CENTRIFUGACIN DE UN EMBRIN DE RATN EN FASE DE 2 CLULAS:

ESTRATIFICACIN Y RESTABLECIMIENTO CITOPLASMTICO

AUTORES: VERNICA TLLEZ, ARIEL AHUMADA, JUAN MURO, SOLEDAD
SEPLVEDA Y LUIS EZQUIERDO
AO: 1988
RESUMEN
Embriones de ratn en fase de 2 clulas, los cuales fueron durante 1h a 70
000-90 000 x g, mostr una precisa

estratificacin del citoplasma y una

elongacin del ncleo. Los embriones fueron fijados en diferentes tiempos y

fueron observados por microscopa ptica y electrnica utilizando mtodos
citoqumicas y extracciones con detergente. Entre 40 minutos despus de
la centrifugacin, se recuper el aspecto normal de su morfologa con
excepcin de las tapas de lpidos persistentes en los polos centrpetos de los
blastmeros.

Segmentacin,

compactacin

blastulacin

no

fueron

impedidos por centrifugacin. Los tratamientos con colcemid o citocalasina

D retrasaron, mas no perjudicaron el restablecimiento. Estos resultados
sugieren que una estructura elstica del citoesqueleto

puede estar

implicada en este tipo de regulacin embrionaria.

INTRODUCCIN
Embriones

de

ratn

en

fase

de

clulas,

inmunofluorescencia, muestran una regionalizacin de

observados

por

miosina. fodrina y

espectrina y de la etapa 4-NCHA en adelante una regionalizacin de fosfatasa

alcalina y actividad de 5' Nucleotidasa, lo cual se puede demostrar en la
membrana celular. Ninguna regin distinta ha sido reconocida anteriormente,
ya sea en el ovocito o en el vulo fertilizado, lo cual puede ayudar a establecer
una lnea de clulas que enlace los primeros blastmeros con las clulas
diferenciadas

de

blastocitos.

Adems,

embriones

alterados

experimentalmente son capaces de regular y desarrollar un blastocito normal.

Estas observaciones, sin embargo, no excluyen la existencia de una estructura
espacial oculta que puede determinar el desarrollo, aunque tal determinacin
podra ser controlada por la regulacin embrionaria.

Aqu se analiza la

estructura espacial de un embrin de 2-celulas por medio de su centrifugacin

y posterior cultivo in vitro. Este mtodo no se ha utilizado en los mamferos,
excepto por un interesante informe de investigacin preliminar por Mulnard
(1970).

MATERIALES Y MTODOS
Recoleccin de embriones. Los embriones de dos clulas fueron colectados en
medio Biggers el cual contiene 4 mg / ml de albmina de suero bovino (BSA)
(Calbiochem) de ratones superovulados de la cepa CF1, 36 h despus de la
supuesto tiempo de ovulacin.
Procedimiento de centrifugacin. Soluciones Dextran (MW 40.000 Sigma) fueron
preparadas en medio Biggers a concentraciones de 17%, 15%, 13% y 11%
(w/v). Gaseados por separado con C02 en aire con el fin de ajustar el pH entre
7.2 a 7.4 y luego fueron introducidos secuencialmente en tubos de 0,8 ml de
nitrocelulosa. Los embriones fueron colocados en la capa ms ligera de la
gradiente discontnua y los tubos fueron centrifugaron durante 60 min
utilizando el rotor de cubeta oscilante SW 39 de la centrfuga Beckman
modelo L. Las fuerzas centrfugas aplicadas oscilaron de 15.000 hasta 120.000
x g. La temperatura del contenido de los tubos vari entre 13 y 18 C,
excepto para los experimentos en los que se llev a centrifugacin a 4 C.
El cultivo in vitro. Despus de la centrifugacin los embriones se enjuagaron
con medio Biggers y, o bien fijado inmediatamente o cultivadas durante
diferentes momentos antes de la fijacin. Los embriones fueron cultivados
en microgotas de medio Bigger con BSA en placas Petri de plstico (Falcon)
bajo aceite mineral a 37 C en una atmsfera hmeda con 5% de CO, en el
aire, pH 7.2 a 7.4. El nmero de clulas se determinaron por el mtodo de
Tarkowski. Antes de y durante la centrifugacin los embriones fueron
expuestos a temperatura ambiente y a la atmsfera; los controles se
trataron de forma similar.
Microscopa ptica y electrnica. Despus de centrifugacin y cultivo in vitro,
los embriones fueron procesados para microscopa ptica y electrnica
como se inform anteriormente sin la adicin de cido tnico. La
microscopa de luz se llev a cabo en preparaciones completas en glicerol.
En

algunas

series

experimentales,

inmediatamente

despus

de

la

centrifugacin los embriones se lavaron en un buffer de estabilizacin, se

permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en buffer de estabilizacin para 1

min a 37 C y se lav en el mismo buffer durante 30 s antes de la fijacin.
Tcnicas citoqumicas. La Manifestacin inespecfica de lpidos se logr mediante
Red Oil, Sudn Black y por su osmiofilia. La presencia de fosfatasa cida se
demostr en todos los embriones segn el mtodo de Gomori modificado por
Weissenfels. EL ADN se demostr mediante una prueba modificada de
Feulgen se haban fijado en akohol-formaldehdo cidoactico.
Inhibidores del citoesqueleto: Estos inhibidores se aadieron al medio de
cultivo y al gradiente de Dextrano. Algunos experimentos se llevaron a cabo
con una mezcla de 0,5 ug/ml de colemid (Sigma) y 0,5 ug/ml de citocalasina
D (Sigma), otros se llevaron a cabo ya sea con colcemid (2 ug/ml) o con
citocalasina D (0,5 giga ml); por ltimo, algunos experimentos se llevaron a
cabo a 4 C. Los embriones fueron cultivados en medios que contenan
inhibidores por 1h antes, durante y despus de la centrifugacin. Los
inhibidores se prepararon en dimetilsulfoxido (DMSO) y no se observaron
diferencias ser entre los controles con o sin DMSO.

Embrin fijado despus de centrifugacin a 90000x g (fig. 1) o en 70000X g

(fig. 2-5). 1-2 zona de lpidos (L), zona de vesculas y membranas (VM), zona
homognea (H); plana cisternas (flecha), zona pelcida (ZP). Bares. Figura 1,

2 um; Fig. 2, 1um; Fig. 2, 1um, 3 Zona de las mitocondrias (m) un material
fibrilar

(f).

Golgi

sustancia

(g);

cuerpos

multivesiculares

(mb).

Microvellosidades (mv) en el espacio interblastomerico.

Bar, 1um. 4 Zona de cuerpos cristaloides (cb). Seccin tangencial revela
corteza (Co) y microvellosidades (MV). Material fibrilar (f). Bar, 0,5 um, 5 de
contraste de fase de vulo entero; tapa lpidos (L), capa hialina (H) y la capa
granular (G). Bar, 10um

RESULTADOS
Estratificacin: observaciones al microscopio ptico
Despus de la centrifugacin, los embriones se encontraron en las capas
correspondientes a 13% o 15% de Dextrano. Las fuerzas centrfugas
superiores a 30.000 x g indujo una visible y reproducible estratificacin del
citoplasma (ver Fig. 5-7). Algunos embriones empezaron a romperse a
120.000 x g.
El embrin 71 fijado tras la centrifugacin a 70000 x g o 90.000 x g mostr
bajo el microscopio de luz una ligera elongacin de sus blastmeros en el
sentido de la fuerza centrfuga y algunas veces un estrechamiento. Los
embriones orientados generalmente a s mismos de tal manera que los
estratos estaban en un ngulo de 90 con respecto al plano de separacin
de los blastomeros. El cuerpo polar se observ con mayor frecuencia en el
polo centrfugo.
Una tapa de material lipdico fuertemente teidas con Sudn Negro o Rojo
Aceite o Tetroxido osmio fue encontrado en el polo centrpeto de cada
blastmero (fig. 5). Debajo de la tapa de lpidos se observ una capa hialina,
que en su margen centrpeto se ti dbilmente para la actividad de
fosfatasa cida. Bajo la capa hialina, una capa granular se extendi hasta el
polo centrfugo. En esta capa, el ncleo puede verse abarcando desde el
centro del blastmero al polo centrfugo, como si hubiese sido empujado en
esa direccin por el denso nuclolo (Fig. 7).

La prueba Feulgen no revel

ninguna cromatina fuera del
ncleo elongado.
El 33 que fue extrado con
Triton X-100 antes de la fijacin
y la observacin a microscopa
de luz mostr estratificacin
similar a la de los no extrados.
Incluyendo las tapas de lpidos.
Sin embargo, la capa de hialina
apareci parcialmente extrada
y se observ una reduccin
general en el volumen de los
blastmeros de alrededor de
50% (fig. 8).

Estratificacin. Observaciones al microscopio electrnico

En 62 embriones, que se observaron por microscopa electrnica, las capas
descritas por microscopa de luz pueden ser subdivididas en zonas. La tapa
de lpidos corresponde a la zona de lpidos y la capa hialina se subdivide en
una zona centrpeta llena de vesculas y membranas, y una zona centrfuga
homognea.

L= zona lipdica

VM = zona de vesculas y membranas. (zona hialina)

N = zona homognea. (Zona hialina)
La capa granular est subdividida en una zona centrpeta que se caracteriza
por el material de las mitocondrias y material fibrilar

y una zona de

centrfuga que muestra cuerpos cristaloides.

M = zona de mitocondrias
f = material fibrilar
cb = cuerpos cristaloides
La zona de lpidos contiene innumerables gotitas y entre ellas, vesculas y
vesiculadas mitocondrias eran ocasionalmente reconocidas. La zona de
vesculas y membranas contiene vesculas de diferente tamao, aisladas o
asociadas y una plana y membranosa cisterna. Las vesculas junto a la zona
de lpidos probablemente corresponden a los lisosomas ya que su
localizacin coincide con la actividad de la fosfatasa cida demostrada en
los embriones en conjunto y las membranas pueden corresponder a
suavizar el retculo endoplsmico. La zona homognea contiene material
fino granular uniformemente distribuido y sin orgnulos.
La zona caracterizada por el material de las mitocondrias y fibrilar
tambin contiene la sustancia de Golgi, cuerpos multivesiculares y las
vesculas que son ms pequeas que las que se encuentran en la zona de
vesculas y membranas. La zona de

cuerpos cristaloides no se detecta

cuando los embriones han sido centrifugados a menos de 70.000 x g; a esta

o fuerzas superiores esta zona parece llena de material fibrilar y cuerpos
cristaloides. El cortex de laclula es claro y muestra una malla fina
carecente de orgnulos. Parece ser afectado por centrifugacin y no cambia
apreciablemente de acuerdo a la fuerza centrfuga aplicada.
En

25

embriones

los

cuales

fueron

extrados

con

detergente

inmediatamente despus de la centrifugacin y antes de la fijacin para

microscopa electrnica, la capa lipdica persiste pero parece algo extrado y
numerosas gotitas de lpido se agregan en unas pocas gotas grandes. Todas
la citomembranas en sta y las otras capas han desaparecido, quedando
fragmentos de materia amorfa.
El material fibrilar se conserva y componentes del citoesqueleto se
vuelven distintos con el tratamiento con detergente. Particularmente
evidente se muestran la

corteza celular densa, la red interna de

microfilamentos de actina (7nm) y los microtbulos (21 nm) observados en

diversas ubicaciones, especialmente prxima al ncleo.

= material fibrilar
microfilamentos sealados con la flecha
co = corteza de la zona centrfuga

Relaciones espaciales cercanas fueron observadas entre los microtbulos y

las indentaciones en el polo centripetal del ncleo, y microfilamentos son
encontrados alrededor del ncleo.

La cabeza de la flecha seala los microfilamentes y la flecha muestra

los microtbulos cercanos al ncleo (N)

El ncleo, ya sea visualizado en preparados de extraccin con detergente

o no, no se desubica por centrifugacin, de su insercin en la zona de
material mitocondrial y fibrilar y se muestra elongado hacia polo centrifugo
del

blastmero.

La

parte

centrpeta

final

del

ncleo

nos

muestra

indentaciones profundas y el extremo centrfugo contiene los nucleolos,

fusionados en uno o dos.

Ncleo elongado hacia la zona centrfuga,

con el nucleolo (Nu), con indentaciones
en

la zona centrpeda

Restablecimiento

de

embriones

estratificados:

Observaciones

al

microscopio ptico
Un nmero embriones (66) se fija 30 mm a 4 h despus de ser centrifugada
a 70.000 o 90.000 x g y se observaron al microscopio ptico. Dentro de 30 a
40 minutos despus de centrifugacin, los ncleos y nuclolos se
encuentran de nuevo en el centro de la clula y la estratificacin del
citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapas de lpidos persistir en los
polos centrpetos de ambos blastmeros.

En embriones en los que se permiti seguir con su desarrollo, la segunda

divisin por lo general divide a las tapas y conforme se da escisin, las
gotas de lpidos son redistribuidas entre los blastmeros.

La centrifugacin no impide el desarrollo a blastocitos normales con cerca

de 30 clulas, aunque la blastulasion es algo retrasada. El porcentaje de
blastulacin en embriones centrifugados es de aproximadamente 20%
menos que en los embriones no centrifugada y tratados en condiciones
similares: sin embargo, un aumento en la fuerza centrfuga de 50.000 x g a
90.000 x g no cambia el porcentaje de blastulacin significativamente. El
porcentaje

blastulacin

sobre

los

controles

en

experimentos

de

centrifugacin es aproximadamente 73% que es considerablemente ms

bajo que el 91-92% observado en nuestros cultivos estndares. sta
diferencia puede atribuirse a bajas temperaturas y a la alcalinizacin de los
medios, cuando los embriones estn fuera de la incubadora (ver Materiales
y mtodos).

Efecto de los inhibidores del citoesqueleto: observaciones al microscopio

ptico y electrnico

Las observaciones por microscopa de luz en 180 embriones que fueron

tanto centrifugados como cultivados en un medio que contena una mezcla
de colcemid (0,5 ug / ml) y citocalasina D (. 0.5 ug/ ml) revelan que los
embriones tratados con esta mezcla de mineral de drogas son frgiles: a
70.000 x g. 30% de ellos se rompieron entre la capa hialina y granular, y en
90.000 x g. Esto se observa en el 60% de los embriones. Slo el 10% de los
embriones no tratados se rompieron a 130.000 x g. La estratificacin de los
vulos tratada y no tratada es bastante similar, pero los embriones tratados
a 30.000 x g muestran el efecto producido por 5,000 x g en los vulos sin
tratar.
Los vulos que se centrifugaron y cultivaron en medios que contienen
colcemid o citocalasina D se repusieron de la estratificacin mucho ms
lento que vulos de control, y su desarrollo normal se detuvo. Nosotros
comparamos el efecto de estas medicinas registrando el tiempo que pas
despus de la centrifugacin hasta que el nuclolo recobrara una posicin
central en blastmeros, que revela la recuperacin de forma y la posicin
de los ncleos. La observacin de 144 vulos tratados con colcemid
muestra que en el 93% de ellos el nuclolo recuper su posicin central 180
minutos despus de la centrifugacin, mientras esta situacin se recuper
despus de 240 minutos en el 95% de 236 vulos tratados con citocalasina
D.
La morfologa de los 98 vulos centrifugados
citocalasina

D,

que

se

extrajeron

del

tratados con colcemid o

detergente

despus

de

la

centrifugacin, es diferente de la descrita anteriormente para los vulos sin

tratar. Bajo el microscopio ptico la diferencia destacable es el contorno liso
o el polo centrpeto nuclear en vulos tratados con frmacos, en
comparacin con las hendiduras observadas en los vulos sin tratar.
Los embriones que fueron tratados con colcemid o en frio el ncleo
permanece en la capa granular,

mientras que

el tratamiento con

citocalasina D causa una separacin del ncleo dejando un espacio entre el

material fibrilar y la membrana nuclear colapsada. El citoplasma de los
embriones tratados con colcemid carece de perfiles de micro tbulos y los
embriones tratados con citocalasina D demuestran una corteza discontinua
y una red interior relajada (suelta floja) del material fibrilar.

DISCUSION
Estratificacin de los componentes celulares:
La estratificacin del citoplasma ha demostrado que al menos dos tipos de
(o estados) de los cuerpos vesiculares pueda ser reconocido por su
densidad: vesculas de luz que se encuentran debajo de la tapa de lpidos,
que incluyen elementos que muestran la actividad fosfatasa cida y las
vesculas pesados que se encuentran en la capa granular mezclan con el
material de las mitocondrias y fibrilar nuestras observaciones sugieren que
este material fibrilar, en virtud de la fuerza de las pilas centrfugas hasta la
formacin de cuerpos cristaloides.
El alargamiento de los ncleos y la muesca en su fuerza centrpeta postes
pueden atribuirse a un discontinuo de la membrana nuclear en el
citoesqueleto. De hecho, el detergente de vulos extrados revelan los
microtbulos y microfilamentos asociado a la hendiduras nucleares y estas
desaparecen de vulos que han sido tratados con coloemid o denominado
citocalasina o fro en l no se ha estudiado los otros componentes del
citoesqueleto que han sido identificadas en embriones de preimplantacin,
alfa-actinina, citoqueratina, miosina, fodrin y spectrin.
RECUPERACION POR ESTRATIFICACION
La recuperacin pasiva de acuerdo a la densidad relativa probablemente
requerira de un periodo ms largo que el tiempo de recuperacin que
nosotros hemos encontrado y no explicara por qu las gotas de lpidos
permanecen coleccionadas en los polos centrpetos. Sin embargo, esto no
es posible para descartar el rol de una matriz viscosa no estructurada con
comportamiento elstico (Crick y Hughes 1950) en la recuperacin del OVA
despus de la centrifugacin. El rol del citoesqueleto es sugerido por el
retraso

observado en la recuperacin cuando los rectritores son usados

especialmente

con

cytocalasina

D.

Aunque

estas

drogas

en

las

concentraciones usadas aqu, previenen la divisin celular y el desarrollo

normal (mirar Izquierdo et. at. 1984), el citoesqueleto no es desmantelado y
la recuperacin desde la estratificacin quiz an sea atribuida para un
armazn resiliente que est conectado para diversas citomembranas y de
este modo mantenerlos o restaurarlos en una orden especial.

EL DESARROLLO DESPUS DE LA RECUPERACIN

En todos los experimentos de centrifugacin, la hendidura y el desarrollo del
blastocisto parcialmente son perjudicados probablemente porque los
embriones son observados bajo el microscopio simple durante la hendidura,
la consolidacin o la formacin del blastocisto, parece que la centrifugacin
no causa ningn desorden de organizacin de clula fundamental. La
asumisin que el desarrollo posterior es completamente normal, al menos
dos interpretaciones generales de los resultados es posible. Primero, la
existencia de estructura preestablecida que se opone a la centrifugacin o
fcilmente nuevas ensenadas de ello, que retira los componentes de clula
complicados en morfognesis a su lugar apropiado. Segundo, la ausencia en
esta etapa de cualquier estructura de morfognesis espacial. Nuestros
resultados aqu apoyan la primera interpretacin pero no podemos ser ms
asertivos porque la recuperacin de la estratificacin puede ser un proceso
pasivo, o an uno activo que es sin relaciones a morfognesis del
blastocisto; y ms lejos, porque las anormalidades del desarrollo que
pueden aparecer posteriores no han sido excluidas. Estas publicaciones
estn todava abiertas para el debate (mirar discusiones en 1997 Izquierdo,
1986; Johnson 1981; Johnson et Al-, 1984).

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Biggers JD, Whiten WK, Whittingham DG (1971) The culture of mouse
embryos in vitro.

In: Daniel JC (ed) Methods in mammalian

embryology. Freema, San Francisco, pp 86-116.

Casselman WGB (1959 Histochemical) Technique. Methuen, London.

 Crick FH, Hughes AFW (1950) The physical properties of cytoplasman.

A study by means of magnetic particle method. Part I. Exp Cell Res
37: 37-80.
Damjanov I,

Damjanov A, Lehto V-P, Virtanen I (1986) Spectrin in

mouse gametogenesis and embryogenesis. Dev Biol 114: 132-140.

Izquierdo L (1977) Cleavage and differentiation. In: Johson MH (ed)
Develoment in mammals vol 2. North Holland, Amsterdam, pp 99118.