 44C
lcool etlico a 95% (v/v)
gua destilada-deionizada q.s.p.

4g
8ml
20ml
100ml

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CAPTULO 10

243

Dissolver a fucsina bsica no lcool etlico e adicionar a gua destilada, lentamente com agitao. Adicionar 8ml de fenol ao corante com uma
pipeta com bulbo de borracha.
Nota: O corante Fuchsin-Carbol (Kinyoun Acid Fast) pode ser adquirido comercialmente (WWR Scientific Products, EUA).
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Misturar em lmina de microscopia um volume igual (3 a 10l) de
fezes frescas ou formolizadas e o corante de Kinyoun.
3. Preparar esfregao fino e deixar secar temperatura ambiente.
4. Adicionar leo de imerso diretamente sobre o esfregao corado e
cobrir com lamnula.
5. Observar atravs do microscpio de fundo claro (430X).
Caractersticas da Colorao
Todos os elementos coram-se em negro, com exceo dos oocistos, os
quais apresentam-se brilhantes e refringentes30.

MTODO RPIDO

DA

SAFRANINA

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas, ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a
10%.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

cido clordrico (HCl)


lcool metlico (CH4O)
Safranina O (CI 50240-Sigma) (C20H19N4Cl)
Cristal violeta (Bacto Crystal violet) (CI 42555) (C25H30ClN3)
Azul-de-metileno (CI 52015-Sigma) (C16H18ClN3S.3H2O)

Preparao das Solues


1. Soluo Alcolica de cido Clordrico (v/v)
cido clordrico
lcool metlico

3ml
100ml

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244

CAPTULO 10

2. Soluo Aquosa de Safranina a 1% (m/v)


Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo Aquosa de Azul-de-metileno a 1% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar um esfregao fino com fezes frescas ou formolizadas.
3. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar pelo calor, passando rapidamente a lmina no bico de Bunsen.
5. Fixar com soluo alcolica de cido clordrico a 3% por cinco minutos e deixar secar temperatura ambiente.
6. Lavar com gua corrente e drenar.
7. Corar com a soluo aquosa de safranina a 1% por um minuto e
aquecer at o aparecimento de vapores.
8. Lavar com gua corrente e drenar.
9. Corar o fundo da preparao com soluo aquosa de azul-de-metileno
a 1%.
10. Adicionar leo de imerso diretamente sobre o esfregao corado e
cobrir com lamnula.
Caractersticas da Colorao
Os oocistos apresentam-se corados em brilhante vermelho-alaranjado
e as leveduras mostram a mesma colorao do fundo da preparao9.
Observaes
A soluo aquosa de azul-de-metileno a 1% poder ser substituda, com
bons resultados, pela soluo aquosa de cristal violeta; entretanto, a soluo
aquosa de verde de malaquita a 5% mostrou-se insatisfatria.

MTODO MODIFICADO

DA

SAFRANINA (FORNO

DE

MICROONDAS)

Colorao de Oocistos de Cyclospora cayetanensis


O mtodo de colorao da safranina modificada cora os oocistos da
Cyclospora cayetanensis uniformemente em um brilhante vermelho-alaranjado
sobre um fundo azul (azul-de-metileno) ou verde (verde de malaquita), des Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 10

245

de que os esfregaos fecais sejam aquecidos no forno de microondas antes


da colorao. Esse procedimento de colorao rpido, seguro e de fcil
realizao 60.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo salina de formaldedo a
10%.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

Safranina O (CI 50240-Sigma) (C20H19N4Cl)


Azul-de-metileno (CI 52015-Sigma) (C16H18ClN3S.3H2O)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2 H2O4]
Citrato de sdio, cristais (Na3C6H5O7.2H2O)
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Solues
1. Soluo Aquosa de Safranina a 1% (m/v) (pH 6,5)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
2. Soluo Aquosa de Azul-de-metileno a 1% (m/v) ou Soluo
Aquosa de Verde de Malaquita a 1% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao, colocando em lminas de microscopia uma gota
(50l) de suspenso de fezes frescas ou formolizadas. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Mergulhar as lminas na soluo aquosa de safranina a 1% e aquecer no forno de microondas, com potncia total (650W) por 30 segundos (cubas
de Coplin devero ser usadas nessa fase do procedimento de colorao).
4. Lavar com gua corrente por 30 segundos.
5. Corar o fundo da preparao mergulhando as lminas na soluo aquosa
de azul-de-metileno a 1% ou na soluo aquosa de verde de malaquita a
1% por um minuto (cubas de Coplin devero ser usadas nessa fase do procedimento de colorao).
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246

CAPTULO 10

6. Lavar com gua corrente por 30 segundos e secar.


7. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
Caractersticas da Colorao
Os oocistos aparecem arredondados com 8 a 10m, uniformemente
corados em um brilhante vermelho-alaranjado sobre um fundo azul (azul-demetileno) (Fig. 10.6B) ou verde (verde de malaquita) (Fig. 10.6C).
Observaes
1. O procedimento original de Baxby, Blundell e Hart8 no cora com
regularidade os oocistos de Cyclospora.
2. O aquecimento na chama do bico de Bunsen com freqncia no
uniforme devido evaporao e o corante que cobre o esfregao seca, deixando
ocultos resduos de cristais, os quais interferem na colorao do oocisto. O
aquecimento dos esfregaos em banho de gua a 60C tambm no mostrou bons resultados.
3. Quando o esfregao aquecido no forno de microondas, depois de
ter sido coberto pela soluo aquosa de safranina (em gua destilada
acidificada em pH 2,5 ou pH 6,5 ou em tampo de citrato), observada uma
colorao uniforme nos oocistos.
4. O exato modo de ao do aquecimento no forno de microondas no
conhecido. Entretanto, alguns autores supem que as ligaes cruzadas
das protenas (cross-linking of proteins) poderiam ser alteradas pelo aquecimento no forno de microondas, ou existiria a possibilidade de o calor modificar a configurao da superfcie dos oocistos, tornando a membrana
permevel, favorecendo a penetrao uniforme do corante safranina.
5. Visvesvara e cols.60 obtiveram excelentes resultados na identificao da Cyclospora, preservando a amostra fecal em formaldedo a 10%,
corando os esfregaos pela safranina a 1% (pH 6,5) e o fundo da preparao com verde de malaquita a 1% (safranina-verde de malaquita). Esfregaos
individuais mergulhados na soluo de safranina so aquecidos por 30 segundos no forno de microondas, enquanto os grupos de cinco a 10 esfregaos
mergulhados na soluo corante na cuba de Coplin so aquecidos por um
minuto.
6. As amostras fecais armazenadas na soluo de bicromato de potssio a 2,5% no mostram resultados de colorao uniforme. Entretanto, quando
o preservador removido pela lavagem com soluo salina tamponada e aps
as amostras serem fixadas em soluo de formaldedo a 10%, os oocistos
corados pela safranina apresentam uma colorao uniforme.
7. Para a obteno de timos resultados na colorao, a soluo corante
de safranina deve ser trocada aps 10 ciclos de colorao. Quando os oocistos
so corados pelo mtodo de Giemsa, os organismos aparecem arredondados, de colorao azul tnue.
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CAPTULO 10

247

8. Certos organismos no ficam corados e so dificilmente identificados. As leveduras e outros artefatos das fezes, com o mesmo tamanho, coramse em azul. Os organismos no so corados pelos mtodos do tricrmico,
do chromotrope e do Gram-Chromotrope. A congelao das amostras fecais
a -20C no altera as propriedades de colorao dos oocistos, os quais so
corados em brilhante vermelho-alaranjado, como os organismos que no foram
congelados60.
Colorao de Oocistos de Cryptosporidium parvum
A colorao da safranina modificada por Visvesvara e cols.60 tambm indicada para a colorao de oocistos de C. parvum.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou sedimento concentrado
de fezes frescas ou fezes preservadas em soluo de formaldedo a 10%.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

cido clordrico (HCl)


lcool metlico (CH4O)
Safranina O (CI 50240-Sigma) (C20H19N4Cl)
Azul-de-metileno (CI 52015-Sigma) (C16H18ClN3S.3H2O)
Verde de malaquita (CI 42000) [(C23H25N2)2.3C2H2O4]
Citrato de sdio, cristais (.Na3C6H5O 7.2H2O)
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Solues
1. Soluo Aquosa cida de Safranina a 1% (m/v) (pH 6,5)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
2. Soluo Aquosa de Azul-de-metileno a 1% (m/v) ou Soluo
Aquosa de Verde de Malaquita a 1% (m/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
3. Soluo Alcolica de cido Clordrico (v/v)
cido clordrico
lcool metlico

3ml
100ml

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248

CAPTULO 10

Colorao da Amostra
1. Preparar o esfregao colocando em lminas de microscopia uma gota
(50l) de suspenso de fezes frescas ou formolizadas.
2. Secar o esfregao temperatura de ~60C (aquecedor de lmina).
Antes de corar, deixar o esfregao esfriar temperatura ambiente.
3. Imergir na soluo cido-lcool a 3% por cinco minutos (cubas de
Coplin devero ser usadas nessa fase do procedimento de colorao).
4. Lavar com gua corrente.
5. Imergir as lminas na soluo aquosa de safranina a 1% e aquecer
no forno de microondas, com potncia total (650W) por um minuto (cubas
de Coplin devero ser usadas nessa fase do procedimento de colorao).
6. Lavar com gua corrente.
7. Corar o fundo da preparao mergulhando as lminas na soluo aquosa
de azul-de-metileno a 1% ou na soluo aquosa de verde de malaquita por
um minuto (cubas de Coplin devero ser usadas nessa fase do procedimento
de colorao).
8. Lavar com gua corrente e secar.
9. Fazer a montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).

COLORAO

PELA

HEMATOXILINA FRRICA MODIFICADA

Esse mtodo de colorao foi desenvolvido para amostras fecais preservadas com o fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF). O mtodo
de colorao pela hematoxilina frrica modificada pela incorporao do corante
de Kinyoun (soluo de fucsina-fenicada) uma tentativa de apresentar um
procedimento simultneo de colorao para trofozotos, cistos e oocistos. A
combinao do corante hematoxilina frrica, com o material preservado pela
soluo fixadora SAF e com o corante de Ziehl-Neelsen modificado, resultou
em um mtodo com muito bom rendimento, indicado para o diagnstico das
espcies C. parvum, Cyclospora cayetanensis e I. belli 46.
Amostra
Material fecal preservado em acetato de sdio-cido actico-formaldedo
(SAF). Os espcimes frescos podero ser corados aps a fixao (30 minutos) em SAF.
Reagentes
1. Claras de ovos de galinha
2. Glicerina (C3H8O3)
3. Salicilato de sdio (C7H5O3Na) ou timol (C10H14O) ou tintura
de mertiolato (1:10.000) ou formaldedo 37-40% (HCOH) (1:100)
4. Acetato de sdio triidratado (C2H3O2Na.3H2O)
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CAPTULO 10

249

5. cido actico glacial (C2H4O2)


6. Formaldedo 37-40% (HCHO)
7. lcool etlico absoluto (C2H6O)
8. lcool etlico a 70%, 95% (v/v)
9. cido clordrico concentrado (HCl)
10. Corante de Kinyoun (soluo de fucsina-fenicada)
11. Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290) (C16H14O6)
12. cido pcrico (CI 10305) [C6H2(OH)(NO2)3]
13. Sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O]
14. Sulfato frrico amoniacal [FeNH4(SO4)2.12H2O]
15. Xilol (Xileno) (C8H10) ou Toluol (Tolueno) (C7H8)
Preparao das Solues
1. Corante de Kinyoun (soluo de Fucsina-fenicada)
Fucsina bsica
Fenol, fundido a 44C
lcool etlico a 95% (v/v)
gua destilada-deionizada q.s.p.

4g
8ml
20ml
100ml

Dissolver a fucsina bsica no lcool etlico e adicionar a gua destilada lentamente com agitao. Adicionar 8ml de fenol ao corante, com uma
pipeta com bulbo de borracha.
Nota: O corante Fuchsin-Carbol (Kinyoun Acid Fast) pode ser adquirido comercialmente (WWR Scientific Products, EUA).
2. Soluo Corante de Hematoxilina Frrica de Spencer e
Monroe 14,55
Soluo I
Hematoxilina, forma cristalina
lcool etlico absoluto

10g
1.000ml

Dissolver a hematoxilina no lcool etlico absoluto. Estocar em frasco


de vidro de cor mbar. Deixar amadurecer durante seis meses, ou durante uma semana exposto ao sol.
Soluo II
Sulfato ferroso amoniacal
Sulfato frrico amoniacal

10g
10g

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250

CAPTULO 10

cido clordrico concentrado


gua destilada-deionizada

10ml
1.000ml

Soluo de Trabalho
Misturar partes iguais das solues I e II. Esta soluo deve ser preparada todas as semanas.
3. Soluo Aquosa Saturada de cido Pcrico (m/v)
cido pcrico
gua destilada-deionizada

2g
100ml

Adicionar o cido pcrico gua. Agitar vigorosamente e deixar em


repouso durante vrios dias. Depois de quatro a cinco dias, alguns cristais
do cido pcrico podem permanecer no dissolvidos. Usar o lquido sobrenadante
lmpido ou filtrar a soluo. Essa soluo diferenciadora tem conservao
indefinida e no apresenta problemas de estocagem.
4. Soluo de cido-lcool (v/v)
cido clordrico (HCl) concentrado
lcool etlico absoluto q.s.p.

30ml
1.000ml

5. Soluo de lcool Etlico-Amnia (v/v)


lcool etlico a 70%
Amnia

50ml
0,5-1ml

6. Soluo Fixadora Acetato de Sdio-cido Actico-Formaldedo (SAF)


Acetato de sdio
cido actico glacial
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

1,5g
2ml
4ml
92,5ml

Misturar em um beaker os componentes. Estocar o fixador em frasco de plstico ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
7. Albumina Fixadora de Mayer
1. Colocar as claras de vrios ovos frescos em um prato fundo.
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CAPTULO 10

251

2. Bater as claras com um garfo ou com um batedor de ovos, at que


elas estejam brancas e viscosas.
3. Deixar em repouso por uma hora e, em seguida, retirar a espuma da
superfcie e transferir o lquido remanescente para uma proveta.
4. Adicionar ao lquido igual volume de glicerina (v/v) e 1g de salicilato
de sdio ou timol, ou 0,5ml de tintura de mertiolato ou formaldedo 37-40%,
para prevenir a proliferao de fungos, a cada 100ml da mistura.
5. Agitar vigorosamente a mistura e filtrar atravs de papel-filtro. A
filtrao lenta, sendo necessrio usar pequenas quantidades da mistura,
com trocas dirias do filtro.
6. Estocar em frasco com tampa esmerilhada temperatura de 4C com
data de expirao de trs meses.
Colorao da Amostra
Preparao dos esfregaos
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Em uma lmina, colocar uma gota da amostra fecal concentrada,
preservada com SAF e uma gota de albumina fixadora de Mayer.
3. Misturar as gotas e preparar um esfregao estirado.
4. Deixar secar temperatura ambiente (o esfregao aparece opaco
quando seco).
Colorao
1. lcool etlico a 70%, cinco minutos.
2. Lavar com gua destilada-deionizada em cuba de Coplin, dois minutos (no usar gua corrente).
3. Corante de Kinyoun, cinco minutos.
4. Lavar com gua corrente, um minuto.
5. Soluo cido-lcool, quatro minutos
Esta etapa pode ser realizada como segue:
Soluo de cido-lcool, dois minutos.
Lavar com gua corrente, um minuto.
Soluo de cido-lcool, dois minutos.
Lavar com gua corrente, um minuto.
Continuar a seqncia da colorao na etapa 7.
6. Lavar com gua corrente, um minuto.
7. Soluo corante de trabalho de hematoxilina frrica, oito minutos.
8. Lavar com gua destilada-deionizada, um minuto.
9. Soluo de trabalho de cido pcrico, trs a quatro minutos.
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252

CAPTULO 10

10. Lavar com gua corrente, 10 minutos.


11. lcool etlico a 70%-amnia, trs minutos.
12. lcool etlico a 95%, cinco minutos.
13. lcool etlico absoluto, cinco minutos.
14. Xilol ou tolueno (1), cinco minutos.
15. Xilol ou tolueno (2), cinco minutos.
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do processo de colorao.
Caractersticas da Colorao
Os trofozotos e cistos de protozorios coram-se de azul-cinzento ao
preto, como tambm o material de fundo. As estruturas nucleares, os corpos de incluso e o citoplasma adjacente apresentam-se em preto. Os oocistos
de C. parvum e I. belli apresentam colorao do rosa ao vermelho ao prpura intenso46.
Observaes
1. Os mtodos de colorao modificados, a frio (Henriksen-Pohlenz e
Kinyoun35 e a quente (Ziehl-Neelsen)27,30 so excelentes procedimentos de
colorao para oocistos de coccdios (C. parvum e I. belli).
2. Alguns autores afirmam que a penetrao do corante no mtodo a
quente uniforme e apresenta melhores resultados, mas poder haver uma
retrao do oocisto. Entretanto, se houver diferenas, entre as duas condutas, a quente e a frio, essas, provavelmente, so mnimas.
3. O Cyclospora cayetanensis duas vezes maior que o C. parvum
e facilmente visvel, apesar de ser cido-resistente-varivel. Os esporos dos
microspordios so tambm cido-resistentes e o seu tamanho (1 a 2m) torna
a identificao muito difcil sem o uso de corantes especiais ou de anticorpos monoclonais. A microscopia eletrnica tem sido usada extensivamente
para confirmar a infeco e classificar os organismos nos tecidos.
4. Os parasitologistas devero estar atentos com a Cyclospora
cayetanensis, quando so usadas as variaes da colorao de Ziehl-Neelsen
para a deteco e identificao do C. parvum.
5. Em razo do risco de contaminao do operador, necessrio tomar
precaues durante a manipulao (usar luvas, descontaminar o material e
incinerar os resduos). Quando as fezes forem provenientes de pacientes com
SIDA/AIDS os laboratrios devem tomar os mesmos cuidados usados para
a hepatite.
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do processo de colorao.
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CAPTULO 10

253

Controle de Qualidade (CQ)


1. Incluir ao procedimento de colorao uma lmina controle com C.
parvum, preparada com amostra fecal preservada em soluo salina de
formaldedo a 10%.
2. Quando os oocistos do Cryptosporidium apresentarem uma boa
colorao (rosa-vermelho ao prpura com o fundo da preparao em azul
uniforme), os organismos I. belli e Cyclospora cayetanensis tambm tomaro o corante.
3. Conferir a aderncia macroscpica dos espcimes lmina.
4. A colorao do rosa ao vermelho depende da penetrao do corante,
da espessura do esfregao e da idade do espcime.
5. A soluo salina de formaldedo a 10% apresenta a vantagem de fixar
os oocistos e destruir o seu poder patognico e inativar outros agentes infecciosos. Entretanto, so contraditrias as afirmaes de que os organismos perderiam a capacidade de tomar o corante (fucsina-fenicada) depois
de um longo perodo de armazenamento em soluo de formaldedo a 10%.
6. Testar diariamente a soluo de trabalho da hematoxilina-frrica, pela
adio de uma gota do corante gua corrente. Se no houver desenvolvimento de cor azul, preparar uma nova soluo de trabalho.
7. O micrmetro ocular e o microscpio devem ser calibrados a cada
12 meses. Colocar as objetivas e as oculares originais no microscpio durante a calibrao. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
8. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados. Quando
necessrio seguir o plano de ao para resultados fora de controle14,31.

REVISO: MODIFICAES DAS COLORAES DE


ZIEHL-NEELSEN
Princpio: Produzir contraste de colorao entre os artefatos do fundo
da preparao e os parasitos presentes; permitir o exame e o reconhecimento das caractersticas cido-resistentes dos organismos atravs de
objetiva de grande aumento (objetiva de 40X, totalizando um aumento
de 400X). Indicadas para isolar e identificar oocistos de coccdios intestinais. A morfologia interna (esporozotos) dos oocistos do
Cryptosporidium observada atravs do exame com leo de imerso
(1.000X de aumento).
Amostra: Amostras fecais frescas ou preservadas pelo formaldedo,
ou SAF.
Reagentes: Colorao de Kinyoun modificada (a frio), Ziehl-Neelsen
modificada (a quente) e solues associadas; solues desidratantes (lcoois e xilol); resinas sintticas ou blsamo do Canad. Os agentes de
descolorao so menos intensos do que o cido-lcool usado na rotina
de colorao dos organismos cido-resistentes (esse fato torna o procedimento um mtodo modificado).

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254

CAPTULO 10

Exame: Examinar no mnimo 300 campos com objetiva de imerso; um


nmero adicional de campos poder ser requerido se um organismo suspeito no foi claramente identificado como cido-resistente.
Resultados: Identificao de oocistos de Cryptosporidium parvum (45m) e de Isospora belli (20-30 x 10-19m); os oocistos da Cyclospora
cayetanensis (8-10m) tambm so visveis; entretanto, so mais cido-resistentes, com intensidade de cor varivel. Realizar a morfometria
com micrmetro ocular.
Observaes e Limitaes: As coloraes de Kinyoun modificada
(a frio) e de Ziehl-Neelsen modificada (a quente) so excelentes mtodos para a colorao de oocistos de coccdios. Alguns parasitologistas
afirmam que o mtodo a quente resulta em melhor penetrao do corante,
mas as diferenas so provavelmente mnimas. As limitaes do procedimento esto relacionadas com as amostras (correto tempo e velocidade de centrifugao; filtrao atravs de gaze levemente umedecida
em gua corrente, dobrada duas vezes. Existem controvrsias relacionadas com a habilidade dos organismos em receberem o corante fucsinafenicada depois de um longo perodo estocados e preservados em formalina
a 10%. Os organismos so dificilmente identificados em pacientes que
no apresentam a tpica diarria coleriforme (as fezes, quanto mais formadas, maior quantidade de artefatos apresentam).
ANEXO

MTODO MODIFICADO

DE

KINYOUN (A

FRIO )

Esta tcnica indicada para a identificao de coccdios, especialmente Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e I. belli. Nessa
variao do mtodo modificado de Kinyoun (a frio) usada a soluo alcolica de azul-de-metileno a 0,3% para a colorao do fundo da preparao,
enquanto no mtodo descrito na pgina 248 usada a soluo aquosa de
verde de malaquita a 3%30.

Tabela 10.2.
Comparao entre Cyclospora, Cryptosporidium e Isospora
Cyclospora
Nmero de esporocistos em
cada oocisto
Nmero de esporozotos em
cada esporocisto
Estgio nas fezes
Tamanho do oocisto (m)
Colorao especfica para
amostras fecais

Autofluorescncia

Presente

2
Oocisto
8-10
Safranina
a quente

Cryptosporidium
0
4 esporozotos
livres
Oocisto
4-5
Ziehl-Neelsen
mod./Safranina
a quente
Ausente

Isospora
2
4
Oocisto
9-16x7,5-12
Ziehl-Neelsen
mod./Safranina
a quente
Presente

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CAPTULO 10

255

Tabela 10.3
Procedimentos de Colorao para Cryptosporidium parvum*
Mtodos de
Colorao

Aparncia dos
Oocistos

Colorao direta
Giemsa
Rosa
Gram
Vermelho
Corante de Kohn
Verde-escuro
Azul-de-metileno
Azul-claro
Anilina-carbometil-violeta
Azul
Safranina + colorao de fundo
Alaranjado
Coloraes derivadas de Ziehl-Neelsen
Kinyoun
Rosa-vermelho
Henriksen-Pohlenz
Vermelho
Ziehl-Neelsen
Rosa-vermelho
DMSO-fucsina fenicada
Vermelho
Hematoxilina frrica
Rosa-vermelho
Coloraes pelos fluorocromos
Auramina-rodamina
Alaranjado
Auramina-fucsina fenicada
Alaranjado
Alaranjado de acridina
Verde-alaranjado
Diaminofenilidona
Azul
Mepacrine
Alaranjado
Iodeto de propdio
Vermelho
Coloraes negativas
Fucsina-fenicada
No se cora
Iodo
No se cora
Light green
No se cora
Merbromine
No se cora
Prata-Metenamina
No se cora
Nigrosina
No se cora
cido Peridico de Schiff
No se cora
cido fosfotngstico
Marrom-claro
Acetato de Uranil
Marrom-claro

Aparncia das
Leveduras

Referncias

Azul
Prpura
Cinza
Azul-escuro
No se cora
MCFP *

24
3
5
21
40
8

MCFP
MCFP
MCFP
No se cora
Azul-cinzento

38
35
27
50
6

No se cora
No se cora
Alaranjado
No se cora
No se cora
No se cora

38
16
38
37
59
37

Azul
Marrom
Verde
Alaranjado
Preta
No se cora
Vermelho
Preta
Preta

34
38
17
17
3
46
27
9
9

*Adaptado de ODonoghue 42. MCFP = Mesma colorao de fundo da preparao.

Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

lcool metlico (CH4O)


lcool etlico (C2H6O)
Fenol, fundido a 44C (C6H6O)
Fucsima bsica (CI 42500) (C19H19N3O)
cido sulfrico concentrado (H2SO4)
Azul-de-metileno (CI 52015-Sigma) (C16H18ClN3S.3H2O)
Hidrxido de Potssio (KOH)
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Preparao das Solues


1. Corante de Kinyoun (Soluo de Fucsina-fenicada)
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256

CAPTULO 10

10m

Fig. 10.7 Oocistos de coccdios humanos Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis


e Isospora belli diagnosticados por diferentes procedimentos: esfregaos corados pelos
derivados de Ziehl-Neelsen (10.1A, 10.1C, 10.F), microscopia de contraste diferencial de
interferncia (DIC ou Nomarsky) (10.1B, 10.1D, 10.1G); epifluorescncia (10.1E, 10.1H).
Os oocistos de Cryptosporidium parvum no autofluorescem. (Cortesia da DPDx, the CDC
website for parasitology diagnosis, EUA.)

a. Soluo A
Fucsina bsica
lcool etlico a 95% (v/v)

4g
20ml

Fig. 10.8 Oocistos de coccdios humanos em esfregaos fecais corados pelo mtodo de
Ziehl-Neelsen modificado. (a, b, c) oocistos de Cryptosporidium parvum (cortesia de Denis
Lemeteil, PhD, Facult Mixte de Medicine et de Pharmacie de Rouen, Rouen, Frana); (d,
e, f) oocistos de Cyclospora cayetanensis (cortesia de DPDx, the CDC website for parasitology
diagnosis); (g, h, i) oocistos de Isopora belli (cortesia da Profa. Lenilza Mattos de Lima,
Departamento de Anlises Clnicas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis,
SC).

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CAPTULO 10

257

10m
Fig. 10.9 Oocistos de Cyclospora em esfregaos a fresco e em preparaes coradas.
(a) oocistos em fezes frescas (microscopia de contraste diferencial de interferncia; microscopia DIC); (b) oocisto esporulado depois de cinco dias de incubao, mostrando dois
esporocistos (microscopia DIC); (c) oocisto esporulado maduro depois de 10 dias de incubao, mostrando dois esporocistos (microscopia DIC); (d) ruptura do oocisto, com um
esporocisto no interior e outro em liberdade (microscopia DIC); (e) quatro oocistos em fezes frescas preservadas pela soluo de formaldedo a 10% e coradas pela colorao de
Ziehl-Neelsen modificada, mostrando a desigual (tpica) colorao da Cyclospora; (f) quatro oocistos em fezes frescas preservadas pela soluo de formaldedo a 10% e coradas
pela colorao de Ziehl-Neelsen modificada, mostrando a variabilidade de colorao e o
aumento da visualizao dos oocistos no corados pela microscopia DIC; (g) quatro oocistos
em fezes frescas preservadas pela soluo de formaldedo a 10% e coradas pela colorao
da safranina, mostrando a uniformidade de colorao dos oocistos por esse mtodo. Escala
(barra): 10 m. (Cortesia DPDx, the CDC website for parasitology diagnosis, EUA.)

b. Soluo B
Fenol, fundido a 44C
gua destilada-deionizada q.s.p.

8g
100ml

c. Soluo Corante
Soluo A
Soluo B

20ml
100ml

Fig. 10.10 Cyclospora spp. versus artefatos. (A, B) Cyclospora spp. (fezes humanas);
(C) fezes concentradas de roedores; (D, E) sedimento concentrado de gua de rio. (Cortesia DPDx, the CDC website for parasitology diagnosis, EUA.)

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258

CAPTULO 10

Misturar as solues e armazenar temperatura ambiente at o momento do uso. Estvel por um ano
ou
Fucsina bsica
4g
Fenol, fundido a 44C
8ml
lcool etlico a 95% (v/v)
20ml
gua destilada-deionizada q.s.p.
100ml
Dissolver a fucsina bsica no lcool etlico e adicionar a gua destilada, lentamente com agitao. Adicionar 8ml de fenol ao corante, com uma
pipeta com bulbo de borracha.
2. Soluo de lcool Etlico a 50% (v/v)
Armazenar temperatura ambiente.
3. Soluo Aquosa de cido Sulfrico a 1% (v/v)
Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.
4. Soluo lcolica (lcool etlico a 95%) de Azul-de-metileno
a 0,3%
ou
5. Soluo Alcalina de Azul-de-metileno (Soluo de Loeffler)
Azul-de-metileno
lcool etlico a 95% (etanol)
Hidrxido de potssio diludo (KOH) (0,01%)

0,3g
30ml
100ml

Armazenar temperatura ambiente. Estvel por um ano.


Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar o esfregao com fezes frescas ou preservadas. As amostras fecais formolizadas podero ser concentradas pela centrifugao (500
X g/10min).
3. Deixar secar temperatura ambiente. Fixar com lcool metlico por
um minuto e deixar secar temperatura ambiente.
4. Corar com o corante de Kinyoun (a frio) por trs a cinco minutos.
5. Escorrer o corante e lavar com soluo aquosa de lcool etlico a
50% (trs a cinco segundos).
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CAPTULO 10

259

6. Lavar com gua corrente.


7. Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 1% por dois minutos ou at que o corante cesse de escorrer da lmina.
8. Lavar com gua corrente. Deixar escorrer.
9. Corar o fundo da preparao com soluo alcolica de azul-de-metileno
a 0,3% por um minuto.
10. Lavar com gua corrente e secar. Montar com resina sinttica
(Cytoseal 60).
Observao: Cubas de Coplin podero ser usadas nas diferentes fases do processo de colorao.
Caractersticas da Colorao
Os oocistos do C. parvum e I. belli apresentam colorao do rosa ao
vermelho, ao prpura intenso. Alguns dos quatro esporozotos podem ser vistos nos oocistos do Cryptosporidium. Os oocistos imaturos da Isospora aparecem corados, enquanto os oocistos maduros mostram os dois esporocistos
corados, usualmente do rosa ao prpura, com uma zona clara entre os esporocistos
corados e a parede do oocisto. O fundo da preparao corado em azul. Os
organismos presentes freqentemente apresentam, entre eles, uma intensidade de cor varivel. Quando presentes, os oocistos de Cyclospora cayetanensis
com tamanho de aproximadamente 10m, assemelham-se aos do C. parvum,
os oocistos no apresentam morfologia interna bem definida e a intensidade
de cor tende a ser mais varivel do que aquela vista no Cryptosporidium e
na Isospora. Quando o paciente for portador de uma grande infeco com
microspordios (doente imunocomprometido) pequenos esporos (1 a 2m) podero ser vistos, mas no sero facilmente identificados como as bactrias e
as pequenas clulas de leveduras51 (Figs. 10.7 e 10.8).

COLORAO

DE

GIEMSA

Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou preservado na soluo salina de formaldedo a 10% ou no fixador acetato de sdio-cido actico-formaldedo (SAF).
Observaes
Ver Captulo 12 Exame do Sangue: Reagentes, Preparao das Solues, Colorao da Amostra e Controle de Qualidade.
Caractersticas da Colorao
O Cryptosporidium ligeiramente menor (4-5m). O citoplasma granulado, a colorao varia do rosa ao violeta-escuro, com a zona central mais
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260

CAPTULO 10

clara. Os corpos residuais so bem marcados em posio lateral, os


esporozotos coram-se de vermelho-escuro. Certas formas no ficam coradas e so dificilmente identificadas. As leveduras com o mesmo tamanho,
muitas vezes ovides, coram-se em azul24.
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CAPTULO 10

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CAPTULO 10

263

CAPTULO

11

Mtodos de Colorao para


Microspordios Intestinais
Geraldo Attilio De Carli
Hrcules Moura

CONSIDERAES GERAIS
Os microspordios que parasitam o homem pertencem ao
filo Microsporidia e ordem Microsporida17. Nesse filo esto
classificados mais de 100 gneros e aproximadamente 1.000
espcies3. Esses organismos so parasitos intracelulares obrigatrios dos vertebrados e invertebrados, caracterizados pela produo de esporos e pela presena do tbulo polar. A infeco
da clula hospedeira se inicia quando um estmulo apropriado
determina a expulso do tbulo polar (Fig. 11.1), o qual penetra
na membrana da clula hospedeira, permitindo a libertao do
esporoplasma no interior da clula23 (Fig.11.2).
As fases subseqentes da reproduo e da formao dos
esporos termina com a ruptura da clula hospedeira e a libertao dos esporos22. As infeces humanas so adquiridas
pela ingesto de pequenos esporos ovides 3,16 . Os microspordios infectam insetos, peixes e mamferos8,9,14,16. O relato de
casos de microsporidiose humana antes de 1985 eram extremamente raros. Atualmente existe uma emergente evidncia da
ligao dos microspordios com as doenas em pacientes portadores do vrus da imunodeficincia humana (HIV) e de sua seqela, a sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA/
AIDS) 2,7,14,20-22 .
O Enterocytozoon bieneusi foi descrito por Desportes e
cols.7. Esse organismo produz um pequeno esporo (0,8 x 1,5m)
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CAPTULO 11

265

Fig. 11.1 Microfotografia pelo microscpio eletrnico de varredura (MEV) de esporo de


microspordio com o tbulo polar inserido na clula eucaritica. (Cortesia de DPDx, the
CDC website for parasitology diagnosis.)

e se constitui no mais importante agente de diarria em pacientes aidticos


(Tabela 11.1). Estima-se que o E. bieneusi pode ser a causa de 6,5% a 27%
de todas as diarrias crnicas nesses pacientes. Estudos subseqentes mostraram que o Enterocytozoon bieneusi pode colonizar alm dos entercitos
do intestino delgado 6, do epitlio do canal biliar e do pulmo 22. Em 1993,
Cali, Kotler e Orenstein5, descreveram a Septata intestinalis como um novo
gnero e nova espcie. Hartskeerl e cols.13 reclassificaram esse microspordio
para o gnero Encephalitozoon, passando a ser descrito como
Encephalitozoon intestinalis. Oito gneros de microspordios esto relacionados com essas infeces, mas somente as espcies Enterocytozoon
bieneusi e Encephalitozoon intestinalis permanecem como parasitos intestinais, apesar da Encephalitozoon intestinalis se disseminar atravs de
outros tecidos 1,4,14,24. Os outros trs gneros (Nosema, Encephalitozoon e
Pleistophora) so encontrados em vrios tecidos14,16. Os espcimes nos quais

Fig. 11.2 Microfotografia pelo microscpio eletrnico de varredura (MEV) mostrando a


clula eucaritica em colapso e esporos livres de Encephalitozoon hellem no meio extracelular.
(Cortesia de DPDx, the CDC website for parasitology diagnosis, EUA.)

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266

CAPTULO 11

os microspordios so diagnosticados incluem: urina, escarro, lavado


broncoalveolar, lquido biliar, aspirado duodenal e fezes. Os organismos so
tambm identificados em coletas e raspagens de tecidos da mucosa sinovial,
crnea, conjuntiva e secreo nasal, alm de bipsias traqueobronquial, do
intestino delgado, da bexiga, do seio paranasal, do fgado, dos msculos e
em colecistectomia3.
O diagnstico da microsporidiose intestinal (Enterocytozoon bieneusi
e Encephalitozoon intestinalis) realizado pela deteco dos esporos. A
determinao da espcie causal dessa parasitose, com freqncia, realizada pela microscopia eletrnica, dependendo desta maneira de procedimentos
invasivos (amostras de bipsia ou de autpsia). A maioria dos corantes histolgicos no coram os microspordios4. Os microspordios, apesar de estarem localizados nos tecidos, no provocam uma resposta inflamatria importante, podendo os mesmos passar despercebidos no exame das amostras
histolgicas23.
No diagnstico da microsporidiose intestinal os esporos podem ser
detectados nas fezes, mas seu pequeno tamanho e sua similaridade com
pequenas bactrias, torna a visualizao dos esporos uma tarefa muito
difcil. As amostras e os procedimentos usados para a colorao e
identificao desses organismos so: a) tecidos de bipsias: mtodos derivados de Ziehl-Neelsen, Giemsa, prata-metenamina, cido peridico de
Schiff (PAS) e hematoxilina-eosina (HS), alm da microscopia eletrnica; b) fezes: mtodo do tricrmico modificado e microscopia eletrnica 3,9,12,14,19,25 .
Entre os procedimentos descritos para detectar esporos de microspordios
incluem-se os mtodos de Giemsa, azul de toluidina, Gram, cido peridico
de Schiff, Chromotrope 2R e suas modificaes10,11,15,18,19,22,28. Tambm so
usados para a deteco dos esporos agentes quimiofluorescentes 26,28 e
anticorpos mono e policlonais23,27,30. O mtodo modificado do tricrmico de
Weber e cols.28 fornece caractersticas diferenciais da colorao dos esporos,
as quais tornam mais fcil a deteco dos microspordios nas fezes e nos
lquidos orgnicos, tornando-se o mtodo padro de colorao. Algumas
modificaes foram includas ao procedimento padro de Weber28.
Ryan e cols. 22 descreveram que a reduo da quantidade do cido
fosfotngstico e a substituio da anilina azul pelo fast green na colorao
original resultou em melhor contraste dos esporos com o fundo da colorao
mais claro. Kokoskin e cols.15 descreveram que 10 minutos de exposio para
o Chromotrope 2R, corante-chave no mtodo de Weber a 50C, no eram
suficientes para a visualizao dos esporos, como tambm a reduo do tempo total de colorao do procedimento de 120 para 40 minutos.
Os esporos so resistentes e no se coram satisfatoriamente pela
hematoxilina frrica, so ocasionalmente cido-resistentes fucsina-fenicada
e quando corados pelo cido peridico de Schiff (PAS-positivo) apresentam
um grnulo polar na extremidade anterior 4,9,10,12 . Os esporos dos microspordios tm uma evidente afinidade para a colorao de Gram18,19. A colorao de Gram-Chromotrope tem sido usada para a deteco de esporos
de microspordios em amostras clnicas (fezes, urina, escarro, saliva e
sobrenadante de cultura de clulas)18,19,27. Moura e cols.18,19 descreveram um
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CAPTULO 11

267

novo e excelente procedimento para a colorao de esporos de microspordios


em amostras clnicas, independente da origem, pela combinao da colorao de Gram e o mtodo de Weber. Os estgios de diagnstico (esporos)
so muito pequenos (1 a 4m), mas so visveis em cortes histolgicos e
em espcimes fecais, quando corados por diferentes corantes e observados
pela microscopia ptica. A identificao verdadeira das espcies pode depender da microscopia eletrnica, dos anticorpos fluorescentes (Fig. 11.3)
ou da reao em cadeia da polimerase (PCR). A morfologia comparada entre
os estgios de diagnstico dos microspordios e dos coccdios apresentada
na forma de diagrama (Fig. 10.1).

COLORAO PELO C HROMOTROPE (TRICRMICO MODIFICADO )


(WEBER-VERDE)
Um novo chromotrope bsico, utilizado na colorao de amostras fecais
frescas ou formolizadas, observado pela microscopia de fundo claro, mostrou-se eficiente para a colorao e identificao dos esporos. A quantidade do corante Chromotrope 2R maior do que a usada anteriormente na
colorao pelo tricrmico modificada por Wheatley, como tambm mais
longo o tempo de colorao (90 minutos)28. Esse mtodo foi desenvolvido
no National Center for Infectious Diseases, Centers for Disease Control
and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, EUA, usando vrios componentes do mtodo de colorao do tricrmico para diferenciar os esporos dos
microspordios dos elementos fecais do fundo da preparao.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou fezes preservadas em
soluo de formaldedo 5-10% ou no fixador acetato de sdio-cido acticoformaldedo (SAF). Agitar vigorosamente a mistura de fezes e preservador.
Reagentes
1. Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10N 2Na 2O 8S2)
2. Fast green (CI 42053) (C 37H 34N 2Na 2O 10S 3)
3. Acetato de sdio (C 2H 3O 2Na.3H 2O)
4. cido fosfotngstico (24WO 3.2H3PO4.48H2O)
5. cido actico glacial (C 2H 4O2)
6. lcool etlico absoluto (C 2H 6O)
7. lcool etlico a 90% (C2H 6O)
8. lcool etlico a 95% (C2H 6O)
9. lcool metlico absoluto (CH4O)
10. Formaldedo 37-40% (HCHO)
11. Xilol (C8H1O) ou Hemo-De
12. Meio de montagem (Cytoseal 60)

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CAPTULO 11

Fig. 11.3 Identificao de Encephalitozoon hellem pela imunofluorescncia (anticorpos


monoclonais). Presena de esporos em amostra de lavado broncoalveolar de paciente com
SIDA/AIDS. Observar os esporos em brilhante fluorescncia nos quais os tbulos polares
foram expulsos. (Cortesia de DPDx, the CDC website for parasitology diagnosis, EUA.)

Preparao das Solues


1. Corante Modificado de Tricrmico para Microspordios
Chromotrope 2R
Fast green
cido actico glacial
cido fosfotngstico
gua destilada-deionizada

6g*
0,15g
3ml
0,7ml
100ml

*10 vezes maior do que na frmula original do tricrmico.

Tabela 11.1
Microspordios Intestinais: Estgio de Diagnstico, Forma, Nmero
de Tbulos Polares e Tamanho 10,15
Espcie

Estgio de
Diagnstico

Forma

Nmero de
Tbulos
Polares

Tamanho
( m)

Enterocytozoon bieneusi

Esporo

4-7

0,8 x 1,5

Encephalitozoon intestinalis

Esporo

Esfrico
ou oval
Esfrico
ou oval

4-7

1,2 x 2,0

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CAPTULO 11

269

a. Dissolver o Chromotrope 2R e o Fast green em 3ml de cido actico glacial e adicionar o cido fosfotngstico. Agitar vigorosamente e deixar a mistura em repouso por 30 minutos, temperatura ambiente.
b. Adicionar 100ml de gua destilada-deionizada ao corante, o qual dever
apresentar uma cor prpura forte quase preta.
c. Armazenar o corante em frasco de plstico ou em frasco de vidro
com tampa esmerilhada. A soluo corante estvel por um ms.
2. Soluo de cido-lcool (v/v)
lcool etlico a 90%
cido actico glacial

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
3. Soluo de Formaldedo a 5 e 10% (v/v)
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

10ml
90ml

Misturar o formaldedo com a gua.


4. Fixador Acetato de Sdio-cido Actico-Formaldedo (SAF)
Acetato de sdio
cido actico glacial
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

1,5g
2ml
4ml
92,5ml

Misturar em um beaker os componentes. Estocar o fixador em frasco de plstico ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Usando uma alquota de 10l de fezes frescas (no concentradas)
ou preservadas (formalina a 5-10% ou SAF), preparar o esfregao pela
extenso do material em uma rea total de 45 por 25mm.
3. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar com lcool metlico absoluto por cinco minutos.
5. Deixar secar temperatura ambiente.
6. Imergir o esfregao por 90 minutos no corante modificado do tricrmico.
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CAPTULO 11

7. Escorrer o corante e lavar com soluo cido-lcool, por no mais


de 10 segundos.
8. Imergir o esfregao, vrias vezes (3-4), em lcool etlico a 95%. (Essa
etapa pode ser considerada como uma lavagem.)
9. Lavar com lcool etlico a 95% por cinco minutos.
10. Lavar com lcool etlico a 100% por 10 minutos.
11. Imergir em xilol por 10 minutos.
12. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
13. Examinar os esfregaos com leo de imerso (1.000X) e ler no mnimo
100 campos.
Observao: Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas
do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
A parede dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa
ao vermelho, com uma zona central clara, ou, eventualmente, mostrando uma
faixa horizontal ou em diagonal, a qual representa o tbulo polar. As bactrias, clulas de leveduras e alguns artefatos coram-se de verde. Entretanto,
algumas bactrias e artefatos coram-se de rosa-vermelho. O tamanho e a
forma dos outros componentes fecais so de grande importncia na diferenciao dos esporos de outras estruturas 12.

COLORAO PELO C HROMOTROPE


(RYAN-AZUL)

OU

M ODIFICAO

DE

RYAN

O mtodo de Weber e cols.28,29 modificado por Ryan e col.22 foi descrito com o objetivo de melhorar o contraste entre a colorao dos esporos e
o fundo da preparao. Inmeras variaes do mtodo modificado do tricrmico
foram experimentadas para melhorar o contraste entre a colorao dos esporos
e o fundo da preparao. A soluo tricrmico-azul contrasta com a soluo do tricrmico modificada por Weber e cols. 29 em dois aspectos: o cido
fosfotngstico foi reduzido em aproximadamente 65% e o fast green, substitudo pela anilina azul.
Amostra
Material fecal no preservado (fezes frescas) ou fezes preservadas em
soluo de formaldedo 5% a 10% ou no fixador acetato de sdio-cido acticoformaldedo (SAF). Agitar vigorosamente a mistura de fezes e preservador.
Reagentes
1. Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10N 2Na 2O 8S 2)

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CAPTULO 11

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2.
3.
4.
5.
6.
7.

Anilina azul (C6H7N)


cido fosfotngstico (24WO 3.2H3PO4.48H2O)
cido actico glacial (C 2H 4O2)
lcool etlico absoluto (C 2H 6O)
lcool metlico absoluto (CH4O)
lcool etlico a 90%

8. lcool etlico a 95%


9. cido clordrico (HCl)
10. Formaldedo 37-40% (HCHO)
11. Xilol (C8H 1O) ou Histol
12. Meio de montagem (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Corante Tricrmico Modificado
Chromotrope 2R
6g*
Anilina azul
0,5g
cido actico glacial
3ml
cido fosfotngstico
0,25ml
gua destilada-deionizada
100ml
pH 2,5
*10 vezes maior do que na frmula original do tricrmico
a. Dissolver o Chromotrope 2R e a anilina azul em 3ml de cido actico glacial e adicionar o cido fosfotngstico. Agitar vigorosamente e deixar a mistura em repouso por 30 minutos, temperatura ambiente.
b. Adicionar 100ml de gua destilada-deionizada ao corante.
c. Ajustar o pH em 2,5 com soluo de HCl 1M.
d. Estocar o corante em frasco de plstico ou em frasco de vidro com
tampa esmerilhada. Proteger a soluo da luz. A soluo corante estvel
por um ms.
2. Soluo de cido-lcool (v/v)
lcool etlico a 90%
cido actico glacial

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
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CAPTULO 11

3. Soluo Um Molar (1M) de cido Clordrico (v/v)


cido clordrico concentrado
gua destilada-deionizada q.s.p.

85ml
1.000ml

Misturar o HCl e a gua e estocar em frasco de vidro com tampa


esmerilhada. Conservao indefinida.
4. Soluo de Formaldedo a 5% e 10% (v/v)
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

5ml
95ml

10ml
90ml

Misturar o formaldedo com a gua.


5. Fixador Acetato de Sdio-cido Actico-Formaldedo (SAF)
Acetato de sdio
cido actico glacial
Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

1,5g
2ml
4ml
92,5ml

Misturar em um beaker os componentes. Estocar o fixador em frasco de plstico ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Usar uma alquota de 10ml de fezes frescas (no concentradas) ou
preservadas (formalina a 5% ou a 10%). Preparar o esfregao pela extenso do material em uma rea total de 45 por 25mm.
3. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar com lcool metlico por 10 minutos.
5. Deixar secar temperatura ambiente.
6. Imergir o esfregao por 90 minutos no corante tricrmico-azul.
7. Escorrer o corante e lavar com soluo lcool-cido por 10 segundos.
8. Lavar com lcool etlico a 95% por 10 segundos.
9. Lavar com lcool etlico a 95% por cinco minutos.
10. Lavar com lcool etlico a 95% por cinco minutos.
11. Lavar com lcool etlico a 100% por 10 minutos.
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CAPTULO 11

273

12. Imergir em xilol (Histol) por 10 minutos.


13. Montagem com resina sinttica (Cytoseal 60).
14. Examinar os esfregaos com leo de imerso (1.000X) e ler no mnimo
100 campos.
Observao: Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas
do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
A parede dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa
ao vermelho, com uma zona central clara ou, eventualmente, mostrando uma
faixa horizontal em diagonal, a qual representa o tbulo polar. Essencialmente
houve duas mudanas no mtodo de Weber e cols. 28,29. A reduo do cido
fosfotngstico em 65% permitiu melhor colorao do fundo da preparao,
evitando sua descolorao. O fast green muito tnue e desfalece rapidamente. Esse corante foi substitudo pela anilina azul, a qual, na presena do
cido fosfotngstico, torna-se um corante que no desbota. Outra vantagem
a colorao das leveduras e dos pseudomiclios em verde-azulado. Com
uma fixao rpida dos esfregaos o contraste entre os esporos dos
microspordios, dos tecidos e das clulas dos fungos muito bom, permitindo uma fcil identificao dessas classes de organismos. Entretanto, se os
esfregaos forem preparados com fezes preservadas pelo fixador de Schaudinn
ou pelo fixador lcool polivinlico (APV) os resultados sero insatisfatrios,
devido a uma supracolorao. O corante tricrmico-azul inadequado para
amostras coradas com sangue e para material de autpsias, porque em ambos
os espcimes os eritrcitos e os tecidos mal preservados coram-se fortemente com o Chromotrope 2R. O tamanho e a forma dos outros componentes fecais so de grande importncia na diferenciao dos esporos de
outras estruturas 12.

COLORAES
RYAN-AZUL)

PELO

T RICRMICO M ODIFICADO (WEBER-VERDE

Controle de Qualidade
1. A nica maneira de realizar o controle de qualidade (CQ) aceitvel
para esses mtodos usar esporos verdadeiros como controle dos organismos. Na maioria das vezes, a obteno do controle positivo muito difcil.
O uso dos microrganismos particularmente importante porque os esporos
so dificilmente corados e muito pequenos (1 a 1,5m).
2. Os esfregaos para CQ devem ser includos em todos os procedimentos de colorao, particularmente quando no so realizadas coloraes
com freqncia.
3. Usar no procedimento de colorao cubas de Coplin para evitar a
evaporao das solues.
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274

CAPTULO 11

4. Conferir a aderncia (macroscopicamente) dos espcimes lmina.


5. Quando os esfregaos forem corretamente fixados e corados, os esporos
aparecem ovides e refrteis, com a parede corada do rosa ao vermelho,
com uma zona central clara ou, eventualmente, mostrando uma faixa horizontal ou em diagonal, a qual representa o tbulo polar.
6. As bactrias, clulas de leveduras e alguns artefatos coram-se de
verde (Weber-verde) ou azul (Ryan-azul). Entretanto, algumas bactrias e
artefatos coram-se de rosa-vermelho.
7. Os resultados desse mtodo de colorao devero ser reportados
somente se o esfregao-controle estiver bem corado12.

COLORAO PELO CHROMOTROPE


KOKOSKIN (A QUENTE)

QUENTE

OU

M ODIFICAO

DE

Esse procedimento de colorao de Kokoskin15 apresenta mudanas na


temperatura de aquecimento das lminas (50C) e no tempo de colorao (90 a
10 minutos). Garcia e Bruckner12 recomendam substituir a temperatura ambiente pelo aquecimento a 50C e o tempo de colorao em 10 minutos.
Amostra
Material fecal preservado em soluo de formaldedo a 10%. Agitar
vigorosamente a mistura de fezes e preservador.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10 N 2Na 2O 8S 2)


Fast green (CI 42053) (C 37H 34 N 2Na 2O 10S 3)
cido fosfotngstico (24WO3.2H 3PO4.48H 2O)
cido actico glacial (C2H 4O 2)
lcool metlico absoluto (CH4O), livre de acetona
lcool etlico absoluto (C2H 6O)
lcool etlico a 95% (C 2H 6O)
Formaldedo 37-40% (HCHO)

9. Xilol (C8H1O)
10. Meio de montagem (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Corante Tricrmico Modificado
Chromotrope 2R
Fast green

9g
0,22g

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CAPTULO 11

275

cido actico glacial


cido fosfotngstico
gua destilada-deionizada

4,5ml
1,05ml
150ml

a. Dissolver o Chromotrope 2R e o Fast green em 4,5ml de cido actico


glacial e adicionar o cido fosfotngstico. Agitar vigorosamente e deixar a
mistura em repouso durante 30 minutos, temperatura ambiente.
b. Adicionar 150ml de gua destilada-deionizada ao corante, o qual dever
apresentar cor prpura forte quase preta.
c. Estocar o corante em frasco de plstico ou em frasco de vidro com
tampa esmerilhada. A soluo corante estvel por um ms.
2. Soluo de cido-lcool (v/v)
cido actico glacial

0,675ml

lcool etlico a 95% q.s.p

150ml

3. Soluo de Formaldedo a 10% (v/v)


Formaldedo 37-40%
gua destilada-deionizada

10ml
90ml

Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar um esfregao, usando uma alquota de 10l de fezes preservadas (formalina a 10%), pela extenso do material em uma rea total
de 45 por 25mm.
3. Deixar secar temperatura ambiente.
4. Fixar o esfregao com lcool metlico durante cinco minutos.
5. Deixar secar temperatura ambiente.
6. Corar com o corante tricrmico modificado, aquecendo a lmina
temperatura de 50C durante 10 minutos.
7. Escorrer o corante e lavar com soluo lcool-cido por 10 segundos.
8. Lavar com lcool etlico a 95% por 10 segundos.
9. Lavar com lcool etlico a 95% por cinco segundos.
10. Lavar com lcool etlico absoluto por 10 minutos.
11. Imergir em xilol por 10 minutos.
12. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
13. Examinar os esfregaos com leo de imerso (1.000X) e ler no mnimo
100 campos.
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276

CAPTULO 11

Observao: Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas


do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
A parede dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa
ao vermelho, com uma zona central clara ou, eventualmente, mostrando uma
faixa horizontal ou em diagonal, a qual representa o tbulo polar. O tamanho e a forma dos outros componentes fecais so de grande importncia na
diferenciao dos esporos de outras estruturas12.

COLORAO

DE

GRAM -CHROMOTROPE

PARA

MICROSPORDIOS

Em 1996, Moura e cols. desenvolveram o mtodo do Gram-Chromotrope


para microspordios, uma combinao da colorao de Gram e a colorao
modificada do tricrmico18,19,28 (Figs. 11.4 e 11.5).
Amostra
Fezes, urina, escarro, saliva, sobrenadante de cultura de clulas.
Reagentes
1.
2.
3.
4.

Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10N 2Na 2O 8S 2)


Fast green (CI 42053) (C 37H 34 N 2Na 2O 10S 3)
cido fosfotngstico (24WO3.2H3PO4.48H2O)
cido actico glacial (C2H 4O2)

5. Acetona (C 3H 6O)
6. lcool metlico (CH4O)
7. lcool etlico absoluto (C 2H 6O)
8. lcool etlico 95% (C2H 6O)
9. ter etlico (C4H 10O)
10. Cristal violeta (Bacto Crystal violet) (CI 42555) (C25H 30ClN 3)
11. Hidrogenocarbonato de sdio (NaHCO3)
12. Iodo, cristais (I2)
13. Iodeto de potssio (KI)
14. Resina sinttica (Cytoseal 60)

Nota: Os corantes do mtodo de Gram podem ser adquiridos comercialmente da Fisher Scientific (Gran Stain Kit SD100).

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CAPTULO 11

277

Preparao das Solues


1. Soluo de Cristal Violeta (m/v)
Cristal violeta
gua destilada-deionizada

1g
100ml

Colocar o cristal violeta em um gral e acrescentar lentamente a gua.


Deixar em repouso durante 24 horas e filtrar.
2. Soluo de Hidrogenocarbonato de Sdio a 5% (m/v)
Hidrogenocarbonato de sdio
gua destilada-deionizada

1g
20ml

Dissolver hidrogenocarbonato de sdio em gua. Filtrar e estocar em


frasco conta-gotas.
3. Soluo de Lugol
Iodo
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

1g
2g
300ml

Dissolver o iodeto de potssio em gua. Adicionar lentamente o iodo


e agitar a mistura at a completa dissoluo. Filtrar e estocar em frasco de
cor mbar com tampa esmerilhada, ao abrigo da luz.
4. Soluo cido-lcool (v/v)
lcool etlico a 90%
cido actico glacial

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de cor


mbar com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
5. Soluo de ter Etlico-Acetona (v/v)
Acetona
ter etlico

75ml
25ml

Misturar o ter etlico e a acetona e estocar em frasco de cor mbar


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
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278

CAPTULO 11

6. Soluo de Chromotrope
Chromotrope 2R
Fast green
cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

6g
0,15g
0,7g
3ml
100ml

Colocar os ingredientes secos em um beaker e adicionar 3ml de cido


actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para amadurecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve ser diludo.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar um esfregao delgado estirado (uma a duas gotas) com a
amostra que deve ser corada. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Fixar o esfregao pelo calor em chama baixa (trs vezes por um
segundo) ou cinco minutos no aquecedor de lmina (slide warmer) temperatura de 60C. Deixar esfriar temperatura ambiente. O esfregao pode
ser fixado com lcool metlico por trs a cinco minutos.
4. Colorao pelo mtodo de Gram
a. Cobrir o esfregao durante dois minutos com a soluo corante de
cristal violeta a 1%, adicionada de trs gotas de soluo de hidrogenocarbonato
de sdio a 5%.
b. Escorrer o excesso do corante e lavar com gua corrente.
c. Imergir o esfregao na soluo de iodo de Gram por dois minutos.
d. Escorrer o excesso da soluo de iodo de Gram e lavar com gua
corrente.
e. Diferenciar com a soluo de ter etlico-acetona.
f. Lavar com gua corrente.
5. Colorao pela soluo corante do Chromotrope
a. Imergir o esfregao na soluo corante de Chromotrope por 10 minutos.
b. Imergir na soluo de lcool-cido por um a trs segundos.
c. Lavar com lcool etlico a 95% por um minuto.
d. Lavar duas vezes, um minuto cada uma, com lcool etlico absoluto.
e. Deixar secar temperatura ambiente ou no aquecedor de lmina (slide
warmer) por cinco minutos. Montar com resina sinttica.
f. Examinar 200 a 300 campos do esfregao com objetiva de imerso (100X).
Observao: Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas
do procedimento de colorao.
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CAPTULO 11

279

Caractersticas da Colorao
A parede dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa
plido ao vermelho. As bactrias, clulas de leveduras e alguns artefatos
coram-se de verde desmaiado.
Controle de Qualidade
1. A nica maneira de realizar o controle de qualidade (CQ) aceitvel
para esse mtodo usar esporos verdadeiros como controle dos organismos. O uso dos microrganismos particularmente importante porque os esporos
so dificilmente corados e muito pequenos (1 a 1,5m).
2. Os esfregaos para o controle de qualidade (CQ) devem ser includos em todos os procedimentos de colorao, particularmente quando no
so realizadas coloraes com freqncia.
3. Dependendo do nmero de esfregaos corados, no mais de 10 lminas, as solues subseqentes soluo corante do Chromotrope devem
ser trocadas para a obteno de uma adequada lavagem e/ou desidratao.
4. Quando os esfregaos forem corretamente fixados e corados, os esporos
aparecem ovides e refrteis, com a parede corada do rosa ao vermelho,
com uma zona central clara ou, eventualmente, mostrando uma faixa horizontal ou em diagonal, a qual representa o tbulo polar.
5. Usar cubas de Coplin no procedimento de colorao para evitar a
evaporao das solues.

COLORAO RPIDA

QUENTE

PELO

G RAM-CHROMOTROPE

Este procedimento foi desenvolvido por Moura e cols. (19) para a deteco de esporos de microspordios em amostras clnicas. (Figs. 11.4 e 11.5)
Amostra
Fezes, urina, escarro, saliva, sobrenadante de cultura de clulas.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10N 2Na 2O 8S 2)


Fast green (CI 42053) (C 37H 34 N 2Na 2O 10S 3)
cido fosfotngstico (24WO3.2H 3PO4.48H 2O)
cido actico glacial (C2H 4O2)
Acetona (C 3H 6O)
lcool etlico a 95% (C 2H6O)
lcool etlico absoluto (C2H 6O)
Cristal violeta (Bacto Crystal violet) (CI 42555) (C 25H 30ClN3)

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280

CAPTULO 11

9. Iodo, cristais (I2)


10. Iodeto de potssio (KI)
11. Resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
1. Soluo de Cristal Violeta (m/v)
Cristal violeta
gua destilada-deionizada

1g
100ml

Dissolver o cristal violeta em gua. Filtrar e estocar em frasco conta-gotas de cor mbar, ao abrigo da luz.
2. Soluo de Lugol
Iodo
Iodeto de potssio
gua destilada-deionizada

1g
2g
300ml

Dissolver o iodeto de potssio em gua. Adicionar lentamente o iodo


e agitar a mistura at a completa dissoluo. Filtrar e estocar em frasco
conta-gotas de cor mbar, ao abrigo da luz.
3. Soluo de lcool Etlico-Acetona (1:1) (v/v)
lcool etlico a 95%
Acetona

100ml
100ml

4. Soluo cido-lcool (v/v)


lcool etlico a 90%
cido actico

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
5. Soluo de Chromotrope
Chromotrope 2R
Fast green

1g
0,15g

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CAPTULO 11

281

cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

0,25g
3ml
100ml

Colocar os ingredientes secos em um beaker e adicionar 3ml de cido actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para
amadurecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve
ser diludo.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar esfregao delgado estirado com as amostras que devero
ser coradas. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Fixar o esfregao pelo calor em chama baixa (trs vezes por um
segundo em chama baixa ou cinco minutos em aquecedor de lmina a 60C
(slide warmer). Deixar esfriar temperatura ambiente antes de corar.
4. Colorao pelo mtodo de Gram (excluir a etapa da safranina)
a. Imergir o esfregao na soluo corante de cristal violeta por 30 segundos.
b. Escorrer o excesso do corante e lavar com gua corrente.
c. Imergir o esfregao na soluo de lugol de Gram por 30 segundos.
d. Escorrer a soluo de iodo de Gram e lavar com soluo de lcool
etlico-acetona at que a soluo diferenciadora escorra do esfregao incolor.
e. Lavar o esfregao com gua corrente fria para remover o excesso
da soluo diferenciadora.
5. Colorao pela soluo de Chromotrope
a. Imergir o esfregao na soluo quente do corante de Chromotrope
(50C a 55C) por um minuto.
b. Lavar na soluo de lcool-cido por um a trs segundos.
c. Lavar em lcool etlico a 95% por 30 segundos.
d. Lavar duas vezes, 30 segundos cada uma, em lcool etlico a 100%.
(Colocar o lcool etlico em duas cubas de Coplin diferentes).
e. Deixar secar temperatura ambiente.
f. Montar em resina sinttica (Cytoseal 60).
g. Examinar 200 a 300 campos do esfregao com objetiva de imerso
(100X).
Observaes
1. Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas do procedimento de colorao.
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282

CAPTULO 11

2. Moura e cols.19 recomendam para cortes de tecidos montados em


parafina, lavar rapidamente a preparao na soluo de lcool etlico a 50%
+ xilol a 50% (1:1) por 15 segundos e aps em xilol a 100% por 15 minutos,
antes de montar com Cytoseal 60 e sem deixar a preparao secar.
Caractersticas da Colorao
Os esporos dos microspordios aparecem ovides, de colorao violeta
intensa sobre o fundo claro da preparao. Depois da colorao rpida a
quente pelo mtodo do Gram-Chromotrope, os espcimes fecais corados,
contendo Encephalitozoon intestinalis e Entercytozoon bieneusi, podem
ser separados em dois grupos, baseados no tamanho dos esporos. As leveduras aparecem coradas em rosa-vermelho, sendo facilmente diferenciadas
dos esporos dos microspordios. As bactrias coram-se fracamente pelo corante
e no so confundidas com os esporos dos microspordios.

COLORAO

PELO

C HROMOTROPE

Esse mtodo de colorao foi desenvolvido no Center for Infectious


Diseases, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta,
Georgia, EUA, usando vrios componentes do mtodo da colorao do
tricrmico para diferenciar esporos de microspordios dos elementos fecais
do fundo da preparao.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Chromotrope 2R (CI 16570) (C 16H 10 N 2Na 2O 8S 2)


Fast green (CI 42053) (C 37H 34 N 2Na 2O 10S 3)
cido fosfotngstico (24WO3.2H 3PO4.48H 2O)
cido actico glacial (C2H 4O 2)
lcool etlico absoluto 100% (C2H 6O)
lcool etlico a 90%
lcool etlico a 95%
lcool metlico (CH4O)
Resina sinttica (Cytoseal 60)

Preparao das Solues


1. Soluo de Chromotrope
Chromotrope 2R
Fast green
cido fosfotngstico
cido actico glacial
gua destilada-deionizada

6g
0,15g
0,75g
3ml
100ml

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CAPTULO 11

283

Colocar os ingredientes secos em um beaker e adicionar 3ml de cido actico glacial. Agitar a mistura e deixar em repouso 30 minutos para
amadurecer. Adicionar 100ml de gua. O corante estvel e no deve
ser diludo.
2. Soluo lcool-cido (v/v)
lcool etlico a 90%
cido actico

995,5ml
4,5ml

Adicionar o cido actico ao lcool etlico e estocar em frasco de vidro


com tampa esmerilhada. Conservao indefinida.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Preparar esfregao delgado estirado com a amostra que dever ser
corada. Deixar secar temperatura ambiente.
3. Fixar o esfregao com lcool metlico durante trs a cinco minutos.
4. Imergir o esfregao na soluo corante de Chromotrope por 90
minutos.
5. Lavar com soluo lcool-cido por um a trs segundos.
6. Lavar por imerso em lcool etlico a 95%.
7. Lavar duas vezes, um minuto cada uma, em lcool etlico a 100%.
8. Deixar secar temperatura ambiente.
9. Montar em resina sinttica.
10. Examinar 200 a 300 campos do esfregao com objetiva de imerso
(100X).
Observao: Cubas de Coplin devem ser usadas em todas as etapas
do procedimento de colorao.
Caractersticas da Colorao
A parede dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa
plido ao vermelho, medindo aproximadamente 1m.
Controle de Qualidade
1. Incluir ao mtodo de colorao uma lmina-controle com microspordios
preparada com amostra fecal preservada pela soluo salina de formaldedo a 10%.
2. Dependendo do nmero de esfregaos corados, no mais de 10 lminas, as solues subseqentes soluo corante do Chromotrope devem
ser trocadas para a obteno de uma adequada colorao.
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284

CAPTULO 11

3. Devido s dificuldades encontradas no diagnstico desse pequeno esporo,


recomendada a pesquisa e a confirmao dos resultados positivos por um
segundo microscopista.

REVISO: COLORAES PELO TRICRMICO MODIFICADO PARA A COLORAO DE MICROSPORDIOS


Princpio: Produzir contraste de colorao entre os artefatos do fundo
da preparao e os parasitos presentes; permitir o exame e o reconhecimento das caractersticas dos organismos atravs de objetiva de imerso
(objetiva de 100X, totalizando um aumento de 1.000X). Indicado para
identificar e diagnosticar esporos de microspordios. A parede celular
dos esporos dos microspordios apresenta colorao do rosa ao vermelho, com uma zona central clara ou, eventualmente, mostrando uma faixa
horizontal em diagonal, a qual representa o tbulo polar. Alguns esporos
so observados atravs do exame com leo de imerso (1.000X de
aumento).
Amostra: Amostras fecais frescas ou preservadas pelo formaldedo ou
SAF.
Reagentes: A colorao do tricrmico modificada (usando alta concentrao de Chromotrope 2R) e solues associadas; solues
desidratantes (lcoois e xilol); resinas sintticas ou blsamo-do-canad.
Exame: Examinar no mnimo 200 a 300 campos com objetiva de imerso;
um nmero adicional de campos pode ser requerido se um organismo
suspeito no foi claramente identificado como cido-resistente.
Resultados: O reconhecimento e a identificao de esporos de
microspordios torna-se muito difcil devido ao pequeno tamanho dos organismos. O diagnstico final de laboratrio depende principalmente da
aparncia dos esfregaos do controle de qualidade e da comparao
com os espcimes do paciente.
Observaes e limitaes: Devido s dificuldades em obter a penetrao do corante na parede celular dos esporos, as modificaes do
mtodo do tricrmico apresentam excelentes resultados. As limitaes
do procedimento esto relacionadas com as amostras: correto tempo e
velocidade de centrifugao; filtrao atravs de gaze levemente
umedecida com gua corrente dobrada duas vezes e dificuldades na
identificao dos esporos devido ao seu pequeno tamanho (1 a 2m).
Realizar a morfometria com micrmetro ocular.

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CAPTULO 11

285

Fig. 11.4 Microfotografias de esporos de microspordios corados pelo Gram-Chromotrope


(1.259X). A, B) Enterocytozoon bieneusi em esfregaos de fezes humanas; C) Encephalitozoon
intestinalis em esfregaos de fezes humanas; D) Encephalitozoon intestinalis em cultura de
clulas. (Cortesia de Hrcules Moura, CDC, EUA.)

Fig. 11.5 Microfotografias de microspordios obtidos de cultivo celular, corados pelo GramChromotrope (1.259X). A) Encephalitozoon cuniculi; B) Encephalitozoon hellem; C) Vittaforma
corneae; D) Nosema algerae. (Cortesia de Hrcules Moura, CDC, EUA.)

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286

CAPTULO 11

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO 11

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CAPTULO 11

4
Parasitos do Sangue
e dos Tecidos

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CAPTULO 12

CAPTULO

12

Exame do Sangue

Geraldo Attilio De Carli

CONSIDERAES GERAIS
Diferentes estgios de desenvolvimento de vrias espcies
de parasitos so diagnosticados no sangue perifrico humano.
Entre estes hemoparasitos esto includos protozorios e helmintos.
Nesses grupos encontram-se tripanossomos (Trypanosoma cruzi),
plasmdios (Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae),
babsia (Babesia bigemina), Leishmania donovani e diversas
espcies de filrias (Wuchereria bancrofti, Mansonella ozzardi,
Onchocerca volvulus). Os Plasmodium (P. vivax, P. falciparum,
P. malariae) e a Babesia spp. so encontrados parasitando as
hemcias; enquanto os tripanossomos e as microfilrias so
detectados fora das hemcias, e os estgios amastigotas da
Leishmania so ocasionalmente encontrados nos moncitos. As
microfilrias e os tripanossomos podem ser identificados no sangue
perifrico, devido a sua forma e motilidade. Entretanto, uma colorao permanente necessria para estabelecer uma identificao especfica final dos organismos. Uma variedade de procedimentos usada e indicada na preparao e no exame do
sangue para a pesquisa dos parasitos. A identificao de todos
os parasitos do sangue realizada por um ou dois tipos de
esfregaos sangneos: esfregaos estirados ou esfregaos espessos (gota espessa). Esses esfregaos so preparados com
sangue total colhido com anticoagulante, ou com o sedimento de
diferentes mtodos indicados para concentrar tripanossomos e
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CAPTULO 12

291

microfilrias no sangue. Os organismos no so identificados tomando como


referncia, somente, a preparao direta a fresco; esfregaos permanentes
corados devero ser examinados para que seja estabelecida a caracterizao morfolgica e a identificao especfica do organismo em estudo. Uma
variedade de corantes e mtodos de colorao indicada para a colorao
dos hemoparasitos. Quando os parasitos no forem encontrados na primeira
amostra, colher novos espcimes em intervalos de seis a 12 horas, at que
um diagnstico seja estabelecido ou que no haja mais suspeita de infeco
(usualmente trs a cinco dias). O diagnstico das infeces pelos parasitos
do sangue no deve ser considerado negativo, quando somente uma amostra sangnea foi examinada3.
PREPARAO DOS ESFREGAOS SANGNEOS
Dois tipos de esfregaos sangneos so usados: os espessos e os estirados. Entretanto, a combinao de ambos em uma mesma lmina de microscopia pode oferecer melhores resultados. Essas preparaes so indicadas para o estudo e diagnstico das hemoparasitoses. As lminas devero
estar quimicamente limpas, para assegurar uniforme preparao dos esfregaos
e permitir sua adeso lmina. Antes do uso, as lminas velhas devero
ser lavadas com detergente e depois em lcool etlico a 70%, enquanto as
lminas novas, somente em lcool etlico a 70%1,3,15,16,19,20.

ESFREGAOS ESTIRADOS
Os esfregaos estirados (Figs. 12.1 e 12.3) so geralmente empregados
para o estudo das hemcias, a contagem diferencial dos leuccitos e para o

Fig. 12.1 Preparao de esfregao sangneo estirado. (Adaptada de Markell EK, Voge
M, John DT. Medical Parasitology. 7 th ed. Philadelphia (Pa): W.B. Saunders Co., 1992.)

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292

CAPTULO 12

diagnstico e o estudo diferencial dos distintos estgios das espcies de


Plasmodium, quando a densidade dos parasitos for alta; entretanto, esses
esfregaos no apresentam bons resultados quando a densidade dos parasitos da malria baixa 1,2,4,15,16,20.
Preparao
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colocar em lmina de microscopia, perto de uma das extremidades,
uma gota de sangue fresco, colhido por puno venosa ou da polpa digital.
3. Com outra lmina, estirar a gota de sangue da direita para a esquerda, em direo ao lado oposto, deixando, se for necessrio, um espao para
a preparao de esfregao espesso.
4. Fazer um ngulo de 30-45 entre a segunda lmina e a gota de sangue. Dessa maneira, as clulas so estendidas separadamente, no sendo
sobrepostas ou amontoadas.
5. O esfregao estirado dever ter no mnimo 2cm de comprimento,
ocupando a rea central da lmina, com as margens livres de ambos os lados (Fig. 12.1).
6. Deixar secar temperatura ambiente.
7. A necessidade de fixar o esfregao antes da colorao depende do
mtodo de colorao a ser usado.
Observao: Os esfregaos estirados podero ser preparados com
sangue colhido com cido etilenodiaminotetractico (EDTA).
EDTA (C 10 H 16 N 2 O 8 )
gua destilada-deionizada

5g
100ml

Dissolver o anticoagulante em gua. Distribuir em alquotas de 0,4ml


e deixar evaporar a gua. Esse volume de anticoagulante suficiente para
10ml de sangue. Na preparao do EDTA poder ser usado o Na 2EDTA
(sal dissdico do cido etilenodiaminotetractico) ou K2EDTA (sal dipotssico
do cido etilenodiaminotetractico).

ESFREGAOS ESPESSOS (GOTA ESPESSA)


Os esfregaos espessos (Figs. 12.2 e 12.3) so preparaes sangneas
que usam quantidades relativamente grandes de sangue em pequena rea, a
qual desemoglobinada para oferecer melhores resultados ao exame microscpico 1,2,5,15,16.
Preparao
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.

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CAPTULO 12

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2. Colocar em lmina de microscopia trs a quatro gotas de sangue fresco,


colhidas por puno venosa ou da polpa digital.
3. Com a ponta de outra lmina e com movimentos circulares, contnuos, reunir as gotas, criando uma rea de aproximadamente 2cm de dimetro
(Fig. 12.2); continuar com os movimentos circulares, do centro para a periferia, durante 30 segundos, para evitar a formao de fibrina, a qual poder
obscurecer as preparaes coradas.
4. Terminar os movimentos circulares no centro do crculo de sangue;
por meio desse procedimento o esfregao apresenta a borda fina e o centro
espesso.
5. Deixar secar temperatura ambiente e, aps, mergulhar a preparao em gua corrente ou em soluo salina a 0,85%, para que se produza a
hemlise. Secar temperatura ambiente.
Controle de Qualidade (CQ)
1. O esfregao estirado dever ter no mnimo 2cm de comprimento,
ocupando a rea central da lmina e com as margens livres de ambos os
lados.
2. O esfregao espesso dever ser de arredondado a oval com aproximadamente 2cm de rea, ocupando obliquamente uma extremidade da lmina.
3. O esfregao no deve apresentar reas claras ou manchas (indicativo de gordura ou impresso digital na lmina de microscopia).
4. Excesso de corante no esfregao poder confundir e tornar difcil a
identificao do organismo (Fig. 12.3).

Fig. 12.2 Preparao de esfregao sangneo espesso. (Adaptada de Markell EK, Voge
M, John DT. Medical Parasitology. 7 th ed. Philadelphia (Pa): W.B. Saunders Co., 1992.)

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CAPTULO 12

ESFREGAOS SANGNEOS ADEQUADA E INADEQUADAMENTE PREPARADOS

Esfregao espesso e estirado

Esfregao espesso

ERROS QUE DEVEM SER EVITADOS

Muito fino

Muito pequeno

Gotas desconectadas

Dano por insetos

Impropriamente seco

Muito espesso
(parte descolando-se)

Lmina engordurada

Esfregao estirado
muito espesso

Esfregao espesso
muito espesso

Fig. 12.3 Esfregaos sangneos adequada e inadequadamente preparados. (Adaptada e


reproduzida de Laboratory Diagnosis of Parasitic Diseases, Emory Medical School Course
and Laboratory Training Unit Laboratory Consultation and Developed Branch, CDC, Atlanta
Georgia, EUA, 1966.)

Observaes
1. No estudo e diagnstico da malria, por meio de esfregaos espessos, o nmero das hemcias aumenta extraordinariamente em um nico campo
microscpico; a eficincia na observao dos parasitos ampliada de trs
a 22 vezes, mas depende da espessura do esfregao, da densidade dos parasitos e da exatido da pesquisa realizada pelo tcnico.
2. Outros lquidos so indicados para a produo de hemlise: soluo
isotnica de azul-de-metileno; soluo de saponina a 0,2-0,5%, soluo tampo, pH 7,0-7,2 e gua destilada, tamponada, pH 7,0-7,2.
3. Infeces leves podem ser omitidas no exame dos esfregaos
estirados; entretanto, o aumento do volume do sangue presente nos
esfregaos espessos permite detectar a infeco, mesmo com parasitemias
leves.
4. A morfologia dos parasitos e dos eritrcitos pode se tornar atpica
quando o sangue colhido com anticoagulante e quando os esfregaos so
preparados uma hora aps a colheita.

COMBINAO
ESPESSOS

DE

ESFREGAOS ESTIRADOS

Em inquritos epidemiolgicos recomendada a preparao de lminas com esfregaos espessos e estirados.


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CAPTULO 12

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COLORAO DOS ESFREGAOS SANGNEOS


Uma variedade de corantes e mtodos de colorao indicada para a
colorao e identificao dos hemoparasitos. Alguns procedimentos apresentam o fixador combinado com o corante (colorao de Wright); em outros, a fixao realizada antes da colorao (colorao de Giemsa). Os
mtodos de colorao mais difundidos so os de: Leishman, Wright, Field,
Giemsa, JSB, Walker e Shute.

COLORAO

DE

GIEMSA

A colorao de Giemsa usada para diferenciar a morfologia nuclear


e/ou citoplasmtica de plaquetas, eritrcitos, leuccitos e de parasitos. Esse
mtodo indicado para a colorao de esfregaos estirados, que so fixados com lcool metlico e para esfregaos espessos, que no requerem
fixao, pois a lise das hemcias necessria para que a observao seja
realizada. A diluio da soluo concentrada de Giemsa, para o uso em
soluo tampo de fosfato, pH 7,2 ou 6,6-7,2, depende do mtodo especfico usado. A soluo estoque, apesar de sua estabilidade, deve ser protegida contra a umidade, porque a reao de colorao oxidativa. Por essa
razo, o oxignio da gua inicia a reao destruindo o corante. A soluo
aquosa para o uso tem validade de um dia. A adio do detergente
no-inico de superfcie Triton X-100 em tampo fosfato ao corante de
Giemsa, nas quantidades de 0,1% para esfregaos espessos e 0,01% para
esfregaos estirados ou para a combinao de esfregaos estirados e espessos, facilita a observao das caractersticas morfolgicas dos hematozorios, como as granulaes de Maurer (P. falciparum) e de Schffner
(P. vivax) 1,6,15,16,20 .
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Giemsa p (Azur B) (CI 52010)(C15H16N3SCl)


lcool metlico (CH4O), livre de acetona
Glicerina (C3H8O3)
Diidrogenofosfato de potssio anidro (KH2PO4)
Hidrogenofosfato dissdico diidratado (Na2HPO4.2H2O)
Hidrogenofosfato dissdico anidro (Na2HPO4)
Diidrogenofosfato de sdio monoidratado (NaH2PO4.H2O)
Triton X-100 (Rohm & Haas)

Preparao do Corante
1. Soluo Concentrada de Giemsa
Giemsa, p (Azur B)

0,6g

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296

CAPTULO 12

Glicerina
lcool metlico

50ml
50ml

Misturar, em um gral, o Giemsa p e a glicerina. Aquecer em banho


de gua a 60C durante duas horas. Deixar esfriar e adicionar o lcool metlico
absoluto. Armazenar a soluo em um frasco mbar por duas a quatro semanas. Filtrar em papel-filtro antes de usar.
2. Soluo Tampo de Fosfatos, pH 7,2
Diidrogenofosfato de potssio anidro
Hidrogenofosfato dissdico diidratado
gua destilada-deionizada, q.s.p.

0,49g
1,09g
1.000ml

Dissolver KH 2PO 4 e Na 2HPO 4.2H 2O em gua e misturar bem.


Ou
3. Solues Tampo de Fosfatos (para a preparao de solues
tampo)
a. Soluo tampo alcalina, 0,067M
Hidrogenofosfato dissdico anidro
gua destilada-deionizada q.s.p.

9,5g
1.000ml

Dissolver Na 2HPO4 em gua e misturar bem. Armazenar a soluo


tampo em frasco de vidro com tampa esmerilhada. Validade da soluo:
24 meses.
b. Soluo tampo cida, 0,067M
Diidrogenofosfato de sdio monoidratado
gua destilada-deionizada q.s.p.

9,2g
1.000ml

Dissolver NaH2PO4.H2O em gua e misturar bem. Armazenar a soluo tampo em frasco de vidro com tampa esmerilhada. Validade da soluo: 24 meses.
c. Soluo tampo pH 7,0 a 7,2 (para diluir corante e lavar esfregaos)
Soluo tampo alcalina
Soluo tampo cida
gua destilada-deionizada

61ml
39ml
900ml

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CAPTULO 12

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Misturar a soluo tampo alcalina e a soluo tampo cida. Desprezar a soluo tampo quando o pH no estiver entre 7,0 e 7,2. Armazenar a soluo tampo em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
d. Soluo tampo pH 6,8 (para diluir corante e lavar esfregaos)
Soluo tampo alcalina
Soluo tampo cida
gua destilada-deionizada

50ml
50ml
900ml

Misturar a soluo tampo alcalina e a soluo tampo cida. Desprezar a soluo tampo quando o pH estiver fora de 6,8 0,1. Armazenar
a soluo tampo em frasco de vidro com tampa esmerilhada.
4. Corante: Soluo de Giemsa a 5% em Tampo de Fosfatos,
pH 7,2
Giemsa (concentrado)
Soluo tampo de fosfatos pH 7,2

5ml
95ml

Preparar a soluo corante em proveta de 100ml. Essa soluo de


trabalho dever ser preparada diariamente.
5. Soluo Estoque de Triton X-100 a 10% (v/v)
Triton X-100
gua destilada-deionizada

10ml
90ml

6. Soluo Triton Tamponada a 0,01% (v/v) e 0,1% (v/v)


Soluo aquosa estoque de Triton X-100 a 10%
Soluo tampo de fosfatos, pH 7,2

1ml
10ml
1.000ml 1.000ml

Colorao
A fixao e a colorao so usualmente realizadas na cuba de
Coplin. A soluo corante de Giemsa deve ser preparada fresca diariamente.
Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
1. Esfregaos Estirados
a. Fixar os esfregaos com lcool metlico durante cinco minutos.
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CAPTULO 12

b. Corar os esfregaos durante 45 minutos com a soluo de Giemsa a


5% em tampo de fosfatos pH 7,2.
c. Lavar os esfregaos com gua corrente. Deixar secar temperatura ambiente na posio vertical.
2. Esfregaos Espessos
a. No fixar os esfregaos.
b. Corar os esfregaos durante 45 minutos com a soluo de Giemsa a
5% em tampo de fosfatos pH 7,2.
c. Lavar os esfregaos com gua corrente. Deixar secar temperatura ambiente na posio vertical.
3. Combinao de Esfregaos Espessos e Estirados
a. Fixar somente os esfregaos estirados com lcool metlico durante
cinco minutos.
b. Corar ambos os esfregaos, simultaneamente, durante 45 minutos com
a soluo de Giemsa a 5% em tampo de fosfatos pH 7,2.
c. Lavar os esfregaos com gua corrente. Deixar secar temperatura ambiente na posio vertical.
Controle de Qualidade (CQ)
1. As solues tampo de fosfatos e a gua tamponada devem ser claras sem contaminao visvel.
2. Antes do uso, conferir a soluo de Giemsa a 5% em tampo fosfato, pH 7,2, incluindo o tampo de fosfatos e gua tamponada.
3. Preparar e corar esfregaos de sangue humano normal e avaliar
microscopicamente as reaes de colorao das plaquetas, eritrcitos e
leuccitos:
a. macroscopicamente, os esfregaos de sangue apresentam a colorao purprea. Quando esto azuis, a gua tamponada est muito alcalina;
quando apresentam cor de rosa ao vermelho a gua tamponada est muito
cida;
b. microscopicamente, os eritrcitos coram-se em rosa-plido, as plaquetas em rosa forte e o ncleo dos leuccitos em prpura-azul, com citoplasma mais claro; os grnulos eosinoflicos, em brilhante prpura-vermelho
e os grnulos dos neutrfilos, em prpura. As granulaes basfilas noinfectadas dentro dos eritrcitos coram-se em azul.
4. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
usadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com
o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
5. Os resultados do controle de qualidade devem ser apropriadamente
registrados.
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CAPTULO 12

299

Observaes
1. Os esfregaos preparados com sangue venoso colhido com anticoagulante devem ser processados dentro de uma hora. Caso contrrio, as caractersticas morfolgicas dos parasitos e dos eritrcitos podem apresentar
estruturas atpicas.
2. Com freqncia os esfregaos espessos desprendem-se das lminas
durante o processo de colorao. O correto pH da gua tamponada, das
solues tampo de fosfato e da soluo de Giemsa a 5% em tampo de
fosfatos, propicia uma correta colorao. As solues e os corantes com
pH incorreto impedem que certas caractersticas morfolgicas nos esfregaos
corados tornem-se visveis, obstruindo as coloraes tpicas do ncleo e do
citoplasma.
3. Os esfregaos para o controle de qualidade devero ser corados junto
aos esfregaos preparados para o diagnstico.
4. Quando vrios espcimes de pacientes so corados no mesmo dia
(usando os mesmos reagentes), necessrio corar e examinar somente um
esfregao para o controle de qualidade.
5. A infeco parasitria no deve ser descartada ou negativada, tomando como referncia o estudo e o exame de somente alguns esfregaos
permanentes corados.
6. O procedimento aconselhvel colher amostras de sangue em intervalos de seis a 12 horas at que um diagnstico seja estabelecido em um
intervalo de trs a cinco dias.
7. Aps o exame de, no mnimo, 300 campos com objetiva de imerso
(100X), o resultado da pesquisa de parasitos poder ser considerado negativo.
8. Dependendo da experincia do microscopista, o exame satisfatrio
de esfregaos espessos requer cinco a 10 minutos (aproximadamente 100
campos) e 15 a 20 minutos para esfregaos estirados (aproximadamente 200
a 300 campos) com aumento de 1.000X (com leo de imerso).
9. Examinar todo o esfregao, com objetiva de imerso (100X), para
pesquisa de microfilrias.

COLORAO

DE

FIELD

Esse mtodo foi desenvolvido por Field para a colorao de esfregaos


espessos no diagnstico da malria. De modo idntico colorao de Giemsa,
os esfregaos espessos no so fixados, mas devero estar secos e sempre
preparados com sangue fresco. Duas solues (A e B) so usadas, ambas
isotnicas ou em pH 6,612,13.
Reagentes
1. Azul-de-metileno (CI 52015) (C16H18ClN3S.3H2O).
2. Azur B (CI 52010) (C15H16N3SCl)

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300

CAPTULO 12

3. Eosina B (CI 45400) (C20H6N 2O9Br 2Na 2)


4. Hidrogenofosfato dissdico anidro (Na2HPO4)
5. Diidrogenofosfato de potssio anidro (KH2PO4)
Preparao dos Corantes
1. Soluo A
Azul-de-metileno
Azur B
Hidrogenofosfato dissdico anidro
Diidrogenofosfato de potssio anidro
gua destilada-deionizada

0,80g
0,50g
5g
6,25g
500ml

Dissolver os sais fosfatos em gua e adicionar os corantes. Deixar a


soluo em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel-filtro antes do uso.
2. Soluo B
Eosina B
Hidrogenofosfato dissdico anidro
Diidrogenofosfato de potssio anidro
gua destilada-deionizada

1g
5g
6,25g
500ml

Dissolver os sais fosfatos em gua e adicionar o corante. Deixar a


soluo em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel-filtro antes de usar.
Colorao
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Mergulhar os esfregaos por 1-5 segundos na soluo A.
3. Lavar os esfregaos com gua destilada-deionizada, at que o corante
cesse de escorrer da lmina.
4. Mergulhar os esfregaos por 1-5 segundos na soluo B.
5. Lavar os esfregaos com gua destilada-deionizada por 2-3 segundos e secar temperatura ambiente na posio vertical.
Observao: A colorao usualmente realizada na cuba de Coplin.

COLORAO

DE

LEISHMAN

Esse mtodo de colorao indicado para a colorao de esfregaos


estirados 18.
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CAPTULO 12

301

Reagentes
1. Eosina-azul-de-metileno, segundo Leishman (Merck cat. n.o 1.350)
2. lcool metlico (CH4O)
3. Tampo de fosfatos pH 6,8-7,2 (ver p. 298)
Preparao do Corante
Eosina-azul-de-metileno, segundo Leishman
lcool metlico

0,15g
100ml

Em capela de exausto, dissolver o corante no lcool metlico, previamente aquecido a 40C. Deixar em repouso durante cinco dias. Filtrar em
papel-filtro antes do uso.
Colorao
1. Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
2. Cobrir os esfregaos durante 30-60 segundos com 0,5ml da soluo
metanlica saturada de Leishman.
3. Dissolver o corante com igual volume de tampo de fosfatos, pH 7,07,2 (1ml) e deixar corar por cinco minutos.
4. Lavar os esfregaos com tampo de fosfatos (pH 7,0-7,2) e deixar
secar temperatura ambiente na posio vertical.

COLORAO

DE

WRIGHT

O corante de Wright usado na colorao de esfregaos estirados de sangue


para a deteco de parasitos do sangue; entretanto, esse procedimento
inferior ao mtodo de Giemsa para a colorao de esfregaos espessos. Sendo
a reao de colorao semelhante ao mtodo de Giemsa, no procedimento
usado gua tamponada com pH 6,8. Os esfregaos no necessitam ser
fixados, desde que a frmula do corante possua lcool metlico. Alguns autores recomendam que na colorao de esfregaos estirados o corante no
deve ser diludo, enquanto na de esfregaos espessos o corante pode ser
diludo, com tampo de fosfatos (pH 7,0-7,2), na proporo de 1:30 (v/v)7,21.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.

Eosina-azul-de-metileno, segundo Wright (Merck cat. n.o 9.278)


Glicerina (C3H8O3)
lcool metlico (CH4O)
Soluo tampo de fosfatos pH 6,8 (ver p. 298)
Soluo tampo alcalina, 0,067M (ver p. 297)

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302

CAPTULO 12

6. Soluo tampo cida, 0,067M (ver p. 297)


7. Soluo tampo de fosfatos pH 7,2 (ver p. 297)
Preparao do Corante
Eosina-azul-de-metileno, segundo Wright
Glicerina
lcool metlico
ou
Eosina-azul-de-metileno, segundo Wright
lcool metlico

0,24g
3ml
97ml
0,9g
500ml

Dissolver o corante em gral pela adio de pequenas quantidades de


lcool metlico at completar o volume de 500ml. Filtrar em papel-fitro antes do uso. Validade: 36 meses.
Colorao
Usar luvas durante todas as etapas da colorao.
Esfregao Estirado
1. Cobrir o esfregao durante 1-3 minutos com 1ml do corante (o tempo timo de colorao varia com cada bateria de corante).
2. Dissolver o corante com igual volume de gua tamponada, pH 6,8
(1ml) e deixar corar por 2-4 minutos (formar-se-, na superfcie do lquido,
uma pelcula de brilho metlico).
3. Lavar o esfregao com gua tamponada, pH 6,8. Deixar secar
temperatura ambiente na posio vertical.
Combinao entre Esfregao Estirado e Espesso
1. Mergulhar o esfregao espesso em gua tamponada, pH 6,8, durante 10 minutos para que se produza a hemlise dos eritrcitos (o esfregao
pode tambm ser mergulhado em gua destilada). Cuidar para que a gua
tamponada no toque o esfregao estirado no fixado.
2. Cobrir o esfregao estirado e o espesso durante 1-3 minutos com
1ml do corante.
3. Dissolver o corante com igual volume de gua tamponada, pH 6,8
(1ml) e deixar corar por 2-4 minutos (formar-se-, na superfcie do lquido,
uma pelcula de brilho metlico).
4. Lavar o esfregao com gua tamponada, pH 6,8, e deixar secar
temperatura ambiente na posio vertical.
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CAPTULO 12

303

Controle de Qualidade (CQ): Coloraes


1. As solues tampo de fosfatos e a gua tamponada devem ser claras sem contaminao visvel.
2. Antes do uso, conferir a soluo de Wright em tampo fosfato, pH
6,8, incluindo o tampo de fosfatos e a gua tamponada.
3. Preparar e corar esfregaos sangneos nornais de sangue humano
e, microscopicamente, avaliar as reaes de colorao das plaquetas, eritrcitos e leuccitos:
a. macroscopicamente, os esfregaos de sangue apresentam a colorao purprea. Quando esto azuis, a gua tamponada est muito alcalina;
quando apresentam cor de rosa ao vermelho a gua tamponada est muito
cida;
b. microscopicamente, os eritrcitos coram-se em rosa-plido, as plaquetas,
em rosa forte e o ncleo dos leuccitos, em prpura-azul, com citoplasma
mais claro; os grnulos eosinoflicos, em prpura-vermelho brilhante e os
grnulos dos neutrfilos, em prpura. As granulaes dos basfilos variam
do azul-escuro ao preto.
4. Discretas variaes podem ocorrer nas coloraes descritas anteriormente, as quais dependem da partida do corante usado e das caractersticas do sangue, mas se as vrias estruturas morfolgicas forem distintas, a
colorao considerada satisfatria.
5. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
usadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com
o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
6. Os resultados do controle de qualidade devem ser apropriadamente
registrados.
Observaes
1. Os esfregaos preparados com sangue venoso colhido com anticoagulante devem ser processados dentro de uma hora. Caso contrrio, as caractersticas morfolgicas dos parasitos e dos eritrcitos podem apresentar
estruturas atpicas.
2. Com freqncia os esfregaos espessos desprendem-se das lminas
durante o processo de colorao. O correto pH da gua tamponada, das
solues tampo de fosfato e da soluo de Giemsa a 5% em tampo de
fosfatos propicia uma correta colorao. As solues e corantes com pH
incorreto impedem que certas caractersticas morfolgicas nos esfregaos
corados tornem-se visveis, obstruindo as coloraes tpicas do ncleo e do
citoplasma.
3. Os esfregaos para o controle de qualidade devero ser corados junto
aos esfregaos preparados para o diagnstico. Quando vrios espcimes de
pacientes so corados no mesmo dia (usando os mesmos reagentes), necessrio corar e examinar somente um esfregao para o controle de qualidade.
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304

CAPTULO 12

4. A infeco parasitria no deve ser descartada ou negativada, tomando como referncia o estudo e o exame de somente alguns esfregaos
permanentes corados. O procedimento aconselhvel colher amostras de
sangue em intervalos de seis a 12 horas at que um diagnstico seja estabelecido em um intervalo de trs a cinco dias.
5. Somente aps o exame de, no mnimo, 300 campos (1.000X), com
objetiva de imerso, o resultado da pesquisa de parasitos poder ser considerado negativo.
6. Dependendo da experincia do microscopista, o exame satisfatrio
de esfregaos espessos requer de cinco a 10 minutos (aproximadamente 100
campos) e de 15 a 20 minutos para esfregaos estirados (aproximadamente
200 a 300 campos) com aumento de 1.000X (com leo de imerso).
7. Examinar todo o esfregao, com aumento de 100X, para pesquisa
de microfilrias6,7.
Controle de Qualidade (CQ): Colorao dos Esfregaos Sangneos
1. Nos esfregaos estirados, corados pelo mtodo de Giemsa, as formas amastigotas da L. donovani so encontradas dentro dos moncitos. O
material nuclear cora-se de vermelho-prpura escuro, o citoplasma em azulclaro e o cinetoplasto, quando presente, em azulado-purpreo.
2. As formas tripomastigotas, com localizao extracelular (mveis no
exame direto a fresco) e coradas pelo mtodo de Giemsa, apresentam reaes de colorao semelhantes a da L. donovani, mostrando um visvel
cinetoplasto.
3. As microfilrias podem ser encontradas no exame direto a fresco.
Quando coradas pelo mtodo de Giemsa, mostram a clula excretora e a
embrionria em azul-celeste, a clula R, o poro excretor e o anal em rosaavermelhado e a bainha, quando presente, em rosa-claro. Pela hematoxilina
de Delafield os ncleos caudais coram-se em azul ou prpura; a bainha, quando
presente, em prpura-claro; e o citoplasma, em avermelhado. As clulas
excretora e embrionria quando visveis, no diferem em colorao dos ncleos. O corpo central visto como uma estrutura esbranquiada 6,7.
CONCENTRAO DO SANGUE
Os procedimentos de concentrao aumentam o nmero de organismos
recuperados nas amostras sangneas, ampliando a sensibilidade do exame.
Esses mtodos desenvolvidos para o isolamento e concentrao de
tripanossomos, leishmnias e microfilrias devem ser realizados rotineiramente
com todas as amostras sangneas enviadas ao laboratrio. Os procedimentos de concentrao do sangue so indicados para a pesquisa de hemoparasitos
quando: a) os organismos suspeitos no so identificados nos esfregaos
espessos e b) a taxa do parasitismo, sendo muito baixa, dificulta a identificao das espcies. Pode-se conseguir maior concentrao dos parasitos
por diferentes processos: a) centrifugao do sangue (creme leucocitrio);
b) mtodo da centrifugao trplice; c) tcnica das fito-hemaglutininas; d)
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CAPTULO 12

305

centrifugao do micro-hematcrito; e) tcnica da diferena de gravidade;


f) tcnica de Knott; g) mtodo da membrana filtrante e h) tcnica alternativa da membrana filtrante. Por vezes, necessrio repetir a pesquisa
em vrios dias e vrias vezes ao dia, at que se positive a presena do
parasito.

CENTRIFUGAO DO SANGUE (CREME LEUCOCITRIO)


A concentrao do sangue pela centrifugao o mais simples procedimento para a pesquisa de parasitos no creme leucocitrio. Esse mtodo
empregado para a deteco da Leishmania donovani, de tripanossomos e
de microfilrias no sangue perifrico8.
Amostra
Sangue total colhido com anticoagulante (EDTA, heparina e/ou citrato
de sdio).
Reagentes
1. Soluo salina de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O)
a 5% (m/v), heparina ou EDTA.
2. Corante de Giemsa (ver p. 296)
3. lcool metlico (CH4O), livre de acetona
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher 9ml de sangue venoso e transferir diretamente para tubo de
centrfuga contendo 1ml de citrato de sdio a 5%. Misturar. Tampar o tubo
e centrifugar (100 x g por 15 minutos).
3. Com pipeta capilar, remover o creme leucocitrio, sedimentado entre os eritrcitos e o plasma, ou transferir o creme leucocitrio e o plasma
para outro tubo e centrifugar (300 x g por 15 minutos).
4. Realizar exame microscpico direto do creme leucocitrio para a
observao de formas tripomastigotas ativamente mveis e de microfilrias:
a. colocar uma gota de soluo salina a 0,85% em uma lmina de
microscopia;
b. remover uma gota do sedimento (creme leucocitrio) e mistur-la na
salina, cobrindo a preparao com uma lamnula;
c. examinar a presena de organismos mveis com pequeno aumento
(10X) e grande aumento (40X).
5. Preparar esfregaos estirados, deixar secar temperatura ambiente, fixar e corar pelo mtodo de Giemsa e/ou pela hematoxilina de Delafield.

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306

CAPTULO 12

Controle de Qualidade (CQ)


1. Verificar a calibrao da centrfuga.
2. Preparar e corar esfregaos sangneos normais de sangue humano
e, microscopicamente, avaliar as reaes de colorao das plaquetas, eritrcitos e leuccitos. Quando presentes, os parasitos apresentam coloraes
caractersticas.
3. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
usadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com
o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do controle de qualidade devem ser apropriadamente
registrados.

MTODO DA CENTRIFUGAO TRPLICE


Essa tcnica indicada para detectar a presena de tripanossomos no
sangue perifrico, especialmente quando o nvel da parasitemia muito baixo. Nesse procedimento as hemcias podem ser previamente removidas por
uma ou duas centrifugaes em baixa velocidade. O sedimento do plasma
sobrenadante centrifugado e examinado 10,11,15.
Amostra
Sangue total coletado com anticoagulante (EDTA, heparina ou citrato
de sdio).
Reagentes
1. Soluo salina de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O)
a 5% (m/v), heparina ou EDTA
2. Corante de Giemsa (ver p. 296)
3. lcool metlico (CH4O), livre de acetona
4. Corante de Wright (ver p. 302)
Mtodo
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher 9ml de sangue venoso e transferir diretamente para tubo de
centrfuga contendo 1ml de citrato de sdio a 5%. Misturar.
3. Centrifugar (100 x g por 15 minutos).
4. Colher o lquido sobrenadante e transferir diretamente para outro tubo
de centrfuga e centrifugar a 250 x g por 10 minutos.
5. Transferir, outra vez, o lquido sobrenadante para outro tubo de centrfuga e centrifugar a 700 x g por 10 minutos.
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CAPTULO 12

307

6. Decantar o lquido sobrenadante e examinar diretamente a metade


do sedimento atravs do exame direto a fresco para a presena de
tripomastigotas ativamente mveis. Com o sedimento remanescente, preparar esfregaos estirados corados pelos mtodos de Giemsa ou de Wright.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Verificar a calibrao da centrfuga.
2. Quando possvel, controlar o procedimento usando sangue positivo
contendo tripanossomos. Na impossibilidade da obteno de sangue positivo, seguir o mtodo testando a amostra enviada ao laboratrio para diagnstico.
3. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
usadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com
o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do controle de qualidade devem ser apropriadamente
registrados.
Observao
1. Existem outros mtodos que removem as hemcias e permitem melhor visualizao dos parasitos.
2. Strout deixa o sangue coagular e retrair o cogulo, para ento
obter soro. Em seguida, retira os glbulos residuais pela centrifugao
lenta (160 x g por 3 minutos) 11 . Ver Captulo 13 Trypanosoma (S)
cruzi.

TCNICA DAS FITO-HEMAGLUTININAS


Esse mtodo tem sido empregado com sucesso para o isolamento de
tripanossomos (T. cruzi, T. (b) gambiense), principalmente quando o nvel
de parasitismo muito baixo11.
Amostra
Sangue total coletado com anticoagulante (EDTA, heparina ou citrato
de sdio)
Reagentes
1. Soluo salina de citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O)
a 5% (m/v), heparina.
2. Fito-hemaglutinina P (Bacto Phytohemagglutinin P)
(Difco n. 3110-56-4).

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308

CAPTULO 12

Mtodo
1. Reidratar a fito-hemaglutinina P. Ver orientao do fabricante.
2. Colher 9ml de sangue venoso e transferir diretamente para tubo
de centrfuga contendo gotas de heparina ou 1ml de citrato de sdio a 5%.
Misturar.
3. Adicionar fito-hemaglutinina ao sangue heparinizado ou citratado na
concentrao (0,1mg/1ml).
4. Agitar cuidadosamente o sangue durante cinco segundos e deixar em
repouso a mistura durante cinco minutos, temperatura ambiente.
5. Centrifugar lentamente (150 x g por 10 minutos). Os glbulos
aglutinados sedimentam pela centrifugao em baixa velocidade.
6. Decantar o lquido sobrenadante e examinar o sedimento por meio
do exame direto a fresco para a presena de tripomastigotas ativamente mveis.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Verificar a calibrao da centrfuga.
2. Quando possvel, controlar o procedimento usando sangue positivo
contendo tripanossomos. Na impossibilidade da obteno de sangue positivo, seguir o mtodo testando a amostra enviada ao laboratrio para diagnstico.
3. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
usadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com
o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do controle de qualidade devem ser apropriadamente
registrados.
Observao: Segundo Yaeger 22 h recuperao de 50% a 60% das
formas tripomastigotas presentes que mostram morfologia e infectividade
preservada.

CENTRIFUGAO

DO

MICRO-HEMATCRITO

A utilizao de tubos capilares (micro-hematcrito) indicada para o


diagnstico rpido da tripanossomase e da malria, principalmente quando
o nvel de parasitemia muito baixo11.
Procedimento de Feilij
Coletar 50ml de sangue digital em seis tubos de micro-hematcrito.
Fechar cada tubo. Centrifugar o sangue em centrfuga de micro-hematcrito
(700 x g por 40 segundos). Cortar os tubos entre o creme leucocitrio e a
pelcula de eritrcitos. Colocar o creme leucocitrio em uma lmina de
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CAPTULO 12

309

microscopia, cobrindo a preparao com lamnula. Observar a presena de


tripanossomos ativamente mveis com aumento de 400X14.
Procedimento de La Fuente
Coletar 75l de sangue digital em um ou mais tubos de micro-hematcrito
heparinizado. Fechar os tubos. Centrifugar (1.500 x g por 7 minutos). Fixar
o tubo capilar em uma lmina e examinar com objetiva de imerso, aumento
de 400X, a presena de tripanossomos ativamente mveis17.
Mtodo da Centrifugao do Micro-Hematcrito QBC
O mtodo do tubo capilar (QBC Capillary Blood Tube, Becton
Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) indicado para a pesquisa de
Plasmodium spp., sendo tambm usado com sucesso na pesquisa de
tripanossomos, principalmente quando o nvel de parasitemia muito baixo13,15.
Ver Captulo 15 Plasmodium spp.

TCNICA DA DIFERENA DE GRAVIDADE


Outro mtodo de concentrao separar os parasitos das hemcias por
diferena de densidade.
Mtodo de Rohwedder
Adicionar silicone lquido, de densidade 1.075g/ml ao sangue colhido com
anticoagulante. Por centrifugao, as hemcias sedimentam e os parasitos
e os leuccitos ficam acima do silicone11.
Mtodo de Budzko e Kierszenbaum
Adicionar a mistura Ficoll-Hypaque de densidade 1.077g/ml, ou seja,
soluo com 9,6% de N-metil 3,5-diacetamida-2,4,6 triiodobenzoato de sdio
e 5,6% de Ficoll. Os autores referem-se recuperao de 95% a 100% de
tripomastigotas a partir de sangue contendo 9,5 x 10x a 18,4 x 106 parasitos
por milmetro11.

MTODO DA MEMBRANA FILTRANTE


O mtodo da membrana filtrante foi desenvolvido para a recuperao
de microfilrias em pacientes com infeces baixas. Quando for necessrio, grandes quantidades de sangue (20ml ou mais) podem ser usadas nesse
mtodo, o que representa uma vantagem sobre os procedimentos de
centrifugao simples. As microfilrias so concentradas e recuperadas na
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310

CAPTULO 12

membrana mida, quando estiverem presentes na amostra9. Ver captulo 19


Diagnstico Laboratorial da Filariose Bancroftiana.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Insenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC): ASM
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312

CAPTULO 12

CAPTULO

13

Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi

Mrio Steindel
Edmundo Carlos Grisard

CONSIDERAES GERAIS
O diagnstico parasitolgico na fase aguda da doena de
Chagas baseia-se na deteco de formas tripomastigotas de
Trypanosoma cruzi, por meio da observao microscpica de
amostras de sangue ou de mtodos indiretos. Nesta fase da
infeco os parasitos podem estar presentes em nmero considervel na corrente sangnea, no sendo, entretanto, uma
regra geral. A infeco chagsica em sua fase crnica apresenta parasitemias sangneas usualmente muito baixas e irregulares. Dessa forma, a deteco parasitolgica do T. cruzi
nesta fase feita por mtodos indiretos (hemocultura e xenodiagnstico). Embora apresentem alta especificidade, estes mtodos so laboriosos e sua sensibilidade, baseada em
apenas um exame, varia de 40% a 50% nos diferentes estudos realizados 15,16 .
A despeito do nmero reduzido de parasitos na infeco
chagsica crnica, elevados ttulos de anticorpos anti-T. cruzi
esto presentes nesta fase. A deteco desses anticorpos pode
ser feita atravs de vrias tcnicas sorolgicas, as quais apresentam elevada sensibilidade e especificidade. Apesar disso, a
ocorrncia de resultados falso-positivos e falso-negativos tem sido
demonstrada7. Neste captulo abordaremos as principais tcnicas parasitolgicas, imunolgicas e moleculares utilizadas atualmente no diagnstico da infeco pelo T. cruzi.
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CAPTULO 13

313

MTODOS PARASITOLGICOS

MTODOS DIRETOS
Na fase aguda da infeco pelo T. cruzi, que compreende aproximadamente os dois primeiros meses da infeco, formas tripomastigotas do parasito
podem estar presentes no sangue perifrico do paciente 4,7. Nesta fase, tcnicas de demonstrao do parasito podem ser particularmente teis para o
diagnstico rpido da parasitose.
Exame direto ou a fresco Para realizao desta tcnica, uma pequena gota de sangue, obtida por puno da polpa digital ou de sangue venoso colhido com anticoagulante, colocada entre lmina e lamnula e examinada exaustivamente ao microscpio em objetiva de (40X). Pelo fato de
as formas tripomastigotas serem bastante mveis, estas, quando presentes,
podem ser facilmente detectadas entre os elementos figurados do sangue45.
Entretanto, em face dos pequenos volumes de sangue examinados a cada
vez, o mtodo necessita ser repetido vrias vezes ao dia ou mesmo em dias
consecutivos at que o parasito seja detectado45.
Mtodo de Strout modificado Consiste em coletar o sangue em
tubo capilar e aps centrifugao a baixa rotao, examinar entre lmina e
lamnula o material da interface entre as hemcias e o creme leucocitrio
(buffy coat). Em pacientes na fase aguda da infeco, taxas de positividade da ordem de 70% tm sido demonstradas8 (Fig. 13.1).
Preparaes coradas O esfregao delgado (ou estirado) e a gota
espessa devem ser preparados e corados pelo mtodo de Giemsa ou de
Leishman. O exame do material corado permite, alm da deteco, a diferenciao morfolgica entre tripomastigotas sangneas de T. cruzi e T. rangeli.
A desvantagem dos esfregaos corados que estes normalmente requerem
parasitemias elevadas para evidenciao do parasito. No entanto, a utilizao de diferentes mtodos parasitolgicos isolados ou combinados, na fase
aguda da tripanossomase americana, pode levar deteco rpida e precoce da infeco. (Fig. 13.2)

Fig. 13.1 A) Forma tripomastigota sangnea de Trypanosoma cruzi; B) Forma tripomastigota


sangnea de Trypanosoma rangeli (Esfregaos corados pelo mtodo de Giemsa. Aumento
1.000X.)

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CAPTULO 13

Fig. 13.2 A) Ninhos de formas amastigotas de Trypanosoma cruzi em tecido cardaco,


corados pela hematoxilina-eosina (HE). Aumento 400X; B) Formas amastigotas intracelulares de Trypanosoma cruzi em cultura de clulas, coradas pelo mtodo de Giemsa. Aumento
1.000X; C) Formas do Trypanosoma rangeli encontradas livres na hemolinfa de triatomneo,
coradas pelo mtodo de Giemsa. Aumento 1.000X; D) Formas epimastigotas de Trypanosoma
rangeli em hemcito de triatomneo, coradas pelo mtodo de Giemsa. Aumento 1.000X.

MTODOS INDIRETOS
A fase crnica da doena de Chagas caracteriza-se por uma parasitemia
sangnea baixa e irregular, dificultando sobremaneira o encontro do parasito pelos mtodos diretos. Nesta situao, mtodos indiretos que permitam a multiplicao do flagelado so particularmente teis na deteco do
parasito.
Xenodiagnstico Este mtodo introduzido por Brumpt3 largamente
empregado ainda nos dias atuais no diagnstico da doena de Chagas. A
multiplicao do T. cruzi no trato digestivo do triatomneo permite sua deteco
nas fezes ou na urina dos insetos alimentados com sangue do paciente ou
de animais suspeitos aps um perodo de um a dois meses. O xenodiagnstico
uma tcnica perfeitamente aplicvel para a pesquisa de campo e/ou isolamento de amostras de T. cruzi de pacientes e/ou animais. Entretanto, sua
utilizao em pacientes pode ocasionar com certa freqncia o desenvolvimento de reaes alrgicas decorrentes da saliva dos triatomneos, levando
rejeio do exame pelo paciente. Neste mtodo, recomenda-se a utilizao de 30 a 40 ninfas do 3. ao 5. estgio de desenvolvimento, as quais so
criadas em condies controladas em laboratrio, sendo portanto livres do
parasito 12,42,44.
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CAPTULO 13

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As ninfas em jejum alimentar de 20 a 30 dias so acondicionadas em


pequenas caixas cobertas com tela, as quais so aplicadas diretamente sobre o hospedeiro por 30 a 60 minutos, at completar-se a alimentao dos
insetos. Em humanos, a caixa aplicada no antebrao e em animais devese escolher um local onde os plos no dificultem a alimentao dos
triatomneos. O exame dos insetos para pesquisa do T. cruzi realizado aos
30 e 60 dias aps o repasto sangneo, devendo ser realizado individualmente ou em grupos, dependendo do propsito do estudo. As fezes ou urina dos
triatomneos so obtidas atravs de uma leve compresso do abdmen dos
insetos, adicionadas de uma gota de soluo salina e em seguida examinadas a fresco ao microscpio ptico entre lmina e lamnula, ou utilizadas para
a confeco de preparaes coradas.
Devido recusa em humanos, pode-se alternativamente realizar o xenodiagnstico de maneira artificial9. Para tanto, o sangue do paciente colhido com anticoagulante, mantido a 37C e oferecido aos insetos atravs
de uma membrana. As percentagens de positividade, embora um pouco mais
baixas, se equiparam s observadas no xenodiagnstico convencional. Em
face da existncia de infeces mistas T. cruzi/T. rangeli em vrias espcies de hospedeiros vertebrados, incluindo o homem, prudente realizar-se
o exame da hemolinfa e das glndulas salivares dos triatomneos utilizados
no xenodiagnstico, especialmente se pertencerem ao gnero Rhodnius25,43.
Alm disso, a infeco natural de triatomneos pelo flagelado
Blastocrithidia triatominae, j observada em diferentes laboratrios, pode
levar a diagnsticos equivocados11,38. Assim, colnias destes insetos para fins
de xenodiagnstico devem ser mantidas isoladas e monitoradas regularmente para a presena deste protozorio e cuidados com a esterilizao das
solues utilizadas no exame dos insetos so recomendados.
Xenocultura A tcnica da xenocultura pode ser utilizada tanto para
o diagnstico como para o isolamento de amostras do parasito2. Neste procedimento, o intestino dos insetos retirado em condies asspticas e
o material semeado em meio de cultura. Essa metodologia apresenta uma
sensibilidade superior do exame direto, especialmente quando a densidade
de flagelados nos insetos baixa. Para realizao da xenocultura, os triatomneos
so inicialmente esterilizados em soluo de White (HgCl2 0,25g; NaCl
6,50g; HCl concentrado 1,25ml; Etanol 95% 250ml; gua destilada 750ml), por 90 minutos. Grupos de cinco a 10 triatomneos so dissecados e os contedos intestinais dos insetos macerados em tampo PBS pH
7,4 estril. Amostras de 0,2 a 0,5ml do material so ento semeadas em tubos
contendo 3ml de meio LIT (Liver Infusion Tryptose) 4, acrescido de ampicilina sdica na concentrao de 6,6mg/ml e mantidos a 28C. Aps 15
dias do inculo realiza-se o exame a fresco das culturas para a pesquisa de
flagelados. Este procedimento tem demonstrado grande utilidade no isolamento de amostras.
Hemocultura O T. cruzi capaz de crescer e de multiplicar-se em
diferentes meios de cultura acelulares que contenham hemina ou derivados
da hemoglobina. A hemocultura uma tcnica mais difcil de ser realizada,
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CAPTULO 13

uma vez que requer condies asspticas para a coleta e o manuseio da


amostra de sangue, o que a torna pouco prtica nos trabalhos de campo. A
tcnica consiste em coletar cerca de 10ml de sangue venoso do paciente
com anticoagulante e semear alquotas de cerca de 1 a 2ml de sangue total
em tubos contendo 5ml de meio LIT. As culturas so mantidas a 28C e
examinadas em intervalos de 15 dias at um total de quatro meses. As percentagens de positividade obtidas na hemocultura convencional por diferentes estudos so muito semelhantes quelas observadas para o xenodiagnstico 13,14,15.
Galvo e cols.24, modificando a tcnica convencional de hemocultura,
obtiveram taxas de positividade bem mais elevadas16. Neste mtodo, coletase de cada paciente 30ml de sangue venoso na presena de heparina ou EDTA.
O plasma removido atravs de centrifugao a 1.000rpm por 10 minutos a
4C, realizando-se a seguir uma nova lavagem do sedimento celular com meio
LIT. A remoo do plasma faz-se necessria para retirada de fatores lticos
(anticorpos e complemento) capazes de destruir formas epimastigotas de T.
cruzi. A seguir, o sedimento novamente adicionado de meio LIT e distribudo em alquotas de 5ml e mantido a 28C. O exame das culturas para pesquisa de T. cruzi realizado em intervalos de 15 dias at um total de quatro
meses. Caso o sangue no possa ser processado imediatamente, este dever
ser mantido a 4C. Em um estudo comparativo em 40 pacientes chagsicos
crnicos, os autores obtiveram percentuais de positividade de 30% e 50% para
o xenodiagnstico e a hemocultura, respectivamente.
Recentemente, Luz e cols.32, realizando trs hemoculturas repetidas em
um grupo de 52 pacientes chagsicos no-tratados do Estado de Minas Gerais
com idade de 18 a 82 anos, obtiveram taxas de positividade de at 94%.
Fernandes e cols.20, estudando um grupo de 74 pacientes chagsicos notratados do Estado do Rio Grande do Sul, com idade variando de quatro a
20 anos, obtiveram uma taxa de positividade de 73% realizando apenas uma
hemocultura. Estes resultados mostram que a hemocultura pode ser um mtodo
parasitolgico de grande utilidade no diagnstico, assim como no monitoramento
de pacientes aps o tratamento especfico33.
Inoculao em animais de laboratrio A inoculao de camundongos
ou cobaias jovens tem sido utilizada por alguns pesquisadores. Face aos avanos
cientficos atuais, esta metodologia no mais empregada para o diagnstico
da infeco chagsica. Entretanto, a inoculao de animais pode ser perfeitamente utilizada para isolamento de amostras de T. cruzi a partir de sangue
positivo, tanto de pacientes como de outros reservatrios do parasito.

M TODOS S OROLGICOS
O diagnstico sorolgico da infeco chagsica baseia-se na deteco
de anticorpos anti-T. cruzi das classes IgM e IgG no soro do paciente, dependendo da fase da infeco. Os testes sorolgicos em geral apresentam
uma alta sensibilidade e especificidade no diagnstico laboratorial da infeco chagsica humana. No entanto, fatores como a imunocompetncia do
hospedeiro, a qualidade do antgeno, reagentes, calibrao de instrumentos,
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CAPTULO 13

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como micropipetadores, entre outros, podem interferir na qualidade do teste. Dessa forma, a padronizao da metodologia a ser empregada de fundamental importncia, garantindo sua reprodutibilidade e permitindo a comparao de resultados entre diferentes laboratrios.
sabido que a presena de outras parasitoses, como esquistossomose,
leishmaniose, toxoplasmose e rangeliose, apresenta reaes sorolgicas com
o T. cruzi5,6,27,41. A coexistncia de vrias dessas doenas, como ocorre em
grande parte dos pases latino-americanos, torna-se um problema adicional
no diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi, levando ao aparecimento de resultados falso-positivos6. A Organizao Mundial da Sade (OMS)
recomenda o uso de pelo menos dois testes sorolgicos diferentes, em paralelo, para o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi. Resultados
de testes sorolgicos duvidosos ou muito prximos do limite de positividade
(cut off) devem ser repetidos inclusive utilizando-se novas amostras e um
nmero maior de testes. Do ponto de vista prtico, os testes de imunofluorescncia indireta (IFI) e ELISA podem ser tomados como referncia ou
padro-ouro (gold standard) dos testes sorolgicos para deteco da infeco pelo T. cruzi. Esses dois testes so atualmente os mais utilizados
em bancos de sangue e em diferentes laboratrios de pesquisa.
Reao de fixao do complemento (RFC) Essa tcnica, idealizada por Guerreiro e Machado26 para o diagnstico da doena de Chagas,
foi durante muito tempo a nica tcnica sorolgica para deteco da infeco pelo T. cruzi disponvel no mercado. O mtodo utiliza um antgeno homlogo
(extrato de formas de cultura de T. cruzi), sendo que a sensibilidade e
especificidade desta tcnica so tidas como controversas entre diferentes
autores devido a vrias dificuldades tcnicas, como a falta de padronizao
de antgeno, a discordncia de resultados entre diferentes laboratrios, fazendo com que a tcnica, apesar de barata, esteja em desuso.
Teste de hemaglutinao (HA) uma tcnica de elevada sensibilidade, largamente empregada na triagem de doadores em bancos de sangue, bem como no diagnstico da infeco crnica. O mtodo consiste em
sensibilizar hemcias de carneiro fixadas com um extrato antignico de T.
cruzi. As hemcias sensibilizadas so depositadas em placa de 96 orifcios
com o fundo em forma de U, na presena do soro-teste em diferentes
diluies. Os anticorpos anti-T. cruzi, se presentes no soro, iro promover a
aglutinao das hemcias formando uma rede. Estudos comparativos mostraram que a sensibilidade da HA comparvel da imunofluorescncia
indireta10,35. Alm de utilizar antgenos padronizados, a tcnica de HA pode
ser automatizada pela sua simplicidade de leitura, no requerendo, entretanto, aparelhagem sofisticada.
Reao de imunofluorescncia indireta (RIFI) Essa tcnica de
elevada sensibilidade largamente utilizada tanto na triagem de doadores
de sangue como no diagnstico da infeco aguda e crnica pelo T. cruzi.
As diferentes formas evolutivas do T. cruzi (amastigotas, epimastigotas e
tripomastigotas) foram testadas independentemente como antgenos para a
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CAPTULO 13

deteco da infeco chagsica humana, tendo apresentado resultados similares1,6,22,37. A padronizao da RIFI com formas epimastigotas se deve
praticidade de cultivo e obteno dessas formas em laboratrio. Para preparao de antgeno, formas epimastigotas de cultura de T. cruzi colhidas
na fase exponencial de crescimento so lavadas em PBS e fixadas em
paraformaldedo a 2%. Os parasitos so distribudos sobre orifcios de lminas prprias para imunofluorescncia, secos temperatura ambiente e incubados a 37C por uma hora com o soro diludo. Aps trs lavagens de
cinco a 10 minutos em PBS, as lminas so incubadas com um conjugado
fluoresceinado anti-IgG ou anti-IgM humana por 60 minutos, novamente lavadas para remoo do conjugado no ligado, montadas em glicerina alcalina e observadas em microscpio de fluorescncia. Para cada lmina recomenda-se fazer um controle positivo e negativo do teste. Assim como em
outros testes na RIFI, ocorrem reaes cruzadas com soros de pacientes
infectados por Leishmania spp. e pelo T. rangeli.
Ensaio imunoenzimtico (ELISA) Este mtodo imunoenzimtico
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) altamente sensvel e especfico
e permite pesquisar as subclasses de imunoglobulinas envolvidas na resposta imune direcionada contra o T. cruzi. O ensaio realizado em placas de
poliestireno, onde os orifcios da placa so sensibilizados com preparaes
antignicas obtidas a partir de formas de cultura de T. cruzi ou com protenas recombinantes, sendo este mtodo semelhante RIFI no seu conceito.
No entanto, utiliza-se um conjugado marcado com uma enzima, em geral a
peroxidase. Aps a adio de um substrato especfico, que consumido na
presena da enzima, a reao gera um produto colorido. A leitura da densidade ptica de cada orifcio feita por um processo automatizado em
espectrofotmetro para leitura de placas. Um dos grandes problemas no
diagnstico sorolgico so as reaes inconclusivas ou de ttulo limtrofe. Nestes
casos a confirmao diagnstica deve ser feita com novas amostras, antgenos
clonados ou mesmo peptdeos sintticos21,36. Durante os ltimos anos vrios
grupos brasileiros e de outros pases sul-americanos tm envidado esforos
no sentido de produzir antgenos especficos para deteco especfica da
infeco pelo T. cruzi 22,29,30. Recentemente, Umezawa e cols. 44 avaliaram
vrios antgenos recombinantes especficos contra um painel de 541 soros
chagsicos e no chagsicos, representativos de nove pases das Amricas
Central e do Sul. Os resultados mostraram que nenhum dos seis antgenos
utilizados isoladamente foi capaz de detectar 100% das infeces, comprovando mais uma vez a heterogeneidade antignica do T. cruzi e as implicaes desta variabilidade no diagnstico da enfermidade. Desta forma, uma
mistura de antgenos dever ser utilizada em um kit diagnstico, visando
minimizar a influncia da variao individual de cepas do parasito e promover uma elevao da sensibilidade do teste para deteco da infeco pelo
T. cruzi. Outros mtodos para deteco de antgenos de T. cruzi no sangue
e urina de pacientes chagsicos tm sido estudados 23,28. A pesquisa de
antgenos solveis de T. cruzi na urina tem apresentado resultados muito
promissores e poder se constituir em uma interessante abordagem para estudos
de outras doenas infecciosas.

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CAPTULO 13

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MTODOS MOLECULARES
Reao em cadeia da polimerase (PCR) A PCR (Polymerase
Chain Reaction) foi descrita na dcada de 80 e tem sido amplamente utilizada no diagnstico de importantes doenas bacterianas, virais e parasitrias que afetam o homem, bem como na caracterizao de seus diferentes
agentes etiolgicos 34,40 . O mtodo baseia-se na gerao exponencial de
cpias de fragmentos de DNA ou RNA atravs de uma sntese enzimtica
in vitro. Para tanto, utilizam-se oligonucleotdeos complementares a regies
flanqueadoras do fragmento do gene ou seqncia-alvo, os chamados iniciadores (primers), que na presena ainda de uma DNA polimerase termoestvel
(Taq DNA polimerase), de deoxinucleotdeos trifosfatados e de um tampo
prprio geram, atravs da alternncia de temperatura, cpias do fragmento
do DNA molde compreendido entre os stios de ligao dos iniciadores. A
alterao da temperatura promove a desnaturao da fita molde, ligao dos
iniciadores fita molde e posterior sntese da nova fita complementar pela
atuao da enzima ao incorporar cada nucleotdeo da nova fita. Ao final de
cada ciclo de amplificao, cada fita molde gera duas novas fitas, idnticas
em suas seqncias. O diagnstico ento realizado pela observao de fragmentos de tamanho molecular esperados, revelados atravs da eletroforese
do produto de amplificao em gis de agarose ou poliacrilamida. So inmeros os iniciadores descritos na literatura e dirigidos a seqncias de DNA
nuclear, kDNA (DNA cinetoplstico) ou ao RNA do T. cruzi, apresentando
resultados variveis e distintos quanto sua especificidade e ao seu poder
diagnstico. Dentre esses, podemos citar alguns dirigidos aos genes do miniexon
ou do rRNA 24S, aos minicrculos de kDNA ou ainda a seqncias repetitivas do DNA nuclear, os quais tm apresentado resultados promissores,
podendo detectar, em condies experimentais, at cerca de 1 a 0,1fg do
DNA total do T. cruzi, o que equivale a cerca de 1/3 a 1/300 do DNA de
um nico parasito, respectivamente. Muitos iniciadores apresentam reatividade cruzada com outros organismos geneticamente relacionados, como, por
exemplo, o T. rangeli ou parasitos do gnero Leishmania. Apesar de sua
alta sensibilidade, a PCR ainda um mtodo de elevado custo quando comparado com os mtodos sorolgicos convencionais. Considerando somente
os reagentes e materiais utlizados, a PCR tem um custo aproximado de oito
a 10 dlares/reao, no sendo assim amplamente difundida entre laboratrios de anlises clnicas. Assim como nas reaes sorolgicas, a PCR necessita ser adaptada e otimizada a cada objetivo proposto, podendo apresentar resultados falso-positivos ou falso-negativos devido presena de
contaminantes ou inibio da amplificao, respectivamente. A contaminao de uma reao de PCR ocorre pela presena de fragmentos de DNA
anteriormente amplificados em uma nova reao. Essa contaminao (carryover) evidenciada quando o controle negativo da reao, composto por
todos os componentes, exceo do DNA molde, torna-se positivo, apresentando a banda correspondente ao fragmento esperado. Este DNA
contaminante pode estar presente em equipamentos, materiais ou reagentes
utilizados na preparao e/ou execuo da reao. Nesse sentido, cuidados
bsicos, como a correta e necessria separao de ambientes, materiais,
reagentes e equipamentos utilizados nos procedimentos pr e ps-amplifica Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

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CAPTULO 13

o, so extremamente eficazes. Alm disso, so descritos na literatura alguns processos fsicos e/ou qumicos de descontaminao, dentre os quais
podemos citar os protocolos baseados na utilizao da uracil-DNA-glicosilase
(UDG), de derivados do isopsoralen ou, ainda, a hidrlise alcalina psPCR18,31,39. De uma maneira geral, a inibio da reao de PCR devida
presena de componentes que no permitem a Taq DNA polimerase realizar a incorporao nucleotdica. Apesar de a literatura no descrever quais,
quantos e como agem os inibidores, sabe-se que alguns compostos, como
hemoglobina, heparina, formol e fenol, presentes nos tecidos ou utilizados
nos processos de extrao de DNA, inibem a reao quando presentes. Assim
sendo, a utilizao de EDTA como anticoagulante, quando da coleta de sangue,
ou a coleta e conservao em soluo de Guanidina/EDTA, a fixao de
tecidos de bipsia com etanol ao invs de formol e a correta realizao de
protocolos de extrao de DNA, evita a presena de inibidores da reao
de amplificao. At o momento, a adoo de kits comerciais que no utilizam solventes orgnicos na extrao de DNA ou RNA so medidas que
podem minimizar a inibio da PCR. Controles utilizando iniciadores dirigidos a genes constitutivos, como, por exemplo, o da gliceraldedo fosfato
desidrogenase (GAPDH) humana, podem ser utilizados com o intuito de
constatar essa inibio. A utilizao da PCR no diagnstico da infeco
chagsica tem sido avaliada por diferentes autores, apresentando resultados diversos devidos particularidade da infeco pelo T. cruzi. Alm de
fatores intrnsecos do prprio parasito (infectividade, parasitemia, histiotropismo)
e do hospedeiro (imunidade, susceptibilidade), deve-se ainda considerar a
relao parasito-hospedeiro, as quais influem diretamente na deteco do
parasito. O poder diagnstico da PCR est ligado ainda escolha do gene
ou seqncia-alvo para o diagnstico, seu nmero de cpias e sua localizao, assim como a seqncia dos iniciadores utilizados. Nesse sentido, a PCR
apresentou em um ensaio comparativo uma sensibilidade de 82%, quando
comparada sorologia convencional realizada por trs mtodos distintos (IFI,
ELISA e HAI) na deteco do T. cruzi em amostras de pacientes chagsicos
e no chagsicos 17,19. Salientando que a deteco do DNA do T. cruzi por
PCR no significa necessariamente uma infeco ativa, conclui-se que a PCR
apresenta-se como uma ferramenta de alta sensibilidade e especificidade,
assim como um grande potencial para o diagnstico da infeco chagsica;
entretanto, ainda necessitando de padronizao.
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CAPTULO 13

323

CAPTULO

14

Leishmanioses

Mrio Steindel
Edmundo Carlos Grisard

CONSIDERAES GERAIS
As leishmanioses so infeces parasitrias que ocorrem
em inmeras espcies animais, incluindo o homem, sendo causadas por protozorios pertencentes ao gnero Leishmania. A
transmisso do parasito ao hospedeiro vertebrado ocorre pela
picada de fmeas de dpteros (flebotomneos) pertencentes famlia
Psychodidae. A doena humana apresenta um largo espectro de
manifestaes clnicas que incluem formas tegumentares,
mucocutneas e viscerais. As diferentes formas de leishmanioses ocorrem de forma endmica em cerca de 80 pases, onde,
segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS), estima-se que
ocorram anualmente 12 milhes de casos novos e que aproximadamente 350 milhes de pessoas vivam em reas de risco de
transmisso 23 . Entre todas as doenas causadas por protozorios, a leishmaniose considerada como sendo a terceira em
importncia mdica para o homem, seguida da malria e da
amebase. Embora as formas tegumentares e mucocutneas
raramente levem morte, a leishmaniose visceral, quando no
tratada, ocasiona elevadas taxas de mortalidade18,23.
Atualmente, so conhecidas nas Amricas 20 espcies do
gnero Leishmania das quais 14 infectam o homem6,12. Entretanto, os agentes etiolgicos mais freqentemente isolados de casos
de leishmaniose tegumentar americana (LTA) em humanos so
L. braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, L. panamensis,
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CAPTULO 14

325

L. mexicana e L. peruviana12. No Brasil a LTA ocorre de forma endmica


em todos os Estados da Federao exceo do Estado do Rio Grande do
Sul11,22. Nas ltimas dcadas as leishmanioses vm mostrando uma crescente
expanso e urbanizao em diferentes regies do pas. Em vista da variedade de manifestaes clnicas na LTA, torna-se da maior importncia o
diagnstico diferencial de outras patologias, como tuberculose, hansenase,
sfilis, micoses, lcera tropical, piodermites, picadas de insetos e neoplasias,
entre outras4,5,14,18. Do ponto de vista prtico, o diagnstico de LTA baseiase nos aspectos clinicoepidemiolgicos, intradermorreao de Montenegro
positiva, testes parasitolgicos e/ou resposta favorvel ao tratamento especfico; entretanto, o diagnstico baseado em tcnicas de biologia molecular
tem sido cada vez mais utilizado (Fig. 14.1).
MTODOS PARASITOLGICOS
Obteno do Material. Para obteno de material realiza-se a assepsia
local da leso com lcool etlico a 70% ou Povidine, seguido de anestesia
local, usualmente realizada com Lidocana a 2%. A bipsia deve visar as
bordas da leso e pode ser realizada utilizando-se uma lmina de bisturi
ou punch de 4 a 6mm de dimetro. Em caso de mltiplas leses, recomenda-se fortemente que a obteno de material seja realizada em leses
mais recentes, uma vez que estas se apresentam mais ricas em parasitos. O
fragmento de tecido obtido pode ser subdividido para procedimentos diversos, como histopatologia, preparao de esfregaos por aposio, semeadura
em meio de cultura, inoculao em hamster. Vale salientar que amostras
visando ao diagnstico molecular devem ser fixadas em etanol a 70%, pois
outras substncias podem inibir a reao de PCR, como, por exemplo, o formaldedo.
Esfregao Corado. Para realizao de esfregaos por aposio (imprint)
comprime-se repetida e delicadamente o fragmento de tecido sobre uma lmina
previamente desengordurada, deixando-se o material secar temperatura
ambiente. Para a confeco de esfregaos de boa qualidade, recomenda-se
a lavagem do fragmento de tecido em soluo salina estril (NaCl 0,85%)
para remoo do excesso de sangue. Aps a secagem, os esfregaos so
fixados por trs minutos com metanol e corados pelo mtodo de Giemsa.

Fig. 14.1 A) Leso inicial tpica determinada por Leishmania sp. com dois meses de
evoluo; B) Leso determinada por Leishmania sp. com oito meses de evoluo; C) Leso
determinada por Leishmania sp. com trs meses de evoluo.

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326

CAPTULO 14

Na falta deste corante pode-se utilizar o corante de Leishman. A pesquisa


do parasito feita em objetiva de 100X e em geral requer experincia e
pacincia do microscopista devido usual baixa parasitemia. Formas
amastigotas de Leishmania podem ser encontradas livres ou no interior de
macrfagos ou histicitos. De maneira geral, a demonstrao do parasito
inversamente proporcional ao tempo de evoluo da lcera. Para preservao permanente do esfregao recomenda-se a montagem da preparao em
blsamo-do-canad ou Entellan (Fig.14.2).
Histopatologia. O fragmento de tecido pode ser processado atravs
de tcnicas histolgicas convencionais, podendo o material ser corado pela
Hematoxilina-Eosina (HE), Giemsa ou Grocott. O exame do material pode
revelar, alm das leishmanias, outros patgenos como fungos e bactrias,
permitindo, desta forma, o diagnstico diferencial de outras patologias inflamatrias e/ou neoplasias. Em geral, o aspecto histopatolgico da LTA consiste de um infiltrado inflamatrio mononuclear misto, apresentando granulomas tuberculides. O encontro de amastigotas depende do tempo de evoluo
da leso, bem como da forma clnica da doena.
Cultura. A cultura de Leishmania pode ser realizada a partir do fragmento de tecido retirado na bipsia da borda da leso, que semeado em
meio LIT (Liver Infusion Tryptose), NNN (gar-sangue)+ LIT ou Schneider.
A coleta do material pode ser feita atravs de aspirao de material da leso utilizando-se uma seringa de 5ml com agulha de 25 x 8 , onde, aps
assepsia e anestesia local, a agulha introduzida na borda da leso injetando-se cerca de 1-3ml de salina estril e, atravs de movimentos rotacionais, possvel aspirar o material o qual pode ser semeado em meio
de cultura 1. Recentemente Marzochi e cols. 15 desenvolveram uma nova
metodologia para coleta da amostra utilizando tubos selados a vcuo
(Vacutainer) pr-adicionados de meio de cultura. Neste caso, o material
aspirado diretamente no tubo. Esta metodologia, alm de prtica, particularmente muito til para trabalhos em condies de campo, pois evita a
ocorrncia de contaminao. Os tubos semeados so mantidos a 26C e examinados semanalmente. Alguns isolados de Leishmania apresentam cresci-

Fig. 14.2 A) Esfregao por aposio de bipsia de leso demonstrando formas amastigotas
intracelulares de Leishmania sp. em macrfagos; B) Formas amastigotas de Leishmania chagasi
em clula mononuclear de medula ssea. Esfregaos corados pelo mtodo de Giemsa. Aumento:
1.000X.

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CAPTULO 14

327

mento muito lento e podem apresentar dificuldade para o seu estabelecimento


em cultura (Fig.14.3).
Inoculao em Animais. O hamster (Mesocricetus auratus) o animal
mais utilizado devido a sua grande suscetibilidade ao parasito. O tecido obtido na bipsia triturado em soluo salina ou tampo fosfato e inoculado
por via subcutnea na superfcie dorsal das patas traseiras e/ou no focinho
do animal. O tempo de aparecimento de leses nodulares pode variar de dois
meses a um ano, dependendo do inculo e principalmente da espcie de parasito.
LEISHMANIOSE VISCERAL
Na leishmaniose visceral (LV) o agente etiolgico pode ser demonstrado em amostras de tecido obtidas por puno de vsceras (bao, fgado e
medula ssea)19. A bipsia de bao e fgado procedimento de elevado risco e s deve ser realizada em condies especiais. Face maior simplicidade e menor risco ao paciente, o material de medula ssea coletado atravs
de puno do esterno, tbia ou da crista ilaca, sendo esta a preferencial em
adultos. Com o material coletado devem ser feitos esfregaos corados pelo
mtodo de Giemsa, semeadura em meio de cultura NNN+LIT, inoculao
em hamster, e, se possvel, esfregaos sobre papel Whatman n. 1 esterilizado ou papel de nitrocelulose, visando-se ao diagnstico por PCR. A cultura deve apresentar-se positiva aps um perodo de at quatro a cinco semanas, sendo que os repiques das culturas devem ser feitos semanalmente.
A inoculao de animais, embora no tenha aplicao prtica para fins de
diagnstico imediato, pode ser til para o isolamento do parasito visando a
sua caracterizao e estudos epidemiolgicos.

M TODOS I MUNOLGICOS
Intradermorreao de Montenegro (IDRM). Este teste avalia a
reao de hipersensibilidade retardada do paciente frente a antgenos de

Fig. 14.3 Formas promastigotas de cultura de Leishmania sp. em meio LIT, coradas pelo
mtodo de Giemsa. Aumento 1.000X.

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CAPTULO 14

Leishmania sp. Alm de sua utilizao com fins diagnsticos, a IDRM pode
ser utilizada em inquritos epidemiolgicos e na monitorao de programas
de vacinao contra a leishmaniose tegumentar. A intradermorreao realizada com antgeno padronizado, composto de promastigotas mortos do gnero
Leishmania, a uma concentrao de 240g de nitrognio total ou 40g de
nitrognio protico por mililitro16. Para a realizao do teste, cerca de 0,1ml
do antgeno injetado intradermicamente na face anterior do antebrao. A
leitura realizada 48 a 72 horas aps a inoculao, medindo-se o dimetro
do halo de endurao com o auxlio de uma caneta esferogrfica. Embora
no existam medidas limites do teste, a endurao com dimetro 5mm
considerada positiva. A intensidade da reao pode variar com a resposta
celular do paciente, tempo de evoluo da leso, forma clnica da doena
(tegumentar ou mucocutnea) e a qualidade do antgeno. Na forma tegumentar
a intensidade da resposta maior quando o paciente j apresenta lceras
crnicas; na forma mucocutnea, devido ao estado hiper-reativo do paciente, a resposta pode ser to intensa a ponto de causar flictemas e necrose
no local de injeo do antgeno. Contrariamente, na leishmaniose difusa, devido
ao estado alrgico do paciente, a resposta negativa. Da mesma forma na
LV o teste intradrmico geralmente negativo na fase da doena ativa em
virtude da imunossupresso causada pelo parasito. Na LV o teste intradrmico volta a ser positivo aps a cura da doena.
Reao de Imunofluorescncia Indireta (RIFI) e Ensaio Imunoenzimtico (ELISA). Estes mtodos, largamente empregados no diagnstico de
vrias infeces, no so utilizados de forma rotineira no diagnstico da LTA.
Entretanto, esses testes sorolgicos podem ser utilizados para detectar anticorpos da classe IgM e IgG anti-Leishmania, especialmente no calazar,
onde podem auxiliar no diagnstico da enfermidade assim como em inquritos soro-epidemiolgicos2. Apesar de sua elevada sensibilidade, a reao
grupo-especfica e, desta forma, reaes cruzadas com T. cruzi e a leishmaniose tegumentar devem ser esperadas. Este fato especialmente importante, uma vez que em vrias regies geogrficas estas patologias distintas coexistem. Desta forma, a reunio dos vrios elementos clnicos e
epidemiolgicos de fundamental importncia no diagnstico da parasitose.
Na leishmaniose visceral os ttulos sorolgicos se mantm elevados frente
ao antgeno homlogo tanto na RIFI como no ELISA, mesmo aps o tratamento especfico. Alm destes, vrios outros testes como Dot-ELISA, Fast
ELISA, contra-imunoeletroforese e aglutinao direta (DAT) tm sido empregados no diagnstico de leishmaniose visceral humana e canina 3,9,10. Elevadas especificidade e sensibilidade tm sido demonstradas no sorodiagnstico
da leishmaniose visceral utilizando-se antgenos recombinantes20. Alm disso, o desenvolvimento de outras metodologias para deteco de antgenos
circulantes no sangue e na urina podero ser de grande utilidade no diagnstico da leishmaniose visceral.

MTODOS M OLECULARES
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Assim como o anteriormente descrito para o diagnstico da doena de Chagas, inmeros so os
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CAPTULO 14

329

trabalhos utilizando a PCR no diagnstico das leishmanioses. Da mesma forma,


diferentes genes ou seqncias de DNA tm sido utilizadas com propsitos
diagnsticos, apresentando boa sensibilidade. Dentre estas seqncias podemos citar os minicrculos de kDNA, cuja abundncia e conservao constituem-se como importantes pr-requisitos. A sensibilidade de deteco do
DNA destes parasitos tem girado em torno de fentogramas (fg) de DNA.
Recentemente, variaes da tcnica de PCR ou a associao da PCR com
outras tcnicas tem permitido, alm da deteco do parasito, sua identificao especfica. Utilizando-se o DNA extrado de bipsias de leses, o mtodo capaz de detectar a presena do DNA de Leishmania spp., mesmo
quando no so observadas formas amastigotas do parasito ao exame microscpico. A utilizao de imprints de bipsias realizados em papel de filtro ou de nitrocelulose provou recentemente ser to eficaz como fonte de
DNA molde em reaes de PCR quanto utilizao da bipsia propriamente dita. Este fato facilitou a coleta em campo e posterior processamento no
laboratrio, evitando os problemas de fixao e preservao do material13.
Assim como foi descrito no captulo sobre o diagnstico molecular da infeco pelo T. cruzi, a preocupao com a contaminao da reao deve ser
abordada com seriedade. A PCR especfica, utilizando diferentes pares de
iniciadores, pode revelar a espcie do parasito envolvido, como o recentemente descrito por Passos e cols.17, ao pesquisarem a presena do kDNA
do parasito em bipsias de pacientes. Entretanto, deve-se proceder uma reao
diferente para cada espcie do parasito a ser considerada. Dentre as variantes da PCR utilizadas na caracterizao especfica de Leishmania spp. a
partir de bipsias, podemos citar a multiplex-PCR ou ainda a hibridizao
dos produtos de amplificao com sondas espcie-especficas 7,8,21 . A
multiplex PCR utiliza diferentes pares de iniciadores em uma mesma reao, permitindo o diagnstico atravs da deteco do DNA do parasito, assim
como a caracterizao especfica dos parasitos atravs do padro distinto
de migrao eletrofortica dos produtos de amplificao gerados com os
diferentes pares de iniciadores. Uma outra tcnica a amplificao de um
fragmento de um mesmo gene entre as diferentes amostras e posterior
hibridizao dos produtos de amplificao com sondas espcie ou grupoespecficas. Mesmo que produtos de amplificao apresentem um mesmo
padro de migrao eletrofortica, eles necessariamente no possuem a mesma
seqncia nucleotdica. Assim sendo, as sondas so fragmentos de DNA cuja
seqncia especfica de uma ou outra espcie ou grupo, que ao serem
utilizadas nos ensaios de hibridizao, somente se ligam seqncia homloga,
revelando assim a identidade do agente etiolgico. Em um estudo recente, a
PCR foi capaz de detectar a presena de DNA de Leishmania spp. em 90,9%
das bipsias de pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana, comprovados pelo exame microscopia ptica. A falha da PCR em
detectar o DNA do parasito em bipsias positivas foi atribuda presena
de excesso de sangue quando da coleta do material. Embora necessite ainda de padronizao, reafirmamos que a PCR apresenta-se como uma ferramenta de alta sensibilidade e especificidade no diagnstico de doenas
parasitrias, tendo um grande potencial para o diagnstico das diferentes formas
da leishmaniose.
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CAPTULO 14

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CAPTULO 14

CAPTULO

15

Plasmodium spp.

Cor Jesus Fernandes Fontes

CONSIDERAES GERAIS
A descoberta de que a malria uma hemoparasitose aconteceu em 1880, quando o francs Louis Alphonse Laveran conseguiu observar organismos em movimento ao examinar, a fresco,
o sangue de um paciente com a doena. Posteriormente, em 1884,
a parasitose foi confirmada por Gerhardt, que conseguiu reproduzir a doena a partir de transfuso de sangue infectado. Em
1891, a presena e a morfologia desses parasitos puderam ser
demonstradas em esfregaos sangneos corados por um mtodo desenvolvido por Romanowsky. A transmisso da doena, no
entanto, s foi elucidada em 1897, por Ronald Ross, que identificou a participao de mosquitos como vetores da doena e descreveu o ciclo do parasito no hospedeiro invertebrado9. Os parasitos causadores de malria pertencem ao filo Apicomplexa,
famlia Plasmodiidae e ao gnero Plasmodium. Das 150 espcies causadoras de malria em diferentes hospedeiros, apenas
quatro espcies parasitam o homem: Plasmodium falciparum,
P. vivax, P. malariae e P. ovale, que ocorre apenas em regies
restritas do continente Africano3.
PATOGENIA
Apenas o ciclo eritroctico assexuado responsvel pelas
manifestaes clnicas e patologia da malria. Os possveis
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CAPTULO 15

333

mecanismos determinantes das diferentes formas clnicas da doena baseiamse, fundamentalmente, na interao dos seguintes fenmenos patognicos:

DESTRUIO

DOS

E RITRCITOS P ARASITADOS

Embora participe do desenvolvimento da anemia, esta no se correlaciona


com a parasitemia, indicando a influncia de outros fatores como: a destruio de eritrcitos no parasitados pelo sistema imune ou por aumento da
eritrofagocitose esplnica; a participao de auto-anticorpos com afinidades
tanto para o parasito como para o eritrcito; a disfuno da medula ssea
estimulada por ao de citocinas (diseritropoiese).

TOXICIDADE RESULTANTE DA LIBERAO DE CITOCINAS


Clulas imunocompetentes produzem citocinas que agiro direta ou indiretamente sobre o parasito, mas que podem ser nocivas para o hospedeiro. A febre, por exemplo, resultado da liberao de pirognio endgeno
pelos moncitos e macrfagos, ativados por produtos do parasito. Outras
citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF) e as interleucinas 1, 6 e
8, esto associadas a muitos dos sintomas da malria aguda e seus nveis
esto geralmente elevados nos casos de malria grave.

SEQESTRO

DOS

E RITRCITOS PARASITADOS

NA

REDE C APILAR

Durante a esquizogonia sangnea, o P. falciparum induz uma srie de


modificaes na superfcie da clula parasitada, que permite sua adeso
parede endotelial dos capilares. Este fenmeno de citoaderncia ocorre principalmente na rede capilar de rgos vitais, como crebro, rins e fgado,
podendo levar obstruo da microcirculao e conseqente reduo do fluxo
de oxignio. Este mecanismo tem sido implicado na gnese da malria cerebral, insuficincia renal aguda e hepatite, to comuns nos quadros de malria
grave.

LESO C APILAR

POR

DEPOSIO

DE

I MUNOCOMPLEXOS

Em infeces crnicas por P. malariae descrita a ocorrncia de leso renal, produzida pela deposio de imunocomplexos e componentes do
complemento nos glomrulos, alterando sua permeabilidade e induzindo a perda
macia de protena, a qual se apresenta clinicamente como sndrome nefrtica.
QUADRO CLNICO
O perodo de incubao da malria varia de acordo com a espcie de
plasmdio, sendo de oito a12 dias para P. falciparum, 13 a 17 para P. vivax
e 28 a 30 dias para P. malariae. Uma fase sintomtica inicial, caracteriza Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

334

CAPTULO 15

da por mal-estar, cefalia, cansao e mialgia, geralmente precede a clssica febre da malria. O ataque paroxstico agudo geralmente acompanhado de calafrio e sudorese, dura de 15 minutos a uma hora e seguido por
uma fase febril, com temperatura corprea, podendo atingir 41C ou mais.
Depois de algumas horas, os sintomas desaparecem e o paciente sente-se
melhor. Aps esta fase inicial a febre assume um carter intermitente, com
periodicidade dependente do tempo de durao dos ciclos eritrocticos de cada
espcie de plasmdio: 48 horas para P. falciparum, P. vivax e P. ovale (malria
ter) e 72 horas para P. malariae (malria quart). Entretanto, a constatao
desta regularidade pouco comum nos dias atuais, em decorrncia de tratamento precoce, realizado ainda na fase de assincronismo das esquizogonias
sangneas.
Adultos no-imunes, bem como crianas e gestantes, podem apresentar manifestaes mais graves da infeco, podendo ser fatal no caso de P.
falciparum. As formas mais comuns de doena complicada so a malria
cerebral, a insuficincia renal aguda, o edema pulmonar agudo, a hipoglicemia, a ictercia e a hemoglobinria macia.
EPIDEMIOLOGIA
A endemicidade da malria em uma regio definida com base no ndice esplnico, o qual determinado pela proporo de crianas entre dois
e 10 anos com bao palpvel. Classifica-se ento em hipoendmica quando o ndice esplnico inferior a 10%, mesoendmica entre 11% e 50%,
hiperendmica entre 51% e 75% e holoendmica quando superior a 75%.
Outra forma de avaliar epidemiologicamente a malria pelo seu perfil de
incidncia no decorrer do tempo: estvel, se o nvel de transmisso alto e
no sofre oscilao no decorrer dos anos, e instvel, como o caso do Brasil,
quando comum a variao anual da incidncia.
Os nveis de endemicidade da malria esto intimamente ligados densidade
vetorial da regio, s condies que favorecem o ciclo de transmisso do
parasito no inseto e suscetibilidade do indivduo infeco pelo plasmdio.
No Brasil, a malria apresenta distribuio heterognea e dependente das
atividades ocupacionais desenvolvidas por populaes expostas na Amaznia. Por exemplo, a infeco freqente entre garimpeiros e trabalhadores
envolvidos em projetos agropecurios e de colonizao.
IMUNIDADE
Os mecanismos imunes envolvidos na proteo contra a malria so
complexos, mas podem ser simples e didaticamente divididos em duas categorias: a) resistncia inata ou imunidade natural e b) imunidade adquirida.
A resistncia inata uma propriedade inerente do hospedeiro e independe
de qualquer contato prvio com o parasito. Fatores do hospedeiro, geneticamente determinados, podem influenciar sua suscetibilidade malria. Por
exemplo: algumas populaes negras africanas que no apresentam o antgeno
de grupo sangneo Duffy na superfcie de seus eritrcitos so resistentes
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infeco pelo P. vivax, explicando a raridade deste tipo de malria em certas regies da frica. Certos polimorfismos genticos, como a anemia falciforme, esto associados a quadros menos graves de malria por P.
falciparum.
A histria natural da malria em regies de alta transmisso, como na
frica e em algumas regies da sia, ilustra bem a resposta imunolgica
naturalmente adquirida pelo homem contra o plasmdio e a dinmica relao parasito/hospedeiro, que se desenvolve nos indivduos constante e cronicamente expostos doena. Nessas reas, onde o P. falciparum predominante, os recm-nascidos so protegidos da malria grave durante os
seis primeiros meses de vida. A transferncia passiva de anticorpos IgG da
me imune para o filho considerada um dos principais fatores responsveis pela resistncia do recm-nascido. Aps os seis meses as crianas so
altamente suscetveis malria grave, sendo alta a letalidade nos dois primeiros anos de vida. Com o aumento da idade, as crianas sofrem progressivamente menos episdios de malria aguda, embora possam apresentar altas
parasitemias, na ausncia de sintomas. Atingindo a idade adulta, os sintomas clnicos da doena so menos pronunciados e os nveis de parasitos
sangneos muito baixos, refletindo, ento, o desenvolvimento de uma imunidade antiparasito, tambm denominada premunio3.
MORFOLOGIA
Os plasmdios variam individualmente em tamanho, forma e aparncia,
de acordo com o seu estgio de desenvolvimento e com suas caractersticas especficas:
Esporozoto alongado, mede cerca de 11m de comprimento por
1m de largura e apresenta ncleo central nico. Sua estrutura interna
semelhante nas diferentes espcies de plasmdio.
Forma exoeritroctica aps a penetrao do esporozoto no hepatcito
o parasito se torna arredondado, sendo denominado trofozoto. O seu tamanho varia de 30 a 70m de dimetro e isto provoca aumento do tamanho do
hepatcito infectado. O nmero de merozotos formados por hepatcito ,
em geral, acima de 10.000 formas.
Merozoto independente de sua origem, se pr-eritroctica ou sangnea, os merozotos so clulas similares e capazes de invadir somente
hemcias. So pequenos e arredondados, com 1 a 5m de comprimento por
2m.
Formas eritrocticas compreendem os estgios de trofozoto jovem,
trofozoto maduro, esquizonte jovem, esquizonte maduro e gametcitos. As
caractersticas morfolgicas de cada estgio para as diferentes espcies
causadoras de malria humana esto esquematizadas na Tabela 15.1.
Microgameta clula flagelada de 20 a 25m de comprimento, constituda de uma membrana que envolve o ncleo e o nico flagelo, originria
do processo de exflagelao.
Macrogameta clula que apresenta uma estrutura atrativa na
superfcie, por onde se d a penetrao do microgameta (fecundao).
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Raro no sangue perifrico.


Geralmente arredondado.
Citoplasma pouco deformado.
Cromatina em grnulos
grossos.

Raro no sangue perifrico.


Pequeno e compacto.
Citoplasma espesso.
Cromatina indistinta.

Trofozoto maduro

Esquizonte

Citoplasma delgado.
Cromatina pequena e saliente
(forma em anel) ou dupla.
Poliparasitismo freqente.
Raramente granulaes de
Maurer.

Normal. Granulaes de
Maurer raras.

Aspecto dos
eritrcitos infectados

Trofozoto jovem

Trofozotos jovens,
gametcitos.

Formas encontradas
no sangue perifrico

P. falciparum

Forma amebide.
Citoplasma irregular
vacuolizado. Cromatina
segmentada.

Citoplasma irregular e com


aspecto amebide.
Cromatina isolada.

Citoplasma espesso. Ncleo


com cromatina nica e
interna. Poliparasitismo raro.

Aumentado. Granulaes de
Schffner freqentes.

Trofozotos jovens, trofozotos


maduros, esquizontes e
gametcitos.

Espcie de plasmdio
P. vivax

Trofozotos jovens,
trofozotos maduros,
esquizontes e gametcitos.
Aumentado e oval.
Granulaes de Schffner.
Citoplasma espesso.
Ncleo com cromatina
nica e interna.

Citoplasma irregular e
com aspecto amebide.
Cromatina isolada.

Forma amebide.
Citoplasma irregular
vacuolizado. Cromatina
segmentada.

Normal. Granulaes de
Ziemann raras.
Citoplasma espesso. Ncleo
com cromatina mdia e
nica. Ocupa 1/3 do
volume do eritrcito.

Citoplasma compacto,
arredondado. Cromatina
pouco visvel. Disposio
em faixa equatorial no
eritrcito.
Cromatina pouco
segmentada. Posio em
banda equatorial.
Hipoparasitemia.

P. ovale

Trofozotos jovens e
maduros, esquizontes e
gametcitos.

P. malariae

Tabela 15.1
Caractersticas Morfolgicas das Formas Eritrocticas das Diferentes Espcies Causadoras de Malria Humana

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Citoplasma azul plido e a


cromatina azul frouxa.

Marrom-claro e pouco
evidente.

Mais curto e menos


encurvado, com citoplasma
fracamente corado, cromatina
difusa e pigmento malrico
disseminado.

Negro, grosseiro e evidente.

Microgametcito

Pigmento malrico

Marrom-escuro, grosseiro e
evidente.

Cromatina nica, menos


distinta e mais difusa.

Semelhante ao do P. vivax,
diferindo apenas por seu
tamanho menor.

Citoplasma abundante,
arredondado ou oval, ncleo
grande, cromatina pouco
densa. Ocupa quase todo
volume do eritrcito.
Citoplasma cora-se de azul.

Alongados e curvos, em
forma de crescente ou foice,
com citoplasma azul intenso e
ncleo denso, cercado de
pigmento malrico.

Macrogametcito

Nmero de
merozoitos no
esquizonte
6-12
(mdia = 8)
Em forma de roseta.

P. malariae

12-24
(mdia = 16)

Espcie de plasmdio
P. vivax

6-32
(mdia = 22)

P. falciparum

Marrom-escuro e evidente.

Cromatina difusa.

Semelhante ao do P. vivax,
diferindo apenas por seu
tamanho menor.

6-14
(mdia = 8)

P. ovale

Tabela 15.1
Caractersticas Morfolgicas das Formas Eritrocticas das Diferentes Espcies Causadoras de Malria Humana (Continuao)

Oocineto forma alongada de aspecto vermiforme, mvel, com comprimento entre 10 e 20m, contendo ncleo volumoso e excntrico.
Oocisto estrutura esfrica de 40 a 80m, a qual apresenta grnulos pigmentados em seu interior. Estima-se que um nico oocisto possa produzir, em mdia, 1.000 esporozotos.
DIAGNSTICO DE LABORATRIO
Por orientao dos programas oficiais de controle da doena, em situaes de epidemia e em reas de difcil acesso da populao aos servios
de sade, indivduos com febre so considerados portadores de malria 4.
Entretanto, os sintomas da malria so extremamente inespecficos, no se
prestando distino entre essa parasitose e outras infeces agudas do
homem5. Assim, o diagnstico de certeza da malria s possvel pela demonstrao do parasito, ou de antgenos relacionados, no sangue perifrico
do paciente. O diagnstico laboratorial da malria feito pela pesquisa do
parasito no sangue perifrico, pelo mtodo da gota espessa ou pelo esfregao
estirado sangneo.

ESFREGAO ESPESSO

OU

ESFREGAO E STIRADO

Esses mtodos baseiam-se na visualizao do parasito atravs de microscopia ptica, aps colorao com corante vital (azul-de-metileno) e pelo
mtodo de Giemsa. Esses so os nicos mtodos que permitem a diferenciao especfica dos parasitos, a partir da anlise da sua morfologia e das
alteraes provocadas no eritrcito infectado. Em funo de sua simplicidade de realizao, seu baixo custo e sua eficincia diagnstica, o exame
da gota espessa tem sido utilizado em todo o mundo para o diagnstico especfico da malria. A determinao da densidade parasitria til para a
avaliao prognstica e deve ser realizada em todo paciente com malria,
especialmente nos portadores de P. falciparum. Para tal, o exame padro
da gota espessa ser de 100 campos microscpicos, examinados com aumento de 600-700X, o que equivale a 0,25l de sangue. Um mtodo
semiquantitativo de avaliao da parasitemia, expressado em cruzes ento
obtido, conforme segue:
+
++
+++
++++

=
=
=
=

1-10 parasitos por 100 campos de gota espessa.


2-100 parasitos por 100 campos de gota espessa.
1-10 parasitos por 1 campo de gota espessa.
mais de 10 parasitos por 1 campo de gota espessa.

Uma forma mais precisa para quantificar a parasitemia feita pela


contagem simultnea de parasitos e leuccitos em 200-500 campos da gota
espessa. Se a contagem global de leuccitos do paciente conhecida, a razo
parasitos/leuccitos da lmina permitir a determinao da parasitemia por
mm3 de sangue5. A diferenciao especfica dos parasitos importante para
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CAPTULO 15

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a orientao do tratamento. Uma vez que o P. falciparum completa o seu


ciclo eritroctico assexuado aderido ao endotlio capilar, sua deteco no exame
do sangue perifrico suspeitada quando apenas trofozotos e gametcitos
so visualizados. Em contrapartida, a visualizao de todos os estgios de
desenvolvimento de ciclo sangneo na gota espessa sugere P. vivax, P. malariae
ou P. ovale. As caractersticas de diferenciao destas trs espcies so
melhor visualizadas atravs do exame do esfregao sangneo e podem ser
observadas nas Figs. 15.1, 15.2 e 15.3. Apesar de sua simplicidade e baixo
custo, o diagnstico microscpico da malria dependente dos seguintes
fatores:
a. Habilidade tcnica no preparo da lmina, seu manuseio e colorao.
b. Qualidade ptica e iluminao do microscpio.
c. Competncia e cuidado por parte do microscopista.
d. Capacidade de deteco de parasitemia igual ou superior a 10 a 20
parasitos/microlitro de sangue, quando 100 campos microscpicos so examinados por microscopista devidamente treinado.
Em muitos locais onde a malria ocorre impraticvel satisfazer a todos esses quesitos, seja pela precariedade dos servios de sade ou pela
dificuldade de acesso da populao aos centros de diagnstico10-13.

QBC (QUANTITATIVE B UFFY COAT)


Nos ltimos 10 anos, mtodos rpidos, prticos e sensveis vm sendo
desenvolvidos. O primeiro deles foi o QBC (Quantitative Buffy Coat), uma
tcnica que combina a concentrao dos parasitos pela centrifugao do sangue
em tubos de micro-hematcrito e a colorao de seus cidos nuclicos (DNA
e RNA) pelo fluorocromo alaranjado de acridina. um teste rpido, sensvel
e especfico, no necessitando de profissional altamente qualificado para sua
interpretao. adequado para situaes em que grande o volume de trabalho, ou com maior probabilidade de baixas parasitemias. Todavia, trata-se
de tcnica de alto custo financeiro, j que envolve microscopia epifluorescente
e tubos previamente preparados com anticoagulante e corantes especiais.
Embora vrios estudos tenham mostrado a eficincia do QBC para o diagnstico da malria, anlises mais recentes tm mostrado que, embora mais
rpida e mais objetiva, esta tcnica ainda no se mostrou superior gota
espessa no diagnstico parasitolgico da malria 1,6.

PARASIGHT-F (BECTON & D ICKINSON)


(ICT DIAGNOSTICS).

ICT MALARIA P F

Um grande avano na metodologia diagnstica da malria foi conseguido a partir de 1993, com o desenvolvimento de ensaios rpidos baseados
na captura qualitativa de um antgeno do P. falciparum, a protena 2, rica

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CAPTULO 15

Trofozoto jovem

Esquizonte jovem

Esquizontes maduros

Gametcitos

Fig. 15.1 Plasmodium falciparum.

em histidina (PfHRP2), conhecida comercialmente como ParaSight-F


(Becton & Dickinson) e ICT Malaria Pf (ICT Diagnostics). Fitas de papel
de nitrocelulose contendo anticorpo monoclonal especfico contra peptdeos
da PfHRP2 so a base do teste. Uma gota de sangue lisada com deter-

Trofozoto

Esquizontes maduros

Esquizonte jovem

Gametcitos

Fig. 15.2 Plasmodium malariae.

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Trofozoto jovem

Esquizonte jovem

Esquizontes maduros

Gametcitos
Fig. 15.3 Plasmodium vivax.

gente e a ela aplica-se a fita, sobre a qual o lisado lentamente absorvido.


A reao da PfHRP2 com o seu anticorpo monoclonal revelada pela adio de anticorpo policlonal anti-HRP2 conjugado com lipossomas contendo
o corante sulforodamine B. Para controle do teste, PfHRP2 tambm fixada fita, 8mm acima do anticorpo monoclonal. Tanto a fita quanto os reagentes
so extremamente estveis, sendo adequados para a realidade de trabalho
de campo, onde a temperatura e a umidade so geralmente elevadas e muito
variveis. Sensibilidades superiores a 95% tm sido relatadas quando o
ParaSight-F comparado gota espessa e com parasitemias superiores a
60 parasitos/l. Entretanto, com parasitemias menores, a sensibilidade diminui drasticamente, sendo inferior a 60% nos casos de parasitemia igual ou
inferior a 10%. Pela sua praticidade e facilidade de realizao, tanto o
ParaSight-F como o ICT Malaria Pf tm sido considerados testes teis
para a triagem e mesmo para a confirmao diagnstica, principalmente em
situaes onde complicado processar o exame da gota espessa, como reas
de difcil acesso, ou em situaes de baixa parasitemia. No entanto, PfHRP2
s produzida para o P. falciparum, no sendo possvel, portanto, diagnosticar outras espcies de plasmdios com esses testes. Isto representa um
inconveniente para a nossa realidade, j que o P. vivax a espcie mais
prevalente no Brasil1,7.

ICT MALARIA PF/PV E OPITMAL (FLOW INC., EUA)


Mais recentemente, outros mtodos de diagnstico rpido foram desenvolvidos, tendo a vantagem de se poder capturar antgenos de P. falciparum
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CAPTULO 15

e P. vivax, simultaneamente. Tratam-se do ICT Malaria Pf/Pv, do ParaSightF+V e do OpitMAL , testes tambm baseados em fitas de deteco por
imunocromatografia, os quais utilizam anticorpos policlonais e monoclonais
marcados com ouro e dirigidos contra a enzima lactato desidrogenase, especfica do parasito (pDHL), presente no sangue total do paciente. Esta
uma enzima intracelular produzida em abundncia pelos parasitos vivos, o
que permite diferenciar entre fase aguda e convalescena da infeco. Apesar
de promissores, estes testes ainda no so comercializados em nosso meio
e poucos estudos de campo foram feitos at o momento para determinar
sua efetividade no diagnstico da malria2,8.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CAPTULO

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Babesiose Humana*

Philippe Brasseur

CONSIDERAES GERAIS
A babesiose humana uma infeco devida invaso das
hemcias por protozorios parasitos transmitidos por carrapatos.
As duas espcies Babesia microti e Babesia divergens so
responsveis pela maioria das infeces reportadas. Mais de 200
casos por B. microti foram descritos na costa nordeste dos EUA12,
enquanto na Europa foram documentados 29 casos, dos quais
83% ocorreram em pacientes que sofreram extirpao do bao.
A maioria dessas infeces foi atribuda a B. divergens. A infeco lembra a malria, com diagnstico difcil e com sintomas
clnicos semelhantes. A identificao rpida do parasito de extrema importncia para prevenir complicaes severas como hemlise
e insuficincia renal. Recentemente, infeces relacionadas a organismos tipo Babesia WA1, que ocorreram em pacientes esplenectomizados, foram descritas no norte da Califrnia8, no Estado
de Washington5,9 e no Missouri4.
MTODOS PARASITOLGICOS

E XAME M ICROSCPICO
O diagnstico da babesiose humana baseia-se na presena
*Traduzido do Ingls por Geraldo Attilio De Carli e Edmundo Carlos Grisard.

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de parasitos dentro das hemcias, os quais so detectados pelo exame microscpico do sangue perifrico em esfregaos sangneos corados pelo mtodo
de Giemsa. As hemcias so infectadas por parasitos com pleomorfismo mltiplo (1-3m), geralmente de dois a quatro organismos. Merozotos extracelulares
podem ser detectados. A babesia caracterizada por no acumular pigmento
no citoplasma.
Os gametcitos no so identificados pela colorao de Giemsa. Nas
infeces pela B. divergens so observados parasitos intra-eritrocitrios na
posio central ou subcentral com aparncia puntiforme, anular ou filamentosa
(Fig. 16.1).
Os parasitos piriformes so freqentemente vistos aos pares ligados atravs
de suas pequenas extremidades ou, mais raramente, como a forma de cruz
de malta. A parasitemia apresenta ndices altos (1 a 80%) na maioria dos
casos.
Nas infeces pela B. microti, os parasitos intracelulares apresentam
a forma em anel e de cesta, mas as formas de cruz de malta so
raramente vistas e no so consideradas especficas para essa espcie. O
grau da parasitemia baixo.
As outras espcies, como, por exemplo, B. bovis ou B. canis so raramente encontradas nas infeces humanas. Nas infeces pela B. bovis
so observadas formas anulares, que so menores do que as da B. divergens
(1-2m). A B. canis caracterizada por formas bigeminadas (3-5m). Ambas
as espcies produzem somente baixos nveis de parasitemia e os parasitos
esto localizados no centro das hemcias (Fig. 16.1).

Fig. 16.1 Babesia microti: A) Esfregao estirado corado pelo mtodo de Giemsa; B, C)
Infeco pela Babesia, esfregao estirado corado pelo mtodo de Giemsa; notar em (B) a
ttrade (cruz de malta), as variaes no tamanho, na forma dos estgios em anel de bacharel e a ausncia de pigmento no citoplasma. (Cortesia DPDx, the CDC website for
parasitology diagnosis, EUA.)

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CAPTULO 16

Mtodo de Concentrao
Os esfregaos espessos no so indicados para a pesquisa dos parasitos da Babesia, os quais so muito pequenos e no so identificados com
confiana. O Quantitative Buffy Coat (QBC ) foi proposto para a pesquisa da babesiose6. Esse mtodo combina a concentrao dos parasitos pela
centrifugao do sangue em tubos de micro-hematcrito e a colorao pelo
fluorocromo alaranjado de acridina. A tcnica requer micro-hematcritos
revestidos com alaranjado de acridina e anticoagulante, preenchidos com cerca
de 50 a 60l de sangue total e centrifugados a 15.000 x g por 5 minutos.
Aps a centrifugao, os micro-hematcritos so submetidos a epifluorescncia
(UV). A sensibilidade desse mtodo estimada entre 10-7 e 10 -8, sendo a
sensibilidade maior do que o exame de esfregaos permanentes corados pelo
mtodo de Giemsa, os quais apresentam um ndice de 10-5 a 10 -6. O mtodo
QBC indicado para detectar baixos nveis de parasitemia, sendo especialmente adaptado para o diagnstico da B. microti, uma vez que os parasitos dessa espcie, nas infeces, so geralmente mais escassos. No existe
interesse em avaliar os altos nveis de parasitemias como nas infeces pela
B. divergens. O principal limite do sistema QBC o alto custo do equipamento.
IMUNODIAGNSTICO

REAO

DA

IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA (RIFI)

A reao da imunofluorescncia indireta (RIFI) foi idealizada para detectar


anticorpos de B. microti em pacientes com babesiose 1. O antgeno da B.
microti obtido de cepas mantidas em hamsters fmeas (Golden hamster)
atravs da passagem mensal contnua pela inoculao intraperitoneal. Quando
a parasitemia atinge 40% de eritrcitos infectados, os animais so anestesiados
e o sangue colhido com seringa heparinizada atravs de puno cardaca.
O sangue centrifugado (500 x g por 5 min), o plasma desprezado e as
hemcias lavadas em trs ciclos de centrifugao, com 10ml de soluo salina
tamponada (PBS), estril e pH 7,6. Os eritrcitos so ressuspendidos em
PBS para obter uma concentrao de um a quatro parasitos por eritrcito,
por campo, em esfregao espesso.
O antgeno da B. divergens preparado pela cultura contnua in vitro
do parasito (cepa Rouen, 1987) em eritrcitos humanos 3. O antgeno pode
tambm ser preparado pela inoculao intraperitonial de gerbils com eritrcitos humanos parasitados. A puno cardaca realizada quando a parasitemia
atinge 50% (3-4 dias aps a inoculao).
Na babesiose aguda os ttulos excedem a diluio de 1:2.056; entretanto, esses ttulos sofrem um declnio dentro de seis a 12 meses aps o tratamento do paciente. Existe uma fraca correlao entre o ttulo dos anticorpos e a severidade dos sintomas11. O ttulo dos anticorpos negativo nos
estgios precoces da doena, os quais no podem ser detectados na primeira semana da doena.
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A RIFI no indicada para o diagnstico de urgncia, mas para a confirmao do diagnstico. Em reas endmicas a sorologia no discrimina entre
a exposio e a pessoa realmente infectada. Na babesiose pela B. divergens
os ttulos de anticorpos so altos quando so usados antgenos de B. canis
em detrimento aos homlogos, especialmente nos estgios recentes da infeco. No existe evidncias da troca de eptopo entre antgenos em diluies baixas da B. microti, B. equi, B. caballi e Plasmodium falciparum9.
Os soros de pacientes infectados com o organismo tipo Babesia WA1 e B.
microti no apresentam reaes cruzadas.
MTODOS MOLECULARES

REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)


A amplificao in vitro de seqncias especficas de DNA de B. microti
tem sido utilizada para o diagnstico rpido e sensvel da babesiose humana7. Foi descrito um fragmento especfico de um gene de 589pb codificante
para a subunidade menor do RNA ribossmico (ssu-rRNA), o qual permite
a diferenciao entre B. microti e B. gibsoni. Iniciadores especficos baseados na seqncia deste gene tm sido utilizados na PCR para identificao
especfica.
A aplicao da anlise por PCR permite a deteco da presena do
parasito to cedo como 24 horas aps o surgimento dos sintomas, permanecendo positivo por mais de dois meses. O nvel de sensibilidade dessa reao estimado em trs merozotos por amostra. Em um estudo comparativo, a PCR apresentou-se mais sensvel e to especfica quanto a inoculao
em hamsters. Da mesma forma, a PCR apresentou-se to especfica e sensvel quanto o exame de esfregaos sangneos em pacientes com babesiose
recente.
INOCULAO EM ANIMAIS
Em muitos casos a inoculao de animais requerida, desde que os
aspectos morfolgicos do parasito no so suficientes para a identificao
da espcie. A inoculao de 0,1 a 0,5ml do sangue do paciente em fmeas
de golden hamster (Mesocricetus auratus) muito til para a identificao da espcie B. microti 2,10. O sangue do animal deve ser examinado semanalmente para detectar os parasitos, os quais aparecem dois a quatro dias
aps a inoculao. O exame microscpico deve ser realizado at a sexta
semana antes de considerar o teste negativo. O hamster infectado desenvolve uma severa anemia com presena de reticulcitos. A parasitemia atinge
mais do que 50% e decresce gradualmente at a recuperao do animal. A
inoculao do hamster pode detectar 300 parasitos por ml de sangue, mas
requer vrias semanas para confirmar a espcie do parasito.
Para a infeco da B. divergens o gerbil (Meriones unguiculatus)
usado como hospedeiro substituto. Um volume de 0,5ml de sangue do paciente inoculado pela via intraperitoneal em animais com trs a quatro me Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

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ses de idade. A infeo desenvolve-se com rapidez e o sangue diariamente


colhido da veia da cauda para detectar os parasitos. Em contraste com a localizao perifrica do parasito observado no sangue de bovinos, nos eritrcitos do gerbil o parasito localiza-se na posio central. Os pequenos animais
desenvolvem uma alta parasitemia (60% a 80%) e morrem em trs a seis dias.
OUTROS RESULTADOS DE LABORATRIO
Em acrscimo ao diagnstico especfico da babesiose humana, outros
achados de laboratrio podem ser de valia. Devido freqente anemia
hemoltica, especialmente na infeco pela B. divergens, observada uma
diminuio dos eritrcitos e da contagem dos trombcitos, da hemoglobina,
do hematcrito e nos nveis de hepatoglobulinemia. Em contraste h um aumento
da contagem dos reticulcitos, da bilirrubinemia direta e da lactato desidrogenase. Em relao funo renal, as anormalidades incluem o aumento da
uria e da creatinina sangnea.
CONCLUSES
A colorao de esfregaos sangneos pelo mtodo de Giemsa sensvel e especfica, sendo indicada para o diagnstico da B. divergens e da
infeo aguda pela B. microti. A amplificao pela PCR deve ser usada
para o diagnstico precoce, especialmente quando o sangue examinado permanece negativo e existe suspeita de babesiose clnica. A inoculao em
animais e a RIFI no so indicadas para o diagnstico precoce. A inoculao de animais limitada pela avaliao das espcies de Babesia e pela
suspeita prvia pelo exame microscpico. A RIFI til somente para confirmar o diagnstico ou para detectar portadores assintomticos, mas para
esse propsito, a PCR aparece como o procedimento mais sensvel e mais
prtico.
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CAPTULO

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Angiostrongilase Abdominal

Carlos Graeff-Teixeira

CONSIDERAES GERAIS
A famlia Angiostrongylidae inclui nematides que se localizam no interior dos vasos arteriais 11 . Duas espcies so
importantes na Parasitologia humana: Angiostrongylus
cantonensis e A. costaricensis. O A. cantonensis ocorre na
sia e nas ilhas do Pacfico, provocando meningoencefalite
com eosinofilia no lquor pela passagem das larvas pelo sistema nervoso 4. O A. costaricensis ocorre nas Amricas e os
vermes adultos se localizam nas artrias mesentricas 8 . A
angiostrongilase abdominal uma enfermidade parasitria
causada por um pequeno nematide, Angiostrongylus costaricensis
Moreira e Cpodes, 1971.
O macho mede 20mm de comprimento. O corpo filiforme
com a extremidade caudal levemente encurvada, terminando
em uma bolsa copuladora pouco desenvolvida com dois
espculos. A fmea mede 33mm de comprimento, o corpo
filiforme com a extremidade ceflica arredondada e cauda
cnica. A boca tem trs pequenos lbios, o nus e a vulva
esto localizados ventralmente na extremidade caudal. No
hospedeiro definitivo, roedores silvestres (no sul do Brasil o
mais comum o Oryzomys nigripes), os vermes adultos vivem dentro das artrias mesentricas da regio ileocecal 2 . A
ovoposio ocorre dentro dos vasos arteriais e os ovos
embrionam enquanto transitam pelos vasos e pelos tecidos da
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CAPTULO 17

351

parede intestinal. Os ovos podem ser visualizados nas bipsias do intestino, medindo cerca de 90m, com um envoltrio muito delgado e um espao
claro em torno dos blastmeros ou da larva plenamente formada 7 . O
encontro dos ovos embrionados desse parasito na parede dos intestinos,
no tecido heptico e dentro dos pequenos vasos permite a identificao
da infeco por A. costaricensis 6 . Esses estgios de diagnstico no apresentam oprculo, como os ovos dos trematdeos, que so menores e sem
a presena do espinho (espculo), como os ovos do gnero Schistosoma.
Uma vez formadas, as larvas de primeiro estdio (L1) migram at a
luz do intestino e chegam ao solo com as fezes dos roedores. O hospedeiro
intermedirio molusco (lesmas, geralmente da famlia Veronicellidae) se infecta
ao ingerir o material fecal dos roedores. No molusco se realizam duas mudas, amadurecendo aps 18 dias as larvas de terceiro estdio (L3), que so
infectantes para os mamferos. Essas larvas podem permanecer vivas nas
lesmas por vrios meses ou podem sair com a secreo mucosa do molusco.
Os hospedeiros definitivos ingerem as larvas de terceiro estdio (L3) contidas no tecido fibromuscular dos moluscos9.
Os modos de transmisso para o homem no esto comprovados, mas
pode ocorrer a contaminao atravs de verduras ou frutas com o muco
dos moluscos infectados ou os prprios moluscos podem ser ingeridos inadvertidamente em meio s verduras ou propositadamente como parte da alimentao (escargot) ou por crianas pequenas na fase oral. Existem relatos do uso de lesmas como isca em pescaria, o que certamente constitui
um grande risco de infeco. O homem um hospedeiro acidental e pode
desenvolver a doena, caracterizada por febre e dor abdominal 5. Os produtos de secreo-excreo dos vermes adultos produzem uma intensa
reao inflamatria eosinoflica na parede do intestino, no mesentrio e nos
linfonodos. Quando os vermes morrem induzem trombose e ocluso arterial com infartos intestinais segmentares. As principais complicaes so
a ocluso intestinal por massa inflamatria, que pode ser palpvel no exame do doente e a perfurao dos intestinos com peritonite e sepse. No
h tratamento medicamentoso eficaz e o tratamento cirrgico necessrio quando aparecem as complicaes. Acredita-se que os vermes no
permaneam vivos por muito tempo e em muitos casos de infeco provavelmente ocorra cura espontnea.
A parasitose ocorre nas Amricas, desde o sul dos Estados Unidos da
Amrica do Norte (EUA) at o norte da Argentina e do Estado do Rio Grande
do Sul, no Brasil10. No sul do Brasil so realizados de trs a seis diagnsticos definitivos por ano, sendo a maioria dos casos originrios de reas de
relevo acidentado do norte do Rio Grande do Sul, oeste de Santa Catarina e
sudoeste do Paran. As crianas, como os adultos, podem adquirir a parasitose,
que apresenta uma sazonalidade associada aos perodos de temperatura mais
amena na primavera, vero e outono2.
DIAGNSTICO DE LABORATRIO
Nos roedores infectados, as larvas de primeiro estdio so facilmente
identificadas nas fezes. Entretanto, o mesmo no ocorre com o homem, no
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352

CAPTULO 17

qual o diagnstico depende do exame anatomopatolgico de bipsias ou peas


cirrgicas e do imunodiagnstico.

EXAME ANATOMOPATOLGICO
O diagnstico definitivo feito pelo exame anatomopatolgico de bipsias ou peas cirrgicas, quando evidenciam-se cortes de nematides (cutcula,
tubos reprodutores e um tubo reprodutivo) dentro dos vasos arteriais ou ovos
dentro de pequenos vasos1,3. Os achados histopatolgicos de intenso infiltrado eosinoflico, vasculite eosinoflica e granuloma so teis para o patologista estabelecer a suspeita de angiostrongilase abdominal. No leucograma
poder existir eosinofilia de at 90%, embora a contagem normal dos eosinfilos no sangue perifrico no exclua o diagnstico.

I MUNODIAGNSTICO
Como em outras parasitoses teciduais, nas angiostrongilases o emprego de testes imunolgicos so necessrios para compor o diagnstico presuntivo.
Deteco de anticorpos vem sendo realizada h anos na Costa Rica pelo
Prof. Pedro Morera, como o teste de aglutinao com partculas de ltex,
empregando antgeno bruto, no padronizado, de vermes adultos. No Laboratrio de Parasitologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomdicas da
PUCRS est sendo avaliado um teste imunoenzimtico (ELISA), o qual
emprega antgeno bruto de vermes fmeas e a deteco de IgG. A mais
recente avaliao mostrou sensibilidade de 76% e especificidade de 98% e
capacidade de discriminar 100% dos casos na fase aguda da infeco. Novas
preparaes antignicas tm sido buscadas, inclusive atravs de clonagem
molecular. Estudos de sistemas para a deteco da resposta humoral a nvel de isotipos, como IgG4, esto sendo pesquisados. A subclasse IgE no
apresenta resposta especfica em intensidade significativa, como poderia se
esperar nas helmintases. Esses mesmos procedimentos podem auxiliar na
identificao de casos de meningites eosinoflicas determinadas pelo A.
cantonensis em indivduos que viajam para reas endmicas de
angiostrongilase cerebral (sia, Ilhas do Pacfico e Ilhas do Caribe).

MTODOS M OLECULARES
A deteco de cidos nuclicos no sangue perifrico amplificados pela
reao em cadeia da polimerase (PCR), est sendo desenvolvida, podendo
vir a complementar o imunodiagnstico.

EXAME PARASITOLGICO

DAS

FEZES

O exame parasitolgico das fezes para a pesquisa de larvas no tem


utilidade na infeco humana. As larvas ficam retidas nos tecidos e existem poucas evidncias de que esses organismos saiam com as fezes. En Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

CAPTULO 17

353

tretanto, seria recomendvel verificar o isolamento de larvas atravs do mtodo


de Baermann em casos suspeitos ou com o diagnstico histopatolgico.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Filarioses

Geraldo Attilio De Carli


Tiana Tasca

CONSIDERAES GERAIS
Existem aproximadamente 200 espcies de filrias, embora apenas algumas sejam patognicas. No Brasil, somente trs
espcies so encontradas parasitando o homem: a Wuchereria
bancrofti, a Onchocerca volvulus e a Mansonella ozzardi;
entretanto, a Mansonella perstans foi descrita na Amaznia.
O diagnstico definitivo das filrias W. bancrofti (patognica)
e M. ozzardi (patogenicidade discutida) depende da demonstrao
do estdio embrionrio desses vermes (microfilrias) no sangue
perifrico. As microfilrias (Mf) da O. volvulus so detectadas no tecido celular subcutneo, embora elas possam ser ocasionalmente encontradas no sangue circulante. Os estdios
embrionrios da W. bancrofti so tambm revelados no lquido
da hidrocele e na urina, particularmente nos pacientes que apresentam uma alta parasitemia ou que tenham sido tratados recentemente com dietilcarbamazina (DEC). O horrio ideal para
a colheita do sangue perifrico para detectar as infeces peridicas entre 22 e quatro horas, ao passo que nas infeces noperidicas o sangue circulante pode ser colhido durante as 24
horas, apesar do pico da parasitemia ocorrer ao entardecer.
Dependendo das espcies, esses vermes apresentam periodicidade na circulao. Conseqentemente, deve ser observado, antes
da colheita do sangue, o tipo de periodicidade caracterstica da
espcie da filria presente na rea onde o paciente possa ter
adquirido a infeco. As larvas da W. bancrofti, Brugia malayi
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e Brugia timori apresentam usualmente uma periodicidade noturna. Isso


significa que as microfilrias podem ser encontradas no sangue perifrico
em pequeno nmero durante o dia, mas em nveis altos durante a noite. M.
ozzardi e O. volvulus no so peridicas, mas tendem a ser mais numerosas durante a noite 2,15,22.
DIAGNSTICO LABORATORIAL DA FILARIOSE
A confirmao das infeces por filrias baseada na deteco de
microfilrias no sangue e nos tecidos. As microfilrias podem ser identificadas ao nvel de espcie, tomando como base a presena ou ausncia da
bainha e a posio dos ncleos do corpo em preparaes coradas. As microfilrias
so demonstradas por meio de diversos mtodos e tcnicas: a) exame a fresco
do sangue para a pesquisa de organismos mveis; b) pesquisa das microfilrias
em esfregaos sangneos espessos e corados, e c) mtodos e tcnicas de
concentrao. A probabilidade do encontro dos parasitos aumenta com o nmero de lminas examinadas de um mesmo paciente. O diagnstico presuntivo
da filariose, infeco ou doena causada pela presena no organismo humano de helmintos nematides da superfamlia Filarioidea, deve incluir linfangite
(infeco dos vasos linfticos) e linfedema (obstruo adquirida das vias linfticas), geralmente por filrias dos gneros Wuchereria e Brugia. O diagnstico definitivo realizado pela deteco de microfilrias da W. bancrofti13,21,
B. malayi 18, Loa loa20, M. ozzardi 20 e M. perstans 20 no sangue perifrico.
As microfilrias da O. volvulus e M. streptocerca so primariamente encontradas parasitando o tecido subcutneo, apesar de serem ocasionalmente detectadas no sangue. O exame do esfregao sangneo para a pesquisa
de microfilrias deve incluir uma exaustiva reviso de toda a preparao.
As microfilrias embainhadas freqentemente perdem a bainha quando o
esfregao espesso seca. Outros procedimentos so indicados para o diagnstico e a identificao das microfilrias como: teste com dietilcarbamazina
(DEC); testes sorolgicos; deteco de antgenos circulantes de filria; e,
para os vermes adultos, ultra-sonografia.
FILARIOSE PELA WUCHERERIA BANCROFTI
Ver Captulo 19 Diagnstico Laboratorial da Filariose Bancroftiana.
FILARIOSE PELA MANSONELLA OZZARDI
O diagnstico da infeco por Mansonella ozzardi depende da presena das microfilrias no sangue perifrico. A tcnica de Knott indicada
para concentrao dos parasitos. O sangue obtido do lbulo da orelha apresenta maior densidade de microfilrias do que o sangue obtido por puno
digital. O exame de fragmentos de pele ou bipsia tambm pode demonstrar microfilrias em alguns casos, mas estas tcnicas so menos sensveis
do que o exame de esfregaos de sangue perifrico 2,22.
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CAPTULO 18

FILARIOSE PELA ONCHOCERCA VOLVULUS


O diagnstico da oncocercose estabelecido por meio de exame histolgico da pele, dos ndulos cutneos, dos linfonodos ou dos olhos. As
microfilrias podem ser raramente isoladas na pele e com freqncia na
conjuntiva14,22.
A exciso cirrgica dos ndulos indicada para o diagnstico e apresenta benefcio teraputico. Aspirado de ndulo ou sangue e linfa pode ser
examinado para deteco das microfilrias. O parasito raramente diagnosticado no sangue perifrico afastado do local da leso22. Algumas vezes
o parasito encontrado na urina, provavelmente devido presena de vermes adultos na regio plvica. O parasito identificado ocasionalmente no
escarro e no fluido cerebroespinhal22.
Nas infeces por O. volvulus a bipsia cutnea (retalho cutneo) o
melhor mtodo para a pesquisa e identificao das microfilrias2. Quando o
parasito no pode ser demonstrado pelos mtodos convencionais utilizado
o teste de Mazzotti. O teste consiste na administrao ao paciente, por via
oral, de 50mg de dietilcarbamazina (DEC). Aguardar algumas horas e verificar o aparecimento de prurido, edema e dermatite que indicam o diagnstico da oncocercose. O teste indicado para o diagnstico das infeces
inaparentes e assintomticas.
Os testes sorolgicos esto ainda em fase de padronizao, no existem tcnicas com boa sensibilidade e especificidade para o diagnstico. Os
resultados da reao em cadeia da polimerase (PCR), comparados com o
exame dos fragmentos de pele, demonstraram que em 60 pacientes com teste
do fragmento de pele positivo para a presena de microfilrias foi positivo
tambm para o teste da PCR, enquanto 13 dos 34 pacientes com resultado
negativo para o exame do fragmento de pele positivaram a reao da PCR22.
Quando bipsias de pele so digeridas pela colagenase para a deteco de
microfilrias, a sensibilidade (78,9%) comparvel da PCR (76,2%)22. A
PCR mais sensvel do que os exames de fragmentos de pele e um resultado de PCR positivo prediz recrudescncia da doena22.
EXAME A FRESCO DO SANGUE
Colher o sangue da polpa digital e pesquisar ao microscpio, entre lmina e lamnula, a presena de organismos vivos. Nesse mtodo as hemcias podero ser rompidas pela adio de igual volume de gua destilada ou
soluo aquosa de saponina a 2% (m/v).

ESFREGAOS SANGNEOS E SPESSOS

CORADOS

Esse mtodo indicado, principalmente, para inquritos epidemiolgicos


em zonas endmicas. O procedimento possibilita tambm o envio de amostras para exames em laboratrios centrais, para a confirmao do diagnstico. Os esfregaos corados revelam estruturas morfolgicas, por meio das
quais realizada a diferenciao das espcies; enquanto nas preparaes
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CAPTULO 18

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no-coradas de microfilrias no so suficientemente evidenciados os detalhes morfolgicos, que permitem a identificao das espcies. A colorao
de Giemsa (ver p. 296) e as coloraes da hematoxilina de Bohmer (ver p.
366) e de Delafield (ver p. 360) so os processos indicados para a colorao e diagnstico dessas formas embrionrias9.
Preparao
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Deixar as lminas mergulhadas na soluo de limpeza ou em detergente durante 24 horas; aps, lavar em gua corrente para remover os resduos da soluo de limpeza ou do detergente, enxaguar em gua destilada
e em soluo de lcool etlico a 95%. Deixar secar temperatura ambiente
protegidas da poeira. Qualquer resduo que sobrar aps a limpeza pode causar
a flutuao ou o descolamento do esfregao durante o tratamento subseqente.
3. Com pipeta automtica ou graduada colocar em lmina de microscopia, perto de uma das extremidades, quatro gotas ou quantidade medida
de sangue fresco, colhido por puno venosa ou da polpa digital. Com a ponta
de outra lmina, preparar um esfregao retangular. Quando forem usados
40 a 30l de sangue o esfregao dever ter a rea aproximada de 20 x 25mm.
Nos esfregaos muito pequenos e, portanto, muito espessos, as microfilrias
tendem a se desprenderem durante o procedimento ulterior de desemoglobinizao e de colorao. Os esfregaos grandes apresentam melhores
resultados do que as preparaes pequenas, apesar do exame ser mais demorado.
4. Deixar secar temperatura ambiente e, aps, imergir a preparao em gua corrente ou em soluo salina a 0,85% para produzir a desemoglobinizao. Usar cubas de Coplin nesta fase da preparao. No espalhar gua sobre o esfregao. Remover o esfregao e secar temperatura
ambiente na posio vertical. Quando seco, imergir em metanol por dois
segundos 9. Usar cubas de Coplin nesta fase da preparao. Essa etapa fixa o esfregao, atuando como mordente e permitindo uma boa colorao. Os esfregaos devem ser armazenados e/ou corados pelos mtodos de Giemsa (ver p. 296), hematoxilina de Delafield (ver p. 360) e/ou
de Mayer (ver p. 364)
Observaes
1. Proteger a preparao contra a poeira e os insetos, com gaze ou
com a tampa de placa de Petri. A poeira poder trazer confuses quando o
esfregao for corado.
2. As preparaes tornam-se muito difceis de serem desemoglobinizadas
quando os esfregaos secarem durante um perodo maior do que 24 horas. A desemoglobinizao do esfregao um procedimento crtico. As
hemcias lisadas podem ser vistas soltas na gua e todo o processo no
deve durar mais do que um a dois minutos. Quando os esfregaos perma Direitos reservados EDITORA ATHENEU LTDA.

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CAPTULO 18

necerem na gua durante um tempo maior, as filrias podero soltar-se da


preparao.

MTODO DA CONTAGEM EM CMARA


Vrios mtodos de contagem das microfilrias tm sido descritos na literatura. Esses mtodos dependem da preparao dos esfregaos permanentes corados ou do exame direto a fresco. A identificao das microfilrias
torna-se fcil quando a colorao usada est correta9,11.
Procedimento
1. Com lpis de diamante marcar em lmina de microscopia de 76 x
25mm linhas separadas de aproximadamente 2mm de distanciamento. Preparar um pequeno reservatrio de aproximadamente 20 x 30mm com tiras
de vidro (cortadas de outra lmina) e fixadas lmina com DPX, blsamo
do Canad, ou outra resina sinttica. Quando a substncia glutinosa estiver
seca a lmina est pronta para o uso9,11.
2. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
3. Colher sangue da polpa digital ou do lbulo da orelha. Usar na rotina
aproximadamente 20 a 100l de sangue medido com pipeta automtica.
4. Quando forem colocados na cmara 100l de sangue, usar cmara maior (20 x 45mm), devido intensa colorao vermelha da hemoglobina.
5. O volume medido de sangue descarregado em um pequeno volume de gua previamente colocado na cmara de contagem. Adicionar gua
suficiente at que a cmara esteja cheia. Impedir a formao de menisco
cncavo, o qual poder tornar obscuras as microfilrias situadas nas bordas
da lmina. A cmara no deve transbordar para evitar a formao de menisco
convexo. No usar lamnula.
6. As microfilrias so observadas com o aumento de 30 a 40X. Contar as filrias usando as linhas feitas na lmina.
7. Algumas microfilrias morrem rapidamente na gua, outras vivem
por um longo perodo, por exemplo: a W. bancrofti, B. malayi e L. Loa permanecem vivas, enquanto a Dirofilria immitis morre.
8. Quando a lmina no pode ser examinada imediatamente aps a colheita,
misturar o sangue com 0,5 a 1ml de cido actico. O sangue hemolisado
pode ser armazenado e examinado aps vrios meses.
MTODOS DE COLORAO

COLORAO

DE

GIEMSA

Ver pgina 296 Reagentes, Preparao do Corante, Soluo tampo de fosfatos, Colorao da Amostra e Controle de Qualidade.
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CAPTULO 18

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Caractersticas da Colorao
As microfilrias coradas pelo mtodo de Giemsa mostram as clulas excretora e a embrionria coradas em azul-celeste, os poros excretor e anal corados
em rosa-avermelhado e a bainha, se presente, em rosa-claro2,3,4,15,16.

COLORAO PELA HEMATOXILINA DE DELAFIELD


As microfilrias em preparaes no-coradas no mostram completamente as caractersticas morfolgicas para permitir a identificao positiva
do parasito. Apesar do mtodo de Giemsa ser usado na rotina de colorao
dos parasitos do sangue, o procedimento da hematoxilina de Delafield mais
empregado na demonstrao dos detalhes estruturais das microfilrias. O
corante reala, especialmente, quando presente, os ncleos e a bainha. Nenhum corante, entretanto, revela todas as caractersticas morfolgicas e em
muitos casos mais de um procedimento de colorao pode ser necessrio
para a identificao das espcies. Esfregaos sangneos espessos (gota
espessa) ou esfregaos estirados, preparados com sangue concentrado corados pela hematoxilina de Delafield, so usados para o diagnstico dos estdios embrionrios das filrias1,5,15,16.
Reagentes
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290-Merck) (C16H14O 6)


lcool etlico absoluto (C2H 6O), livre de acetona
Soluo salina a 0,85% (ver p. 35)
lcool metlico (CH4O), livre de acetona
Glicerina (C3H8O 3)
Sulfato de alumnio amoniacal (almen de amnio)
[AlNH 4(SO 4) 2.12H 2O]
7. Corante: hematoxilina de Delafield
8. lcool etlico a 90%, 80% 70%, 50%, 30% (v/v)
9. Soluo alcolica de cido clordrico a 0,5% (v/v)
10. Soluo aquosa de cido clordrico a 0,05% (v/v)
11. Soluo aquosa de cido clordrico a 0,1% (v/v)
12. Soluo de hidrxido de amnio (amonaco) a 25-27% (m/v)
13. Creosoto de faia
14. Xilol (xileno) (C8H 10)
15. Resina sinttica (Cytoseal 60)

HEMATOXILINA DE DELAFIELD SEGUNDO ASH E ORIHEL2,3


Preparao do Corante
Hematoxilina, forma cristalina
lcool etlico absoluto

4g
25ml

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Soluo aquosa saturada de almen de amnio


Glicerina
lcool metlico

400ml
100ml
100ml

Dissolver os cristais de hematoxilina no lcool etlico absoluto. Adicionar, lentamente, a soluo saturada aquosa de sulfato de alumnio amoniacal
(aproximadamente uma parte de almen para 11 partes de gua destiladadeionizada). Deixar exposto, em um balo volumtrico, luz solar ou a 37C,
por trs a cinco dias, para que a hematoxilina se oxide hematina. Quando
a soluo estiver amadurecida (seis semanas), filtrar em papel-filtro e adicionar a glicerina e o lcool metlico. Armazenar o corante em frasco mbar,
protegido do calor.
Preparao dos esfregaos
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Preparar os esfregaos espessos ou estirados com o sedimento de
sangue concentrado. Deixar secar.
3. Para que se produza a hemlise nos esfregaos espessos, mergulhar
as lminas em soluo salina a 0,85%, ou em gua corrente, at que toda a
hemoglobina seja removida. No lisar as hemcias nos esfregaos estirados.
4. Fixar os esfregaos, ainda midos, com lcool etlico quente (60C)
por 10 a 15 minutos.
1. Colorao da Amostra segundo Amato, Boeger e Amato 1
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. lcool etlico a 70%, 15 minutos.
3. lcool etlico a 50%, 15 minutos.
4. lcool etlico a 30%, 15 minutos.
5. Hematoxilina de Delafield, tempo varivel.
6. gua destilada, lavagem rpida.
7. gua corrente (oxidao), 15 minutos.
8. lcool etlico 30%, 15 minutos.
9. lcool etlico 50%, 15 minutos.
10. lcool etlico 70%, 15 minutos.
11. Soluo alcolica de HCl a 0,5% (diferenciao), tempo varivel.
12. lcool etlico a 70%, 15 minutos.
13. lcool etlico a 80%, 15 minutos.
14. lcool etlico a 90%, 5 minutos.
15. lcool etlico absoluto (1), 15 minutos.
16. lcool etlico absoluto (2), 15 minutos.
17. Creosoto de faia, tempo varivel, at a montagem.
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CAPTULO 18

361

2. Colorao da Amostra segundo Ash e Orihel 2,3


1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Hematoxilina de Delafield, 10-15 minutos.
3. gua destilada, lavagem rpida.
4. Soluo aquosa de HCl a 0,1% (diferenciao), um minuto.
5. gua destilada-deionizada, um minuto.
6. gua corrente + gotas de amonaco, cinco minutos (gua alcalina
pH ~9,0 a 10,0).
7. gua corrente, dois minutos.
8. lcool etlico a 50%, dois minutos.
9. lcool etlico a 70%, dois minutos.
10. lcool etlico a 80%, dois minutos.
11. lcool etlico a 90%, dois minutos.
12. lcool etlico absoluto (1), cinco minutos.
13. lcool etlico absoluto (2), cinco minutos.
14. Xilol (1), cinco minutos.
15. Xilol (2), cinco minutos.
16. Montar com resina sinttica ou blsamo do Canad.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Quando possvel, controlar todo o procedimento de colorao antes
de usar o corante para o diagnstico da filariose no sangue. Caso o laboratrio no possua sangue humano infectado com microfilrias, usar como controle
sangue canino com Dirofilria immitis. Essa microfilria no possui bainha,
mas apresenta ncleos bem distintos. A colorao das estruturas est descrita a seguir.
2. Quando sangue positivo no est disponvel para o controle, seguir
com todo o cuidado o procedimento de colorao dos espcimes enviados
ao diagnstico:
a. macroscopicamente, os esfregaos apresentam colorao prpuraazulada;
b. microscopicamente, os ncleos das microfilrias coram-se em azul
ou prpura; a bainha, se presente, em ppura-claro. O citoplasma apresenta
colorao avermelhada. As clulas R, o poro excretor e o embrionrio, quando
visveis, no diferem em colorao dos ncleos da cauda. O corpo central
visto como uma estrutura esbranquiada.
3. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
empregadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados.
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362

CAPTULO 18

Observaes
1. A gota espessa poder ser preparada em uma das faces da lamnula
(32 x 32mm), presa por uma de suas bordas a um pequeno pedao de borracha de forma semicircular de 15-30mm de dimetro por 3mm de espessura (Fig. 3.1).
2. A lamnula encaixada em entalhe feito na face plana do suporte
por meio de um bisturi fino ou com lmina de barbear. O suporte de borracha tem por finalidade facilitar a manipulao do preparado durante os diferentes tempos de fixao e colorao, alm de permitir identificar o material, mediante a gravao de nmero numa das faces do referido fragmento
de borracha.
3. O esfregao deve ser examinado com objetiva de pequeno aumento
(10X); entretanto, as caractersticas morfolgicas devem ser observadas com
objetiva de 40X e 100X (leo de imerso).
4. A idade do corante deve ter no mnimo um ano de preparao. Durante
o envelhecimento, a hematoxilina de Delafield deve ficar exposta ao sol. Quando
os ncleos no se coram em azul e o citoplasma em vermelho, rever o envelhecimento do corante.
5. O maior benefcio dessa colorao a melhora da visibilidade da bainha.
Freqentemente, a bainha da W. bancrofti no vista pela colorao de
Giemsa; entretanto, essa estrutura facilmente observada pelo mtodo da
hematoxilina de Delafield.
6. Quando o sangue muito velho ou no foi apropriadamente processado, a colorao final pode no revelar as caractersticas dos ncleos e da
bainha.

COLORAO

PELA

HEMATOXILINA

DE

HARRIS,

SEGUNDO

MALLORY

Preparao do Corante
Hematoxilina, forma cristalina
1g
lcool etlico absoluto
10ml
Sulfato de alumnio e potssio (almen potssico) 20g
gua destilada-deionizada
200ml
xido de mercrio II
0,5g
cido actico glacial
3-4 gotas
Misturar os componentes com cuidado, a reao pode ser explosiva.
Dissolver a hematoxilina no lcool etlico e o almen potssico na gua. Aquecer
at a ebulio. Adicionar a soluo de hematoxilina e aquecer a ebulio
por 30 segundos. Adicionar o xido de mercrio. Esfriar rapidamente. Acrescentar trs a quatro gotas de cido actico. Armazenar em frasco mbar
com tampa esmerilhada durante um a dois meses19.
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CAPTULO 18

363

Procedimento
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher 1ml de sangue venoso em tubos contendo 0,1ml de citrato de
sdio a 5% ou EDTA.
3. Colocar a membrana-filtrante Nuclepore ou Millipore de 25mm de
dimetro e 5mm de porosidade em porta-filtro, com adaptador para seringa.
Adaptar uma agulha.
4. Com seringa de plstico de 10ml, aspirar vrios mililitros de soluo
salina a 0,85%, misturando-a com 2 a 4ml de sangue venoso.
5. Forar, com cuidado, a passagem da mistura atravs da membrana,
usando presso regular e contnua.
6. Lavar a membrana-filtrante trs vezes, pela passagem de 10ml de
soluo salina a 0,85%.
7. Retirar a membrana-filtrante do adaptador, colocando-a sobre lmina para microscopia.
8. Examinar para a pesquisa de microfilrias vivas.
9. Mergulhar a membrana no corante de Giemsa ou na hematoxilina de
Delafield, ou, na hematoxilina de Harris. A membrana pode ser corada como
os esfregaos sangneos estirados.
10. Deixar a membrana secar e montar em resina sinttica (Cytoseal
60).
Controle de Qualidade (CQ)
1. Quando possvel, controlar o procedimento de colorao usando sangue
humano ou de canino infectado com microfilrias.
2. Quando sangue positivo no estiver disponvel, seguir com todo o cuidado
a tcnica, testando os espcimes enviados ao diagnstico. Examinar o sedimento com pequeno e grande aumento.
3. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
empregadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
4. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados.
Observaes: Ash e Orihel 2 mergulham a membrana-filtrante na
hematoxilina de Harris durante cinco a 10 minutos, lavando-a, aps, em gua
corrente.

COLORAO PELA HEMATOXILINA DE M AYER


Reagentes
1. Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290-Merck) (C16H 14O6)
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364

CAPTULO 18

2. Sulfato de alumnio amoniacal (almen de amnio)


[AlNH 4(SO 4) 2.12H 2O]
3. Iodato de sdio (NaIO3)
4. cido ctrico (C6H 8O 7)
5. Hidrato de cloral (C2H3Cl3O2)
6. lcool etlico absoluto (C2H 6O)
7. Toluol (Tolueno) (C7H8)
Preparao do Corante
Hematoxilina
Iodato de sdio
Almen de amnio
gua destilada-deionizada
Hidrato de cloral
cido ctrico

1g
0,2g
50g
1.000g
50g
1g

A hematoxilina de Mayer poder ser preparada de duas maneiras:


1. Dissolver o almen de amnio em gua fria e juntar a hematoxilina
e o iodato de sdio. Agitar vigorosamente at a completa dissoluo. A soluo
deve apresentar a cor azul-violeta. Adicionar, imediatamente aps, o hidrato
de cloral e o cido ctrico. Filtrar em papel-filtro e estocar em frasco de
vidro mbar com tampa esmerilhada ao abrigo da luz9. Possui validade de
aproximadamente seis meses; ou
2. Dissolver o almen de amnio em 500ml de gua destilada-deionizada,
a quente (no deixar ferver), a hematoxilina em 10ml de lcool absoluto e o
hidrato de cloral, o cido ctrico e o iodato de sdio nos restantes 500ml de
gua destilada-deionizada. Misturar as trs solues e agitar vigorosamente
at a completa dissoluo. Filtrar em papel-filtro e estocar em frasco de vidro
mbar com tampa esmerilhada ao abrigo da luz. Possui validade de aproximadamente seis meses.
Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Preparar e desemoglobinizar o esfregao sangneo.
3. Cobrir o esfregao com a hematoxilina de Mayer, durante 10 a 15
minutos, aquecendo a lmina at a emisso de vapores. No deixar o corante
ferver e secar durante o processo de colorao.
4. Lavar com gua corrente. Drenar.
5. Clarificar com tolueno (uma lavagem), um minuto.
6. Secar temperatura ambiente.
7. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60).
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CAPTULO 18

365

Observaes
1. A colorao no requer diferenciador. O fundo da preparao permanece incolor.
2. A lavagem em gua corrente por mais de 10 minutos possibilita
colorao estvel.
3. O material de bipsia cutnea pode permanecer na hematoxilina de
Mayer por vrias horas.

COLORAO

PELA

HEMATOXILINA DE BOHMER

Reagentes
1. Hematoxilina, forma cristalina (CI 75290-Merck) (C16H 14O6)
2. Sulfato de alumnio e potssio (almen potssico) (AlK (SO4)2.12H2O)
3. lcool etlico absoluto (C 2H 6O)
4. Solues de lcool etlico a 35, 50, 70, 85, 95%
5. cido clordrico concentrado (HCl)
6. Amnia (NH3)
7. Xilol (xileno) (C8H 10)
8. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60)
Preparao das Solues
Soluo A
Hematoxilina
lcool etlico absoluto

1g
12ml

Soluo B
Almen de sulfato de potssio
gua destilada-deionizada

1g
240ml

Soluo de Trabalho
Soluo A
Soluo B

2 ou 3 gotas
5ml

Observao: Deixar a soluo de hematoxilina amadurecer at adquirir cor escura.


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366

CAPTULO 18

Soluo lcool-cido
lcool etlico a 70%
cido clordrico

100ml
1ml

Soluo Aquosa de Amnia 1:10.000


Amnia
gua destilada-deionizada

0,1ml
1.000ml

Colorao da Amostra
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Preparar e desemoglobinizar o esfregao sangneo.
3. Fixar com lcool absoluto por um minuto.
4. Cobrir o esfregao com a hematoxilina de Bohmer e aquecer a lmina at a emisso de vapores. No deixar o corante ferver durante o processo de colorao.
5. Lavar com gua destilada e drenar.
6. Diferenciar com a soluo lcool-cido, um minuto.
7. Lavar com soluo aquosa de amnia, um minuto.
8. Desidratar:
lcool etlico a 35%, cinco minutos.
lcool etlico a 50%, cinco minutos.
lcool etlico a 70%, cinco minutos.
lcool etlico a 85%, cinco minutos.
lcool etlico a 95%, cinco minutos.
lcool etlico absoluto, cinco minutos.
9. Clarificar com xilol, cinco minutos.
10. Montar com resina sinttica (Cytoseal 60)

COLORAO PELA HEMATOXILINA DE CARRAZZI


Ver Captulo 20 Diagnstico Laboratorial da Filariose Bancroftiana
MTODOS E TCNICAS DE CONCENTRAO
Quando a densidade de microfilrias baixa no sangue perifrico, so
indicadas a tcnica de concentrao de Knott 7,8,17 e o mtodo de filtrao
do sangue em membranas de Millipore ou em Nuclepore 6,10,12 para a recuperao e identificao das formas embrionrias.
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CAPTULO 18

367

TCNICA DE KNOTT
Nessa tcnica 7,17 os eritrcitos so hemolisados. Os leuccitos e as
microfilrias do sangue perifrico so concentrados. O sangue hemolisado
oferece a vantagem de remover grande parte do sedimento e aumentar a
probabilidade de que sejam encontradas as microfilrias caso elas estejam
presentes em pequeno nmero. A grande desvantagem dessa tcnica a
morte e a imobilizao dos parasitos, por essa razo no so identificados
pela motilidade. Quando presentes na amostra, as microfilrias so concentradas, no apresentando motilidade no exame direto a fresco. As microfilrias
aps a colorao pelo mtodo de Giemsa ou pela hematoxilina de Delafield
exibem caractersticas morfolgicas tpicas de diagnstico 5. A soluo de
formaldedo a 2%, cido actico a 2% e saponina a 2% so usadas como
agentes hemolisantes.
Amostra
Sangue total colhido com anticoagulante (EDTA, heparina ou citrato de
sdio).
Reagentes
1. Soluo salina de citrato de sdio (Na3C 6H5O 7.2H2O)
a 5% (m/v), heparina ou EDTA (ver p. 318).
2. Soluo de formaldedo a 2% (v/v) ou cido actico a 2% (v/v).
3. Corantes: Giemsa (ver p. 296) ou Hematoxilina de Delafield
(ver p. 360).
Tcnica
1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.
2. Colher 1ml de sangue venoso (total ou citratado) e o transferir diretamente para tubo de centrfuga contendo 10ml de soluo de formaldedo
a 2%. Agitar vigorosamente.
3. Centrifugar (300-500 x g/2min).
4. Decantar o lquido sobrenadante e com pipeta capilar transferir o sedimento para lmina de microscopia. Preparar um esfregao espesso. Deixar secar temperatura ambiente.
5. Corar o esfregao com o corante de Giemsa ou com a hematoxilina
de Delafield.
Controle de Qualidade (CQ)
1. Verificar a calibrao da centrfuga.
2. Quando possvel, controlar o procedimento de colorao usando sangue
humano ou de canino infectado com microfilrias embainhadas ou desembainhadas.
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368

CAPTULO 18

3. Quando sangue positivo no estiver disponvel, seguir com todo o cuidado


a tcnica, testando os espcimes enviados ao diagnstico. Examinar o sedimento com pequeno e grande aumento.
4. Calibrar o microscpio a cada 12 meses; as objetivas e as oculares
empregadas na calibrao devem ser usadas em todas as medidas realizadas com o microscpio. Realizar a morfometria com micrmetro ocular.
5. Os resultados do controle de qualidade devem ser registrados.
Observaes
1. O esfregao espesso dever ser examinado ao microscpio com
pequeno e grande aumento antes da realizao da colorao.
2. Esse procedimento ligeiramente inferior gota espessa, pois apresenta mais resultados negativos quando a parasitemia pequena.
3. As caractersticas morfolgicas no so visveis antes da colorao pelo mtodo de Giemsa ou pela hematoxilina de Delafield.

MTODO DA MEMBRANA-FILTRANTE
O mtodo de concentrao pela membrana-filtrante 6,10,12 muito sensvel porque permite o exame de pequenos volumes de sangue perifrico e
a recuperao absoluta das microfilrias quando presentes em infeces leves. A membrana filtrante recupera a maior parte das microfilrias; entretanto, d